JPH0799979A - 新規遺伝子、それを用いた形質転換体及び その利用 - Google Patents
新規遺伝子、それを用いた形質転換体及び その利用Info
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- JPH0799979A JPH0799979A JP5265447A JP26544793A JPH0799979A JP H0799979 A JPH0799979 A JP H0799979A JP 5265447 A JP5265447 A JP 5265447A JP 26544793 A JP26544793 A JP 26544793A JP H0799979 A JPH0799979 A JP H0799979A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 アスペルギルス・カワチ由来のα−アミラー
ゼ遺伝子、該α−アミラーゼ生産性形質転換体、及びそ
の利用。 【効果】 耐酸性、耐熱性、生デンプン分解性を有する
α−アミラーゼが効率的に得られ、また、形質転換酵母
は、生デンプンから直接アルコールを生産することがで
きる。
ゼ遺伝子、該α−アミラーゼ生産性形質転換体、及びそ
の利用。 【効果】 耐酸性、耐熱性、生デンプン分解性を有する
α−アミラーゼが効率的に得られ、また、形質転換酵母
は、生デンプンから直接アルコールを生産することがで
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアスペルギルス・カワチ
から得られた新規α−アミラーゼ遺伝子、これを含むベ
クター、そのベクターをアスペルギルス属、又は、サッ
カロミセス・セレビシアエに移入した形質転換体及びそ
の利用に関するものである。
から得られた新規α−アミラーゼ遺伝子、これを含むベ
クター、そのベクターをアスペルギルス属、又は、サッ
カロミセス・セレビシアエに移入した形質転換体及びそ
の利用に関するものである。
【０００２】アスペルギルス・カワチの耐酸性α−アミ
ラーゼは、酸性条件下で失活しないα−アミラーゼであ
り、これを産出する遺伝子を含むベクターで形質転換し
たアスペルギルス属やサッカロミセス・セレビシアエを
用いれば酸性条件下で酒類、アルコール等を製造するこ
とができるようになり、発酵工業界に大いに貢献するも
のである。
ラーゼは、酸性条件下で失活しないα−アミラーゼであ
り、これを産出する遺伝子を含むベクターで形質転換し
たアスペルギルス属やサッカロミセス・セレビシアエを
用いれば酸性条件下で酒類、アルコール等を製造するこ
とができるようになり、発酵工業界に大いに貢献するも
のである。
【０００３】また、アスペルギルス・カワチの耐酸性α
−アミラーゼは生デンプンを分解する事ができるので、
これを産出する遺伝子を含むベクターで形質転換したア
スペルギルス属やサッカロミセス・セレビシアエを用い
れば生デンプンから酒類、アルコール等を製造すること
ができるようになり、発酵工業界に大いに貢献するもの
である。
−アミラーゼは生デンプンを分解する事ができるので、
これを産出する遺伝子を含むベクターで形質転換したア
スペルギルス属やサッカロミセス・セレビシアエを用い
れば生デンプンから酒類、アルコール等を製造すること
ができるようになり、発酵工業界に大いに貢献するもの
である。
【０００４】
【従来の技術及び問題点】現在、清酒醸造に用いられて
いるα−アミラーゼはアスペルギルス・オリゼーの生産
する酵素であって、耐酸性が低く、酵素の安定なｐＨが
５〜９の範囲であってｐＨ３以下では１００％失活す
る。また、生デンプンに対する分解力もない。
いるα−アミラーゼはアスペルギルス・オリゼーの生産
する酵素であって、耐酸性が低く、酵素の安定なｐＨが
５〜９の範囲であってｐＨ３以下では１００％失活す
る。また、生デンプンに対する分解力もない。
【０００５】一方、焼酎醸造等で広く利用されているア
スペルギルス・カワチの分泌生産するα−アミラーゼは
アスペルギルス・オリゼーのα−アミラーゼ（タカアミ
ラーゼＡ）に比較して耐熱性及び耐酸性が高く、ｐＨ３
以下の酸性域においても反応する。
スペルギルス・カワチの分泌生産するα−アミラーゼは
アスペルギルス・オリゼーのα−アミラーゼ（タカアミ
ラーゼＡ）に比較して耐熱性及び耐酸性が高く、ｐＨ３
以下の酸性域においても反応する。
【０００６】また他の種のアスペルギルス属のα−アミ
ラーゼにない顕著な特徴として、アスペルギルス・カワ
チのα−アミラーゼは、生デンプン分解力を有すること
が挙げられ本酵素の焼酎醸造以外の分野への利用に期待
がかけられているのである。
ラーゼにない顕著な特徴として、アスペルギルス・カワ
チのα−アミラーゼは、生デンプン分解力を有すること
が挙げられ本酵素の焼酎醸造以外の分野への利用に期待
がかけられているのである。
【０００７】また、これとは別にサッカロミセス・セレ
ビシアエは酒類醸造をはじめとするアルコール発酵に広
く利用されている微生物であるが、α−アミラーゼ生産
能を有しないため、直接デンプンを原料にして、アルコ
ール発酵を行なうことができない。しかし、近年、醸造
工程の簡略化等の目的で直接デンプンを糖化できる酵素
を生産できるサッカロミセス・セレビシアエが求められ
