JPH02124864A - 芳香族酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の（概要〕 本発明は新規な芳香族酸に関し、そして特に、次の式（
ｒ）： （式中、Ｒ，は低級アルキル基であり、Ｒ２は低級アル
キル基であり、Ｒ３は水素、カルボキシ基又はスルホ基
であり、Ｒ４はカルボキシ基又はスルホ基であり、Ｃは
非置換のもしくは置換された１、４フエニレン基、又は
非置換のもしくは置換された１、４−ナフチレン基であ
り、Ｒ３とＲ４は一緒になって追加の結合でありそして
Ｌは酸素原子もしくは硫黄原子であるが、又はＲ３が水
素であり、Ｒ５がＲ６がハロメチル基でありそしてＬが
酸素原子である） で表わされる化合物、又はその塩；化合物（１）又はそ
の塩の使用；化合物（１）及びその塩の製造方法；この
製造方法において使用される出発物質及びその塩；これ
らの出発物質及びその塩の製造方法；式（１）の化合物
及びその塩の使用方法；化合物（Ｉ）及びその塩がそこ
で使用される装置；並びに該装置の使用方法に関する。

〔具体的な説明〕

適当な非置換の又は置換された１、４−フェニレン基は
例えば、非置換の、又はカルボキシにより及び／又はス
ルホにより置換された１、４−フェニレン基であり、該
置換された１、４−フェニレン基は１〜４個、特にｌ又
は２個の前記の基を有する。置換された１、４−フェニ
レン基が１個より多くの置換基を有する場合、これらの
置換基の幾つか又はすべてが同一であることができる。

挙げることができる例は、２−スルホ、２，３−２．５
−及び３，５−ジスルホ、２，３．５−トリスールホー
並びに２．３．５．６−テトラスルホ−１，４−フエニ
レン基−２−カルボキシ、２゜３−．２．５−及び３，
５−ジカルボキシ−２゜３．５１−リカルボキシー並び
に２．３．５．６−テトラカルボキシ−１，４−フエニ
レン基、２−カルボキシ−３−フルホー　２−カルボキ
シ−５−スルホ、３−カルボキシ−５−スルポー、２゜
３−ジカルボキシ−５−スルホ−１３，５−ジカルボキ
シ−２−スルホ−１５−カルボキシ−２゜３−ジスルホ
−及び２−カルボキシ−３，５−ジスルホ−１，４−フ
ェニレン基、そして特に１゜４−フェニレン基である。

適当な非置換の又は置換された１、４−ナフチレン基は
、例えば、非置換の、又はカルボキシにより及び／又は
スルホにより置換された１、４−ナフチレン基であり、
この置換された１、４−ナフチレン基は１〜６個、特に
１〜３個の記載される置換基を有する。置換された１、
４−ナフチレン基が１個より多くの置換基を有する場合
、これらの置換基の幾つか又はすべては同一であること
ができる。挙げることができる例は、２−１５及び６−
スルホ−５２，３−，５，５−，６，７−及び２．６−
ジスルホ、２，３．５−及び２゜３　、６−）リスルホ
ー並びに２．３．５，７−及び２．３，６．７−テトラ
スルホ−１，４−ナフチレン基、２−１５−及び６−カ
ルボキシ−１２゜３〜．５　、６−、６　、７−及び２
，６−ジカルボキシ−，２，３，５−及び２，３．６−
）リカルボキシー並びに２．３，５．７＝及び２　、３
　、６゜７−テトラカルボキシ−１，４−ナフチレン基
、２−カルボキシ−３−スルホ−２−カルボキシ−５−
スルホ−３−カルボキシ−６−スルホ、５−カルボキシ
−７−スルホ−１２，３−ジカルボキシ−５−スルホ−
２３，５−ジカルボキシ−２−スルホ、６，７−ジカル
ポキシー２−スルホ−３−カルボキシ−６，７−ジスル
ホ−５−カルボキシ−２，３−ジスルホ−及び２−カル
ボキシ−３，５−ジスルホ−１，４−ナフチレン基、そ
して特に１．４−ナフチレン基である。

本発明は例えば、Ｒ８が低級アルキル基であり、Ｒ２が
低級アルキル基であり、Ｒ３が水素カルボキシ基又はス
ルホ基であり、Ｒ４がカルボキシ基又はスルホ基であり
、Ｇが非置換のもしくは置換された１、４−フェニレン
基又は非置換のもしくは置換された１、４−ナフチレン
基であり、Ｒ５及びＲ６が一緒になって追加の結合であ
り、そしてＬが酸素原子又は硫黄原子である式（１）の
化合物、及びその塩に関する。

化合物（１）の幾つかは立体異性体の形をとることがで
きる。化合物（１）が少なくとも１個の炭素原子（Ｃ原
子）〔例えば、対応する基Ｒ＋のＣ原子）を含有する場
合、これらは例えば純粋なエナンチオマー又はエナンチ
オマー混合物、例えばラセミ体の形態にあることができ
、そして少なくとも１個の更なるキシルセンター（例え
ば、対応する基Ｒ２のＣ原子）が存在する場合、これら
はまた、ジアステレオアイソマー、ジアステレオアイソ
マーの混合物、又はラセミ体の混合物の形態をとること
ができる。

化合物（１）の塩は、塩基との塩、好ましくは塩基との
医薬として許容される塩、例えばアルカリ金属塩又はア
ルカリ土類金属塩、例えばナトリウム、カリウム又はマ
グネシウム塩、遷移金属塩、例えば亜鉛又は銅塩、ある
いはアンモニア又は有機アミンとの塩、例えば環状アミ
ン、例えばモノ、ジーもしくはトリー低級アルキルアミ
ン、例えばヒドロキシ低級アルキルアミン、例えばモノ
、ジーもしくはトリーヒドロキシ−低級アルキルアミン
、ヒドロキシ−低級アルキル−低級アルキルアミン、又
はポリヒドロキシ−低級アルキルアミンとの塩である。

