JPH02117385A - 遺伝子破壊または遺伝子置換のプラスミドベクター、形質転換体及びその利用 - Google Patents
遺伝子破壊または遺伝子置換のプラスミドベクター、形質転換体及びその利用Info
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- JPH02117385A JPH02117385A JP63268097A JP26809788A JPH02117385A JP H02117385 A JPH02117385 A JP H02117385A JP 63268097 A JP63268097 A JP 63268097A JP 26809788 A JP26809788 A JP 26809788A JP H02117385 A JPH02117385 A JP H02117385A
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- plasmid vector
- transformant
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- arginase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、アルギナーゼ遺伝子（ＣＡＲＩ）を破壊又は
置換することのできるプラスミドベクター、それらの形
質転換体及びその利用に関する。
置換することのできるプラスミドベクター、それらの形
質転換体及びその利用に関する。
本発明の形質転換体はアルギナーゼの欠失によって、尿
素の生成が抑制され、尿素から誘導されるカルバミン酸
エチルの生成をなくすことができるので１本発明の形質
転換体を用いることによって、カルパミ〉酸エチルを含
まない酒類等を製造することができるものである。
素の生成が抑制され、尿素から誘導されるカルバミン酸
エチルの生成をなくすことができるので１本発明の形質
転換体を用いることによって、カルパミ〉酸エチルを含
まない酒類等を製造することができるものである。
従って１本発明は酒類、アルコール、その他醸造食品の
製造に大きく貢献するものである。
製造に大きく貢献するものである。
（発明の背景及び従来技術とその問題点）一般に、各種
醸造食品（清酒、果実酒、ビール、ウィスキー、ブラン
デー、醤油、味噌等）の製造醪中には、含量にはかなり
の差があるが、尿素が存在し、それがエタノールと反応
して発癌物質であるカルバミン酸エチル（ウレタン、Ｃ
ＡＥ）を生成させている。
醸造食品（清酒、果実酒、ビール、ウィスキー、ブラン
デー、醤油、味噌等）の製造醪中には、含量にはかなり
の差があるが、尿素が存在し、それがエタノールと反応
して発癌物質であるカルバミン酸エチル（ウレタン、Ｃ
ＡＥ）を生成させている。
そして、尿素を減少させることにより、カルバミン酸エ
チルも同様に減少することから、尿素が最も主要な前駆
物質と考えられているのである。
チルも同様に減少することから、尿素が最も主要な前駆
物質と考えられているのである。
この尿素は、酵母のアルギナーゼ（ＥＣ３，５，３，１
）によりアルギニンがオルニチンに分解される時に同時
に生成される。
）によりアルギニンがオルニチンに分解される時に同時
に生成される。
従来、尿素を減少させる方法としてはアルギニンの酵母
菌体への取込みに関与するアルギニン透過酵素の欠失し
た変異株（アルギニンのアナログであるカナバニンに対
して耐性が生じる）を用いることにより、清酒中の尿素
量を約半社まで減少させる方法がとられてきた。
菌体への取込みに関与するアルギニン透過酵素の欠失し
た変異株（アルギニンのアナログであるカナバニンに対
して耐性が生じる）を用いることにより、清酒中の尿素
量を約半社まで減少させる方法がとられてきた。
しかし、この変異株は、野生株に比較して発酵が鈍いた
めに、他の酵母に汚染されやすく、かつ、リンゴ酸の生
成景が多いためやや酸度の多い清酒になるという問題が
ある。
めに、他の酵母に汚染されやすく、かつ、リンゴ酸の生
成景が多いためやや酸度の多い清酒になるという問題が
ある。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは、酒類中の尿素が、酵母のアルギナーゼの
作用で生成することから、アルギナーゼ遺伝子（ＣＡＲ
Ｉ）を破壊又は他の遺伝子で置換して尿素生成をなくし
、かつ、発酵速度及び酸生成能が親株と変らない形質転
換体を開発することを目的として、鋭意研究を行った。
作用で生成することから、アルギナーゼ遺伝子（ＣＡＲ
Ｉ）を破壊又は他の遺伝子で置換して尿素生成をなくし
、かつ、発酵速度及び酸生成能が親株と変らない形質転
換体を開発することを目的として、鋭意研究を行った。
まず、本発明者らは、アルギナーゼ遺伝゛子の破壊又は
置換に注目し、サッカロマイセス・セレビシアエのゲノ
ムＤＮＡ制限酵素断片から、アルギナーゼをコードする
ＤＮＡ断片をクローン化し、サッカロマイセス・セレビ
シアエの宿主・ベクター系に連結し、得られたプラスミ
ドベクターを移入することにより、アルギナーゼ遺伝子
（ＣＡＲｌ）が破壊又は置換される形質転換体が得られ
ることを見出したのである。
