JPH0191796A - アンモニア測定法及び固定化酵素カラム - Google Patents
アンモニア測定法及び固定化酵素カラムInfo
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- JPH0191796A JPH0191796A JP24858887A JP24858887A JPH0191796A JP H0191796 A JPH0191796 A JP H0191796A JP 24858887 A JP24858887 A JP 24858887A JP 24858887 A JP24858887 A JP 24858887A JP H0191796 A JPH0191796 A JP H0191796A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
この発明は、アンモニア測定法及びアンモニア測定用カ
ラムに関する。ざらに詳しくは、生体試料中に存在しう
るアンモニアやアンモニア態窒素の定量並びにクレアチ
ニンの定量に好適に用いることができる分析法及びこの
方法に好適に用いられる固定化酵素カラムに関する。
ラムに関する。ざらに詳しくは、生体試料中に存在しう
るアンモニアやアンモニア態窒素の定量並びにクレアチ
ニンの定量に好適に用いることができる分析法及びこの
方法に好適に用いられる固定化酵素カラムに関する。
（ロ）従来の技術
従来、血清等の生体試料中のアンモニアを定量する方法
として、α−ケトグルタル酸及びＮＡＤＰＨ（又はＮＡ
ＤＨ）の存在下、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬ
ＤＨ）で処理してＮＨ３１ｉ１に対応するグルタミン酸
を生成させ（式■）、ＮＨ３＋α−ケトグルータル酸＋
ＮＡＤＰＨ十ＨをＧＬＤＨ −一−→Ｌ−グルタミン酸＋ＮＡＤＰ” 十Ｆ＋２０（
式１） さらに、グルタミン酸オキシダーゼ（ＧＬＸＤ）で処理
して前記アンモニア量に対応する過酸化水素を発生させ
（式■）、 Ｌ−グルタミン酸＋０２＋８２０ ＧＬＸＤ −〉Ｈ２０２＋α−ケトグルタル酸＋ＮＨｓ（式■） この過酸化水素量を吸収光度法や化学発光法で測定し、
この測定値から換算する方法が提案されている（特開昭
６０−４１５００号公報）。
として、α−ケトグルタル酸及びＮＡＤＰＨ（又はＮＡ
ＤＨ）の存在下、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬ
ＤＨ）で処理してＮＨ３１ｉ１に対応するグルタミン酸
を生成させ（式■）、ＮＨ３＋α−ケトグルータル酸＋
ＮＡＤＰＨ十ＨをＧＬＤＨ −一−→Ｌ−グルタミン酸＋ＮＡＤＰ” 十Ｆ＋２０（
式１） さらに、グルタミン酸オキシダーゼ（ＧＬＸＤ）で処理
して前記アンモニア量に対応する過酸化水素を発生させ
（式■）、 Ｌ−グルタミン酸＋０２＋８２０ ＧＬＸＤ −〉Ｈ２０２＋α−ケトグルタル酸＋ＮＨｓ（式■） この過酸化水素量を吸収光度法や化学発光法で測定し、
この測定値から換算する方法が提案されている（特開昭
６０−４１５００号公報）。
また、かかるアンモニア定量法をクレアチニンの定量に
応用する方法も知られている。かかるクレアチニンの定
違法は、試料をクレアチニンデイミナーゼ（ＣＮＩ）で
処理して存在しうるクレアチニンをＮ−メチルヒダント
インとアンモニアに変換しく弐■）、 クレアチニン＋Ｈ２Ｏ −一便し→ＮＨ３＋Ｎ−メチルヒダントイン（式■） ここで生成するアンモニア量を上記（式１）及び（式■
）のアンモニア定量法で定量し、この値から換算する方
法である。
応用する方法も知られている。かかるクレアチニンの定
違法は、試料をクレアチニンデイミナーゼ（ＣＮＩ）で
処理して存在しうるクレアチニンをＮ−メチルヒダント
インとアンモニアに変換しく弐■）、 クレアチニン＋Ｈ２Ｏ −一便し→ＮＨ３＋Ｎ−メチルヒダントイン（式■） ここで生成するアンモニア量を上記（式１）及び（式■
）のアンモニア定量法で定量し、この値から換算する方
法である。
そして上記アンモニア定量法における二つの酵素反応〔