環状アミンは例えばモルホリン、チオモルホリン、ピペ
リジン又はピロリジンである。適当なモノー低級アルキ
ルアミンは例えばエチルアミン又はｔｅｒｔ−ブチルア
ミンであり、適当なジー低級アルキルアミンは、例えば
ジエチルアミン又はジイソプロピル−アミンであり、そ
して適当なトリー低級アルキルアミンは例えばトリメチ
ルアミン又はトリエチルアミンである。適当なヒドロキ
シ−低級アルキルアミンは例えばモノ−、ジー又はトリ
ーエタノールアミンであり、そしてヒドロキシ−低級ア
ルキル−低級アルキルアミンは例えばＮ、Ｎ−ジメチル
アミノ−又はＮ。

Ｎ−ジエチルアミノ−エタノールであり、他方適当なポ
リヒドロキシ−低級アルキルアミンは例えばグルコサミ
ンである。化合物Ｎ）はまた酸付加塩、好ましくは医薬
として許容される酸付加塩を形成することができ、例え
ば弾機酸、例えば鉱酸、例えば硫酸、リン酸又はハロゲ
ン化水素酸、強有機酸、例えば低級アルカンカルボン酸
、例えば酢酸、飽和もしくは不飽和のジカルボン酸、例
えばマロン酸、リンゴ酸もしくはフマル酸、又はヒドロ
キシカルボン酸、例えば酒石酸もしくはクエン酸、又は
スルホン酸、例えば低級アルカンスルホン酸又は非置換
もしくは置換されたベンゼンスルホン酸、例えばメタン
−もしくはｐ−トルエンスルホン酸、との酸付加塩を形
成することができる。化合物（１）はまた内部塩を形成
することができる。

医薬としての用途に適さない化合物（１）の塩も含まれ
る。これらは、例えば、本発明の遊離化合物（１）及び
その医薬として許容される塩の単離又は精製のために使
用することができる。

本明細書において、特にことわらない限り、基又は化合
物について「低級」なる語は、７個以下、そして特に４
個以下の炭素原子を含有する基又は化合物について用い
る。

低級アルキル基は例えばＣ７〜Ｃ４アルキル、例えばメ
チル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチ
ル、イソブチル、５ｅｃ−ブチル又はｔｅｒ　ｔ−ブチ
ル基であり、そしてさらにＣ６〜Ｃ。

アルキル、すなわちペンチル、ヘキシル及びヘプチル基
をも包含する。

ハロメチル基はフルオロ−、クロロ−又はブロモ−メチ
ル基であり、しかし特にヨードメチル基である。

化合物（１）及びその塩は価値ある性質を有する。例え
ば、これらは蛋白質の研究における補助剤として、例え
ば蛋白質の化学修飾のための試薬として使用することが
できる。本明細書において「蛋白質」なる語は、一般に
蛋白質と称される、ｔｏ、ｏｏｏ以上の原子質量単位の
相対分子量を有するペプチド、及び一般にポリペプチド
と称される、１０．０００原子質量単位の相対分子量を
有するペプチドの両方を包含すると理解すべきである。

約１０００〜約２０００原子質量単位の相対分子量の下
限がポリペプチドに適用される。蛋白質の化学修飾が役
割を演じ得る多くの用途の内の例として蛋白質の構造分
析及び着色が挙げられる。

単一アミノ酸構成ブロック又は少数のそれの修飾が蛋白
質の空間的構造を変え、そしてそれ故にさらにその機能
、例えばその生物学的活性を変えることが知られている
。このことは、蛋白質の空間的構造に対してこれらの構
成ブロックによりなされる寄与を決定するための広範に
適用可能な方法としてアミノ酸構成ブロックの特定の化
学修飾を用いる可能性を開く、アミノ酸構成ブロックの
ある種の化学修飾の結果として生ずる蛋白質の空間的構
造の変化をその化学修飾の性質及び程度に関連付ける問
題がここに生ずる。この目的のため、対応する化学修飾
された蛋白質の構造を決定しそして化学修飾が行われる
前に存在した構造と比較しなければならない。この種の
構造解析の目的の１つは、化学修飾の間にいかに蛋白質
の一次構造がいかに変化したか、言いかえればどのアミ
ノ酸構成ブロックが化学修飾されたかを決定することで
ある。この種の一次構造の解析においては、その方法は
しばしば次の通りである。対応する未修飾蛋白質Ｎ、の
化学修飾後に得られた化学修飾された蛋白質Ｍ１を、場
合によっては必要かもしれない変性工程を行った後、そ
れぞ・れ同じプロテアーゼで処理し、こうして得られた
２つのペプチド混合物Ｍ二及びＮ′、をそれぞれ高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、そして得ら
れる２つのクロマトグラムＭ：及びＮ：のピークのパタ
ーンを相互に比較する。これらのクロマトグラムを記録
するために用いられる発現系は通常、ペプチドの吸光挙
動を評価する検出系である。クロマトグラムＭ、中のピ
ークパターンは一般に、少なくとも１個の化学修飾され
たアミノ酸構成プロットを含有するペプチドＭ：が検出
される場所においてクロマトグラムＮ−中のピークパタ
ーンと異る。

なぜなら、ペプチドＭ：は一般に対応する未修飾ペプチ
ドＮ：のそれとは異る吸光挙動を示すからである。ペプ
チドＭ：を分離し、そして更なる一次構造解析、例えば
アミノ酸配列分析、にかける。

