JPH0195775A - 修飾スーパーオキサイド・ジスムターゼ - Google Patents
修飾スーパーオキサイド・ジスムターゼInfo
- Publication number
- JPH0195775A JPH0195775A JP62251618A JP25161887A JPH0195775A JP H0195775 A JPH0195775 A JP H0195775A JP 62251618 A JP62251618 A JP 62251618A JP 25161887 A JP25161887 A JP 25161887A JP H0195775 A JPH0195775 A JP H0195775A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sod
- dicarboxylic acid
- superoxide dismutase
- acid
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- Pending
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、化学修飾されることにより疎水性が増し、か
つ架橋する事により分子量の増した新規スーパーオキサ
イド・ジスムターゼ（以下ＳＯＤと略記する）に関する
ものである。ＳＯＤは酸素分子が一電子還元をうけて生
じるスーパーオキサイド・ラジカル（０２−）の不均化
反応、つまり０−＋Ｏ＋２Ｈ＋→Ｏ＋Ｈ０ を触媒する酵素であって広く生物界に存在することが知
られている。近年このＳＯＤの薬理作用に注目が向けら
れ、自己免疫性疾患において生じる炎症などに効果を有
し、慢性リュウマチ、放射線療法における副作用の治療
、防止剤等として開発が進められている。
つ架橋する事により分子量の増した新規スーパーオキサ
イド・ジスムターゼ（以下ＳＯＤと略記する）に関する
ものである。ＳＯＤは酸素分子が一電子還元をうけて生
じるスーパーオキサイド・ラジカル（０２−）の不均化
反応、つまり０−＋Ｏ＋２Ｈ＋→Ｏ＋Ｈ０ を触媒する酵素であって広く生物界に存在することが知
られている。近年このＳＯＤの薬理作用に注目が向けら
れ、自己免疫性疾患において生じる炎症などに効果を有
し、慢性リュウマチ、放射線療法における副作用の治療
、防止剤等として開発が進められている。
（従来の技術）
しかし、上記のような薬理効果が期待できるにもかかわ
らずＳＯＤを単独で血中投与した際の体内半減期はわず
か４〜６分と短く、速やかに腎から尿中に排泄されてし
まうためその薬理効果はほとんど有効に発現できないの
が現状である。僅かに、関節腔内への直接注入等の局所
的な治療でのみ効果が認められているにすぎない。その
ため従来よりＳＯＤの体内半減期を長くするため多くの
試みがなされてきた。
らずＳＯＤを単独で血中投与した際の体内半減期はわず
か４〜６分と短く、速やかに腎から尿中に排泄されてし
まうためその薬理効果はほとんど有効に発現できないの
が現状である。僅かに、関節腔内への直接注入等の局所
的な治療でのみ効果が認められているにすぎない。その
ため従来よりＳＯＤの体内半減期を長くするため多くの
試みがなされてきた。
例えばポリエチレングリコールによる化学修飾［イー・
ボッチュ、ジー・ピー拳ベロー、エフ・エム・ベロネー
ズ（Ｅ、Ｂｏｃｃｕ、Ｇ、Ｐ、Ｖｅｌｏ、 Ｐ、Ｍ、Ｖ
ｅｒｏｎｅｓｅ ） 、ファーマコロジカル リサーチ
アンドコミュニケーション（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、 ）、１４巻 １１３ページ （
１９８２）、特公昭６１２４９３８８号公報］、疎水性
物質との結合［生化学 ５８巻 ５９２ページ （１９
８６）］等か報告されている。
ボッチュ、ジー・ピー拳ベロー、エフ・エム・ベロネー
ズ（Ｅ、Ｂｏｃｃｕ、Ｇ、Ｐ、Ｖｅｌｏ、 Ｐ、Ｍ、Ｖ
ｅｒｏｎｅｓｅ ） 、ファーマコロジカル リサーチ