置換に注目し、サッカロマイセス・セレビシアエのゲノ
ムＤＮＡ制限酵素断片から、アルギナーゼをコードする
ＤＮＡ断片をクローン化し、サッカロマイセス・セレビ
シアエの宿主・ベクター系に連結し、得られたプラスミ
ドベクターを移入することにより、アルギナーゼ遺伝子
（ＣＡＲｌ）が破壊又は置換される形質転換体が得られ
ることを見出したのである。
また、ここに得られた形質転換体を用いて、アルコール
発酵を行ったところ、尿素の生成は全くみられず、発酵
速度は親株と変らないことを認め、本発明を完成するに
至った。
発酵を行ったところ、尿素の生成は全くみられず、発酵
速度は親株と変らないことを認め、本発明を完成するに
至った。
本発明は、アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプ
ラスミドベクターに関するものであり。
ラスミドベクターに関するものであり。
また、アルギナーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプラス
ミドベクターに関するものである。
ミドベクターに関するものである。
また、本発明は、アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のた
めのプラスミドベクターを作製し、これを直鎖状とし、
サッカロマイセス・セレビシアエに移入することによっ
て得られる尿素生成のない形質転換体に関するものであ
り、また、アルギナーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプ
ラスミドベクターを作製し、これを直鎖状とし、サッカ
ロマイセス・セレビシアエに移入することによって得ら
れる尿素生成のない形質転換体に関するものである。
めのプラスミドベクターを作製し、これを直鎖状とし、
サッカロマイセス・セレビシアエに移入することによっ
て得られる尿素生成のない形質転換体に関するものであ
り、また、アルギナーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプ
ラスミドベクターを作製し、これを直鎖状とし、サッカ
ロマイセス・セレビシアエに移入することによって得ら
れる尿素生成のない形質転換体に関するものである。
そして、本発明は、このようにして得られた形質転換体
を用いることを特徴とする酒類、アルコール等の製造法
に関するものである。
を用いることを特徴とする酒類、アルコール等の製造法
に関するものである。
（詳細な説明）
本発明に用いたゲノムＤＡＮの供与体は、サッカロマイ
セス・セレビシアエであり具体的には協会７号酵母であ
る。
セス・セレビシアエであり具体的には協会７号酵母であ
る。
本菌体から染色体ＤＮＡ を抽出するには、たとえばＪ
、 Ｒ，Ｄｉｌｌｏｎ−Ａ、 Ｎａ５ｉｎ−Ｅ、 Ｒ，
Ｎｅｓｔｍａｎｎ編［組換えＤＮＡ実験」１９０頁記載
された、サッカロマイセス・セレビシアエの全ＤＮＡの
抽出法に従って行った。
、 Ｒ，Ｄｉｌｌｏｎ−Ａ、 Ｎａ５ｉｎ−Ｅ、 Ｒ，
Ｎｅｓｔｍａｎｎ編［組換えＤＮＡ実験」１９０頁記載
された、サッカロマイセス・セレビシアエの全ＤＮＡの
抽出法に従って行った。
次に得られたＤＮＡをＢａｍ旧で部分分解した後、細菌
アルカリフォスファターゼで処理し燐を除去する。
アルカリフォスファターゼで処理し燐を除去する。
同じ接着末端を生じさせる制限酵素で処理したファージ
［）ＮＡに上記で得られたＤＮＡ断片を挿入して染色体
シーンライブラリーを作製する。当該ファージとしては
ＥＭＢＬ３（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 Ｖｏｌ １
７０．８２７〜８４２（１９８３））が用いられる。上
記で得られた染色体シーンライブラリーからの当該遺伝
子の単離に当っては、サッカロマイセス・セレビシアエ
のアルギナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏ ｙＶｏｌ １６０．１０７８〜１０８７（１
９８４））に基づいて合成したＤＮＡオリゴマーを作成
し、それをプローブに用いてプラークハイブリダイゼー
ションを行い、サッカロマイセス・セレビシアエのアル
ギナーゼ遺伝子のＤＮＡをクローニングする。
［）ＮＡに上記で得られたＤＮＡ断片を挿入して染色体
シーンライブラリーを作製する。当該ファージとしては
ＥＭＢＬ３（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 Ｖｏｌ １
７０．８２７〜８４２（１９８３））が用いられる。上
記で得られた染色体シーンライブラリーからの当該遺伝
子の単離に当っては、サッカロマイセス・セレビシアエ
のアルギナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏ ｙＶｏｌ １６０．１０７８〜１０８７（１
９８４））に基づいて合成したＤＮＡオリゴマーを作成
し、それをプローブに用いてプラークハイブリダイゼー
ションを行い、サッカロマイセス・セレビシアエのアル
ギナーゼ遺伝子のＤＮＡをクローニングする。
遺伝子破壊のためのプラスミドの作製は次のようにして
行う。
行う。