ているが、その目的に叶った株の分離がなされていな
い。
ビシアエは酒類醸造をはじめとするアルコール発酵に広
く利用されている微生物であるが、α−アミラーゼ生産
能を有しないため、直接デンプンを原料にして、アルコ
ール発酵を行なうことができない。しかし、近年、醸造
工程の簡略化等の目的で直接デンプンを糖化できる酵素
を生産できるサッカロミセス・セレビシアエが求められ
ているが、その目的に叶った株の分離がなされていな
い。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、耐酸
性、耐熱性及び生デンプン分解性を有するα−アミラー
ゼの効率的生産及び効率的アルコールないし酒類醸造を
目的とし、この目的を遺伝子操作によって達成すること
である。
性、耐熱性及び生デンプン分解性を有するα−アミラー
ゼの効率的生産及び効率的アルコールないし酒類醸造を
目的とし、この目的を遺伝子操作によって達成すること
である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
達成のために鋭意研究の結果、アスペルギルス・カワチ
の耐酸性α−アミラーゼ遺伝子に注目し、アスペルギル
ス・カワチの全ｍＲＮＡを調製し、これに基づいてｃＤ
ＮＡライブラリーを作成し、その中からアスペルギルス
・カワチの耐酸性α−アミラーゼをコードするクローン
を分離することに成功した。そして、耐酸性α−アミラ
ーゼ遺伝子の塩基配列の決定に成功し、このｃＤＮＡを
発現ベクターに連結した後サッカロミセス・セレビシア
エに移入することにより、アスペルギルス・カワチと同
等のα−アミラーゼを生産する形質転換体を得ることに
も成功し、本発明を完成したものである。
達成のために鋭意研究の結果、アスペルギルス・カワチ
の耐酸性α−アミラーゼ遺伝子に注目し、アスペルギル
ス・カワチの全ｍＲＮＡを調製し、これに基づいてｃＤ
ＮＡライブラリーを作成し、その中からアスペルギルス
・カワチの耐酸性α−アミラーゼをコードするクローン
を分離することに成功した。そして、耐酸性α−アミラ
ーゼ遺伝子の塩基配列の決定に成功し、このｃＤＮＡを
発現ベクターに連結した後サッカロミセス・セレビシア
エに移入することにより、アスペルギルス・カワチと同
等のα−アミラーゼを生産する形質転換体を得ることに
も成功し、本発明を完成したものである。
【００１０】すなわち本発明は、 （１）配列表の配列番号１で示される配列 を基本的技術思想のひとつとするものであり、更に次の
ような態様を包含するものである。
ような態様を包含するものである。
【００１１】（２）アスペルギルス・カワチから単離し
たα−アミラーゼのｃＤＮＡ配列。 （３）（２）のｃＤＮＡを含むサッカロミセス・セレビ
シアエのα−アミラーゼを分泌させるベクター。 （４）（３）のベクターをサッカロミセス・セレビシア
エに移入することによって得られる耐酸性、耐熱性及び
生デンプン分解力を有するα−アミラーゼを分泌する形
質転換体。 （５）（４）の形質転換体を培養することにより耐酸性
α−アミラーゼの製造ないし、効率的アルコール発酵。
たα−アミラーゼのｃＤＮＡ配列。 （３）（２）のｃＤＮＡを含むサッカロミセス・セレビ
シアエのα−アミラーゼを分泌させるベクター。 （４）（３）のベクターをサッカロミセス・セレビシア
エに移入することによって得られる耐酸性、耐熱性及び
生デンプン分解力を有するα−アミラーゼを分泌する形
質転換体。 （５）（４）の形質転換体を培養することにより耐酸性
α−アミラーゼの製造ないし、効率的アルコール発酵。
【００１２】以下、本発明について説明するが、本発明
に用いたｍＲＮＡの供与体は、焼酎用白麹菌（アスペル
ギルス・カワチ）であり、具体的には例えばＡｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ（ＩＦＯ ４３０８）
である。
に用いたｍＲＮＡの供与体は、焼酎用白麹菌（アスペル
ギルス・カワチ）であり、具体的には例えばＡｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ（ＩＦＯ ４３０８）
である。
【００１３】本発明を実施するには、耐酸性α−アミラ
ーゼを高生産する条件にて、アスペルギルス・カワチＩ
ＦＯ ４３０８株を培養し、全ＲＮＡを抽出した後、常
法によりｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡのジーンライブラ
リーを作成する。
ーゼを高生産する条件にて、アスペルギルス・カワチＩ
ＦＯ ４３０８株を培養し、全ＲＮＡを抽出した後、常
法によりｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡのジーンライブラ
リーを作成する。
【００１４】一方、耐酸性α−アミラーゼ精製酵素のペ
プチドシークエンスからＮ末及び活性中心付近のアミノ
酸配列をもとにプライマーを合成し、ＰＣＲ法によりプ
ローブを作成、ｃＤＮＡライブラリーよりスクリーニン
グを行いポジティブクローンを得る。
プチドシークエンスからＮ末及び活性中心付近のアミノ
酸配列をもとにプライマーを合成し、ＰＣＲ法によりプ
ローブを作成、ｃＤＮＡライブラリーよりスクリーニン
グを行いポジティブクローンを得る。
