JPH02119779A - 新規遺伝子、ベクター、それを用いた形質転換体及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、７スベルキルス・シロウサミから４１）られ
だ新規グルコアミラーゼ遺伝子、これを含む／＼クター
、そのベクターをアスペルギルス・オリゼー又はサッカ
ロミセス・セレビシアエに移入した形質転換体及びその
利用に関するものである。

アスペルギルス・シロウサミのタルコアミラセは生澱粉
を分解することかできるので、これを産生ずる遺伝子を
含むベクターで形質転換したアスペルギルス・オリゼー
やサッカロミセス・セレビシアエを用いれは生澱粉から
酒類、アルコール等を製造することかできるようになり
、発酵−に業界に大いに貢献するものである。

（従来技術及び問題点） 一般にグルコアミラーゼはデンプンを非還元性末端から
グルコース単位で分解する酵素であって、動物、植物及
び微生物に広く分布し、産業上は酒類醸造をはしめ糖類
製造等においてデンプンを糖化する工程で広く利用され
ている。

現在、清酒醸造あるいは醤油、味噌の醸造に用いられて
いるグルコアミラーゼはアスペルギルス・オリゼーある
いはアスペルギルス・ソヤエの生産する酵素であって、
これらの微生物において、グルコアミラーゼは培養基」
ρ当り数ｇが分泌生産される。しかし、アスペルギルス
・オリゼーの分泌生産するグルコアミラーゼは最適反応
温度が５５℃、反応ｐ）１４．３〜６．０であり、ｐＨ
４，０以下では反応しないという性質をもち、また、生
デンプンに対する分解力がないため基質デンプンは蒸煮
等によってα化しなければならないのである。

近年、醸造原料の多様化及び醸造技術の進展に伴ない、
デンプン粘化に用いるアスペルギルス・オリゼーについ
ても自・１熱性及び耐酸性かあって。

より酸性側でかつ高温域で働くグルコアミラーゼを生産
する株が必要となっている。また、省エネルギーと］−
程の簡略化のために、無蒸煮の生テンブン原料を糖化て
きるグルコアミラーゼの生産が４くめられている。しか
し、これらの必要性にもかかわらず、耐熱性、耐酸性及
び生デンプン分解力も兼ね備えたグルコアミラーゼを生
産する能力を有するアスペルギルス・オリゼーは現在ま
で分離されていない。

一方、焼酎醸造等で広く利用されているアスペルギルス
・シロウサミの分泌生産するグルコアミラーゼはアスペ
ルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼに比較して耐熱
性及び耐酸性が高く、最適反応温度が７０℃、反応ｐ＋
＋もｐＨ３，２〜７．５と広範囲にあり、　ｐＨ４，０
以下の酸性域においても反応する。

また他の種のアスペルギルス属のグルコアミラーゼにな
い顕著な特徴として、アスペルギルス・シロウサミのグ
ルコアミラーゼは生デンプン分解力を有することが挙げ
られ、本酵素の焼酎醸造以外の分野への利用に期待がか
けられているのである。

また、こｊしとは別に酵母サッカロミセス・セレビシア
エは酒類醸造をはじめとするアルコール発酵に広く利用
されている微生物であるが、グルコアミラーゼ生産能を
有しないため、直接デンプンを原料番こして、アルコー
ル発酵を行うことができない。しかし、近年、醸造工程
の簡略化などの目的から、直接デンプンを原料とするエ
タノール発酵が注目されており、グルコアミラーゼの中
で特に生デンプンを糖化できる酵素を生産できるサッカ
ロミセス・セレビシアエが求められているが、まだ、そ
の目的に叶った株の分離はなされていなし）。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らはアスペルギルス・シロウサミのグルコアミ
ラーゼ遺伝子に着目し、アスペルギルス・シロウサミの
ゲノムＤＮＡ制限酵素断片からグルコアミラーゼをコー
トするＩ）ＮＡ断片をクローン化し、こ九をアスペルギ
ルス・オリゼーの宿主ベクター系に移入することにより
アスペルギルス・シロウサミの生産すると同等のグルコ
アミラーゼを生産する形質転換体（Ａ）を得ることがで
きた。

さらに、アスペルギルス・シロウサミの全ｍＲＮＡを調
製し、これに基づいてｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライ
ブラリーを作製し、その中からアスペルギルス・シロウ
サミのグルコアミラーゼをコードするクローンを分離す
ることができた。そして、このｃＤＮＡを発現ベクター
に連結した後サッカロミセス・セレビシアエに移入する
ことにより、アスペルギルス・シロウサミと同等のグル
コアミラーゼを生産する形質転換体（Ｂ）を得ることが
できた。

また、ここで得られた形質転換体によって生米を原料に
用いたエタノール発酵を行ったところ、形質転換体（Ａ
）により無蒸煮原料米を直接糖化することが可能である
こと、更に、形質転換体（Ｂ）を使用することにより、
無蒸煮米を原料に他の一切のグルコアミラーゼの添加を
必要としないエタノール発酵が可能であることを見出し
、本発明を完成するに至った。

本発明は、 （１）アスペルギルス・シロウサミから単離したプロモ
ーターを含むグルコアミラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列。

（２）この（１）のグルコアミラーゼ遺伝子の１）ＮＡ
配列を連結したアスペルギルス・オリゼーのへフタ（３
）　（２）のベクターをアスペルギルス・オリゼーに移
入することによって得られる耐熱性、耐酸性及び生テン
ブン分解力をイ１するグルコアミラーゼを分泌生産する
形質転換体。

（４）アスペルギルス・シロウサミのグルコアミラーゼ
のｃＤＮＡの配列。

（５）　（４）のＣＤＮＡを含むサッカロミセス・セレ
ビシアエのグルコアミラーゼを分泌させるベクター（６
）　（５）のベクターをサッカロミセス・セレビシアエ
に移入することによって得られる耐熱性、耐酸性及び生
デンプン分解力を有するグルコアミラーゼを分泌生産す
る形質転換体。