アンドコミュニケーション（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、 ）、１４巻 １１３ページ （
１９８２）、特公昭６１２４９３８８号公報］、疎水性
物質との結合［生化学 ５８巻 ５９２ページ （１９
８６）］等か報告されている。
また血中では、親水性低分子化合物（低分子のタンパク
質など）は速やかに腎糸球体濾過により尿中に排泄され
るのに比べ、疎水性を合せ持つ両親媒性化合物（胆汁酸
など）は低分子であっても腎糸球体濾過をうけにくい。
質など）は速やかに腎糸球体濾過により尿中に排泄され
るのに比べ、疎水性を合せ持つ両親媒性化合物（胆汁酸
など）は低分子であっても腎糸球体濾過をうけにくい。
その理由が水に対する溶解度の低い両親媒性化合物は、
血中ではアルブミンに結合することにより見掛上高分子
化されて運ばれるからであることが知られている。［テ
ィー・ベーター（Ｔ、Ｐｅｔｅｒ ） ＋ ジャーナル
オフアドバンスト クリニカル ケミストリー（Ｊ。
血中ではアルブミンに結合することにより見掛上高分子
化されて運ばれるからであることが知られている。［テ
ィー・ベーター（Ｔ、Ｐｅｔｅｒ ） ＋ ジャーナル
オフアドバンスト クリニカル ケミストリー（Ｊ。
Ａｄｖ、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、） 、 １３巻 ３７
ページ （１９７０）］。
ページ （１９７０）］。
これを利用し、ＳＯＤと疎水性物質とを結合した例も報
告されている。
告されている。
（発明か解決しようとする問題点）
−船釣にポリエチレングリコールによる修飾法では５０
％近くの酵素活性が失われてしまう。またポリアルキレ
ングリコール又はその誘導体の両末端にＳＯＤが結合し
た化合物は、修飾による活性低下かないとされているが
、高分子架橋化することにより分子量に大きく幅が生じ
るという問題がある。また分子量が数１０万の高分子体
を生成するため、特に静脈注射を行う場合には、血管閉
塞等を起こす恐れかある。
％近くの酵素活性が失われてしまう。またポリアルキレ
ングリコール又はその誘導体の両末端にＳＯＤが結合し
た化合物は、修飾による活性低下かないとされているが
、高分子架橋化することにより分子量に大きく幅が生じ
るという問題がある。また分子量が数１０万の高分子体
を生成するため、特に静脈注射を行う場合には、血管閉
塞等を起こす恐れかある。
（問題点を解決するための手段）
本発明者はＳＯＤ活性の低下がなくかっ血中安定性の期
待できる修飾ＳＯＤを開発すべく鋭意研究を重ねた結果
、ジカルボン酸、により化学修飾され架橋化したＳＯＤ
か安定でかつ修飾による活性低下も少なく、ポリアルキ
レングリコールによる修飾法に比べ生成物の分子量分布
の狭いものが得られることを見出し本発明を完成するに
至った。
待できる修飾ＳＯＤを開発すべく鋭意研究を重ねた結果
、ジカルボン酸、により化学修飾され架橋化したＳＯＤ
か安定でかつ修飾による活性低下も少なく、ポリアルキ
レングリコールによる修飾法に比べ生成物の分子量分布
の狭いものが得られることを見出し本発明を完成するに
至った。
すなわち本発明における修飾ＳＯＤは、分子量６４００
０〜１３００００であり、修飾後に活性を保持し、かつ
ＳＯＤ１分子当たり結合しているジカルボン酸が０．５
〜１５程度である。
０〜１３００００であり、修飾後に活性を保持し、かつ
ＳＯＤ１分子当たり結合しているジカルボン酸が０．５
〜１５程度である。
本発明で用いるジカルボン酸としては、炭素数３から３
０の範囲の天然物から得られるジカルボン酸または合成
ジカルボン酸で、アジピン酸、セバシン酸等又はそれら
の塩がその例として挙げられる。
０の範囲の天然物から得られるジカルボン酸または合成
ジカルボン酸で、アジピン酸、セバシン酸等又はそれら
の塩がその例として挙げられる。
ＳＯＤとジカルボン酸との結合反応はジカルボン酸を塩
化チオニル、五塩化リン、三塩化リン等によりジカルボ
ン酸クロリドとし活性化した後、通常のショツテン−バ