（式Ｉ）（式ＩＩ））を円滑かつ効率良く行なうために
、固定化Ｍ索カラムを用いる方法が研究されるに至って
おり、ことに、ＧＬＤＨ固定化酵素の充填カラムと、Ｇ
ＬＸＤ固定化酵素の充填カラムとを直列に結合したり、
ＧＬＤＨ固定化酵素とＧＬＸＤ固定化酵素とをカラム軸
方向に積層充填してなるカラムが提案されている。
（式Ｉ）（式ＩＩ））を円滑かつ効率良く行なうために
、固定化Ｍ索カラムを用いる方法が研究されるに至って
おり、ことに、ＧＬＤＨ固定化酵素の充填カラムと、Ｇ
ＬＸＤ固定化酵素の充填カラムとを直列に結合したり、
ＧＬＤＨ固定化酵素とＧＬＸＤ固定化酵素とをカラム軸
方向に積層充填してなるカラムが提案されている。
（ハ）発明の詳細な説明
しかしながら、上記いずれの固定化酵素カラムを用いて
も、アンモニアの足囲に限界があり、従って測定に供す
る生体試料の母が微量化できない問題点があった。
も、アンモニアの足囲に限界があり、従って測定に供す
る生体試料の母が微量化できない問題点があった。
この発明は、かかる状況下においてなされたものであり
、ことに前記した従来のアンモニア測定法で必要とされ
る５〜１０ｄ程度の試料をより微量化できる高感度なア
ンモニア測定江を提供しようとするものである。
、ことに前記した従来のアンモニア測定法で必要とされ
る５〜１０ｄ程度の試料をより微量化できる高感度なア
ンモニア測定江を提供しようとするものである。
（ニ）問題点を解決するための手段
本発明者らは上記観点から鋭意研究を行なった結果、Ｇ
ＬＤＨとＧＬＸＤを共存固定化（Ｃ〇−＋１＋１１０ｂ
ｉｌｉＺｅ ）してなる固定化酵素にアンモニア含有試
料を導入して処理することにより、発生する過酸化水素
量が著しく増大し、ことに含有されるアンモニアの当量
以上の過酸化水素が発生する事実を見出し、この発明に
到達した。
ＬＤＨとＧＬＸＤを共存固定化（Ｃ〇−＋１＋１１０ｂ
ｉｌｉＺｅ ）してなる固定化酵素にアンモニア含有試
料を導入して処理することにより、発生する過酸化水素
量が著しく増大し、ことに含有されるアンモニアの当量
以上の過酸化水素が発生する事実を見出し、この発明に
到達した。
かくしてこの発明によれば、カラム容器内にグルタミン
酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）とグルタミン酸オキシ
ダーゼ（ＧＬＸＤ）とを共存固定化してなる固定化酵素
を充填してなる固定化Ｆｊｌｆ＝カラムが提供される。
酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）とグルタミン酸オキシ
ダーゼ（ＧＬＸＤ）とを共存固定化してなる固定化酵素
を充填してなる固定化Ｆｊｌｆ＝カラムが提供される。
さらにこの発明によれば、アンモニアを含有しうる試料
を、α−ケトグルタル酸とＮＡＤＰＨ（又はＮＡＤＨ）
の存在下でグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）
とグルタミン酸オキシダーゼ（ＧＬＸＤ）とを共存固定
化してなる固定化酵素充填カラムに導入して過酸化水素
を発生させ、この過酸化水素値に基づいて試料中のアン
モニアを定量することを特徴とするアンモニア測定法が
提供される。
を、α−ケトグルタル酸とＮＡＤＰＨ（又はＮＡＤＨ）
の存在下でグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）
とグルタミン酸オキシダーゼ（ＧＬＸＤ）とを共存固定
化してなる固定化酵素充填カラムに導入して過酸化水素
を発生させ、この過酸化水素値に基づいて試料中のアン
モニアを定量することを特徴とするアンモニア測定法が
提供される。
この発明におけるＧＬＤＨとＧＬＸＤとの共存固定化酵
素の作製は、被固定酸素としてＧＬＤＩ−１とＧＬＸＤ
との混合酵素を用いることにより、通常の酵素固定化手
法に準じて行なうことができる。
素の作製は、被固定酸素としてＧＬＤＩ−１とＧＬＸＤ
との混合酵素を用いることにより、通常の酵素固定化手
法に準じて行なうことができる。