【００１５】ポジティブクローンからｃＤＮＡを回収
し、ｃＤＮＡを酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にプ
ラスミドベクターにて導入し、形質転換体を得る。そし
てこの形質転換体を各種の用途に利用するのである。
し、ｃＤＮＡを酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にプ
ラスミドベクターにて導入し、形質転換体を得る。そし
てこの形質転換体を各種の用途に利用するのである。
【００１６】以下、更に具体的に本発明について説明す
る。
る。
【００１７】先ず、アスペルギルス・カワチから全ｍＲ
ＮＡを抽出し、それに基づいてｃＤＮＡライブラリーを
作成するが、その作業は次に記載の方法による。
ＮＡを抽出し、それに基づいてｃＤＮＡライブラリーを
作成するが、その作業は次に記載の方法による。
【００１８】すなわち、デンプンを唯一の炭素源、トリ
プトンを唯一の窒素源とすることにより、α−アミラー
ゼ生産の誘導がかかる培地をｐＨ３．０に調製し、培養
したアスペルギルス・カワチの菌体から実施例で後述す
る方法により全ＲＮＡを抽出する。得られた全ＲＮＡか
らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖ
ｏｌ．６９，１４０８〜１４１２（１９７２）に記載の
方法によりポリＡ含有ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セファ
ロースを用いて精製し全ＲＮＡを得る。この全ｍＲＮＡ
からｃＤＮＡをＧｅｎｅ，Ｖｏｌ．２２２，２６３〜２
６９（１９８３）に記載の方法で合成しＳｃｉｅｎｃ
ｅ，Ｖｏｌ．２２２，７７８〜７８２（１９８３）に記
載の方法でファージＤＮＡλｇｔ１０に導入し、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでパッケージングを行なった後ｃＤＮＡのジ
ーンライブラリーを作成する。
プトンを唯一の窒素源とすることにより、α−アミラー
ゼ生産の誘導がかかる培地をｐＨ３．０に調製し、培養
したアスペルギルス・カワチの菌体から実施例で後述す
る方法により全ＲＮＡを抽出する。得られた全ＲＮＡか
らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖ
ｏｌ．６９，１４０８〜１４１２（１９７２）に記載の
方法によりポリＡ含有ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セファ
ロースを用いて精製し全ＲＮＡを得る。この全ｍＲＮＡ
からｃＤＮＡをＧｅｎｅ，Ｖｏｌ．２２２，２６３〜２
６９（１９８３）に記載の方法で合成しＳｃｉｅｎｃ
ｅ，Ｖｏｌ．２２２，７７８〜７８２（１９８３）に記
載の方法でファージＤＮＡλｇｔ１０に導入し、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでパッケージングを行なった後ｃＤＮＡのジ
ーンライブラリーを作成する。
【００１９】上記で得られたジーンライブラリーから、
当該α−アミラーゼ遺伝子ｃＤＮＡのクローニングは、
アスペルギルス・カワチの生産する酵素α−アミラーゼ
の部分アミノ酸配列より推定した塩基配列をプライマー
としたＰＣＲ法により約０．９Ｋｂｐｓの塩基配列をプ
ローブに用いたプラークハイブリダイゼーションによっ
て行なう。単離された当該α−アミラーゼ遺伝子ｃＤＮ
Ａに含まれるコーディング領域はアスペルギルス・カワ
チの生産する酵素α−アミラーゼの部分アミノ酸配列を
有していた。
当該α−アミラーゼ遺伝子ｃＤＮＡのクローニングは、
アスペルギルス・カワチの生産する酵素α−アミラーゼ
の部分アミノ酸配列より推定した塩基配列をプライマー
としたＰＣＲ法により約０．９Ｋｂｐｓの塩基配列をプ
ローブに用いたプラークハイブリダイゼーションによっ
て行なう。単離された当該α−アミラーゼ遺伝子ｃＤＮ
Ａに含まれるコーディング領域はアスペルギルス・カワ
チの生産する酵素α−アミラーゼの部分アミノ酸配列を
有していた。
【００２０】次に得られたアスペルギルス・カワチのα
−アミラーゼ遺伝子のｃＤＮＡをサッカロミセス・セレ
ビシアエの発現ベクター、例えば酵母アルコールデヒド
ロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１）プロモーターを持つ酵母
発現ベクターｐＹＣＤＥ１に挿入し、サッカロミセス・
セレビシアエに移入することにより、形質転換体を作成
する。それぞれ形質転換方法としては公知の方法たとえ
ばＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，Ｖｏｌ．１５３，１６３〜
１６８（１９８３）に記載された方法あるいはそれに準
じた方法がとられる。
−アミラーゼ遺伝子のｃＤＮＡをサッカロミセス・セレ
ビシアエの発現ベクター、例えば酵母アルコールデヒド
ロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１）プロモーターを持つ酵母
発現ベクターｐＹＣＤＥ１に挿入し、サッカロミセス・
セレビシアエに移入することにより、形質転換体を作成
する。それぞれ形質転換方法としては公知の方法たとえ
ばＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，Ｖｏｌ．１５３，１６３〜
１６８（１９８３）に記載された方法あるいはそれに準
じた方法がとられる。
【００２１】以下、本発明の実施例について述べる。
【００２２】
【実施例１】 アスペルギルス・カワチのｃＤＮＡライブラリーの作
成：
成：
【００２３】アスペルギルス・カワチＩＦＯ ４３０８
の分生胞子１白金耳をクエン酸バッファーによりｐＨ
３．０に調製した。デンプン・ペプトン培地（２．０％
スターチ，０．３％ＮａＮＯ3，０．１％Ｋ2ＨＰＯ4，
０．０５％ＫＣｌ，０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，
０．００１％ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，１．０％トリプト
ン，ｐＨ３．０）に接種し、３０℃、１２０時間、回転
振とう培養後、得られた菌体をフィルターで集め、水洗
した。次に、この菌体を予め冷却した乳鉢にガラスビー
ズ（直径約０．５ｍｍ）数ｇと一緒に加え、これに液体
窒素２０〜５０ｍｌを加え、凍結させ、摩砕した。さら
に同様に液体窒素を加え、摩砕操作をさらに２回繰り返
した後、得られた破砕菌体に６Ｍグアニジンチオシアネ
ート水溶液１０ｍｌを加え、これに等量のフェノールを
添加した後、５分間振とうした。この混合液を１２００
０ｒｐｍ、１０分間の冷却遠心にかけ、水層を分取し
た。この水層を等量のフェノールで２回、続けてクロロ
ホルム−フェノール（１：１）で２回処理して、混在す
るタンパク質を除去した後、１／１０容の３Ｍ酢酸ナト
リウムを添加し、さらに２容の冷エタノールを加えて、
全ＲＮＡを凍結乾燥後、水２ｍｌに溶かした。この一連
の操作によって３．５ｍｇの全ＲＮＡを得た。
の分生胞子１白金耳をクエン酸バッファーによりｐＨ
３．０に調製した。デンプン・ペプトン培地（２．０％
スターチ，０．３％ＮａＮＯ3，０．１％Ｋ2ＨＰＯ4，
０．０５％ＫＣｌ，０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，
０．００１％ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，１．０％トリプト
ン，ｐＨ３．０）に接種し、３０℃、１２０時間、回転
振とう培養後、得られた菌体をフィルターで集め、水洗
した。次に、この菌体を予め冷却した乳鉢にガラスビー
ズ（直径約０．５ｍｍ）数ｇと一緒に加え、これに液体
窒素２０〜５０ｍｌを加え、凍結させ、摩砕した。さら
に同様に液体窒素を加え、摩砕操作をさらに２回繰り返
した後、得られた破砕菌体に６Ｍグアニジンチオシアネ
ート水溶液１０ｍｌを加え、これに等量のフェノールを
添加した後、５分間振とうした。この混合液を１２００
０ｒｐｍ、１０分間の冷却遠心にかけ、水層を分取し
た。この水層を等量のフェノールで２回、続けてクロロ
ホルム−フェノール（１：１）で２回処理して、混在す
るタンパク質を除去した後、１／１０容の３Ｍ酢酸ナト
リウムを添加し、さらに２容の冷エタノールを加えて、
全ＲＮＡを凍結乾燥後、水２ｍｌに溶かした。この一連
の操作によって３．５ｍｇの全ＲＮＡを得た。
【００２４】次に、全ＲＮＡからｍＲＮＡの抽出は以下
の方法で行なった。一般に真核生物のｍＲＮＡは３′末
端にポリＡを持っている。アスペルギルス・カワチのｍ
ＲＮＡの場合もポリＡを持つと考えられるので、オリゴ
ｄＴを固定したカラムを用いて“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ”ｐｐ１９７〜１９８，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載の
方法で行なった。なおオリゴｄＴカラムはファルマシア
製ｔｙｐｅ７を０．５ｇ用いた。この方法により２ｍｇ
の全ＲＮＡから１０μｇのｍＲＮＡを得た。
の方法で行なった。一般に真核生物のｍＲＮＡは３′末
端にポリＡを持っている。アスペルギルス・カワチのｍ
ＲＮＡの場合もポリＡを持つと考えられるので、オリゴ
ｄＴを固定したカラムを用いて“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ”ｐｐ１９７〜１９８，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載の
方法で行なった。なおオリゴｄＴカラムはファルマシア
製ｔｙｐｅ７を０．５ｇ用いた。この方法により２ｍｇ
の全ＲＮＡから１０μｇのｍＲＮＡを得た。
【００２５】次にこのｍＲＮＡからｃＤＮＡを以下の方
法により作成した。原理はＭｏｌ．Ｃｅｌｉ．Ｂｉｏ
ｌ．，Ｖｏｌ．２，１６１〜１７０（１９８２）及びＧ
ｅｎｅ，Ｖｏｌ．２５，２６３〜２６９（１９８３）に
記載のＲＮａｓｅ Ｈ法を用い、実際の操作にはｃＤＮ
Ａ合成システム・プラス（アマシャム製）を用いた。こ
の一連の操作によって５μｇのｍＲＮＡから１．５μｇ
のｃＤＮＡを得た。
法により作成した。原理はＭｏｌ．Ｃｅｌｉ．Ｂｉｏ
ｌ．，Ｖｏｌ．２，１６１〜１７０（１９８２）及びＧ
ｅｎｅ，Ｖｏｌ．２５，２６３〜２６９（１９８３）に
記載のＲＮａｓｅ Ｈ法を用い、実際の操作にはｃＤＮ
