JPH0192201A - Ｄ．２５の新規な誘導体とその製造法、並びに免疫刺激物としての利用と本誘導体を含有した薬剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＤ．２５から誘導した新規な化合物に関する、
またこれ等化合物の製造法に関する。更にこれ等化合物
を含有する薬剤組成物に関する。

〔従来の技術〕

０．２５と呼ばれる本化合物は１本質的にガラクトース
単位から成Ｄ．分子量が３０±ｌ０ＫＤである。細菌膜
プロトグリカンから抽出した多糖類である。この多糖類
は１９８４年９月ｌＯ日出願のフランス特許８４／　１
３．８４４号に詳細に記載させている。またこの多糖類
は、免疫刺激性を、特に内因性インターフェロンの誘導
並びにＮＫ（ナチュラル　キラー）細胞の活性に関する
免疫刺激性を持つている。更にこの多糖類はパスツール
研究所（Ｐａｓｔｅｕｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）のナ
ショナルコレクショ：／　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）のナンバー１４５．１．ＩＰ。

とじて保管しである莢膜桿菌肺炎遺伝因子型の非莢膜、
非病源性菌株から優先的に分離したものである。

〔発明の構成〕

本発明は０．２５から誘導した化合物に関するものであ
って、これら化合物はＤ．２５の線状多糖類鎖のガラク
トフラノース残基（Ｇａｌｆ）の少くとも一部を、最初
の物質をここで述べる事以外には一切変化させることな
く、アラビノースに変化させたものである。これらの化
合物に於いて、ガラクトピラノース残基（Ｇａｌｐ）が
優先的に保存される。

これら化合物のうち、一つの化合物が特に興味深いもの
であＤ．その化合物は、線状多糖類鎖における全てのガ
ラクトフラノース残基がアラビノースに変化したもので
あＤ．それは次に示すモノマーによって定義される。

→　　βＧａ１ｐ＋　　　ａＡｒａ　　＋　　　ａＧａ
ｌｐ＋　　　βＧａ１ｐ１．３　　　　　　　　１．３
　　　　　　　　　＋、３　　　　　　　　１．３＋　
　　ａＡｒａ　　＋　　　ａＧａｌｐ−＋　　　ａＡｒ
ａ　　＋　　　βＧａ１ｐ１．３　　　　　　　　　＋
、３　　　　　　　　１．３　　　　　　　　１．３＋
　　　（ｚＧ６１．＋　　　ａＡｒａ　　＋１．３　　
　　　　　　１．３　　　　　　　　１．３〔式中、Ｇ
ａ１ｐはガラクトピラノース（α及びβ型）であＤ．Ａ
ｒａはアラビノース（α及びβ型）である〕 本発明はまた上記化合物の誘導体に関する。即ち特にニ 一半合成誘導体 一標識誘導体ならびに −共役誘導体。

半合成誘導体の中には、酸類、アミン類、アミド類又は
アルコール類が共存するアミド類、エステル類、エーテ
ル類、塩類、または第四アンモニウム誘導体を挙げるこ
とが出来る。

また本発明による化合物の誘導体は、何か適切な方法に
よって、例えば工１２５又はＴ　ｃ９９のような放射性
元素によって、或いは、蛍光化合物又は磁性化合物によ
って標識付けした化合物にすることもできる。これらの
種類の標識付けによって、問題の化合物を生体内又は生
体外で検出できる。

また本発明による化合物の誘導体は、その活性を改善す
ることのできる化合物と、あるいは、共役化合物の活性
を改善するような特に免疫系の特定の場所に接近させる
ことのできる化合物と共役させることができる。

本発明の化合物の製造方法は０．２５を過沃素酸塩で酸
化させてから還元することより或る。

この酸化は、メタ過沃素酸ナトリウムによって行うのが
好ましい、還元は、場合により過剰に使用する事もある
がＮａＢＨ４で行う事ができる。

〔効　果〕

本化合物の誘導体公知の方法、即ち、標識法又は共役性
によって得ることができる。

本発明による化合物および誘導体は、注目にあたいする
免疫刺激性を示し、かつ細胞毒性の無いことである。こ
うした理由によＤ．本発明は、本発明による少くとも一
つの化合物又は誘導体を含有する薬剤組成物に関するこ
とは勿論、刺激物として本発明の化合物を使用すること
および本発明の誘導体を使用することに関している。

本発明による化合物、とりわけ標識付けした誘導体は診
断法に対し、とくに免疫系の特定の要素の検知にも使用
することができる。

〔実施例〕

本発明の他の特徴と利点は、以下に記す詳細な説明を読
むことによって明らかになるであろう。

実施例１：未精製の膜プロテオグリカンの単離。

莢膜稈菌舖炎の菌株（１４５，１，ＩＰ、）のバイオマ
スをＭａｉｌ　（０−１５）ｌ）を含有する氷冷したト
リス−００文緩衝液（１０ｍＭ　、　ｐＨ７，０）に分
散してから細胞壁を破るため機械的磨砕を行う、この菌
溶解物は１５．０００ｇで連続遠心分離して清澄化し、
上清液を集める。上清液は、冷却状態で、Ｈが４．２に
なる迄酢酸を加えて処理し、沈澱により不純物（核酸と
重い蛋白）を分離する。沈澱した不純物は１５．０００
ｇで連続遠心分離して分離する。透明な上清液は集め、
ＮａＯＨで中和する。