理想的には、こうして、化学修飾されたアミノ酸構成ブ
ロックを同定しそして特徴付けることができる。

しかしながら、多くの場合、上記の方法の有用性は必ず
しも満足できるものではない。例えば、研究されるべき
蛋白質が比較的高い相対分子量を有する場合、プロテア
ーゼ処理後の対応するペプチド混合物中に多数の異るペ
プチドが存在し、ＨＰＬＣはこのペプチド混合物を十分
に分離することができない。さらに、化学修飾それ自体
がしばしば非常に複雑であり、これはしばしば非特異的
態様で進行し、そしてそれ故に多数の構造的に異るアミ
ノ酸構成ブロックに、又は被験蛋白質中のすべてのアミ
ノ酸構成ブロックにさえ影響を与える。

しかしながら、有利には、可能な限り特異的に、すなわ
ち可能な限り正確に定義された、そして有利には性質及
び数の点で狭く定義されたアミノ酸構成ブロックのクラ
スにのみ特異的に向けられた化学修飾が可能であるべき
である。

従って、上記の欠点を克服することによって前記の方法
を最適化することが望ましくそして実際的な面で大きな
関心が寄せられる。本発明の範囲内で開示される化合物
（１）及びその塩はこの様な最適化を可能にする。この
最適化は、Ｒｌ　＊　ＲＺ＋Ｒ３，Ｒ４及びＧが上に定
義した通りであり、Ｒ５及びＲ６が一緒になって追加の
結合であり、そしてＬが酸素原子又は硫黄原子である化
合物（１）及びその塩に言及しながら後に詳細に説明す
る。

これらの化合物は、以後、化合物（ＩＡ）と称する。

蛋白質の化学修飾において、すなわちその蛋白質との反
応において、化合物（ＡＩ）及びその塩はまず実質上排
他的にリジン構成ブロックのε−位のアミノ基と反応し
、高い反応性が観察される。

分離されている場合おいてのみ、問題の蛋白質のＮ−末
端アミノ酸構成ブロックのアミノ基との追加の反応が存
在する。従って、化合物（ＩＡ）又はその塩による化学
修飾により影響される蛋白質のアミド酸構成ブロックの
種類及び数は明瞭であり、そして有利には狭く定義され
る。すなわち、化学修飾されるアミノ酸構成ブロックの
数は被験蛋白質中のリジン構成ブロックの数より多くな
い。

分離されている場合においてのみ、追加のＮ−末端修飾
が存在する場合に１だけ多くなり得る。

従って、蛋白質の化学修飾のための化合物（ＩＡ）又は
その塩の使用は次の様な利点を有する。すなわち、生ず
る化学修飾された蛋白質Ｍ。

のプロテアーゼ処理の後ペプチド混合物Ｍ′ｂが得られ
、この混合物においては、少なくとも１個の化学修飾さ
れたアミノ酸構成ブロックを含有するペプチドＭ：の残
りのペプチドＮ２からの分離、特に完全な分離を、単純
な逆相１１ＰＬｃにより行うことができる。

さらに、一方においてペプチド混合物ＭＮｂ中に存在す
る少なくとも１個の化学修飾されたアミノ酸構成ブロッ
クを含有するペプチドＭ＝、及び他方において未修飾ペ
プチドＮｂはそれぞれ非常に異なる波長において検出さ
れ得る。なぜならＮ【はＭ；のそれとは非常に異る吸光
挙動を示すからである。このことが、ペプチドＭ、の同
定をかなり促進する。有利なことには、ペプチドＭ′ｂ
　は、色を有するから、可視光の波長において、すなわ
ち約４００ｍｍと約８００ＩＩＴＩ１１との間の波長に
おいて、例えば酸性溶液中で５３５髄の波長において、
又はアルカリ性溶液中で４６４ｍｍの波長において、好
ましくは例１０〜１５に記載する波長のいずれかにおい
て、検出され得る。しかしながら、無色のペプチドＮ；
は紫外線の波長において、例えば２００．２２０又は２
８Ｏｎ＋ｍの波長において検出することができ、そして
それ故に着色したペプチドＭ２の検出を妨害しない。

色を有するのはペプチドＭ２のみならず、プロテアーゼ
処理によりペプチド＝を生じさせる対応する化学修飾さ
れた蛋白質Ｍｂも色を有することは特に注目される。従
って、化合物（ＩＡ）又はその塩による蛋白質の化学修
飾は常に該蛋白質の着色と関連するから、化合物（ＩＡ
）及びその塩は蛋白質の着色用試薬としても使用され得
る。対応する無色の未修飾の蛋白質Ｎｂのリジン構成ブ
ロックのε−アミノ基と及び分離されている場合におい
てはさらにＮ−末端アミノ酸構成ブロックのアミノ基と
、化合物（ＩＡ）又はその塩との反応により得られる着
色した蛋白質Ｍｂは、種々の方法で分析及び／又は診断
目的のために用いることができる。ペプチドＭ２の分離
及び検出に関して前記した本項は着色された蛋白質Ｍｂ
の分離及び検出にも類似の態様で適用される。ペプチド
Ｍ２もまた、種々の分析及び／又は診断目的に使用する
ことができる。

蛋白質の研究は一般に水溶液又は水含有液中で行われる
から、化合物（ＩＡ）及びその塩の良好な水溶性は更な
る価値ある性質を構成する。少なくとも１個の化学修飾
されたアミノ酸構成ブロックを含有する化学修飾された
蛋白質Ｍ、及びペプチドＭ２はまた良好な水溶性により
特徴付けられるから、蛋白質Ｎｂと化合物（ｒＡ）又は
その塩との反応、及び予想される蛋白質例えば後に記載
する種類のものの研究において一般的な他の工程のいず
れも水溶液中で、場合によっては有機溶剤の添加を伴っ
て、有利に行うことができる。