Ａ合成システム・プラス（アマシャム製）を用いた。こ
の一連の操作によって５μｇのｍＲＮＡから１．５μｇ
のｃＤＮＡを得た。
【００２６】次に、このｃＤＮＡを用いてライブラリー
の作製を以下の方法によって行なった。まず、前述のｃ
ＤＮＡ １μｇをＥｃｏＲＩメチラーゼで処理して、ｃ
ＤＮＡ鎖内に存在する制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位をす
べて、マスキングした。続いて、このｃＤＮＡにＥｃｏ
ＲＩリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化し、両末端にＥｃｏＲＩの粘着末
端を持つｃＤＮＡを得た。これらのｃＤＮＡをファージ
ベクターλｇｔ１０のＥｃｏＲＩ部位につなぎ、ｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージングを行なった後、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＮＷ５１４にトランスフェクションして、ｃＤＮＡラ
イブラリー（約２０万プラーク）を作製した。なお、こ
のｃＤＮＡのクローニングに関する操作はｃＤＮＡクロ
ーニングシステムλｇｔ１０キット（アマシャム社製）
を用いて行なった。
の作製を以下の方法によって行なった。まず、前述のｃ
ＤＮＡ １μｇをＥｃｏＲＩメチラーゼで処理して、ｃ
ＤＮＡ鎖内に存在する制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位をす
べて、マスキングした。続いて、このｃＤＮＡにＥｃｏ
ＲＩリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化し、両末端にＥｃｏＲＩの粘着末
端を持つｃＤＮＡを得た。これらのｃＤＮＡをファージ
ベクターλｇｔ１０のＥｃｏＲＩ部位につなぎ、ｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージングを行なった後、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＮＷ５１４にトランスフェクションして、ｃＤＮＡラ
イブラリー（約２０万プラーク）を作製した。なお、こ
のｃＤＮＡのクローニングに関する操作はｃＤＮＡクロ
ーニングシステムλｇｔ１０キット（アマシャム社製）
を用いて行なった。
【００２７】
【実施例２】 ｃＤＮＡライブラリーからアスペルギルス・カワチの耐
酸性α−アミラーゼ（ＡＡＡ）ｃＤＮＡのクローニン
グ：
酸性α−アミラーゼ（ＡＡＡ）ｃＤＮＡのクローニン
グ：
【００２８】実施例１に記載のｃＤＮＡライブラリーに
保存されたファージのプラークを形成後、プラークハイ
ブリダイゼーションにより、耐酸性α−アミラーゼのｃ
ＤＮＡを含むクローンの選択を行なった。この一連の操
作は“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”ｐｐ．６３
−６７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載の常法によった。プ
ラークハイブリダイゼーションに用いたプローブは、次
に示すアミノ酸配列から推定される塩基配列を合成して
プライマーとし、ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲ法に
より作製した。
保存されたファージのプラークを形成後、プラークハイ
ブリダイゼーションにより、耐酸性α−アミラーゼのｃ
ＤＮＡを含むクローンの選択を行なった。この一連の操
作は“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”ｐｐ．６３
−６７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載の常法によった。プ
ラークハイブリダイゼーションに用いたプローブは、次
に示すアミノ酸配列から推定される塩基配列を合成して
プライマーとし、ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲ法に
より作製した。
【００２９】 5′ 3′ Leu-Ser-Ala-Ala-Glu-Trp-Arg-Thr-Gln 5′ 3′ Ile-Glu-Asn-His-Asp-Asn-Pro-Arg
【００３０】この方法により約４５００個のプラーク中
から、上記のプローブにハイブリダイゼーションするポ
ジティブなクローン３個を選択し、これをＥ．ｃｏｌｉ
のプラスミドベクターｐＵＣ１１８に連結して、ｐＵＣ
１１８−ＡＡＡｃＤＮＡを得た。
から、上記のプローブにハイブリダイゼーションするポ
ジティブなクローン３個を選択し、これをＥ．ｃｏｌｉ
のプラスミドベクターｐＵＣ１１８に連結して、ｐＵＣ
１１８−ＡＡＡｃＤＮＡを得た。
【００３１】
【実施例３】 アスペルギルス・カワチの耐酸性α−アミラーゼ（ＡＡ
Ａ）ｃＤＮＡに含まれるコーディング領域のＤＮＡ配列
の決定：
Ａ）ｃＤＮＡに含まれるコーディング領域のＤＮＡ配列
の決定：
【００３２】実施例２に記載のｐＵＣ１１８−ＡＡＡｃ
ＤＮＡについてｃＤＮＡ由来のコーディング領域のＤＮ