即ち、アルギナーゼ遺伝子由来の０．９ｋｂのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントを組み込んだベクターｐ
Ｕｃ１１９にＹＲｐ７より切り出したＴｒｐｌを含む０
．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントをつない
だＹＩｐ型プラスミドｐＥＰＨ−２を作製する（第１図
）。
ＩＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントを組み込んだベクターｐ
Ｕｃ１１９にＹＲｐ７より切り出したＴｒｐｌを含む０
．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントをつない
だＹＩｐ型プラスミドｐＥＰＨ−２を作製する（第１図
）。
この方法の特徴は、まず破壊される遺伝子（アルギナー
ゼ）と共通な配列を持ち、かつその遺伝子上に存在する
ｍＲＮＡの開始コドンと終止コドンを除いたプラスミド
を作製する。このプラスミドは。
ゼ）と共通な配列を持ち、かつその遺伝子上に存在する
ｍＲＮＡの開始コドンと終止コドンを除いたプラスミド
を作製する。このプラスミドは。
共通配列上の特異な制限酵素部位で切断したのち、直鎖
状のＤＮＡにして形質転換に用いられる０通常このプラ
スミドには選択のためのマーカーがつないであり、形質
転換体、即ち遺伝子破壊体をプレート上で選択できるよ
うになっている。
状のＤＮＡにして形質転換に用いられる０通常このプラ
スミドには選択のためのマーカーがつないであり、形質
転換体、即ち遺伝子破壊体をプレート上で選択できるよ
うになっている。
遺伝子置換のためのプラスミドの作製は次のようにして
行う。
行う。
即ち、第２図に示されるように、プラスミドベクターＰ
ＣＡＲ１１２をＳａＣ■で切断し、得られたＳａｃ Ｉ
Ｉ切断部位を、ベクターＹＲｐ７のＴＲＰＩ ｇｅｎｅ
をコードする０、７ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ夏フラグ
メントと連結してｐＲＥＰ−１を作製する。
ＣＡＲ１１２をＳａＣ■で切断し、得られたＳａｃ Ｉ
Ｉ切断部位を、ベクターＹＲｐ７のＴＲＰＩ ｇｅｎｅ
をコードする０、７ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ夏フラグ
メントと連結してｐＲＥＰ−１を作製する。
このプラスミドは共通配列上の特異な制限酵素部位で切
断し、直鎖状のＤＮＡにして形質転換し、遺伝子置換を
行なわせるものである。
断し、直鎖状のＤＮＡにして形質転換し、遺伝子置換を
行なわせるものである。
なお、アルギナーゼ遺伝子が破壊又は置換されたかどう
かの判定は、次の方法でアルギナーゼ活性を測定し、活
性の有無によって行う。
かの判定は、次の方法でアルギナーゼ活性を測定し、活
性の有無によって行う。
形質転換株及び親株をＹＥＰＤ培地（１％酵母エキス、
２％ペプトン、２％グルコース）中で３０℃。
２％ペプトン、２％グルコース）中で３０℃。
１６時間培養後集菌洗浄し、２５ｗ＋Ｍグリシン−画性
ソーダ緩衝液（ｐＨ９，５）に懸濁し、ガラスピーズで
破壊する。
ソーダ緩衝液（ｐＨ９，５）に懸濁し、ガラスピーズで
破壊する。
このホモジネートの１５００Ｏｒｐｍ、 １０分間の遠
心上滑液を酵素液とし、アルギニンを基質として反応さ
せ、生成する尿素を東洋醸造（株）製尿素キットで定量
し、アルギナーゼ活性とした。
心上滑液を酵素液とし、アルギニンを基質として反応さ
せ、生成する尿素を東洋醸造（株）製尿素キットで定量
し、アルギナーゼ活性とした。
次に、この形質転換体を用いて、常法どおり、清酒や果
実酒、ビール、しょうちゅう、ウィスキー等の酒類を製
造することにより、尿素を含まない酒類を製造でき、ひ
いてはカルバミン酸エチルの生成しない酒類の製造が可
能となる。
実酒、ビール、しょうちゅう、ウィスキー等の酒類を製
造することにより、尿素を含まない酒類を製造でき、ひ
いてはカルバミン酸エチルの生成しない酒類の製造が可
能となる。
実施例１ 染色体ＤＮＡのシーンライブラリーの作製；
サッカロマイセス・セレビシアエ、協会７号のスラント
より１白金耳をＹＥＰＤ培地５ＩＩＩＱ中で対数増殖期
まで増殖させ、遠心によって菌体を集菌した。
より１白金耳をＹＥＰＤ培地５ＩＩＩＱ中で対数増殖期
まで増殖させ、遠心によって菌体を集菌した。
１．０ＭソルビトールｌｎＱ中に）謁濁後、小型遠心機
で３０〜６０秒遠心してペレットにし、５０ｍＭリン酸
カリウム（ｐＨ７，５）、１４ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール、１Ｍソルビトールの溶液０．５ｍΩに再懸濁
した。これに。
で３０〜６０秒遠心してペレットにし、５０ｍＭリン酸
カリウム（ｐＨ７，５）、１４ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール、１Ｍソルビトールの溶液０．５ｍΩに再懸濁
した。これに。
ザイモリアーゼ６００００５００μｇを加え３０℃、３
０分間培養し、プロトプラスト化した。プロトプラスト
を遠心し、 ５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，５）０．