化合物（［Ａ）又はその塩との反応の過程で、−数式： ％式％（） （式中、Ｒｘは各場合において蛋白質の残部である） で表わされる蛋白質Ｎ、の対応するアミノ基、すなわち
、リジン構成ブロックのε−アミノ基、及び分離されて
いる場合においてはさらにＮ−末端アミノ酸構成ブロッ
クのアミノ基がそれぞれカルバモイル基又はチオカルバ
モイル基に転換され、その結果、次の式（Ｉｂ）　　： （式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ：ｌ、Ｒ４，ＲＸ及びＧは前に
定義した通りであり、そしてＬは酸素原子又は硫黄原子
である） で表わされる化学修飾された蛋白質が得られる。

この転換反応の速度は温度が高（なるに従って、且つ反
応媒体のｐＨ値が高くなるに従って上昇する。

典型的な反応条件の例は、例９〜１５に見ることができ
る。蛋白質（Ｉ　ｂ）中のそれぞれカルバモイル結合又
はチオカルバモイル結合の安定性は有利なことには通常
の場合非常に高いから、蛋白質（ｒ　ｂ）を数日間にわ
たり検出可能な分解をなんら伴うことなく貯蔵すること
ができ、そして該蛋白質は、蛋白質の研究において一般
的な更なる工程、例えば、分子排除クロマトグラフィー
、例えばゲルクロマトグラフィー、又は１（ＰＬＣによ
るクロマトグラフ分離、酵素処理、例えばトリプシン又
はキモトリプシンのごときプロテアーゼによる処理、他
の標準的な反応、例えばジスルフィド橋の還元及びそれ
に続くメルカプト基のカルボキシメチル基、あるいは生
物学的活性の分析のための試験反応、等に対して害され
ることなく抵抗する。

この様な工程の詳細な例もまた例９〜１５に記載する。

ペプチドＭ＝中のカルバモイル基及びチオカルバモイル
基の安定性に関しても、蛋白質（Ｉ　ｂ）について上に
記載した事項が同様に適用される。

蛋白質の化学修飾のため及びその様に化学修飾された蛋
白質の一次構造の分析のための方法の前記の最適化のた
めには、化合物（ＩＡ）及びその塩に加えて、Ｒ，、Ｒ
，、Ｒ，、Ｒ，及びＧが前に定義した通りであり、Ｒ２
が水素であり、Ｒ６がハロメチルであり、そしてＬが酸
素原子である式（Ｉ）の化合物、及びその塩も使用する
ことができる。

この様な化合物を、以下に、化合物（ＩＢ）と称する。

化合物（ＩＡ）及びその塩について上に記載した事項は
一般に類似の態様で化合物（ＩＢ）及びその塩に適用さ
れる。しかしながら、蛋白質の化学修飾において、すな
わちその蛋白質との反応において、化合物（ＩＢ）及び
その塩はその蛋白質のリジン構成ブロックのε−アミノ
基とも反応せず、またＮ−末端アミノ酸構成ブロックの
アミノ基とも反応しない。これに反して、化合物（ＩＢ
）又はその塩との反応の過程で、次の一般式（Ｉｄ）：
Ｒ３−Ｒ，（Ｉｄ） （式中、ＲＶは各場合において蛋白質の残部を表わす） で表わされる蛋白質Ｎｅのシスティン構成ブロックのメ
ルカプト基がカルボニルメルカプト基に転換されて、次
の式（Ｉｅ）　　： （式中、Ｒ，、Ｒ，、Ｒ，、、Ｒ４，Ｒ，及びＧは前に
定義した通りである） で表わされる化学修飾された蛋白質が得られる。

従って、化合物（！Ｂ）及びその塩が使用される場合、
化学修飾にり影響を受けるアミノ酸構成ブロックの種類
及び数は一般に、同様に明瞭であり、そして有利なこと
には狭く定義され、化学修飾されるアミノ酸構成ブロッ
クの数は被験蛋白質中のシスティン構成ブロックの数よ
り多くない。

従って本発明はまた、蛋白質研究における補助剤として
の、例えば蛋白質の化学修飾のための試薬としての、特
に着色に関連する蛋白質の化学修飾のための試薬として
の、式（１）の化合物及びその塩の使用に関する。前記
補助剤の商業的配合物も含まれる。

本発明はさらに、蛋白質の化学修飾のための対応する方
法、特に着色に関連する蛋白質の化学修飾方法に関し、
この方法は蛋白質を化合物（１）又はその塩と反応せし
めることを含んで成る。

本発明は特に、Ｒ１が低級アルキル基であり、Ｒ２が低
級アルキル基であり、Ｒ１が水素、カルボキシ基又はス
ルホ基であり、Ｒ４がカルボキシ基又はスルホ基であり
、Ｇが非置換の、又はカルボキシにより及び／又はスル
ホにより置換された１、４−フェニレン基、あるいは非
置換の、又はカルボキシにより及び／又はスルホにより
置換された１、４−ナフチレン基であり、そしてＲ５及
びＲ５は一緒になって追加の結合であり、そしてＬは酸
素原子又は硫黄原子であり、あるいはＲ６は水素であり
、Ｒ６はハロメチル基でありそしてＬは酸素原子である
式（１）の化合物、及びその塩に関する。