ウマン反応（Ｓｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｍ反応）を
行ないＳＯＤ分子中に存在する一級及び二級アミンと反
応しアミド結合を生成する。
化チオニル、五塩化リン、三塩化リン等によりジカルボ
ン酸クロリドとし活性化した後、通常のショツテン−バ
ウマン反応（Ｓｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｍ反応）を
行ないＳＯＤ分子中に存在する一級及び二級アミンと反
応しアミド結合を生成する。
塩素に代えて臭素、ヨウ素など他のハロゲン化物でも同
様なジカルボン酸ハライドを合成し得るが、塩化物か最
も一般的である。また、市販のジカルボン酸ハライドを
使用しても本発明においてなんら問題はない。これら酸
ハライドによるアシル化は常温常圧、弱アルカリ性水溶
液中で行なうことができ、かつ高価な縮合剤などを使用
する必要もないので本発明のような用途には好ましい。
様なジカルボン酸ハライドを合成し得るが、塩化物か最
も一般的である。また、市販のジカルボン酸ハライドを
使用しても本発明においてなんら問題はない。これら酸
ハライドによるアシル化は常温常圧、弱アルカリ性水溶
液中で行なうことができ、かつ高価な縮合剤などを使用
する必要もないので本発明のような用途には好ましい。
また高濃度での反応が容易であるのもこの方法の特徴で
ある。具体的には水又はｐＨ６，８〜１１．０゜好まし
くはｐＨ８，Ｏ〜１０．０の緩衝液に対し、ＳＯＤを０
．０１〜１０．０重量％、好ましくは０．１〜５．０重
量％になるよう溶解した後撹拌しつつジカルボン酸ハラ
イドを徐々に滴下する。
ある。具体的には水又はｐＨ６，８〜１１．０゜好まし
くはｐＨ８，Ｏ〜１０．０の緩衝液に対し、ＳＯＤを０
．０１〜１０．０重量％、好ましくは０．１〜５．０重
量％になるよう溶解した後撹拌しつつジカルボン酸ハラ
イドを徐々に滴下する。
その量には特に限定はないが、反応溶液に対し０．１〜
５．０容量％程度が好ましい。この除用いる緩衝液の種
類は特に限定されないが、例えば０．１Ｍリン酸緩衝液
などが挙げられる。またジカルボン酸ハライドを滴下し
、反応が進行するにつれ徐々にｐＨか低下するので初期
のｐＨを維持するために水酸化ナトリウム水溶液などの
希アルカリを適宜加える。
５．０容量％程度が好ましい。この除用いる緩衝液の種
類は特に限定されないが、例えば０．１Ｍリン酸緩衝液
などが挙げられる。またジカルボン酸ハライドを滴下し
、反応が進行するにつれ徐々にｐＨか低下するので初期
のｐＨを維持するために水酸化ナトリウム水溶液などの
希アルカリを適宜加える。
反応時間は特に限定しないが、操作上、より簡便である
という点において１〜６０分程度が良い。
という点において１〜６０分程度が良い。
反応終了後、該反応溶液よりアシル化ＳＯＤを精製する
方法としては、通常用いられているタンパク質の精製法
がそのまま利用できるが、疎水性が増していることに注
意しなければならない。具体的には、アセトンやエタノ
ール等の有機溶媒を添加し沈澱としてアシル化ＳＯＤを
集めた後カラムクロマトグラフィーにより生成する方法
などがある。本発明に使用されるＳＯＤはヒト、牛、豚
等の動物組織や赤血球又は酵母等の微生物又はＳＯＤの
構造遺伝子をベクターにより導入された大腸菌、酵母等
の菌体等より精製されたＳＯＤいずれでも良くその由来
に限定されるものではない。
方法としては、通常用いられているタンパク質の精製法
がそのまま利用できるが、疎水性が増していることに注
意しなければならない。具体的には、アセトンやエタノ
ール等の有機溶媒を添加し沈澱としてアシル化ＳＯＤを
集めた後カラムクロマトグラフィーにより生成する方法
などがある。本発明に使用されるＳＯＤはヒト、牛、豚
等の動物組織や赤血球又は酵母等の微生物又はＳＯＤの
構造遺伝子をベクターにより導入された大腸菌、酵母等
の菌体等より精製されたＳＯＤいずれでも良くその由来
に限定されるものではない。