ここで固定化手法としては一般に、化学結合法、包括法
等種々の方法があるが、安定な固定化が行なえる点で化
学結合法を用いるのが適しており、その好ましい一例と
してシランカップリング剤を用いて適当な担体く例えば
ガラスピース、シリカゲル等）に固定化する方法が挙げ
られる。
等種々の方法があるが、安定な固定化が行なえる点で化
学結合法を用いるのが適しており、その好ましい一例と
してシランカップリング剤を用いて適当な担体く例えば
ガラスピース、シリカゲル等）に固定化する方法が挙げ
られる。
上記ＧＬＤＨ−ＧＬＸＤ共存固定化酵素を用いたアンモ
ニアの測定は、適当なキャリア液の流通下、試料をこの
固定化酵素の充填カラムに導入することにより行なうの
が適している。この際のキャリア液中又は試料中には前
記（式１）と（式■）のような反応を進めるべくα−ケ
トグルタル酸及びＮＡＤＰＨ（又はＮＡＤＨ）を含有さ
せておくことが必要である。またキャリア液の−は７〜
８に調整しておくのが適している。この導入処理により
過酸化水素が生成するが、この生成量は試料中に含有さ
れるアンモニア量の大小に対応する。
ニアの測定は、適当なキャリア液の流通下、試料をこの
固定化酵素の充填カラムに導入することにより行なうの
が適している。この際のキャリア液中又は試料中には前
記（式１）と（式■）のような反応を進めるべくα−ケ
トグルタル酸及びＮＡＤＰＨ（又はＮＡＤＨ）を含有さ
せておくことが必要である。またキャリア液の−は７〜
８に調整しておくのが適している。この導入処理により
過酸化水素が生成するが、この生成量は試料中に含有さ
れるアンモニア量の大小に対応する。
従ってこの過酸化水素ｍを測定することにより、試料中
のアンモニアを換算定量することが可能となる。なお、
この際の過酸化水素量の測定は、ルミノールと赤血塩を
用いるルミノール化学発光法、ＥＣＤや過酸化水素電極
等を用いる電気化学的検出法、パーオキシダーゼを用い
る比色測定法、等が適している。
のアンモニアを換算定量することが可能となる。なお、
この際の過酸化水素量の測定は、ルミノールと赤血塩を
用いるルミノール化学発光法、ＥＣＤや過酸化水素電極
等を用いる電気化学的検出法、パーオキシダーゼを用い
る比色測定法、等が適している。
この発明のアンモニア測定法は、試料中のクレアチニン
の定量に適用することができる。即ち、試料をまずクレ
アチニンデイミナーゼ（ＣＮ Ｉ ）で処理してアンモ
ニアを発生させ、この処理液について上記アンモニア測
定法によってアンモニアを足囲し、この値からクレアチ
ニンを換算定量することができる。ただし、試料中のア
ンモニアやグルタミン酸はかかるクレアチニン定量に正
の誤差を与える。従って、このクレアチニン定量法にお
いては、予め試料中のアンモニアとグルタミン酸を除去
処理しておくのが好ましい。かかる除去処理としては、
ＧＰＴ、ＧＯＴ、ＧＬＤＨ等を用いた酵素反応により行
なうのが適しており、ことにＧＰＴ、ＧＯＴ及びＧＬＤ
Ｈを共存固定化した固定化酵素カラムやＧＰＴとＧＬＤ
Ｈの共存固定化酵素とＧＯＴとＧＬＤＨの共存固定化酵
素とをカラム容器内の軸方向に積層充填したカラムに、
α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＰＨ（又はＮＡＤＨ＞オキ
サロ酢酸及びピルビン酸の存在下、試料を導入処理する
ことにより効率良くアンモニア及びグルタミン酸の除去
処理を行なうことができる。なお、上記ＣＮＩによる処
理も固定化酵素カラムを用いて行なうのが適している。
の定量に適用することができる。即ち、試料をまずクレ
アチニンデイミナーゼ（ＣＮ Ｉ ）で処理してアンモ
ニアを発生させ、この処理液について上記アンモニア測
定法によってアンモニアを足囲し、この値からクレアチ
ニンを換算定量することができる。ただし、試料中のア
ンモニアやグルタミン酸はかかるクレアチニン定量に正
の誤差を与える。従って、このクレアチニン定量法にお
いては、予め試料中のアンモニアとグルタミン酸を除去
処理しておくのが好ましい。かかる除去処理としては、