次に、得られた溶液を透析し、ついで１０，０００ドル
トンでカットオフする膜で限外濾過してｆ３縮する。

本段階で得られた濃縮溶液は、未精製の膜プロテオグリ
カンに相当する。

実施例２：未精製の多糖類フラクションの単離。

末法は、多糖類フラクションを遊離するため未精製の膜
プロテオグリカンを解重合するよう、条件を調節したア
ルカリ性加水分解から或る。上記の未精製の膜プロテオ
グリカンを濃縮し、かつ透析した溶液に対して、最終的
ＮａＯＨ濃度が０．５ＭになるようＮａＯＨを添加する
。ついで５６℃で１時間加水分解する。そして急冷後に
本溶液をＨＣｌで中和する。

中和した溶液はフィルタープレスで清澄化し、ついで１
０，０００ドルトンでカットオフする膜で限外濾過して
濃縮する。

実施例３：多糖類フラクションの精製。

前例で得た濃縮物は、リゾチームで酵素処理して製造時
に残存するムレイン（鳳ｕｒｅｉｎ）を破壊する。加水
分解は、ＥＤＴＡ　、　Ｎａｚ　（４ｍＭ）および０．
１　ｒａｇ／腸文のりゾチームを含有したトリス−ＨＣ
ｌ緩衝液（１０ｍＭ　、　ｐＨ８，０）中で、環境温度
で２時間行う。

リゾチームの作用が終ったら、汚染性のある蛋白を次の
条件により蛋白分解によって除去する。

即ち、この場合、溶液のｐＨを７．０に調整し、ついで
（ｌ１ｍｇ／ｍｕのプロティナーゼＫを加える。そして
撹拌しながら、３７℃２時間インキュベーションを続け
る。

ついで多糖類をアルコールで析出させて単離する。環境
温度下で３倍容積量のエチルアルコールを加える。３０
分間撹拌の後、析出物を濾過して集める。そしてこれを
蒸留水で再溶解し、得られた溶液を有孔度０．４５ｐｍ
の膜で濾過する。

酵素による加水分解分解に由来する多糖類の残存汚染物
を、セファクリル（ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ）　５２００Ｈ
Ｒ樹脂を充填しファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）工
業用カラムを用い１分子ふるいクロマトグラフィーによ
り分離した。沈着するサンプルの容積は、樹脂の容積の
５％に当たる、溶離は線流速５　ｃｍ／時間で蒸留水を
用いて行う。

連続的に屈折率を測定しながら確認した、精製した多糖
類のピークを集め、そして１０．０００ドルトンでカッ
トオフする膜を用い最初の容積の１１５になるまで限外
濾過によってＢ縮する。

この段階で得られた濃縮溶液は、精製した多糖類Ｄ．２
５に相当する。

実施例４：新規な多糖類の製造。

前記溶液を希釈してリットル当り２０ｇの多糖類溶液を
用意する。そして０．１Ｍの酢酸ナトリウムを加えてｐ
ｎを３．８に調節する。

ついで、リットル当り１５ｇのメタ過沃素酸ナトリウム
溶液を加え、その後、１５℃で暗所で４８時間撹拌する
。

過剰なメタ沃素酸塩は、析出し終るまで撹拌しなからＣ
線溶液状の水酸化バリウムを徐々に加えて析出作用によ
って除去する。こうして生成した析出物は簡単な濾過で
除去する。

上記濾過に次いで２１．８ｇのＮａＢＨｓを加えた後。

得られた混合物を環境温度で１８時間反応させる０次い
で、過剰なＮａＢＨｎは混合物が中性になるまで酢酸を
加えて無効にする。

得られた溶液は、１０，０００ドルトンでカットオフす
る膜で透析かつ濃縮し、ついで冷結乾燥する。

こうして得られた凍結乾燥物は、本発明の新規なＤ．２
５ｄ導体を構成している。

実施例５：細胞毒性不在の確認。

細胞毒性は、５１Ｃｒで標識付けしたＹＡＣ−１細胞の
培養物中で本発明の各種濃度誘導体を試験管内培養する
ことにより測定する。４時間培養した後、細胞の溶解に
よって遊離した５ＩＣｒの収量を上清液中で測定する。