＜７）　（３）あるいは（６）の形質転換体を用いるこ
としこよって酒類、アルコール等を製造する方法。

である。

（、；を細な説明） 本発明に用いたケノムＤＮＡ及びｍＲＮＡの供与体はア
スペルギルス・シロウサミであり、具体的には例えはＲ
ＩＢ２５０４株である。

本菌株からケノＡ　ＤＮＡを抽出するには、たとえば八
Ｂ＋ｙｊｃ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃ１＋ｅｍ、、　　Ｖ
ｏｗ、　　５１．　３２：ｌ−３２８（１９８７）に記
載されたアスペルギルス・オリぜ−の染色体１）ＮＡの
抽出に関する方法に準じて行われる。

次に、得られたケノｌい１）ＮＡを適当な制限酵素で処
理し、ｐｉ（（分分解を行った後蔗糖密度勾配超遠心θ
、で分画して２０Ｋｂｐ〜４０Ｋｂｐの断〕−°１を得
る。同じ接不末端を生じさせる制限酵素で処理したファ
ージに−１、記て得Ｉ′：、れた１）ＮＡ断片を挿入し
て染色体シンライフラリ−を作製する。当該ファージと
してはＦ、ＭＢＬ：（（，１、Ｍｏ　ｌ　、旧ｏ１．．
　Ｖｏｗ、、　１．７０，８２７−８４２（１！１８３
））が用いられる。また、サックローンにはＭｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏＪｏｇｙ　Ｖｏｌ、　１５３
．３−１１（１９８７）に記載のＰＵＣ］］８を用いた
。

」ユ記で得られた染色体シーンライフラリ−からの当該
遺伝ｒ・の単離にあたっては、アスペルギルス・シロウ
サミと同居のアスペルギルス・二カーのグルコアミラー
ゼ遺伝子のＤＮＡ配列（ｌｉＭＢｏ　、１．。

Ｖｏｌ、３１５８１〜１５８５（＋９８４））に基づい
て合成オリ」マーを作成し、それをプローブに用いてプ
ラーク・ハイブリダイゼーションを行ないアスペルギル
ス・シロウサミのグルコアミラーゼ遺伝子のＤＮＡをク
ローニングする。得られたＤＮＡ断片は第１図のＤＮＡ
配列を有していた。

上記で得られたＤＮＡ断片をアスペルギルス・オリゼー
のベクターとして例えばＡ　ＲＧ　Ｂ遺伝子をマカーに
持つｐＲＢＭｌ　（Ａｇｒｉｃ、　ｌ１ｊｏ１．　Ｃｈ
ｅｍ、、　Ｖｏｌ、　５３゜２５４９〜２５５５（１９
８７）に挿入し、得られたＤＮＡｔ！：す叩１）欠損株
のアスペルギルス・オリゼーに移入し形質転換体を得る
。ａｒ３Ｂ欠損株として、さらに具体的にはトン−３株
（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、
　５３．２５４９）があげられる。形質転換方法として
は公知の方法たとえばＡｇｒｉｃ、　Ｂ」ｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ、、　Ｖｏｌ。５１，３２３−３２８（１９８７）
に記載された方法あるいはこれに７９１シた方法がとら
れる。

後述の実施例で製造された形質転換体（Ａ）は、ＦＵＡ
（Ｍ　Ｉ）−１０３２９として微工研に寄託されている
。

アスペルギルス・シロウサミから得られたグルコアミラ
ーゼ遺伝子を含む１）ＮＡ断ノ１．かアスペルギルス・
オリゼーで機能するブ［Ｉモーターを含むことは次に記
載する方法によ−って確認できる。すなオ〕ちＧｅｎｅ
、　Ｖｏｌ、、２８．３５］−３５９（１９８４）の方
法に準してゲルコアミラー遺伝子のさらにト流部位をエ
キソヌクレアー七■で消化し、生した１本鎖部分をマン
グビーンのスクレアーセで消化して得られた」、流部の
一部か脱落した１）ＮＡ断片をｐＲＢＭｌに挿入した後
、アスペルギルス・オリゼーのａ−ｒ、Ｈ，Ｂ株に移入
することしこより、グルコアミラーゼか生成されないこ
とによ−〕で確認できる。

次に−１−起て得られた形質転換体がアスペルギルス・
シロウサミと同等の耐熱性、耐酸性及び生テンブン分解
力をイ」するグルコアミラーゼを生産することの確認方
法を記載する。

即ち、形質転換体を米製生デンプンを唯一の炭素源とす
る培地で培養し、得られた培養液中に含まれる酵素の耐
熱性、耐酸性及び生デンプン分解力を測定する。酵素活
性の測定は公知の方ａζたとえば国税庁所定分析法注解
に記載の方法による。

さらに、形質転換体かアスペルギルス・シロウサミと同
等のグルコアミラーゼを生産するかどうかは、次に記載
の方法によって確認することができる。すなわち、アス
ペルギルス・シロウサミの生産するグルコアミラーゼを
精製し、得られたグルコアミラーゼを用いてポリクロー
ナル抗体を作製し、この抗体と形質転換体の培養酸中の
タンパク質との抗原−抗体反応を公知の方法たとえばオ
フタロニー法によって判定する。

アスペルギルス・シロウサミからの全ｍ　ＲＮ　Ａの抽
出及び、それに基づ＜　ｃＤＮＡライブラリーの作製は
次に記載する方法による。

即ち、デンプンを唯一の炭素源とすることによリグルコ
アミラーゼ生産の誘導がかかる培地において培養したア
スペルギルス・シロウサミの菌体から実施例で後述する
方法により全１ｉＮＡを抽出する。得られた全ＲＮＡか
らＰｒｏｃ、Ｎａｔ］、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