ＧＰＴ、ＧＯＴ、ＧＬＤＨ等を用いた酵素反応により行
なうのが適しており、ことにＧＰＴ、ＧＯＴ及びＧＬＤ
Ｈを共存固定化した固定化酵素カラムやＧＰＴとＧＬＤ
Ｈの共存固定化酵素とＧＯＴとＧＬＤＨの共存固定化酵
素とをカラム容器内の軸方向に積層充填したカラムに、
α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＰＨ（又はＮＡＤＨ＞オキ
サロ酢酸及びピルビン酸の存在下、試料を導入処理する
ことにより効率良くアンモニア及びグルタミン酸の除去
処理を行なうことができる。なお、上記ＣＮＩによる処
理も固定化酵素カラムを用いて行なうのが適している。
（ホ）作 用
Ｇ Ｌ Ｄ ＨとＧＬＸＤとが共存固定化された固定化
酵素を用いているため、前記（式１）と（式■）の反応
がほぼ同時に進行し、見かけ上（式■）：ＮＡＤＰＨ＋
Ｈ２０＋０２ 。
酵素を用いているため、前記（式１）と（式■）の反応
がほぼ同時に進行し、見かけ上（式■）：ＮＡＤＰＨ＋
Ｈ２０＋０２ 。
（又はＮＡＤ）−１）
ＮＡＤＰ÷＋８２０２
（又はＮＡＤ÷）
（式■）
に基づいてＮＡＤＰＨ（又はＮＡＤＰ）の酸化反応が進
行する。従って（式１）と（式■）の反応を別個に行な
わせた場合には、生成する過酸化水素量は試料中のアン
モニア当量に規制されるが、同時反応の場合には、結果
的に試料中のアンモニア量に対応するがその当量以上の
過酸化水素が生成されることとなる。この同時反応の酵
素反応サイクルを（式Ｖ）に示した。
行する。従って（式１）と（式■）の反応を別個に行な
わせた場合には、生成する過酸化水素量は試料中のアン
モニア当量に規制されるが、同時反応の場合には、結果
的に試料中のアンモニア量に対応するがその当量以上の
過酸化水素が生成されることとなる。この同時反応の酵
素反応サイクルを（式Ｖ）に示した。
（式Ｖ）
従って、アンモニア量に対応する処理液中の過酸化水素
濃度が従来法に比して増大され、高感度な測定が可能と
なる。
濃度が従来法に比して増大され、高感度な測定が可能と
なる。
（へ）実施例
多孔質ガラス担体１．Ｏｇ当り、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ＧＬＤＨ：東洋紡（株）製）５０ｍｇ、グル
タミン酸オ゛キシダーゼ（ＧＬＸＤニヤマサ醤油（株）
製） ５０ｍｇを共存固定化した。
ゲナーゼ（ＧＬＤＨ：東洋紡（株）製）５０ｍｇ、グル
タミン酸オ゛キシダーゼ（ＧＬＸＤニヤマサ醤油（株）
製） ５０ｍｇを共存固定化した。
用いた多孔質多孔質ガラス担体は、細孔径５００人で２
０〜８０メツシユのガラスピーズである。また、固定化
は、塩ｉ！ｉ！酸性のγ−アミノプロピルトリエトキシ
シラン水溶液で多孔質ガラス担体を処理してアミノプロ
ピル化した後、このガラスを２．５％のグルタルアルデ
ヒド水溶液で処理してグルタルアルデヒド化し、このガ
ラス担体をＧＬＤＨとＧＬＸＤの混合水溶液（リンＲ緩
衝液）中に所定量混合して固定化する方法を用いて行な
った。かかるＧＬＤＨ−ＧＬＸＤ共存固定化酵素（ピー
ズ）を内径３ｍｍ、長さ２０ ｍｍのアクリル製カラム
に充填してこの発明の固定化酵素カラムを作製した。
０〜８０メツシユのガラスピーズである。また、固定化
は、塩ｉ！ｉ！酸性のγ−アミノプロピルトリエトキシ
シラン水溶液で多孔質ガラス担体を処理してアミノプロ
ピル化した後、このガラスを２．５％のグルタルアルデ
ヒド水溶液で処理してグルタルアルデヒド化し、このガ
ラス担体をＧＬＤＨとＧＬＸＤの混合水溶液（リンＲ緩
衝液）中に所定量混合して固定化する方法を用いて行な
った。かかるＧＬＤＨ−ＧＬＸＤ共存固定化酵素（ピー
ズ）を内径３ｍｍ、長さ２０ ｍｍのアクリル製カラム
に充填してこの発明の固定化酵素カラムを作製した。
この固定化酵素カラムを用いたアンモニア測定系を応用
して第３図に示すクレアチニン分析装置を構成した。図
中、１は送液ポンプ、２はバルブ切換方式の試料導入器
、３はＧＰＴ−ＧＬＤＨ共存固定化酵素とＧＯＴ−ＧＬ
ＤＨ共存固定化酵素とをこの順に積ＩＩ （２ｃｍ ；
２Ｃ１ｌ） Ｌ／てなるアンモニア及びグルタミン