この発明は特に、Ｒ５が低級アルキル基であり、Ｒ２が
低級アルキル基であり、Ｒ３が水素、カルボキシ基又は
スルホ基であり、Ｒ４がカルボキシ基又はスルホ基であ
り、Ｇが非置換の、又はカルボキシにより及び／又はス
ルホにより置換された１、４−フェニレン基、あるいは
非置換の、又はカルボキシにより及び／又はスルホによ
り置換された１、４−ナフチレン基であり、Ｒ６及びＲ
５は一緒になって追加の結合であり、そしてＬが酸素原
子又は硫黄原子である式（１）の化合物、及びその塩に
関する。

この発明は特に、Ｒ８がＣ１〜Ｃ４アルキル基、例えば
メチル基又はエチル基であり、Ｒ２がＣ１〜Ｃ４アルキ
ル基、例えばメチル基又はエチル基であり、Ｒ１が水素
又はスルホ基であり、Ｒ４がスルホ基であり、Ｇが非置
換の又はスルホにより置換された１、４−フェニレン基
であり、そしてＲ３及びＲ，は−緒になって追加の結合
でありそしてＬは酸素原子又は硫黄原子であり、あるい
はＲ５が水素であり、Ｒ，はヨードメチル基でありそし
てＬが酸素原子である弐（１）の化合物、及びその塩に
関する。

この発明は特に、ＲがＣ０〜Ｃ４アルキル基、例えばメ
チル基又はエチル基であり、Ｒ２がＣ８〜Ｃ４アルキル
基、例えばメチル基又はエチル基であり、Ｒ３が水素又
はスルホ基であり、Ｒ４がスルホ基であり、Ｇが非置換
の又はスルホにより置換された１、４−フェニレン基で
あり、Ｒ５及びＲ６が一緒になって追加の結合であり、
そしてＬが酸素原子又は硫黄原子である式（１）の化合
物、及びその塩に関する。

この発明は特に、Ｒ＋がＣ８〜Ｃ４アルキル基、例えば
メチル基であり、Ｒ２がＣ，−Ｃ，アルキル基、例えば
メチル基であり、Ｒ３が水素であり、Ｒ４がスルホであ
り、Ｇが非置換の１．４−フェニレン基であり、そして
Ｒ５及びＲ６が一緒になって追加の結合でありそしてＬ
が硫黄原子であり、あるいはＲ５が水素であり、Ｒ，が
ヨードメチル基でありそしてＬが酸素原子である弐（１
）の化合物、及びその塩に関する。

この発明は特に、Ｒ１が０１〜Ｃ４アルキル基、例えば
メチル基であり、Ｒ２がＣ，−Ｃ，アルキル基、例えば
メチル基であり、Ｒ１が水素であり、Ｒ４がスルホ基で
あり、Ｇが非置換のフェニレン基であり、Ｒ５及びＲ６
が一緒になって追加の結合であり、そしてＬが硫黄原子
である式（１）の化合物、及びその塩に関する。

この発明は特に、例に記載する式（１）の新規化合物、
及びその塩に関する。

本発明はまた、式（１）の化合物又はその塩の製造方法
に関し、この方法においては、例えば、次の式（■）： で表わされる化合物又はその塩中のＮＯ３基を次の式（
Ｉｃ）　： で表わされる基に転換し、そして所望により、この方法
により得られる異性体の混合物をその成分に分離しそし
て所望の異性体（１）を単離し、この方法により得られ
るエナンチオマー又はジアステレオアイソマーの混合物
を個々のエナンチオマー又はジアステレオアイソマーに
分割しそして所望のエナンチオマー又はジアステレオア
イソマーを単離し、そして／又はこの方法によって得ら
れる遊離化合物（Ｉ）を塩に転換し又はこの方法によっ
て得られる塩を遊離化合物（１）又は他の塩に転換する
。

この明細書に記載する反応は、それ自体既知の方法によ
り、例えば触媒の存在下又は非存在下で、又は通常は適
当な不活性溶剤もしく゛は稀釈剤又はその混合物の存在
下で、必要に応じて冷却しながら、室温で又は加熱しな
がら、例えば約−８０°Ｃ〜反応媒体の沸点の範囲、好
ましくは約−２０″Ｃ〜約＋１５０°Ｃの範囲の温度に
おいて、そして所望により密閉容器中で、加圧下で、不
活性ガス雰囲気中及び／又は無水条件下で行われる。

式（Ｉ）の化合物又はその塩の製造のために使用される
式（ＩＩ）、　（Ｉｌａ）、（Ｉ［［）、　（ＩＶ）、
　（Ｎａ）及び（Ｖ）の本明細書に記載する出発物質の
幾つかは知られており、又はそれらはそれ自体既知の方
法により製造することができる。

塩基性中心を有する出発物質は酸付加塩として、例えば
前記の酸との酸付加塩の形で存在することができ、他方
酸性基を有する出発化合物は、例えば上記の種類の塩基
と共に塩を形成することができる。

化合物（ＩＩ）又はその塩中のＮＨｚ基の、基（Ｉｃ）
への転換は、例えば、弐（ＩＩ）の化合物又はその塩を
、次の式（ＩＩａ）： （式中、■、は酸素原子又は硫黄原子であり、そしてＺ
ｌ及びＺ２はそれぞれ独立に原核性脱離基Ｇ、であるか
、あるいは−緒になって遊離の又は官能的に変性された
オキソＧ２であり；あるいはＬは酸素原子であり、ＺＩ
は原核性脱離基Ｇ、であり、そしてＺ２はハロメチル基
である）で表わされる化合物と反応せしめることにより
行うことができる。

原核性脱離基Ｇは、例えば、遊離も、エーテル化された
もしくはエステル化されたヒドロキシもしくはメルカプ
ト基、アミン基、アンモニウム基又はスルホニウム基で
ある。エーテル化ヒドロキシは例えば、低級アルコキシ
基、例えばメトキシ基もしくはエトキシ基、又は非置換
のもしくは置換されたフェニル−低級アルコキシ、例え
ば非置換のもしくは置換されたベンジルオキシ基である
。