Ｖｏｗ、　６９．１４０８−１４１２（１９７２）に記
載の方法によりポリΔ含有ＲＮ　Ａをオリゴ（ｄｌ）−
セファロースを用いて精製し全ｍ　ＲＮ　Ａを得る３、
この全ｍ　ＲＮ　ＡからｃＤＮＡをりリタ、Ｖｏｗ、　
２５．２６３〜２６！］（１９８３）に記載の方θミで
合成し１，５ｃｊｅｎ（、ｅ、　Ｖｏｗ、　２２２．７
７８−７８２（１９８３）に記載の方法でファージＤＮ
Ａ　２４ｔ　１．０に挿入し、１ｎｖｊ　ｔｒｏでパッ
ケージを行った後ｃＤＮＡのシーンライブラリーを作製
する。

Ｌ記で得られたシーンライブラリーから、当該グルコア
ミラーゼ遺伝子ｃＤＮＡのクローニングは、前述のアス
ペルギルス・シロウサミの染色体ジーン・ライフラリ−
からｌｉ離したグルコアミラーゼ遺伝子をブローンに用
いたプラークハイフリタイセーションによって行なう。

単離された当該グルコアミラーゼ遺伝子ｃＤＮＡに含ま
れるコーディング領域は第２図の１）ＮＡ配列を有して
いた。

次に、得られたアスペルギルス・シロウサミのグルコア
ミラーゼ遺伝子のｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビシ
アエの発現ベクター、例えば酵母アルコルテヒ１−ロゲ
ナーゼ遺伝子（ＭＤＩＩＩ）プロモータを持つ酵母発現
ベクターｐＹＣＤＥ　ｌあるいはｐＡＡＩ＋５に挿入し
、サッカロミセス・セレビシアエに移入することにより
、それぞれ形質転換体（旧）あるいは（Ｂ２）を作製す
る。形質転換方法としては、公知の方法たとえばＪ、　
Ｂａｃｔｅｒｊｏｌ、　Ｖｏｗ、　１５３，１６３−１
６８（１９８３）に記載された方法あるいはそれに準し
た方法がとられる。

後述の実施例で製造された形質転換体（＋１）はＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−１０３３０として微工研に寄託されている。

−に記で得られた形質転換体（Ｂ）がアスペルギルス・
シロウサミと同一のグルコアミラーゼを生産するかどう
かは前述のアスペルギルス・オリゼーを宿主にした場合
のグルコアミラーゼを確認する方法と同様の方法で確認
する。

次に、形質転換体（Ａ）を蒸米」二で生育させ、分生胞
子を形成させ、得られた分生胞子を用いて公知の方法に
よって米麹を製造し、これに水、酵母及び破砕した生米
を加え、生米中の生デンプンを糖化し、次いで発酵させ
ることにより、酒類、エタノール等を製造する。

また、本形質転換体（Ａ）又は（Ｂ）を用いることによ
り各種生デンプンを糖化することが可能である。

次ぎに本発明の実施例を示す。

実施例１゜ 染色体ＤＮＡのシーンライブラリーの作製アスペルギル
ス・シロウサミＲＩＢ２５０４の分生胞子１白金耳をデ
キス１へリン・ペプＩ・ン培地（２％テキス１−リン、
１％ポリペプトン、０．５％旧＋２ＰＯ４，０，１％Ｎ
ａＮ０＋、　０．０５％閃ｇｓ０４）　２００ｎ＋Ｑに
接種し、３０°Ｃ１４０時間、回転振盪培養後、得られ
た菌体を３０１ガラスフイルターで集めた。次にこの菌
体を細胞壁溶解酵素を含むプロ１へプラス１〜調製用溶
液（５０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐｌ＋６．０）　５．０％
ＮａＣ１）に懸濁し、３５°Ｃ１２時間、振盪して、細
胞壁を溶解することによりプロトプラス１−化した。得
られたプロ１〜プラス１−を３０００　ｒ　ｐ　ｍ、１
０分間遠心分離することにより狽めた。このプロ１−プ
ラス１−を５％ＮａＣ］溶液で洗浄後、５％５Ｉ）Ｓ　
を含む５０ｍＭ　ＴｒｊｓｉｌＣｌ（ｐＨ８，０）に懸
濁し、溶菌した。得られた溶菌液を１５００ｏｒｐｍ、
１０分間冷却遠心分離後、−１−清を取得した。その」
二清を痔量のフェノールで２回、続けて等量のタロロホ
ル１１て２回処理して、夾雑するタンパク質を除去後、
２容の冷エタノールを加え核酸分な沈殿させた。この沈
殿を凍結乾燥後、’Ｉ’　Ｅ溶液に溶解し、１）Ｎ　Ａ
溶液とし、た。得られたＩ）ＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａ
で部分の解後１分解断ハを１３へ２０％の蔗糖密度超遠
心分離にかけ分画して２０〜４０Ｋｂｐ断ノ“１メ１分
を集めた。この断ノｉ区分をファージλ［４Ｍ１１１．
：１−１１＋ｍ１ｌｌアー１、（東洋紡（株））に１４
リカーセを用いて連結し、１；）られたファージＤＮＡ
をｉｎシｊｔｒｏパソケーシンクキソＩ〜（キカバック
コールド（東洋紡績（株）販売））を用いてバソケーシ
ンク後、ｌｉ、ｃｏｌｊ　ｍｌミニ（９２に１−ランス
フエクションし、染色体１）ＮＡのシーンライブラリー
とした４゜ 実施例２゜ 染色体ＤＮＡのシーンライフラリ−からのアスペルギル
ス・シロウサミのグルコアミラーセ（以ド、ＡＳｆｉど
もいう）遺伝子のクローニンク実施例１に記載の染色体
１）ＮＡのジーンライフラ」−に保存されたファージの
プラークを形成後、ブラークハイプリダイセーションに
よりＡＳＧ遺伝イを含むクローンの選択を行った。この
一連の操作は常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ＋　ｐｐ６３−６７、　Ｃｏｌｄ８ｐｒｉｎｇ　１ｌ
ｉｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））によ
った。ブラークハイプリダイセーションに用いたプロー
ブは次の配列を持つ合成オリゴマー（４５ｍｅｒ）を３
２１１で放射能標識したものである。