酸除去用の前処理カラム（内径３ｍｍ、長さ４０ｍｍ）
、４はＣＮＩ固定化酵素カラム（内径３ｍｍ、長さ２０
ｍｍ） 、５はブランクカラム、６はこの発明のＧＬＤ
Ｈ−ＧＬＸＤ共存固定化酵素カラム、７は化学発光検出
器、８ａ 、 ８ｂは各々流路切換バルブ、９は記録計
、１０ａ、１０ｂは各々分岐流路を示す。また、１１は
蒸留水供給路（供給量０．５ｙｊ／分）、１２は下記組
成：第２リン酸ナトリウム ５７２５１１Ｍ ｇ
第１リン酸カリウム ５４３ｍｇ／ρα−ケト
グルタル酸 ７０１ＭρＥＤＴＡ ジナト
リウム ７７５ｍＱ／ρ（２Ｈ２０） オキサロ酢＠ １０１Ｍピルビン酸
ナトリウム ４０ ｍＭビリドキサルリン＠
０，２ ｍＭからなりＰＨ７，２５に調整
された緩衝溶液の供給路（供給量０．２５ｚ／／分）、
１３はＮＡＤＰ８２００ｍＭΩ水溶液供給路、１４は赤
面ＭＡ ６．６（＋ ／ｇ水溶液供給路、１５はルミノ
ール１０ｍｏ／ Ｑ水溶液（水酸化カリウム１１．２ｇ
／ Ｑ 、ホウ酸１２．４ｆＪ ／ｇ金含有の供給路を
各々示すものである。
して第３図に示すクレアチニン分析装置を構成した。図
中、１は送液ポンプ、２はバルブ切換方式の試料導入器
、３はＧＰＴ−ＧＬＤＨ共存固定化酵素とＧＯＴ−ＧＬ
ＤＨ共存固定化酵素とをこの順に積ＩＩ （２ｃｍ ；
２Ｃ１ｌ） Ｌ／てなるアンモニア及びグルタミン
酸除去用の前処理カラム（内径３ｍｍ、長さ４０ｍｍ）
、４はＣＮＩ固定化酵素カラム（内径３ｍｍ、長さ２０
ｍｍ） 、５はブランクカラム、６はこの発明のＧＬＤ
Ｈ−ＧＬＸＤ共存固定化酵素カラム、７は化学発光検出
器、８ａ 、 ８ｂは各々流路切換バルブ、９は記録計
、１０ａ、１０ｂは各々分岐流路を示す。また、１１は
蒸留水供給路（供給量０．５ｙｊ／分）、１２は下記組
成：第２リン酸ナトリウム ５７２５１１Ｍ ｇ
第１リン酸カリウム ５４３ｍｇ／ρα−ケト
グルタル酸 ７０１ＭρＥＤＴＡ ジナト
リウム ７７５ｍＱ／ρ（２Ｈ２０） オキサロ酢＠ １０１Ｍピルビン酸
ナトリウム ４０ ｍＭビリドキサルリン＠
０，２ ｍＭからなりＰＨ７，２５に調整
された緩衝溶液の供給路（供給量０．２５ｚ／／分）、
１３はＮＡＤＰ８２００ｍＭΩ水溶液供給路、１４は赤
面ＭＡ ６．６（＋ ／ｇ水溶液供給路、１５はルミノ
ール１０ｍｏ／ Ｑ水溶液（水酸化カリウム１１．２ｇ
／ Ｑ 、ホウ酸１２．４ｆＪ ／ｇ金含有の供給路を
各々示すものである。
かかる装置は、分岐流路１０ａを選択した際の検出器出
力に基づいて、試料中のクレアチニンを定量しうるよう
構成されたものである。即ち、前処理カラム３でアンモ
ニアとグルタミン酸が実質的に完全に除去された処理液
が、カラム４に導入されてクレアチニンがアンモニアに
変換され、これがこの発明のＧＬＤＨ−ＧＬＸＤ共存固
定化酵素カラム６で過酸化水素に変換される。ここで過
酸化水素量は、ルミノール発光法により検出器７で検出
される。この値は、ＣＮＩ処理液中のアンモニア量、ひ
いては試料中のクレアチニン団に対応するため、これに
基づいてクレアチニンを換算定量することが可能となる
。なお、分岐流路１０ｂはバックグラウンド測定用のも
のであり、この流路選択時の出力をベースとすることに
より、より高精度の測定ができることとなる。
力に基づいて、試料中のクレアチニンを定量しうるよう
構成されたものである。即ち、前処理カラム３でアンモ
ニアとグルタミン酸が実質的に完全に除去された処理液
が、カラム４に導入されてクレアチニンがアンモニアに
変換され、これがこの発明のＧＬＤＨ−ＧＬＸＤ共存固
定化酵素カラム６で過酸化水素に変換される。ここで過
酸化水素量は、ルミノール発光法により検出器７で検出
される。この値は、ＣＮＩ処理液中のアンモニア量、ひ
いては試料中のクレアチニン団に対応するため、これに
基づいてクレアチニンを換算定量することが可能となる
。なお、分岐流路１０ｂはバックグラウンド測定用のも
のであり、この流路選択時の出力をベースとすることに
より、より高精度の測定ができることとなる。
なお、かかる装置を用いて血清（８膚）中のクレアチニ
ン分析を行なって、従来のヤツフエ法との相関を調べた