（発明の効果）
本発明におけるＳＯＤは修飾による活性低下が少なく、
血中安定性が高いものであり、医薬剤等として有用であ
る。
血中安定性が高いものであり、医薬剤等として有用であ
る。
（実施例）
以下実施例により本発明の詳細な説明するが、本発明は
これら実施例により限定されるものではない。
これら実施例により限定されるものではない。
実施例１
牛赤血球由来のスーパーオキサイド・ジスムターゼ２５
．０ｍｇ（東ソー（株）製、比活性３０００Ｕ／ｍｇ）
を０．ＩＭリン酸酸水素ナナトリウム緩衝液 ｐＨ９、
０） ５ 、 ０ ｍｌ １．：溶解シタ。溶液ノ温度
を２０℃に保ちながら撹拌しつつアジポイルクロライド
（東京化成社製） １ｏｏμノを徐々に滴下した。こ
の際ｐＨを９．０に保つため１規定ＮａＯＨを滴下しつ
つ行なった。滴下終了後４０℃で１時間撹拌し、その後
５０ｍ１の冷アセトンに反応溶液を滴下した。生じた沈
澱を遠心分離により集め、純水１０．０ｍｌに再溶解さ
せた。不一 ７ − 溶物は遠心分離により除去し、純水に対し透析しアジポ
イル５ＯＤ２２．５＋ｎｇを得た。活性回収率は３０％
、ＳＯＤ比活性は１２００ Ｕ／ｍｇ、アミノ基の修飾
率は５０％であった。
．０ｍｇ（東ソー（株）製、比活性３０００Ｕ／ｍｇ）
を０．ＩＭリン酸酸水素ナナトリウム緩衝液 ｐＨ９、
０） ５ 、 ０ ｍｌ １．：溶解シタ。溶液ノ温度
を２０℃に保ちながら撹拌しつつアジポイルクロライド
（東京化成社製） １ｏｏμノを徐々に滴下した。こ
の際ｐＨを９．０に保つため１規定ＮａＯＨを滴下しつ
つ行なった。滴下終了後４０℃で１時間撹拌し、その後
５０ｍ１の冷アセトンに反応溶液を滴下した。生じた沈
澱を遠心分離により集め、純水１０．０ｍｌに再溶解さ
せた。不一 ７ − 溶物は遠心分離により除去し、純水に対し透析しアジポ
イル５ＯＤ２２．５＋ｎｇを得た。活性回収率は３０％
、ＳＯＤ比活性は１２００ Ｕ／ｍｇ、アミノ基の修飾
率は５０％であった。
実施例２
アジポイルクロライドの代わりにセバコイルクロライド
（東京化成社製）を用いる以外は実施例１と同様の方法
によりセバコイル５ＯＤ２０゜Ｏｍｇを得た。活性回収
率は５０％、ＳＯＤ比活性は２０００Ｕ／＋Ｉ１ｇ、ア
ミノ基の修飾率は７０％であった。
（東京化成社製）を用いる以外は実施例１と同様の方法
によりセバコイル５ＯＤ２０゜Ｏｍｇを得た。活性回収
率は５０％、ＳＯＤ比活性は２０００Ｕ／＋Ｉ１ｇ、ア
ミノ基の修飾率は７０％であった。
本実施例において、ＳＯＤの活性はチトクロムＣ法によ
り測定し、チトクロムＣの還元が５０％阻害されるとき
のＳＯＤ活性を１単位とした［ジェイ・エム・マコード
、アイ・フリドヴイッチ（Ｊ、Ｍ、ＭｃＣｏｒｄ、１．
Ｐｒ１ｄｏｖｉｃｈ） 、ジャーナル オブバイオロジ
カル ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、）、
２４４，６０４９． （１９６９）：ｌ。タンパク濃
度はＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓ５ａｙ Ｋｉｔ （Ｂｉｏ
−ｒａｄ社製）を用い、ウシ血？ｉ！７アルブミンを標
準タンパク質として測定した。
り測定し、チトクロムＣの還元が５０％阻害されるとき
のＳＯＤ活性を１単位とした［ジェイ・エム・マコード
、アイ・フリドヴイッチ（Ｊ、Ｍ、ＭｃＣｏｒｄ、１．
Ｐｒ１ｄｏｖｉｃｈ） 、ジャーナル オブバイオロジ
カル ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、）、
２４４，６０４９． （１９６９）：ｌ。タンパク濃
度はＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓ５ａｙ Ｋｉｔ （Ｂｉｏ
−ｒａｄ社製）を用い、ウシ血？ｉ！７アルブミンを標
準タンパク質として測定した。
また、アミノ基修飾率は、試料溶液０．５ｍｌに対し４
％Ｎ ａ ＨＣＯａ水溶液０．５ｍｌ、０．１％トリニ