５　′ＧＡＧ（ｉＡｃＡｃ（ｉＴＡＣＴＡＣＡＡＣＧＧ
ＣＡＡＣＣＣｃｉ　１’　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＣｌ’　
Ｇ　ｉ’　Ｇ　ＣＡ　ＣＣＴ　Ｔ　Ｇ　３　′５　′Ｇ
ＴＧＡｉ’ＴＴＣＣＡＡＧＣＧＣＧＣＧＡＣＣＴＴ［１
ＧＡ１’　Ｔ　ＣＡ　１’　Ｇ　（コ１゛Ｔ６八６Ｃ八
八ＣＧ八八　３　′５　′　乙Ａ（ｉ（ｉＣＧ’ｌ’Ｇ
ＣＧＧＡＡＣＧｉ’ＣＧＡＣＣＧＣＧＡＣＣ：（ｙ１’
ＧＡＣｒＧＡＣＡＣＣＴＧ（、ＣＧＧ　’、）　′約２
（１，０００個のプラークの中から、」−記３種類のプ
ローブすべてが、ハイブリダイゼーションする１２個の
クローンを選択できた。これらのクローンの中に挿入さ
れているアスペルギルス・シロウサミ由来のＤＮＡ断）
４のうち最も長い断片を各種制限酵素で消化し、上記３
３種類のプローブを用いてサザンハイフリダイゼーショ
ンを行ったところ、１・”ｃｏＲＩで消化して得られた
断片の中に上記の３種類プローブのすべてにハイブリダ
イゼーションの見られる５、４ＫｂｐのＤＮＡ断ハを得
た。このＤＮＡ断片をＥ、ｃｏｌｉのグラスミ１〜ベク
ターｐＵｃ］］８に連結し、４３°ブクローンｐｕｃ１
１８−１０Ｅ２を得て、第５図に示す如く、当該挿入断
）′ｌの制限酵素切断地図を作製した。

実施例３゜ 染色体ＤＮＡから＋４を離したアスペルギルス・シロウ
サミのグルコアミラーセ（ＡＳＧ）遺伝子のＤＮＡ配列 実施例２で得られたｐＵｃ１１８−］ＯＥ２に挿入され
ているアスペルギルス・シロウサミ由来の５．４にｂｐ
挿入断片のＤＮＡ配列を次の方法により決定した。

先ずＧｅｎｅ、　Ｖｏｌ、　２８．３５１−３５９（１
９８４）及びＧｅｎｅ。

Ｖｏｌ、３３．１０３−１１９（１９８５）の方法に従
ってｐｌＪｃ＋１８１０１Ｅ２Ｊ−の５　、４　Ｋ　ｂ
　、、挿入部分をエキソヌクレアーゼ■及び、マンクビ
ーンヌクレアーゼで処理して短鎖化し、当該挿入断片の
一部が脱落し、異なる鎖長を持った種々のクローンを作
製した。この過程ではキロシーフェンス用デレージョン
キット（宝酒造（株））を使用した。得られた種々のク
ローンの挿入断片についてジテオキシ法（Ｓｃｊｅｎｃ
ｅ　２ＩＣ１２０５〜１．２１０（１９８１））により
α−１２ＰｄＣ１’ｐを用いてＤＮＡ配列を決定した。

なお、この決定には旧３シークエンジンクキソ［〜（東
洋紡Ｍ（株）製）を用いた。その結果、アスペルギルス
・シロウサミのグルコアミラーゼ遺伝子のコーディング
領域及びその介在配列の全部ならびにコーティング領域
に隣接する」−流及び下流領域の一部のＤＮＡ配列につ
いて第１図に示す配列が見出された１、 実施例４゜ 括性アスペルギルス・シロウサミクルコアミラーセ（Ａ
ＳＧ）を分泌生産するためのアスペルギルス・オリゼー
で機能するベクターの構築 実施例２で述へたｐＵｃ］　１８　］０Ｅ２１；ｔ、Ａ
ｓＧ遺伝子を含むと見られる両端にｌ＜ｃｏ旧末端を持
った第１図の配列を含む５．４ＫｂｐのＤＮＡ断片Ａ（
以下、配列Ａともいう）をアスペルギルス・オリゼーで
複製可能なベクターｐＲ１’旧（４Ｈｒｉ　ｃ　、　ｌ
ｌ−１ｏ↑、　Ｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ、５１．３２３〜３
２８（１９８７））に次の方法で連結した。ｐＵｃ］］
８１０Ｅ２　］０７ｚｇをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し
た後、１％アガロース電気泳動にかけ５．４Ｋｂｐ断片
を分離し、アガロースゲルを凍結融解後ＴＥ温溶液］Ｏ
ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ−、１ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ
７，５）に回収した。一方、ｐＲＢＭｌ　２μｇをＥｃ
ｏＲＩ制限酵素で消化した後、次の連結操作でｐＲＢＭ
　ｌ自体の自己連結を防ぐ目的で得られた断片の５′末
端のリン酸を除去するため、細菌アルカリフォスファタ
ーゼ（ＢＡＰ）で処理した。