Ａ配列を決定するにあたり、ｐＵＣ１１８−ＡＡＡｃＤ
ＮＡを各種制限酵素処理し、サブクローンを作製した。
このサブクローンをシークエンスすることにより、下記
の表１、表２で示される配列表の配列番号１に示される
ＤＮＡ配列を得た。この全ＤＮＡ配列は、２１４２ｂｐ
ｓであり、Ｍｅｔではじまる６７１アミノ酸からなるペ
プチドをコードするものである。
ＤＮＡについてｃＤＮＡ由来のコーディング領域のＤＮ
Ａ配列を決定するにあたり、ｐＵＣ１１８−ＡＡＡｃＤ
ＮＡを各種制限酵素処理し、サブクローンを作製した。
このサブクローンをシークエンスすることにより、下記
の表１、表２で示される配列表の配列番号１に示される
ＤＮＡ配列を得た。この全ＤＮＡ配列は、２１４２ｂｐ
ｓであり、Ｍｅｔではじまる６７１アミノ酸からなるペ
プチドをコードするものである。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
【実施例４】 活性アスペルギルス・カワチのα−アミラーゼ（ＡＡ）
を生産するサッカロミセス・セレビシアエの作製：
を生産するサッカロミセス・セレビシアエの作製：
【００３６】配列表の配列番号１に示したα−アミラー
ゼのコーディング領域を含む実施例２に記載されたｐＵ
Ｃ１１８−ＡＡＡｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡを酵母サ
ッカロミセス・セレビシアエの発現ベクターに連結し、
酵母に移入し、発現させることによりＡＡＡの分泌生産
が可能になる。
ゼのコーディング領域を含む実施例２に記載されたｐＵ
Ｃ１１８−ＡＡＡｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡを酵母サ
ッカロミセス・セレビシアエの発現ベクターに連結し、
酵母に移入し、発現させることによりＡＡＡの分泌生産
が可能になる。
【００３７】ｐＵＣ１１８−ＡＡＡｃＤＮＡクローンか
ら制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出したｃＤＮＡ（２．１ｋ
ｂｐｓ）を１％アガロースゲル電気泳動により分取後、
図１に示すように発現ベクターに連結した。使用したベ
クターはＭｅｔｈｏｄ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１
０１，ｐｐ．１９２〜２０１（１９８３）記載のｐＹＣ
ＤＥ１である。本ベクターは酵母で複製可能な２μＤＮ
Ａ、Ｅ．ｃｏｌｉのｐＢＲ３２２、標識遺伝子として酵
母ＴＲＰ１及び酵母のプロモーターとしてアルコール脱
水素酵素遺伝子（ＡＤＨ１）、ターミネーターとしてチ
トクロームＣＩの遺伝子（ＣＹＣ１）で構成されてい
る。異種ＤＮＡ挿入部位はＥｃｏＲＩ部位である。この
ベクターをＥｃｏＲＩで処理後、細菌のアルカリフォス
ファターゼを用いて５′末端のリン酸を除去し、これに
ＡＡＡのｃＤＮＡ断片を加えて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで
連結し、ｐＹＥＡＡを得た。
ら制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出したｃＤＮＡ（２．１ｋ
ｂｐｓ）を１％アガロースゲル電気泳動により分取後、
図１に示すように発現ベクターに連結した。使用したベ
クターはＭｅｔｈｏｄ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１
０１，ｐｐ．１９２〜２０１（１９８３）記載のｐＹＣ
ＤＥ１である。本ベクターは酵母で複製可能な２μＤＮ
Ａ、Ｅ．ｃｏｌｉのｐＢＲ３２２、標識遺伝子として酵
母ＴＲＰ１及び酵母のプロモーターとしてアルコール脱
水素酵素遺伝子（ＡＤＨ１）、ターミネーターとしてチ
トクロームＣＩの遺伝子（ＣＹＣ１）で構成されてい
る。異種ＤＮＡ挿入部位はＥｃｏＲＩ部位である。この
ベクターをＥｃｏＲＩで処理後、細菌のアルカリフォス
ファターゼを用いて５′末端のリン酸を除去し、これに
ＡＡＡのｃＤＮＡ断片を加えて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで
連結し、ｐＹＥＡＡを得た。
【００３８】次のこのｐＹＥＡＡをＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ
１０１に移入し、常法により大量に精製した。続いて精
製ｐＹＥＡＡをＩｔｏ等のＪ．ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
Ｖｏｌ．１５３，１６３〜１６８（１９８３）記載の方
法に従って酵母宿主ＤＢＹ７４６（ａ ｔｒｐｌ−２８
９ ｈｉｓ ３Δ１ ｌｅｕ ２−３−１１２ ｕｒａ
３−５２）に導入し、トリプトファン要求性が相補され
たことにより、トリプトファンを含まない培地において
生育可能な形質転換体（Ａ）を得た。この形質転換体を
次に示す組成の合成培地１００ｍｌに接種し、３０℃、
１２０時間、振とう培養した。
１０１に移入し、常法により大量に精製した。続いて精
製ｐＹＥＡＡをＩｔｏ等のＪ．ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
Ｖｏｌ．１５３，１６３〜１６８（１９８３）記載の方