結果は、対照標準培養物と比較して溶解した細胞の百分
率であられす。

対照標準培養物中の自然溶解は約５％である。

結果は、下記の表１に記載。

表　　工 濃迩り一恵血コ乞〔盈　ｌ■ ０．０５　　　−０．２ ０．１　　　１．０ ０．５　　　０．３ ｔ、ｏ　　　　−ｉ、。

５−０　　　０．３ １０．０　　　−０．４ ５０．０　　　−０．１ １００．０　　　−１．３ 結果は、明らかに生成物が全く細胞毒を持っていない事
を示している。

実施例６： 生体内ＮＫ細胞の活性化。

エフェクター細胞（マウスのひ臓細胞）は試験する各種
濃度の誘導体と共に５％の子ウシ助児血清を含有するＲ
　ＰＭ　ｌ−１８４０培養液中で６時間前保温する。

ＮＫ活性は、エフェクター細胞／標的細胞の比を１００
／１にして各ウェル（ｗｅｌｌ）中の５１Ｃ，で標識付
はした１Ｇ、０ＯＯＹ　Ａ　Ｃ−１標的細胞で測定する
。

４時間インキュベーションした後、細胞の溶解によって
上清液中に遊離した５１Ｃｒの量をガンマ−カウンター
で測定する。

結果は下記の表■に示した。

友−−１ 濃」Ｌ−１１文」」ば１ＹＡｃ−１標的細　溶解％〇一
対照標準　　　　　　１８．４ ０・１　　　　　　　　　　２１．８ １．０　　　　　　　　　　３１．８ １０　　　　　　　　　　　４７．４ １００　　　　　　　　　　　４０．８この結果によＤ
．「試験管内」のＮＫ細胞の活性に対する誘導体の非常
に高い刺激力が確認された。

実施例７：マウスにおける「試験管内ＪＮＫ細胞の活性
化、多糖類Ｄ．２５との比較。

退的６ないし８週のＣＢＡ／Ｈのマウスに対し、これら
マウスのひ臓のＮＫ細胞の活性測定を行う１日または３
日前に、本発明の誘導体１００ルｇをＩｒ！ｊ１膜腔内
注射する。

ＮＫ活性を次に上記の様に「試験管内」試験で測定する
。

結果は下記の表■に示した。

表■ 注射物質　　　標的細胞の溶解％ ＋１日における　＋３日における ＰＢＳ一対照標準　　　２５．２　　　　１８．２０．
２５　（１００ＩＬｇ）　　　　２０．０　　　　２２
．Ｏｐｓ誘導体（１００ＩＬｇ）　　　３２．６　　　
　２８．８表に示した結果によＤ．新規な多糖類は、Ｄ
、２５のＮＫ細胞に対する刺激能力を１廻わる刺激能力
を持ってるい事が分る。

本活性は、注射後第１日から効果が現われ、＋３日迄そ
れぞれ続くが、同一条件においてもＤ．２５の活性は＋
３日にの駁効果が現われる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）線状多糖類銷のガラクトフラメース残基（Ｇａｌ
   ｆ）のうち少くとも一部分をアラビノースに変化させた
   Ｄ．２５から誘導した化合物の中から選ぶ事を特徴とす
   る多糖類化合物、並びにこれら化合物の誘導体。 （２）少くとも次の一つの系列； ■βＧａｌ＿ｐ■βＡｒａ■αＧａｌ＿ｐ■βＧａｌ＿
   ｐ■αＡｒａ■αＧａｌ＿ｐ■αＡｒａ■βＧａｌ＿ｐ
   ■αＧａｌ＿ｐ■βＡｒａ■ 〔式中、Ｇａｌ＿ｐはガラクトピラノース（α型及びβ
   型の）を示し、Ａｒａはアラビノース（α型及びβ型の
   ）を示す。〕を含む誘導体である、請求項１記載の多糖
   類化合物。（３）アミン、アミド、酸またはアルコール
   を有する、アミド類、エーテル類、塩類または第四アン
   モニウム誘導体の中から選んだ誘導体である請求項１又
   は２記載の多糖類化合物。 （４）標識付き化合物である請求項１ないし３のいずれ
   かに記載の化合物。 （５）或る化合物と共役している或る化合物である請求
   項１ないし３のいずれかに記載の化合物。 （６）ａ）Ｄ．２５を過沃素酸塩で酸化させること、な
   らびに ｂ）ａ）によって得た化合物を還元させること を特徴とする請求項１又は２記載の化合物の製造法。 （７）場合により過剰に使用する事のあるメタ過沃素酸
   塩を用いて前記過沃素酸塩酸化を行う請求項６記載の方
   法。 （８）過沃素酸ナトリウムを使用する請求項７記載の方
   法。 （９）場合により過剰に使用する事のあるＮａＢＨ＿４
   を用いて前記還元を行う請求項６ないし８のいずれかに
   記載の方法。 （１０）免疫刺激物として請求項１ないし３のいずれか
   に記載の化合物の使用。 （１１）有効成分として、請求項１ないし３のいずれか
   に記載の少くとも一つの化合物、またはその誘導体を含
   有する薬剤組成物。