上記の５．４Ｋｂｐ断片とＥｃｏＲＩで切断したｐｌｔ
ＢＭｌを７４ＤＮＡリガーゼで連結し、第３図に示すベ
クターｐＳＧＯＩを得た。このベクターはＥ、ｃｏｌｉ
のベクターｐＢＲ３２２を含んでいるため、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　ＪＡ２２１に移入することにより、アンピシリン耐
性を有する形質転換体を作製し、ｐｓＧＯＩを大量に取
得することができる。

実施例５゜ 活性アスペルギルス・シロウサミのグルコアミラーゼ（
ＡＳＧ）を分泌生産するアスペルギルス・オリゼーの作
製 実施例３で見出されたＡＳＧ遺伝子に相当するＤＮＡを
含む配列Ａはコープインク領域の開始コ１−ンＡＴＧ上
流に約２．４ＫｂｐのＤＮＡか存在し、プロモーター領
域を含む可能性が強いこと、かつＡＳＧは分泌型の酵素
であることから、実施例４で示した配列Ａを含むｐｓＧ
Ｏ］をアスペルギルス・オリゼーに移入することにより
ＡＳＧの分泌生産されることが予想される。そこで次の
ようにｐｓＧＯＩのアスペルギルス・オリゼーへの移入
を行った。

アスペルギルス・オリゼーのアルギニン要求性株（ｇｒ
、ＨＢ）をデキス１へリン・ペグ１〜ン培地（デキスト
リン２％、ポリペグ１−ン］％、にＨ２ＰＯ４０，５％
、ＮａＮＯ３０，１％及びＭｇ５０４０．０５％を含む
）で３０℃、４８時間振盪培養した後、得られた菌糸を
無菌水で洗浄した。この菌糸を細胞壁溶解液（ｐＨ６，
０５０ｍＭリン酸緩衝液、５．０％ＮａＣ］、　０．５
ｍｇ／ｍｆｆエルスコビア酵素を含む）に懸濁し、３０
°Ｃ，２時間振盪することによりプロ１−プラスト化を
図った。得られたプロトプラス１〜をガラスフィルター
で濾過することにより残存する菌糸を除去した。次にこ
のプロトプラスｌ−１，、ＯＸ　１０８個を５．０％Ｎ
ａＣ１及び１０ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−■ｃＩ（ｐＨ７，５）１００μＭに懸濁し、これ
にρ５ＧＯＩ　ｔｏμｇを加え室温に５分間放置した後
、等量のＰＥＧ溶液（７０％ポリエチレングリコール４
０００．５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐｉ４７．５）
　１０ｍＭ　ＣａＣ１，を含む）を添加し室温に１０分
間放置した。得られたプロトプラストを５％ＮａＣ１で
洗浄後５．０％ＮａＣ１を含むツアペック・ドックス培
地（ＮａＮＯ３０，２％、　Ｋ２ＨＰＯ４０，１％。

Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，００，０５％、　ＫＣＩ　０．０５
％、　Ｆｅ５０４０．００１％。

グルコース２％、　ｐｕｓ。５）の平板上に塗布し、そ
の上に５．０％ＮａＣ１を含む０．５％寒天を重層し、
３０℃で培養した。ｐｓＧｏ　］はアルギニン要求性（
ａｒｇＢ）を相補する遺伝子を含んでおり、形質転換体
は最小培地（ツアペック・ドックス培地）で生育するこ
とができた。得られた形質転換体をデキストリン・ペプ
トン培地あるいは生デンプン培地（米製生デンプン及び
ツアペック培地と同様の窒素源、無機塩を含む培地）に
おいて３０℃でそれぞれ４０時間あるいは７２時間振盪
培養して得られた培養液中のグルコアミラーゼ活性を測
定した。結果を第１表に示した。

実施例６゜ 形質転換体（Ａ）がアスペルギルス・シロウサミと同等
のグルコアミラーゼを生産することの確認。

アスペルギルス・シロウサミのグルコアミラーゼ活性を
導入した形質転換体（Ａ）中で、アスペルギルス 確かに発現分泌されていることを確認するために、アス
ペルギルス・シロウサミのグルコアミラーゼのポリクロ
ーナル抗体を用いて抗原−抗体反応（オフタロニー法）
を行った。

寒天を０．７％含むｐｎｓ溶液（ＮａＣ１　８ｇ．　Ｋ
Ｃ］−　０．２ｇ、Ｎ＋＋，ＩＩＩコ０，、＋２１Ｌ０
　２．！ｉｇ．Ｋｌｌ□１１０．，　０．２，−をＩＱ
の水に溶かしたもの。）を５分間オー１−クレープを行
い、シャーレ中に厚さ約５＋ｎｍになるように流し込み
固化させた後、直径１ｃｍの穴を１ｃｍの間隔で数ケあ
ける。次に実施例５て得られた培養液を中心に、その周
囲にアスペルギルス・シロウサミのタルコアミラーゼを
抗原として得られたウサギ・ポリクローナル抗体を適宜
希釈したものを各々の穴に添加する。本プレー１−を；
３７°Ｃにて２４時間インキコヘトした後、抗原−抗体
の交差反応をみたところ、）］　Ｓ　Ｇ　＋１を有する
形質転換体（Ａ）に対しては強い交差がみられたか、ベ
クターのみの形質転換体に対しては全く交差反応かみら
れなかった。

以１−のことから、形質転換体（Ａ）がアスペルギルス
・シロウサミと同等のタルコアミラーゼを生産している
ことが抗〃；（−抗体反応を用いることによりイイ［認
できた。