５ｍＮに再懸濁し、１０％５ＤＳ２０μＱとジエチルオ
キシジホルメート１μＱを加えた。冷却しながら５Ｍ酢
酸カリウム溶液１００μＱを加え、更に６０分間氷水中
につけた。得られた溶菌液を１５００Ｏｒｐｍ、 １０
分間冷却遠心後上清を取得し、その上清を等量のフェノ
ールで２回、続いて等量のクロロホルムで２回処理して
夾雑するタンパク質を除去後、２容の冷エタノールを加
え核酸分を沈澱させた。この沈澱を凍結乾燥後、ＴＥ温
溶液溶解しＤＮＡ溶液とした。得られた［ｌＮＡを制限
酵素ＢａｍＨＩで部分分解し、アルカリフォスファター
ゼで処理後、λＥＭＢＬ３−Ｂａｍｔ（Ｉアーム（東洋
紡（株））にＴ４リガーゼを用いて連結し、得られたフ
ァージＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングキット
（ギガパックゴールド（東洋紡（株）販売））を用いて
パッケージング後Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｐ２３９２にトラン
スフェクションし染色体ＤＮＡのシーンライブラリーと
した。
０分間培養し、プロトプラスト化した。プロトプラスト
を遠心し、 ５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，５）０．
５ｍＮに再懸濁し、１０％５ＤＳ２０μＱとジエチルオ
キシジホルメート１μＱを加えた。冷却しながら５Ｍ酢
酸カリウム溶液１００μＱを加え、更に６０分間氷水中
につけた。得られた溶菌液を１５００Ｏｒｐｍ、 １０
分間冷却遠心後上清を取得し、その上清を等量のフェノ
ールで２回、続いて等量のクロロホルムで２回処理して
夾雑するタンパク質を除去後、２容の冷エタノールを加
え核酸分を沈澱させた。この沈澱を凍結乾燥後、ＴＥ温
溶液溶解しＤＮＡ溶液とした。得られた［ｌＮＡを制限
酵素ＢａｍＨＩで部分分解し、アルカリフォスファター
ゼで処理後、λＥＭＢＬ３−Ｂａｍｔ（Ｉアーム（東洋
紡（株））にＴ４リガーゼを用いて連結し、得られたフ
ァージＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングキット
（ギガパックゴールド（東洋紡（株）販売））を用いて
パッケージング後Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｐ２３９２にトラン
スフェクションし染色体ＤＮＡのシーンライブラリーと
した。
実施例２ 染色体ＤＮＡシーンライブラリーからのサッ
カロマイセス・セレビシアエのアルギナーゼ遺伝子（Ｃ
ＡＲＩ）のクローニング；実施例１に記載の染色体ＤＮ
Ａのシーンライブラリーに保存されたファージのプラー
ク形成後、プラークハイブリダイゼーションによりアル
ギナーゼ遺伝子を含むクローンの選択を行った。この−
連の操作は常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
、 ｐ６３〜６７゜Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））によった。
カロマイセス・セレビシアエのアルギナーゼ遺伝子（Ｃ
ＡＲＩ）のクローニング；実施例１に記載の染色体ＤＮ
Ａのシーンライブラリーに保存されたファージのプラー
ク形成後、プラークハイブリダイゼーションによりアル
ギナーゼ遺伝子を含むクローンの選択を行った。この−
連の操作は常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
、 ｐ６３〜６７゜Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））によった。
プラークハイブリダイゼーションに用いた２つのプロー
ブは次の配列をもつ合成オリゴマー（３２〜３５ｍｅｒ
）を３２ｐで放射能標識したものである。
ブは次の配列をもつ合成オリゴマー（３２〜３５ｍｅｒ
）を３２ｐで放射能標識したものである。
ＮＲ−１５’ＴＧＧＡＣＡＡＡＴＡＣＣＣＣＧＡＴＧＣ
ＴＧＧＴＣＴＴＴＴＡＴＧＧ３’ＮＲ−２５’ＡＴＧＴ
ＡＡＣＣＣＴＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＴＧＡＴＡ
ＴＣＣＡＴＧ３’約２０，０００個のプラークよりＮＲ
−１，ＮＲ−２プローブのどちらにもハイブリダイゼー
ションする１個のクローンを選択できた。
ＴＧＧＴＣＴＴＴＴＡＴＧＧ３’ＮＲ−２５’ＡＴＧＴ
ＡＡＣＣＣＴＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＴＧＡＴＡ
ＴＣＣＡＴＧ３’約２０，０００個のプラークよりＮＲ
−１，ＮＲ−２プローブのどちらにもハイブリダイゼー
ションする１個のクローンを選択できた。
これらのクローンの中に挿入されているサッカロマイセ
ス・セレビシアエ協会７号由来のＤＮＡ断片をＢａｗｌ
（Ｉで完全消化したところ、２つのプローブでハイブリ
ダイゼーションする５、６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。こ
のＤＮＡ断片をＥ、 ｃｏｌｉのプラスミドベクターρ