エステル化されたヒドロキシ基は特に、鉱酸もしくは有
機スルホン酸によりエステル化されたヒドロキシ基、例
えば塩素、臭素もしくはヨウ素、スルホニルオキシ基、
例えば非置換のもしくはハロ置換された低級アルカンス
ルホニルオキシ基、例えばメタンスルホニルオキシもし
くはトリフルオロメタンスルホニルオキシ基、シクロア
ルカンスルホニルオキシ基、例えばシクロヘキサンスル
ホニルオキシ基、又は非置換の、もしくは低級アルキル
−もしくはハロー置換ベンゼンスルホニルオキシ基、例
えばベンゼンスルホニルオキシ、ｐ−ブロモフェニルス
ルホニルオキシもしくはｐ　−トルエンスルホニルオキ
シ基、さらには低級アルカノイルオキシ、例えばアセト
キシもしくはピバロイルオキシ基である。エーテル化メ
ルカプト基は例えば低級アルキルチオ基、例えばメチル
チオもしくはエチルチオ基、又は非置換のもしくは置換
されたフェニルチオ基、例えばフェニルチオもしくはｐ
〜トリルチオ基である。エステル化メルカプト基は例え
ば、低級アルカノイルチオ基、例えばアセチルチオ基で
ある。アミノ基は例えば、アミノ基、Ｎ−低級アルキル
アミノ基、Ｎ、Ｎ−ジー低級アルキルアミノ基又はＮ−
低級アルカノイルアミノ基、さらにはＮ、Ｎ−低級アル
キレンアミノ基又はＮ、Ｎ−アザ−１Ｎ、Ｎ−オキサ−
もしくはＮ、Ｎ−チアー低級アルキレンアミノ基、例え
ばジメチルアミノもしくはジエチルアミノ基、さらには
ピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノもしくはチオモル
ホリノ基、さらにアニリノ基である。アンモニウム基は
例えば上記のアミノ基に対応する三級又は四級アンモニ
ウム基、例えばトリー低級アルキルアミノもしくはピリ
ジニオ基である。スルホニウム基は例えば、ジー低級ア
ルキルスルホニウム基、例えばジメチルスルホニウム基
である。

遊離の又は官能的に変性されたオキソ基Ｇ２は、例えば
、オキソ基、チオキソ基又は基＝Ｎ−Ｒ’である。基−
Ｎ　−Ｒ’は例えば、Ｒ′が水素、低級アルキル又はア
シル基、例えば低級アルカノイル基、非置換のもしくは
置換されたベンゾイル、ピリドイル又は低級アルカンス
ルホニル基である基、例えばイミノ基、アルキルイミノ
基、Ｎ−低級アルカノイルイミノ基、非置換のもしくは
置換されたＮ−ベンゾイルイミノ基又はＮ−低級アルカ
ンスルホニルイミノ基である。

Ｒ９及びＲ６が一緒になって追加の結合である化合物（
Ｉ）又はその塩の製造のために好適に使用される化合物
（Ｉ［ａ）は、例えば、Ｌが硫黄原子である化合物（Ｉ
）又はその塩をもたらすチオホスゲン（Ｚｌ−Ｚ２＝塩
素）及び二硫化炭素（２＋及びＺ２−チオキソ）、並び
にＬが酸素原子である化合物（Ｉ）又はその塩をもたら
すホスゲン（Ｚ、＝Ｚ２−塩素）である。

Ｒ２が水素でありそしてＲ６がハロメチル基である化合
物（Ｉ）の製造のために好適に使用される化合物（Ｉ［
ａ）は、例えば、ハロ酢酸（Ｚ、＝ヒドロキシ；Ｚ２＝
八ロメチル、Ｌ＝酸素原子）及び対応する反応性ハロ酢
酸誘導体（Ｚ、は例えばハロゲン、低級アルコキシ又は
スルホニルオキシ）である。

Ｒ２が水素でありそしてＲ６がハロメチル基である化合
物（、■）の製造のために好適に使用される化合物（Ｉ
Ｉａ）は、例えば、ハロ酢酸（２＋　−ヒドロキシ；Ｚ
２＝ハロメチル；Ｌ−酸素原子）及び対応する反応性ハ
ロ酢酸誘導体（２＋　は例えばハロゲン、低級アルコキ
シ又はスルホニルオキシ）である。

化合物（ＩＩ）又はその塩と化合物（Ｉｌａ）との反応
は常法に従って、例えば場合によっては適当な塩基のご
とき縮合剤の存在下で、そしてＺＩ及びＺ２が一緒にな
ってチオキソ基である化合物（Ｉｌａ）との反応の場合
には場合によっては硫黄結合剤の存在下で、そしてＺ、
がＧ、であり、Ｚ２がハロメチル基でありそしてＬが酸
素原子である化合物（Ｉ［ａ）との反応の場合には水結
合剤の存在下で、適当な不活性溶剤もしくは稀釈剤又は
その混合物の非存在化又は通常は存在下で、そして必要
であれば冷却しながら、室温において又は加熱しながら
、例えば約−８０゛Ｃ〜約＋２００°Ｃ１好ましくは約
−２０゛Ｃ〜約＋１５０°Ｃの温度範囲において、そし
て必要であれば密閉容器中で、加圧下でそして／又は不
活性ガス、例えば窒素のもので行われる。