法に従って酵母宿主ＤＢＹ７４６（ａ ｔｒｐｌ−２８
９ ｈｉｓ ３Δ１ ｌｅｕ ２−３−１１２ ｕｒａ
３−５２）に導入し、トリプトファン要求性が相補され
たことにより、トリプトファンを含まない培地において
生育可能な形質転換体（Ａ）を得た。この形質転換体を
次に示す組成の合成培地１００ｍｌに接種し、３０℃、
１２０時間、振とう培養した。
【００３９】合成培地：２％グルコース、０．６７％イ
ーストニトロゲンペース（ディフコ社製）、２４ｍｇ／
ｌウラシル、２４ｍｇ／１Ｌ−ヒスチジン、３６ｍｇ／
１Ｌ−ロイシン、ｐＨ５．７。
ーストニトロゲンペース（ディフコ社製）、２４ｍｇ／
ｌウラシル、２４ｍｇ／１Ｌ−ヒスチジン、３６ｍｇ／
１Ｌ−ロイシン、ｐＨ５．７。
【００４０】培養後、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心
分離によって集めた菌体を、あらかじめ冷却した乳鉢に
ガラスビーズ（直径約０．５ｍｍ）数ｇと一緒に加え、
これに液体窒素２０〜５０ｍｌを加え凍結させ、摩砕し
た。さらに同様に液体窒素を加え摩砕操作をさらに２回
繰り返した後、得られた摩砕菌体に０．２Ｍ酢酸緩衝液
１０ｍｌを加えた。得られた液を１５０００ｒｐｍ、１
０分間冷却遠心し、上清を分取した。その上清中のα−
アミラーゼ活性を測定し、下記表３に示した。
分離によって集めた菌体を、あらかじめ冷却した乳鉢に
ガラスビーズ（直径約０．５ｍｍ）数ｇと一緒に加え、
これに液体窒素２０〜５０ｍｌを加え凍結させ、摩砕し
た。さらに同様に液体窒素を加え摩砕操作をさらに２回
繰り返した後、得られた摩砕菌体に０．２Ｍ酢酸緩衝液
１０ｍｌを加えた。得られた液を１５０００ｒｐｍ、１
０分間冷却遠心し、上清を分取した。その上清中のα−
アミラーゼ活性を測定し、下記表３に示した。
【００４１】
【表３】
【００４２】
【実施例５】 形質転換体（Ａ）により得られたα−アミラーゼの耐酸
性：実施例４により得られたα−アミラーゼの各ｐＨに
て３０℃・３時間保持後のｐＨ安定性を図２に示す。ｐ
Ｈ２〜７の範囲で安定であった。
性：実施例４により得られたα−アミラーゼの各ｐＨに
て３０℃・３時間保持後のｐＨ安定性を図２に示す。ｐ
Ｈ２〜７の範囲で安定であった。
【００４３】
【実施例６】 形質転換体（Ａ）により得られたα−アミラーゼの耐熱
性：実施例４により得られたα−アミラーゼの各温度に
おける熱安定性を図３に示す。６０℃で６０分後すくな
くとも８０％の残留活性を有していた。
性：実施例４により得られたα−アミラーゼの各温度に
おける熱安定性を図３に示す。６０℃で６０分後すくな
くとも８０％の残留活性を有していた。
【００４４】
【実施例７】 形質転換体（Ａ）により得られたα−アミラーゼの生デ
ンプン分解活性：
ンプン分解活性：
【００４５】実施例４により得られたα−アミラーゼ
（７０ユニット／ｍｌ）５００ｍｌを５０ｍｇ生デンプ
ンと３０℃にて反応させて遊離してくる還元糖量をフェ
ノール硫酸法により測定した。還元糖の生成経時変化を
図４に示す。生デンプンが分解され遊離還元糖の生成が
確認された。
（７０ユニット／ｍｌ）５００ｍｌを５０ｍｇ生デンプ
ンと３０℃にて反応させて遊離してくる還元糖量をフェ
ノール硫酸法により測定した。還元糖の生成経時変化を
図４に示す。生デンプンが分解され遊離還元糖の生成が
確認された。
【００４６】
【発明の効果】本発明により、耐酸性α−アミラーゼ遺
伝子をコードする配列がはじめて明らかにされ、しかも
酵母においてこれを発現せしめることに成功した。
伝子をコードする配列がはじめて明らかにされ、しかも
酵母においてこれを発現せしめることに成功した。
【００４７】この耐酸性α−アミラーゼは、耐酸性のほ
かに耐熱性及び生デンプン分解性も併有しており、各種
の用途に広く利用することができる。例えば、本遺伝子
で形質転換したサッカロミセス・セレビシアエを用いる
と、酸性条件下で、直接デンプンを原料にして糖化、ア
ルコール発酵を行うことができ、アルコールや酒類製造
の省力化が図られる。
かに耐熱性及び生デンプン分解性も併有しており、各種
の用途に広く利用することができる。例えば、本遺伝子
で形質転換したサッカロミセス・セレビシアエを用いる
と、酸性条件下で、直接デンプンを原料にして糖化、ア
ルコール発酵を行うことができ、アルコールや酒類製造
の省力化が図られる。
【図１】α−アミラーゼ発現用プラスミドｐＹＥＡＡの
構築図である。
構築図である。
【図２】形質転換体により得られたα−アミラーゼのｐ
Ｈ安定性を示す。
Ｈ安定性を示す。
【図３】形質転換体により得られたα−アミラーゼの熱
安定性を示す。
安定性を示す。
【図４】形質転換体により得られたα−アミラーゼの生
デンプン分解活性を示す。
デンプン分解活性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者 金子 明裕 東京都北区滝野川１丁目54番18号 株式会 社醸造資源研究所内 (72)発明者 田村 學造 東京都北区滝野川１丁目54番18号 株式会 社醸造資源研究所内
Claims (7)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に示す塩基配列。
- 【請求項２】 該塩基配列が、アスペルギルス・カワチ