１ｃ１１９に連結し、サブクローンρＣＡＲ１１２を得
て２、これから当該挿入断片の制限酵素切断地図を作製
した。（第２図のｐＣＡＲ１１２）結果は、Ｓｕｍｒａ
ｄａら（ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ
１６０．１０７８〜１０８７（１９８４））と同じであ
った。
ス・セレビシアエ協会７号由来のＤＮＡ断片をＢａｗｌ
（Ｉで完全消化したところ、２つのプローブでハイブリ
ダイゼーションする５、６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。こ
のＤＮＡ断片をＥ、 ｃｏｌｉのプラスミドベクターρ
１ｃ１１９に連結し、サブクローンρＣＡＲ１１２を得
て２、これから当該挿入断片の制限酵素切断地図を作製
した。（第２図のｐＣＡＲ１１２）結果は、Ｓｕｍｒａ
ｄａら（ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ
１６０．１０７８〜１０８７（１９８４））と同じであ
った。
実施例３ アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプ
ラスミドベクターの作製； 実施例２に記載のプラスミドベクターＰＣＡＲ１１２か
ら制限酵素Ｈｉｎｄ ｍ とＰｓｔＩで切り出される
ＣＡＲ１ｇｅｎｅ由来の０．９ｋｂのＤＮＡ断片をｐＵ
ｃ１１９にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、 ’
Ｐ）ＩＰ−１プラスミドベクターを作製した。これに選
択マーカーを付与するために、ベクターＹＲｐ７よりＴ
ＲＰＩ ｇｅｎｅをコードする０、７ｋｂのＥｃｏＲＩ
−Ｐｓｔ Ｉフラグメントを制限酵素で切り出しＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いｐＨＰ−１プラスミドベクターに連
結し、アルギナーゼ遺伝子破壊用プラスミドベクターｐ
ＥＰＨ−２を作製した。（第１図）実施例４ アルギナ
ーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプラスミドベクターの
作製； 実施例２に記載のプラスミドベクターＰＣＡＲ１１２を
ＣＡＲＩ遺伝子上の制限酵素Ｓａｃ ＩＩ切断部位で切
断した。これに選択マーカーを付与するために、ベクタ
ーＹＲｐ７よりＴＲＰＩ ｇｅｎｅをコードする０、７
ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ １フラグメントを制限酵素
で切り出し単離した。次に、上記のベクターおよびフラ
グメントに各々存在する接着末端を７４ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いる常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、 ｐ３９５． ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））により平滑末
端とした。後に、両者をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結し、アルギナーゼ遺伝子直換用プラスミドベクターｐ
ＲＥＰ−１を作製した。（第２図）実施例５ アルギナ
ーゼを生産しないサッカロマイセス・セレビシアエの作
製； アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊用ベクターｐＥＩ’Ｈ
−２を用い、サッカロマイセス・セレビシアエＹＮＮ２
７ （α、 ｔｒｐｌ ｕｒａ３． ｇａ４１）及び８
９２ （ａ、 ｔｒｐｌ。
ラスミドベクターの作製； 実施例２に記載のプラスミドベクターＰＣＡＲ１１２か
ら制限酵素Ｈｉｎｄ ｍ とＰｓｔＩで切り出される
ＣＡＲ１ｇｅｎｅ由来の０．９ｋｂのＤＮＡ断片をｐＵ
ｃ１１９にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、 ’
Ｐ）ＩＰ−１プラスミドベクターを作製した。これに選
択マーカーを付与するために、ベクターＹＲｐ７よりＴ
ＲＰＩ ｇｅｎｅをコードする０、７ｋｂのＥｃｏＲＩ
−Ｐｓｔ Ｉフラグメントを制限酵素で切り出しＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いｐＨＰ−１プラスミドベクターに連
結し、アルギナーゼ遺伝子破壊用プラスミドベクターｐ
ＥＰＨ−２を作製した。（第１図）実施例４ アルギナ
ーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプラスミドベクターの
作製； 実施例２に記載のプラスミドベクターＰＣＡＲ１１２を
ＣＡＲＩ遺伝子上の制限酵素Ｓａｃ ＩＩ切断部位で切
断した。これに選択マーカーを付与するために、ベクタ
ーＹＲｐ７よりＴＲＰＩ ｇｅｎｅをコードする０、７
ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ １フラグメントを制限酵素
で切り出し単離した。次に、上記のベクターおよびフラ