実施例７゜ アスペルギルス・シロウサミのタルコアミラーセ（ＡＳ
Ｇ）遺伝子のプロモーター領域の削除実施例５記載のＡ
ＳＧ遺伝子を含む５．４ＫｂｐのＩＩＮＡ断Ｊ’ｌ’Ａ
はコーティング領域の開始コ１ヘンのＡ’ｒｃ上流に約
２．４ＫｂｐのＤＮＡを持つ。実施例５で示すＡＳＧの
アスペルギルス・オリゼーにおける分泌生産にはこの２
．４にｂ＋）　＋１　Ｎ　Ａに含まれるプロモーターが
関与している可能性がある。この２．４Ｋｂｐ　ＤＮＡ
の一部を削除することによるアスペルギルス・オリゼー
におけるＡＳＧの分泌生産を図った。２．４Ｋｂｐ　Ｄ
ＮＡの一部削除は次のように行った。その概略を第６図
に示す。即ち、実施例］に記載のＤＮＡ断片Ａを含むｐ
Ｕｃｌ］８−］０１ｉ２を制限酵素Ｂａｍ１ｌＪとＰｓ
ｔＩで二重切断を行った。得られたＤＮＡ断片をエキソ
ヌクレアーゼＩＩ＋で１〜１０分間処理してＢａｍｔｌ
Ｉ末端の３′側の鎖を切断した後、残った５′側及びＰ
ｓｔＩ末端の３′側の１本鎖部分をマングビーンヌクレ
アーゼで消化して除去し、末端を平滑化した後、Ｔ４　
ＤＮＡリガーゼで平滑末端を連結し、環状プラスミドを
得た。このプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１に形
質転換し、２．４ＫｂｐＤＮＡの一部が種々削除された
クローンを取得した。なお、この一連の削除にはキロシ
ーフェンス用テレージョンキット（宝酒造製）を用いた
。得られた種々のクローンからブラスミ１−を調製し、
それらを制限酵素ＥｃｏＲＴとＸｂａＩで二重切断した
後、挿入断片の長さをアガロースゲル電気泳動法で比較
することにより６種類の代表的なりローンＤｌ〜Ｄ６を
選択した。ＤＩ−Ｄ６の挿入断片の長さはＤＩ　４．９
Ｋｂｐ、　Ｄ２４．４Ｋｂｐ、　Ｄ３４．０Ｋｂｐ、ｌ
）４３．７Ｋｂｐ、　Ｄ５３．４にｂｐ及びＤ６３．］
Ｋｂｐてあった。これらはいずれもＤＮＡ断片Ａにおい
てＡＳＧ遺伝子の開始コドンＡＴＧのヒ流の一部が削除
されたものである。旧〜Ｄ６のそれぞれ両末端をに１　
ｅ　ｎ　ｏ　ｗ酵素で処理して、平滑化した後、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼＥｃｏＲＩリンカ−を連結し、これらを実
施例５に記載したｐＲｌｌＭＩのＥｃｏＲＩ部位に挿入
し、プラスミドｐｓＧＯＩ−旧、ｐｓＧＯＩ　−１）２
、ｐｓＧＯＩＤ３、ｐｓＧＯＩ−Ｄ４、ｐｓＧＯＩ−Ｄ
５及びｐｓＧＯＩ−Ｉ）６を得た。

これらのプラスミドを実施例５で記載の方法と同様にア
スペルギルス・オリゼーのアルギニン要求性株（σ４Ｈ
１ｌ）に移入しＡＳＧ遺伝子のコーティング領域を含む
にもかかわらず、ＡＳＧの分泌生産が一切見られない形
質転換体を得る。

実施例８゜ アスペルギルス・シロウサミのｃＤＮＡライブラリーの
作製。

アスペルギルス・シロウサミＲＩＢ２５０４の分生胞子
１白金耳をデンプン・ペグ１ヘン３２’４地（２％コー
ンスターチ、１％ボリペプ１−ン、０．５％に＋１２１
１０４．０．１％ＮａＮ０Ｊ、０．０５％ＭＢＳＯ，）
２００ｍＱに接種し、３０℃、２４時間、回転振盪培養
後、得られた菌体を３ＧＩガラスフイルターで集め、水
洗した。次にこの菌体をあらかしめ冷却した乳鉢にガラ
スピーズ（直径約０．５Ｉ＋＋ｍ）数ｇと一諸に加え、
これに液体窒素２０〜５０ｍＱを加え、凍結させ、磨砕
した。さらに同様に液体窒素を加え、磨砕操作を更に２
回繰り返した後、９１）られた破砕菌体に６Ｍグアニシ
ンチオシア不一１・水溶液１０ｍＱを加え、これに等量
のフェノールを添加した後、約５分間振盪した。この混
合液を１２００Ｏｒｐｍ、］００分の冷却遠心にかけ、
水層を分取した。この水層を等凧のフェノールで２回、
続いてクロロホルム−フェノール（１：］）で２回処理
して、混在するタンパク質を除去した後、１／１０容の
３Ｍ酢酸す１−リウムを添加し、更に２容の冷エタノー
ルを加えて、全ＲＮＡのエタノール沈殿を行った。沈殿
した全ＲＮＡを凍結乾燥後、水２ｍＱに溶かした。この
一連の操作によって３．５ｍＨの全ＲＮＡを得る。

次に、全ＲＮＡからｍＲＮＡの抽出は以下の方θζて行
った。一般に真核生物のｍＲＮＡは；３′末端にポリＡ
を持っている。アスペルギルス・シロウサミのｍ　ＲＮ
　Ａの場合もポリ八を持つと考えられるので、オリゴｄ
Ｔを固定したカラムを用いて”Ｍｏ１ｅｃｕｌａ　Ｃ］
ｏｎｊｎｇ”Ｐｐ１９７−１９８、Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｊ
「１ｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（＋９８２）に記載の方法
で抽出を行った。なおオリゴｄＴカラムはファルマシア
製ｔｙｐｅ７を０　、５　、、用いた。この方法により
２１１にの全１＋ＮＡから１０μｇのｍ　ＲＮ　Ａを得
る。