結果を第２図に示した。
ン分析を行なって、従来のヤツフエ法との相関を調べた
結果を第２図に示した。
このように相関性は優れていた。
上記装置において、クレアチニン１１１１Ｍ水溶液を１
４導入した際の検出器７での出力を第３図（ωに示した
。このように１４という極めて微量の試料の添加でも明
確なピークが得られていることが判る。一方、比較のた
めに上記固定化酵素カラム６の代わりに、ＧＬＤＨ固定
化酵素とＧＬＸＤ固定化酵素とをカラム容器内にこの順
に積層したカラム（固定化酵素積層カラム）を用いた装
置について、クレアチニン１１１１Ｍ水溶液を８４導入
した際の出力を第３図（ｂ）に示した。この結果から、
ＧＬＤＨ−ＧＬＸＤ共存固定化酵素を用いることにより
、過酸化水素の発生量が著しく増大しクレアチニンやア
ンモニアの検出感度が顕著に向上していることが判る。
４導入した際の検出器７での出力を第３図（ωに示した
。このように１４という極めて微量の試料の添加でも明
確なピークが得られていることが判る。一方、比較のた
めに上記固定化酵素カラム６の代わりに、ＧＬＤＨ固定
化酵素とＧＬＸＤ固定化酵素とをカラム容器内にこの順
に積層したカラム（固定化酵素積層カラム）を用いた装
置について、クレアチニン１１１１Ｍ水溶液を８４導入
した際の出力を第３図（ｂ）に示した。この結果から、
ＧＬＤＨ−ＧＬＸＤ共存固定化酵素を用いることにより
、過酸化水素の発生量が著しく増大しクレアチニンやア
ンモニアの検出感度が顕著に向上していることが判る。
なお、第３図（ａ＋、＋ｂ）のピークの高さと試料導入
器から換算して、感度は約３４倍向上していることが認
められた。
器から換算して、感度は約３４倍向上していることが認
められた。
（ト）発明の効果
この発明の固定化酵素カラムによれば、アンモニア量に
対応して過酸化水素を多量に発生させることができる。
対応して過酸化水素を多量に発生させることができる。
従って、かかる固定化酵素カラムを用いてアンモニアの
測定を行なうことにより、高感度の定量を行なうことが
でき、１４程度の微量の生体試料についても、アンモニ
アあるいはクレアチニンの定量を行なうことが可能とな
る。
測定を行なうことにより、高感度の定量を行なうことが
でき、１４程度の微量の生体試料についても、アンモニ
アあるいはクレアチニンの定量を行なうことが可能とな
る。
第１図は、この発明のアンモニア測定法を利用したクレ
アチニン分析装置を示す構成説明図、第２図は、第１図
の装置を用いたクレアチニン測定値と従来法の測定値と
の相関を示すグラフ図、第３図（ωは第１図の装置で得
られる検出器出力を例示するグラフ図、第３図＋ｂ＋は
比較例の固定化酵素積層カラムを用いた場合の検出器出
力を例示するグラフ図である。 １・・・・・・送液ポンプ、 ２・・・・・・試
料導入器、３・・・・・・前処理カラム、 ４・・・・・・ＣＮＩ固定化酵素カラム、５・・・・・
・ブランクカラム、 ６・・・・・・ＧＬＤＨ−ＣＬＸＤ固定化酵素カラム、
７・・・・・・化学発光検出器、 ８ａ、８ｂ・・・・・・流路切換バルブ、９・・・・・
・記録計、１０ａ、１０ｂ・・・・・・分岐流路、１１
・・・・・・蒸留水供給路、 １２・・・・・・緩衝溶液供給路、 １３・・・・・・ＮＡＤＰＨ水溶液供給路、１４・・・
・・・赤血塩水溶液供給路、１５・・・・・・ルミノー
ル水溶液供給路。 第３図 （ａ） （ｂ）
アチニン分析装置を示す構成説明図、第２図は、第１図
の装置を用いたクレアチニン測定値と従来法の測定値と
の相関を示すグラフ図、第３図（ωは第１図の装置で得
られる検出器出力を例示するグラフ図、第３図＋ｂ＋は
比較例の固定化酵素積層カラムを用いた場合の検出器出
力を例示するグラフ図である。 １・・・・・・送液ポンプ、 ２・・・・・・試
料導入器、３・・・・・・前処理カラム、 ４・・・・・・ＣＮＩ固定化酵素カラム、５・・・・・
・ブランクカラム、 ６・・・・・・ＧＬＤＨ−ＣＬＸＤ固定化酵素カラム、
７・・・・・・化学発光検出器、 ８ａ、８ｂ・・・・・・流路切換バルブ、９・・・・・
・記録計、１０ａ、１０ｂ・・・・・・分岐流路、１１