グメントに各々存在する接着末端を７４ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いる常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、 ｐ３９５． ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））により平滑末
端とした。後に、両者をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結し、アルギナーゼ遺伝子直換用プラスミドベクターｐ
ＲＥＰ−１を作製した。（第２図）実施例５ アルギナ
ーゼを生産しないサッカロマイセス・セレビシアエの作
製； アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊用ベクターｐＥＩ’Ｈ
−２を用い、サッカロマイセス・セレビシアエＹＮＮ２
７ （α、 ｔｒｐｌ ｕｒａ３． ｇａ４１）及び８
９２ （ａ、 ｔｒｐｌ。
ａｓｐ５． ｍａｋ１２）の２株の形質転換をＩｔｏら
の方法（Ｊ。
の方法（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 ｖｏｌ １５３．１６３
〜（１９８３））に準じて行った。
〜（１９８３））に準じて行った。
つまり、酵母ＹＮＮ２７及び８９２を各々をｌｏｏｍＱ
のＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２
％グルコース、ｐＨ５，３）で３０℃で振とう培養し、
対数増殖期に遠心によってｉ菌した。ＴＥ緩衝液で洗浄
後同じ緩衝液に２Ｘ１０＠セル／ｙｎＱの濃度で懸濁し
た。
のＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２
％グルコース、ｐＨ５，３）で３０℃で振とう培養し、
対数増殖期に遠心によってｉ菌した。ＴＥ緩衝液で洗浄
後同じ緩衝液に２Ｘ１０＠セル／ｙｎＱの濃度で懸濁し
た。
この０ 、５ｍＱを小試験管に移し、等容量の０．２Ｍ
酢酸リチウム溶液を添加し、１時間３０℃で振とうした
。
酢酸リチウム溶液を添加し、１時間３０℃で振とうした
。
この中から０，１ｍＱを１ 、８＋ｎ１２のエッペンド
ルフチューブに移し、プラスミドベクターｐＥＰｌ！−
２を制限酵素ＢｇｌＩＩで処理し直鎖状にしたＤＮＡ溶
液（６７０μｇ／ｍＱ）１５μｇを加え３０℃、３０分
間静置培養した。
ルフチューブに移し、プラスミドベクターｐＥＰｌ！−
２を制限酵素ＢｇｌＩＩで処理し直鎖状にしたＤＮＡ溶
液（６７０μｇ／ｍＱ）１５μｇを加え３０℃、３０分
間静置培養した。
次に殺菌した７０％ＰＥＧ−４０００１１５μＱを加え
、よく混合した。３０℃で１時間静置した後、エッペン
ドルフチューブを４２℃の恒温水中で５分間静置後、菌
体を直ちに室温迄冷却し、室温で殺菌水で洗浄し、形質
転換株を得た。これらの中からまず、Ｔｒｐ＋形質転換
体を選択した。ＹＮＢ−Ｔ培地（２％グルコース、 ０
．６７％ナイトロゲンベースＷ１０ＡＡ、 ０．００２
％ウラシル、１．５％寒天）でＴｒｐなしで生ｆｆする
株が各々５０〜１００株得られた。
、よく混合した。３０℃で１時間静置した後、エッペン
ドルフチューブを４２℃の恒温水中で５分間静置後、菌
体を直ちに室温迄冷却し、室温で殺菌水で洗浄し、形質
転換株を得た。これらの中からまず、Ｔｒｐ＋形質転換
体を選択した。ＹＮＢ−Ｔ培地（２％グルコース、 ０
．６７％ナイトロゲンベースＷ１０ＡＡ、 ０．００２
％ウラシル、１．５％寒天）でＴｒｐなしで生ｆｆする
株が各々５０〜１００株得られた。
次に、Ｔｒｐ＋菌株の中から、アルギナーゼ欠損株とし
て、アルギニンを唯一の窒素源とする培地（２％グルコ
ース、 ０．６７％ナイトロゲンフリーカーボンベース
、０．００２％ウラシル、０．５％アルギニン、１．５
％寒天）で生育できず、オルニチンを唯一の窒素源とす
る培地（２％グルコース、 ０．６７％ナイトロゲンフ
リーカーボンベース、０．００２％ウラシル、０．５％
オルニチン、１．５％寒天）で生育できる株として、Ｙ
ＮＮ２７からの形質転換体３株（Ｕ−１，２，３）を得
た。
て、アルギニンを唯一の窒素源とする培地（２％グルコ
ース、 ０．６７％ナイトロゲンフリーカーボンベース
、０．００２％ウラシル、０．５％アルギニン、１．５
％寒天）で生育できず、オルニチンを唯一の窒素源とす
る培地（２％グルコース、 ０．６７％ナイトロゲンフ
リーカーボンベース、０．００２％ウラシル、０．５％
オルニチン、１．５％寒天）で生育できる株として、Ｙ
ＮＮ２７からの形質転換体３株（Ｕ−１，２，３）を得
た。
アルギナーゼ欠損株Ｕ−３と親株のアルギナーゼ活性を
第３図に示したが、ｕ−３株はアルギナーゼ活性が認め
られないことから、アルギナーゼ遺伝子の破壊株である
ことが確認された。
第３図に示したが、ｕ−３株はアルギナーゼ活性が認め
られないことから、アルギナーゼ遺伝子の破壊株である
ことが確認された。
Ｕ−３株はＦＥＲＭ Ｐ−１０３５７として微工研に寄
託されている。
託されている。
実施例６ 形質転換株による酒類の醸造；形質転換株Ｕ
−３ＦＥＲＭ Ｐ−１０３５７をＹＰＡＤ培地５培地５