のα−アミラーゼｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ配列で
あること、を特徴とする請求項１に記載の塩基配列。 - 【請求項３】 請求項１又は請求項２に記載の配列を含
んでなる、サッカロミセス・セレビシアエのベクター。 - 【請求項４】 請求項３に記載のベクターをサッカロミ
セス・セレビシアエに移入してなる、耐酸性α−アミラ
ーゼ生産能を有する形質転換体。 - 【請求項５】 請求項４に記載の形質転換体を培養する
ことを特徴とする耐酸性α−アミラーゼの製造方法。 - 【請求項６】 α−アミラーゼが、耐酸性、耐熱性及び
生デンプン分解能を有する酵素であること、を特徴とす
る請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 α−アミラーゼの耐酸性が、ｐＨ２〜７
の範囲で安定であり、耐熱性が、６０℃で６０分後の残
留活性が少なくとも８０％であること、を特徴とする請
求項６に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5265447A JPH0799979A (ja) | 1993-09-30 | 1993-09-30 | 新規遺伝子、それを用いた形質転換体及び その利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5265447A JPH0799979A (ja) | 1993-09-30 | 1993-09-30 | 新規遺伝子、それを用いた形質転換体及び その利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0799979A true JPH0799979A (ja) | 1995-04-18 |
Family
ID=17417288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5265447A Pending JPH0799979A (ja) | 1993-09-30 | 1993-09-30 | 新規遺伝子、それを用いた形質転換体及び その利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0799979A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100415879C (zh) * | 2005-06-22 | 2008-09-03 | 天津科技大学 | 耐酸耐高温的α-淀粉酶及其制备方法 |
| US7498159B2 (en) * | 2004-05-27 | 2009-03-03 | Genencor International, Inc. | Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus |
| US9670509B2 (en) | 2003-03-10 | 2017-06-06 | Novozymes A/S | Alcohol product processes |
| CN109679937A (zh) * | 2019-01-07 | 2019-04-26 | 安徽大学 | 一种具有高比酶活力的生淀粉水解酶、其编码基因及其应用 |
-
1993
- 1993-09-30 JP JP5265447A patent/JPH0799979A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9670509B2 (en) | 2003-03-10 | 2017-06-06 | Novozymes A/S | Alcohol product processes |
| US7498159B2 (en) * | 2004-05-27 | 2009-03-03 | Genencor International, Inc. | Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus |
| CN100415879C (zh) * | 2005-06-22 | 2008-09-03 | 天津科技大学 | 耐酸耐高温的α-淀粉酶及其制备方法 |
| CN109679937A (zh) * | 2019-01-07 | 2019-04-26 | 安徽大学 | 一种具有高比酶活力的生淀粉水解酶、其编码基因及其应用 |
| CN109679937B (zh) * | 2019-01-07 | 2022-06-07 | 安徽大学 | 一种具有高比酶活力的生淀粉水解酶、其编码基因及其应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20040105 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040127 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040105 |
|
| A072 | Dismissal of procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A073 Effective date: 20041012 |