・・・・・・蒸留水供給路、 １２・・・・・・緩衝溶液供給路、 １３・・・・・・ＮＡＤＰＨ水溶液供給路、１４・・・
・・・赤血塩水溶液供給路、１５・・・・・・ルミノー
ル水溶液供給路。 第３図 （ａ） （ｂ）
Claims (3)
- （１）アンモニアを含有しうる試料を、α−ケトグルタ
ル酸とＮＡＤＰＨ（又はＮＡＤＨ）の存在下でグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）とグルタミン酸オキ
シダーゼ（ＧＬＸＤ）とを共存固定化してなる固定化酵
素充填カラムに導入して過酸化水素を発生させ、この過
酸化水素量に基づいて試料中のアンモニアを定量するこ
とを特徴とするアンモニア測定法。 - （２）クレアチニン分析に用いられる特許請求の範囲第
１項記載のアンモニア測定法。 - （３）カラム容器内にグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（
ＧＬＤＨ）とグルタミン酸オキシダーゼ（ＧＬＸＤ）と
を共存固定化してなる固定化酵素を充填してなる固定化
酵素カラム。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24858887A JPH0191796A (ja) | 1987-09-30 | 1987-09-30 | アンモニア測定法及び固定化酵素カラム |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24858887A JPH0191796A (ja) | 1987-09-30 | 1987-09-30 | アンモニア測定法及び固定化酵素カラム |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0191796A true JPH0191796A (ja) | 1989-04-11 |
Family
ID=17180354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24858887A Pending JPH0191796A (ja) | 1987-09-30 | 1987-09-30 | アンモニア測定法及び固定化酵素カラム |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0191796A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0339096A (ja) * | 1989-07-04 | 1991-02-20 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素利用高速液体クロマトグラフィー |
| WO2011005289A3 (en) * | 2009-06-23 | 2011-05-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and kits for measuring enzyme activity |
-
1987
- 1987-09-30 JP JP24858887A patent/JPH0191796A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0339096A (ja) * | 1989-07-04 | 1991-02-20 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素利用高速液体クロマトグラフィー |
| WO2011005289A3 (en) * | 2009-06-23 | 2011-05-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and kits for measuring enzyme activity |
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