コＱ℃、１夜振どう培養後、集菌洗浄し、α米１６ｇ、
麹４ｇ、水４０ｍＱおよび加工水（ＫＮ、ＰＯ４１，３
ｇ、 ＮａＣＱＯ，２５ｇ及び醸造用乳酸６ｍＱを水で
１００ｍＧとしたもの）０．２５ｍＱと混合し、１００
ｍ１２容三角フラスコに入れ２５℃でアルコール発酵を
行った。
−３ＦＥＲＭ Ｐ−１０３５７をＹＰＡＤ培地５培地５
コＱ℃、１夜振どう培養後、集菌洗浄し、α米１６ｇ、
麹４ｇ、水４０ｍＱおよび加工水（ＫＮ、ＰＯ４１，３
ｇ、 ＮａＣＱＯ，２５ｇ及び醸造用乳酸６ｍＱを水で
１００ｍＧとしたもの）０．２５ｍＱと混合し、１００
ｍ１２容三角フラスコに入れ２５℃でアルコール発酵を
行った。
アルコール発酵経過をＣＯ□の発生による重量の減少で
測定し、アルギナーゼによるアルギニンからの尿素の生
成経過を東洋醸造（株）製尿素測定キットで測定し、結
果を第４図に示した。
測定し、アルギナーゼによるアルギニンからの尿素の生
成経過を東洋醸造（株）製尿素測定キットで測定し、結
果を第４図に示した。
この結果、ＣＯ２減少による発酵経過は親株とＬｌ−３
の間ではほぼ同一であった。一方、尿素の生成は、親株
が４日目以後直線的に増加を示すのに対し、Ｕ−３株で
は、最後まで尿素の生成はみられず、尿素を含まない酒
類の製造が可能であった。
の間ではほぼ同一であった。一方、尿素の生成は、親株
が４日目以後直線的に増加を示すのに対し、Ｕ−３株で
は、最後まで尿素の生成はみられず、尿素を含まない酒
類の製造が可能であった。
第１図はアルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプラ
スミドベクターの作成説明図で、第２図はアルギナーゼ
遺伝子の遺伝子置換のためのプラスミドベクターの作成
説明図で、第３図は親株と形質転換体のアルギナーゼ活
性を示す図で、第４図は親株と形質転換体のアルコール
発酵の経過図である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 〔＾Ｒ１ （Ｅ） イ５キュベ゛−シシ （＃）
スミドベクターの作成説明図で、第２図はアルギナーゼ
遺伝子の遺伝子置換のためのプラスミドベクターの作成
説明図で、第３図は親株と形質転換体のアルギナーゼ活
性を示す図で、第４図は親株と形質転換体のアルコール
発酵の経過図である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 〔＾Ｒ１ （Ｅ） イ５キュベ゛−シシ （＃）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプラスミ
ドベクター。 ２）アルギナーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプラスミ
ドベクター。 ３）特許請求範囲第１項記載のプラスミドベクターを直
鎖状とし、サッカロマイセス・セレビシアエに移入する
ことによって得られる尿素生成のない形質転換体。 ４）特許請求範囲第２項記載のプラスミドベクターを直
鎖状とし、サッカロマイセス・セレビシアエに移入する
ことによって得られる尿素生成のない形質転換体。 ５）特許請求範囲第３項又は第４項で得られた形質転換
体を用いることを特徴とする酒類、アルコール等の製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26809788A JPH0771493B2 (ja) | 1988-10-26 | 1988-10-26 | 遺伝子破壊または遺伝子置換のプラスミドベクター、形質転換体及びその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26809788A JPH0771493B2 (ja) | 1988-10-26 | 1988-10-26 | 遺伝子破壊または遺伝子置換のプラスミドベクター、形質転換体及びその利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02117385A true JPH02117385A (ja) | 1990-05-01 |
| JPH0771493B2 JPH0771493B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=17453851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26809788A Expired - Lifetime JPH0771493B2 (ja) | 1988-10-26 | 1988-10-26 | 遺伝子破壊または遺伝子置換のプラスミドベクター、形質転換体及びその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0771493B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0420282A (ja) * | 1990-05-15 | 1992-01-23 | Tax Adm Agency | アルギナーゼ遺伝子欠損株選択培地とそれを利用した尿素非生産性酵母の育種及びそれを用いる酒類の製造法 |