次にこのｍＲＮＡからｃＤＮＡを以下の方法により作製
した。ツガ（理はＮｏｔ、　Ｃｅ１１．旧ｏ１．．Ｖｏ
１．２．１６１−１７０（１９８２）及びＧｅｎｅ、Ｖ
ｏｌ、、２５．２６３−２６９　（１９８３）に記載の
ＲＮａｓｅ　ＩＩ　法を用い、実際の操作にはｃＤＮＡ
合成システム・プラス（アマシャ１１社製）を用いた。

この一連の操作によって５μｇのｍＲＮＡから１．５μ
ＧのｃＤＮＡを得る。

次に、このｃＤＮＡを用いてライブラリーの作製を以下
の方法によって行った。まず、前述のｃＤＮＡ　１ｊｉ
ｇをＥｃｏ旧メチラーゼで処理して、　ｃＤＮＡ鎖内に
存在する制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位をすへて、マスキ
ングした。続いて、このｃＤＮＡにＥｃｏＲＩリンカ−
をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、両末端にＥｃｏＲＴの粘着末端を持つｃＤ
ＮＡを得た。これらのｃＤＮＡをファージベクターλＦ
、ｔ１．ＯのＥｃｏＲＴ部位につなぎ、ｉｎ　ｖＮ；ｒ
ｏパッケージングを行った後、ｒＥ、ｃｏｌｉ　ＮＭ５
］４にトランスフェクションして、ｃＤＮＡライブラリ
ー（約２０万プラーク）を作製した。なお、このｃ　ｌ
）Ｎ　Ａのクローニングに関する操イ乍はｃＤＮＡクロ
ーニングシステムλｇｔｌＯキソｌ−（アマジャム社製
）を用いて行った。

実施例９゜ ｃＤＮＡライブラリーからアスペルギルス・シロウサミ
のグルコアミラーゼ（ＡＳＧ）　ｃＤＮＡのクローニン
グ 実施例８に記載のｃＤＮＡライブラリーに保存されたフ
ァージのプラークを形成後、プラークハイブリダイゼー
ションにより、グルコアミラーゼのｃＤＮＡの選択を行
った。この一連の操作はＭｏ１．ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｊｎｇ、　ｐｐ、６３−６７、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎ
ｇ　１ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（，１９８２
）に記載の常法によった。プラークハイブリダイゼーシ
ョンに用いたプローブは実施例２に記載のＡＳＧゲノム
ＤＮＡを含むプラスミドｐｃＵ］］、８−］ＯＥ２をＪ
、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、　　１１３，２３
７−２５１（１９７７）に記載のニック１〜ランスレー
ジヨン法によって３２ｐ放射能ラベルしたものである。

この方法によりポジティブなりローン４個を選択し、さ
らにそれらのクローンについて、実施例２に記載の３種
類の合成オリゴマーをプローブにして２次、３次選択を
行って、すべてのプローブに対してハイブリダイゼーシ
ョンの認められるｃＤＮＡクローンを得て、これをプラ
スミドベクターｐＵｃ］１８に連結してｐＵｃｌ　１８
−ＧＡｃＤＮＡ４を得る。

実施例］０゜ アスペルギルス・シロウサミのグルコアミラーゼ（ＡＳ
Ｇ）ｃＤＮＡに含まれるコーディング領域のＤＮＡ配列
の決定 実施例９に記載のｐＵｃ１１８−ＧＡｃＤＮＡ４につい
てｃＤＮＡ山来の１−ディング領域のＤＮＡ配列を実施
例３に記載と同様の方法で決定し、第２図に示すＤＮＡ
配列を得る。この全ＤＮＡ配列は］、９２０ｂｐであり
、Ｎｅｔではしまる６４０個のアミノ酸からなるペプチ
ドをコー１〜する。

実施例１１゜ 活性アスペルギルス・シロウサミのグルコアミラーゼ（
ＡＳＧ）を生産するサッカロミセス・セレビシアエの作
製 第２図に示したＡＳＧのコーディング領域には介在配列
（イントロン）が存在しない。したがってこのコーディ
ング領域を含む実施例９に記載されたｐＵｃ　Ｉ　］　
８−ＧＡｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡを酵母サッカロミ
セス・セレビシアエの発現ベクターに連結し、酵母に移
入し、発現させることにより、ＡＳＧの分泌ノ１産かｉ
＋ｌ能である。

ｐＵｃ、１１．８−ＧＡｃＤＮＡクローンから制限酵素
ＥｃｏｌＩＩで切り出したＡＳＧのｃＤＮＡ（２，０ｋ
ｂｐ）　を」％アガロースケル電気泳動１こより分取後
、第４図［こ示すように発現ベクターに連結した。使用
した発現ベクターはＭｅｔｈｏｄ　ｊｎ　Ｆｎｚｙｍｏ
］ｏｇｙ、　１０１．　ｐｐ、ｌ９２−２０１（１９８
３）記載のｐＹｃＤＩＥｌである。本ヘクターば酵母で
複製可能な２ミクロンＩ）ＮＡ、Ｔｉｃｏｌｉ　のｐ　
Ｂ　ｌ＋　３２２、標＃遺伝子として酵母Ｔ　Ｒｌ）Ｊ
及び酵母のプロモーターとしてアルコール脱水素酵素遺
伝子（ＡＤＨＩ）のプロモータとチ１−クロームＣＪの
遺伝子（ＣＹＣＴ）のターミネータ−で構成されている
。異種１）ＮＡ挿入部位はＩｉｃ。