トロベンゼンスルホン酸水溶液０．２ｍｌを加え、３７
°Ｃで２時間インキュベートした後、２％ラウリル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）を含む１規定塩酸０．５ｍｌを加
え、３３５ｎｍにおける吸光度を測定し、未反応のＳＯ
Ｄに対する値と比較することにより求めた。
％Ｎ ａ ＨＣＯａ水溶液０．５ｍｌ、０．１％トリニ
トロベンゼンスルホン酸水溶液０．２ｍｌを加え、３７
°Ｃで２時間インキュベートした後、２％ラウリル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）を含む１規定塩酸０．５ｍｌを加
え、３３５ｎｍにおける吸光度を測定し、未反応のＳＯ
Ｄに対する値と比較することにより求めた。
第１図は、実施例１により得られた修飾ＳＯＤと未修飾
ＳＯＤの混合物を高速液体クロマトグラフィーにより分
析した結果である。修飾５ＯＤ（溶出時間：８．７分）
は未修飾５ＯＤ（溶出時間９．８分）に比べて高分子量
化していることがわかる。
ＳＯＤの混合物を高速液体クロマトグラフィーにより分
析した結果である。修飾５ＯＤ（溶出時間：８．７分）
は未修飾５ＯＤ（溶出時間９．８分）に比べて高分子量
化していることがわかる。
Claims (3)
- （１）スーパーオキサイド・ジスムターゼをジカルボン
酸で化学修飾してなる修飾スーパーオキサイド・ジスム
ターゼ。 - （２）ジカルボン酸の炭素数が３〜３０である特許請求
の範囲第１項記載の修飾スーパーオキサイド・ジスムタ
ーゼ。 - （３）スーパーオキサイド・ジスムターゼ１分子あたり
に結合しているジカルボン酸の数が、０．５〜１５であ
る特許請求の範囲第１項記載の修飾スーパーオキサイド
・ジスムターゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62251618A JPH0195775A (ja) | 1987-10-07 | 1987-10-07 | 修飾スーパーオキサイド・ジスムターゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62251618A JPH0195775A (ja) | 1987-10-07 | 1987-10-07 | 修飾スーパーオキサイド・ジスムターゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0195775A true JPH0195775A (ja) | 1989-04-13 |
Family
ID=17225505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62251618A Pending JPH0195775A (ja) | 1987-10-07 | 1987-10-07 | 修飾スーパーオキサイド・ジスムターゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0195775A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100375159B1 (ko) * | 2000-05-16 | 2003-03-08 | 김일한 | 팔미토일 보효소 ａ를 이용한 포유동물의 혈청알부민의 과산화효소 활성을 증가시키는 방법 |
-
1987
- 1987-10-07 JP JP62251618A patent/JPH0195775A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100375159B1 (ko) * | 2000-05-16 | 2003-03-08 | 김일한 | 팔미토일 보효소 ａ를 이용한 포유동물의 혈청알부민의 과산화효소 활성을 증가시키는 방법 |
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