| JP2001238665A (ja) * | 2000-03-02 | 2001-09-04 | Natl Food Res Inst | アミノ酸高蓄積実用パン酵母 |
| JP2013158301A (ja) * | 2012-02-06 | 2013-08-19 | Gekkeikan Sake Co Ltd | 高酸型酵母の育種方法、該育種方法で育種された高酸型酵母、及び該高酸型酵母を用いたアルコール飲料の製造方法 |
| CN105385613A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-03-09 | 绍兴国家黄酒工程技术研究中心有限公司 | 一株低产尿素黄酒酵母菌及其应用 |
| CN105861348A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-08-17 | 江南大学 | 一株低产尿素的酿酒酵母及其在食品生产中的应用 |
| US9469863B2 (en) | 2007-11-30 | 2016-10-18 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Aminoglycoside antibiotics, process for producing the same, and pharmaceutical use thereof |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105273918A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-01-27 | 江南大学 | 一种可降低黄酒发酵中氨基甲酸乙酯积累的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63164876A (ja) * | 1986-12-26 | 1988-07-08 | Tax Adm Agency | 清酒醸造法 |
| EP0286303A1 (en) * | 1987-04-01 | 1988-10-12 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and its use |
-
1988
- 1988-10-26 JP JP26809788A patent/JPH0771493B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63164876A (ja) * | 1986-12-26 | 1988-07-08 | Tax Adm Agency | 清酒醸造法 |
| EP0286303A1 (en) * | 1987-04-01 | 1988-10-12 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and its use |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0420282A (ja) * | 1990-05-15 | 1992-01-23 | Tax Adm Agency | アルギナーゼ遺伝子欠損株選択培地とそれを利用した尿素非生産性酵母の育種及びそれを用いる酒類の製造法 |
| JP2001238665A (ja) * | 2000-03-02 | 2001-09-04 | Natl Food Res Inst | アミノ酸高蓄積実用パン酵母 |
| US9469863B2 (en) | 2007-11-30 | 2016-10-18 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Aminoglycoside antibiotics, process for producing the same, and pharmaceutical use thereof |
| JP2013158301A (ja) * | 2012-02-06 | 2013-08-19 | Gekkeikan Sake Co Ltd | 高酸型酵母の育種方法、該育種方法で育種された高酸型酵母、及び該高酸型酵母を用いたアルコール飲料の製造方法 |
| CN105385613A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-03-09 | 绍兴国家黄酒工程技术研究中心有限公司 | 一株低产尿素黄酒酵母菌及其应用 |
| CN105861348A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-08-17 | 江南大学 | 一株低产尿素的酿酒酵母及其在食品生产中的应用 |
| CN105861348B (zh) * | 2016-06-14 | 2019-04-23 | 江南大学 | 一株低产尿素的酿酒酵母及其在食品生产中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0771493B2 (ja) | 1995-08-02 |
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