ＲＴ部位である。このベクターをＥｃｏ旧で処理後、細
菌のアルカリフォスファターゼを用いて５′末端のリン
酸を除去し、これにＡＳＧのｃＤＮＡ断片を加えて、Ｔ
　４１）Ｎ　Ａリカーゼで連結し、ｐ’Ｉ　Ａ　Ｇ　：
［を得る。次にこのｐＹＡＧ］をＥ、ｃｏｌｉ　ＪＡ２
２］に移入、常法により大量に精製した。続いて精製ρ
ＹＡＧＩをＩｔｏ等のＪ、Ｂａｃ＋、ｃｒＩｏｌ、Ｖｏ
ｌ、］］５３，１６：３−１６８１９８３）記載の方法
にしたかって酵母宿主１翔’／７４７　（ａ　ｊ、、、
ｒｐ、ｌ−２８９ｈｊｓ　３Δ１１ｅｕ　２−３−１１
２　ｕｒａ３−５２）に移入し、トリプトファン要求性
が相補されたことにより、Ｉ−リブ１〜フアンを含まな
い培地において生育可能な形質転換体（Ｉ３）を得る。

この形質転換体を次に示す組成の合成培地１００ｍＱに
接種し、３０℃、４８時間、振盪培養した。

合成培地２２％クルコース、　０．６７％イーストニト
ロゲンヘース（デフコ社製）　、　２４ｍｇ／Ｑウラシ
ル、２４ｍｇ／Ｑ　Ｌ−ヒスチジン、３６ｍｇ＃）　Ｌ
−ロイシン、ｐＨ５，７培養後、３０００ｒｐｍＩＯ分
間の遠心分離によって集めた菌体を冷水で１回洗浄した
。次に、この菌体を、あらかしめ冷却した乳鉢にガラス
ピース（直径約０　、５　＋ｎｎ　）数ｇと一諸に加え
、これに液体窒素２０〜５０ｍＱを加え凍結させ、磨砕
した。さらに同様に液体窒素を加え磨砕操作を更に２回
繰り返した後、得られた磨砕菌体に０．２Ｍ酢酸緩衝液
］　ＯｍＱを加える。得られた液を１５００　Ｏｒ　ｐ
　ｍ、１０分間冷却遠心し、上清を分取した。その上清
中のグルコアミラーセ活性を測定し第２表に示した。

−：３１ 第７図における各シンボルの意味は次表のとおりである
。

実施例１２゜ 形質転換体（Ａ）（アスペルギルス・オリゼー）および
（Ｂ）（サッカロミセス・セレビシアエ）による生でん
ぷんを原料とするアルコール発酵 生米２００ｇに０６１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ４，３）
　Ｉ　Ｑを加え、各米麹を４０ｇ添加した。なお、各米
麹の造り方は、常法どおり、蒸した白米に形質転換体（
Ａ）の胞子を０．１％（Ｗ／１１）、及び、市販種麹を
０．１％（１，１／Ｗ）接種し、４８時間培養して造っ
た。

発酵させるための酵母は、形質転換体（Ｂ）または協会
７号を用い、５　Ｘ　］０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ添加した
。

発酵温度は２０℃とし、経口的にガスクロマＩ・グラフ
を用いてアルコール分をｉｌｌ！Ｉ定し、その結果を第
７図に示した。

第７図から明らかなように、形質転換体（Ａ）（アスペ
ルギルス・オリゼー）で造った米麹を用いた場合、生で
んぷん分解力が強いために、市販種麹を用いた場合より
もアルコール生成速度が大きい。

一方、米麹を用いずに形質転換体（Ｂ）（サッカロミセ
ス・セレビシアエ）のみでも米麹を使用したものに比べ
ると、ややアルコール生成速度が小さいが、充分アルコ
ールが生成される点、親株の協会７号のみの場合と大き
な違いがみられた。

【図面の簡単な説明】

第１図はアスペルギルス・シロウサミのグルコアミラー
ゼ遺伝子の塩基配列を示す図で、第２図は同じくグルコ
アミラーゼのｃＤＮＡの塩基配列を示す図で、第３図は
グルコアミラーゼ発現用プラスミドｐｓＧＯ１の説明図
で、第４図はグルコアミラーゼ発現用プラスミドｐＹＡ
Ｇ１の説明図で、第５図は大腸菌ベクターｐＵｃ１１ｇ
の説明図で、第６図はグルコアミラーゼ遺伝子のプロモ
ーター領域の削除の概略図で、第７図は形質転換体（Ａ
）又は（Ｂ）を用いて生でんぷんを原料とするアルコー
ル発酵を示す図である。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 第 図 第 図 口＝＝コ　： ニ＝＝コ Ａ、　ｎ１ｃｌｕｔａｎｓ Ａ、　ｏｒｙｚａｅ ｒｇＢ Ｍｅ士 （ｊフッ１ばヤｅ　　イ１【） Ｅ　　：　　ＥｃｏＲＩ （切＃杼＆）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）アスペルギルス・シロウサミから単離したグルコア
   ミラーゼ遺伝子のプロモータ及びタンパク質コード領域
   のＤＮＡ配列。 ２）アスペルギルス・シロウサミのグルコアミラーゼｍ
   ＲＮＡから合成したｃＤＮＡ配列。 ３）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含んだア
   スペルギルス・オリゼーのベクター。 ４）特許請求の範囲第２項記載のｃＤＮＡ配列を含んだ
   サッカロミセス・セレビシアエのベクター。 ５）特許請求の範囲第３項記載のベクターをアスペルギ
   ルス・オリゼーに移入することによって得られた耐熱性
   、耐酸性及び生デンプン分解力のあるグルコアミラーゼ
   を分泌生産する形質転換体。 ６）特許請求の範囲第４項記載のベクターをサッカロミ
   セス・セレビシアエに移入することによって得られる耐
   熱性、耐酸性及び生デンプン分解力のあるグルコアミラ
   ーゼを生産する形質転換体。 ７）特許請求の範囲第５項又は／及び第６項の形質転換
   体を用いることを特徴とする生デンプンを原料とした酒
   類、アルコール等の製造法。