適当な塩基は、例えば、アルカリ金属の水酸化物、水素
化物、アミド、アルカル−ト、炭酸塩、トリフェニルメ
チリド、ジー低級アルキルアミド、アミノ−低級アルキ
ルアミド及び低級アルキルシリルアミド、又はナフタレ
ンアミン、低級アルキルアミン、塩基性複素環化合物、
水酸化アンモニウム及び炭素環アミンである。例えば、
水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム、ナトリウムアミ
ド、ナトリウムエタルレート又は炭酸ナトリウム、カリ
ウムｔｅｒ　ｔ−ブタル−ト又は炭酸カリウム、リチウ
ムトリフェニルメチリド、リチウムジイソプロピルアミ
ド、カリウム３−（アミノプロピル）アミドもしくはビ
ス−（トリメチルシリル）−アミド、又はジメチルアミ
ノナフタレン、ジー及びトリーエチルアミン、ピリジン
、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム、１．５−ジ
アザビシクロ（４，３，０）ノン−５−エン（ＤＢＮ）
及び１，５−ジアザビシクロ（５，４，Ｏ）ウンデク−
５−エン（ＤＢＵ）が挙げられる。

Ｚｌ及びＺ２が一緒になってチオキサ基である化合物（
Ｉｌａ）を用いる反応のための適当な硫黄結合剤は、例
えば、リンの酸化物、例えばＰ４Ｏ１０、カルボジイミ
ド、例えばＮ、Ｎ’　−ジシクロへキシルカルボジイミ
ド、及び炭酸の誘導体、例えば炭酸エステル、例えばハ
ロ炭酸低級アルキルエステル、例えばクロロ炭酸エチル
エステルである。

ＺＩがＧ１であり、Ｚ２が八口メチル基でありそしてＬ
が酸素原子である化合物（ＩＩａ）を用いる反応のため
の適当な水結合剤は、例えば、リンの酸化物、例えばＰ
ａＯ＋ｏ　、及びカルボジイミド、例えばＮ　、　Ｎ’
　−ジシクロへキシルカルボジイミド又はＮ−（３−（
Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−プロピル）−Ｎ’−エチル
カルボジイミド及びその酸付加塩、例えば塩酸塩である
。

不活性溶剤又は稀釈剤としては、例えば、水、並びに水
との混合物の形で、環状エーテル、非置換の又はハロゲ
ン化芳香族炭化水素、ハロゲン化低級アルカン、Ｎ、Ｎ
−ジー低級アルキル−低級アルカン酸アミド、リン酸−
低級アルキルアミド、ジー低級アルキルスルホキシド、
塩基性複素環化合物、及び低級アルカノール、例えばテ
トラヒドロフラン、ジオキサン、ベンゼン、トルエン、
キシレン、クロロベンゼン、１．２−ジクロロベンゼン
、トリクロロメタン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、
ヘキサメチルリン酸トリアミド、ジメチルスルホキシド
、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリン、メタノール及びエ
タノールが挙げられる。

出発物質（ＩＩ）又はその塩は、既知の方法と同様にし
て、例えば加水分解により、すなわち次の式（■）： （式中、Ｙはアシル基である） で表わされる化合物又はその塩と水との反応により、製
造することができる。

アシル基Ｙは、例えば、有機カルボン酸又はスルホン酸
に由来するアシル基である。

有機カルボン酸に由来するアシル基は例えば、脂肪族又
は単環芳香族カルボン酸の基、例えばアルカノイル、非
置換の又は置換されたベンゾイル、さらにはピリドイル
基である。

有機スルホン酸由来のアシル基は、例えば、アルカンス
ルホニル基である。

低級アルカノイル基は、例えば、Ｃ２〜Ｃ５アルカノイ
ル基、例えばアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソ
ブチリル又はピバロイル基である。

非置換の又は置換されたベンゾイル基は、例えば、ベン
ゾイル、ｐ−クロロベンゾイル又はｐ　−ニトロベンゾ
イル基である。

低級アルカンスルホニル基は、例えば、Ｃ８〜Ｃ４アル
カンスルホニル基、例えばメタンスルホニル又はエタン
スルホニル基である。

化合物（ＩＩＩ）又はその塩の加水分解は常法により、
例えば、加水分解剤の存在下で、そして適当な不活性溶
剤もしくは稀釈剤又はその混合物の存在下で又は不存在
下で、必要に応じて冷却しながら、室温にて又は加熱し
ながら、例えば約−８０°Ｃ〜約＋２００°Ｃ１好まし
くは約−２０“Ｃ〜約＋１８０”Ｃの温度範囲において
、そして必要であれば密閉容器中で、加圧下でそして／
又は不活性ガス、例えば窒素のもとで、行われる。

適当な加水分解剤は、例えば塩基又は酸である。

適当な酸は例えば、無機もしくは有機プロトン酸、例え
ば鉱酸、例えば硫酸もしくはハロゲン化水素酸、例えば
塩基、スルホン酸、例えば低級アルカンスルホン酸、又
は非置換のもしくは置換されたベンゼンスルホン酸、例
えばメタン−もしくはｐ−トルエン−スルホン酸、又は
カルボン酸、例えば低級アルカンカルボン酸、例えば酢
酸であり、他方、使用し得る塩基は、例えば前記の塩基
、特に水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである。

適当な不活性溶剤又は稀釈剤は、特に上記のもの、水又
は水性低級アルカノール、例えば水性メタノール又はエ
タノールである。

出発物質（ＩＩＩ）又はその塩は、既知の方法と同様に
して、次の式（■）： ｌ （式中、Ａはプロトン酸の陰イオンである）で表わされ
る塩を、次の式（ＩＶａ）：で表わされる化合物又はそ
の塩と反応せしめるごとにより製造することができる。

塩（ＴＶ）中のプロトン酸の陰イオンＡは、例えば、式
（Ｉ）の化合物の酸付加塩の形成について前に記載した
酸の陰イオン、特に強無機プロトン酸の陰イオン、例え
ば鉱酸、例えば硫酸、リン酸もしくはハロゲン化水素酸
、又はテトラフルオロ硼酸の陰イオン、あるいは強有機
カルボン酸、例えば低級アルカンカルボン酸、例えば蟻
酸もしくは酢酸の陰イオン、例えば硫酸イオン、リン酸
イオン、塩素イオン、臭素イオン、テトラフルオロ硼酸
イオン又は酢酸イオンである。

塩（ＩＶ）と化合物（ＩＶａ）又はその塩との反応は、
通常の反応条件のもとで、例えば、不活性溶剤又は稀釈
剤、例えば前記のものの中で、場合によっては酸性剤の
存在下で、例えば前記の酸のいずれかの存在下で、そし
て／又は冷却しながら、室温にて又は加熱しながら、例
えば約−２０°Ｃ〜約＋５０°Ｃ１好ましくは約Ｏ″Ｃ
〜約３０°Ｃの範囲内の温度において、既知の方法と同
様にして行われる。

出発物質（ＩＶ）は既知であるか、又は既知の方法に類
似する方法で製造することができ、例えば次の式（Ｖ）
： Ｒぐ で表わされる化合物又はその塩を亜硝酸と反応せしめる
ことにより製造することができ、この反応は、通常用い
られる反応条件下で、例えば、溶剤又は稀釈剤中で、好
ましくは水中で、そして／又は冷却しながら、室温にて
又は加熱しながら、例えば約−２０″Ｃ〜約＋５０°Ｃ
の範囲の温度において行われる。亜硝酸は好ましくはそ
の場で、例えば、亜硝酸ナトリウムのごときアルカリ金
属亜硝酸塩を強プロトン酸、例えばハロゲン化水素酸、
例えば塩酸、又は低級アルカンカルボン酸、例えば蟻酸
もしくは氷酢酸と反応せしめることにより゛生成せしめ
る。

特に好ましい形態においては、化合物（Ｖ）又はその塩
を、例えばその場で生成される亜硝酸と前記の様にして
反応せしめ、次に、最初に形成された塩（ＩＶ）を、単
離及び／又は更なる精製を行うことなく、本発明によれ
ばその塩で、化合物（ｒＶａ）又はその塩と反応せしめ
ることにより目的の化合物（１）を生成せしめる。

化合物（ＩＶａ）又はその塩は既知であり、又は既知の
方法と同様にして製造することができる。

出発物’ｆｆ１（ｎａ）も既知であるか、又は既知の方
法と同様にして製造することができる。

化合物（１）の塩はそれ自体既知の方法により製造する
ことができる。すなわち、例えば、化合物（１）の酸付
加塩は酸又は適当なイオン交換剤で処理することにより
得られる。酸性の化合物（１）は、例えば、塩又は適当
なイオン交換剤で処理することにより塩に転換すること
ができる。

化合物（１）の塩は常法に従って遊離化合物に転換する
ことができる。例えば酸付加塩は適当な塩基性剤で処理
することにより、そして塩基との塩は例えば適当な酸性
剤で処理することにより、遊離化合物に転換することが
できる。

反応条件及び方法に依存して、塩形成性の２．特に酸性
の化合物（１）は、遊離の形で又は塩の形で得ることが
できる。

新規な化合物（Ｉ）の遊離形及びその塩の形における密
接な関連性の結果として、本明細書において、遊離化合
物（Ｉ）又はその塩は、適当な場合にはそれぞれ対応す
る塩又は遊離化合物（１）をも意味すると理解すべきで
ある。

新規化合物（り及びその塩は、それらの水和物の形で得
ることができ、又は他の溶剤、例えば固体形の化合物の
結晶化のために使用された溶剤を含有することができる
。

出発物質及び選択された方法に依存して、新規な化合物
（１）は可能な異性体の内の１つの形又はそれらの混合
物の形であることができる。分子の対称性に依存して、
例えば不斉炭素原子のごときキラル中心の数並びに絶対
的及び相対的コンフィギユレーションに依存して、純粋
な異性体として例えば純粋なエナンチオマー及び／又は
純粋なジアステレオアイソマー、例えば純粋なシス／ト
ランス異性体又はメソ化合物を得ることができる。

従って、異性体混合物として例えばエナンチオマー混合
物、例えばラセミ体、ジアステレオアイソマー混合物又
はラセミ体の混合物を得ることができる。

得られるジアステレオアイソマー混合物及びラセミ体混
合物は、既知の方法で、成分間の物理化学的性質の相異
に基いて、例えば分別結晶化により、純粋なジアステレ
オアイソマー又はラセミ体に分離することができる。

得られるエナンチオマー混合物、例えばラセミ体は、既
知の方法により、光学活性溶剤からの再結晶化により、
適当な微生物の助けにより、特異的固定化酵素を用いる
開裂により、封入化合物の形成により例えば１つのエナ
ンチオマーのみを複合体化するキラル・クラウンエーテ
ルを用いて、又はジアステレオアイソマー塩への転換に
より、例えば、塩基性最終生成物ラセミ体と光学活性酸
、例えばカルボン酸、例えば酒石酸もしくはリンゴ酸、
又はスルホン酸、例えば樟脳スルホン酸との反応、及び
こうして得られたジアステレオアイソマーの混合物の例
えば異る溶解性に基く、ジアステレオアイソマーへの分
離、及び適当な薬剤の作用による目的のエナンチオマー
の分離により、エナンチオマーに分割することができる
。

本発明はまた、方法の任意の段階で得られる化合物を出
発物質として使用して残りの段階を実施し、あるいは出
発物質を誘導体又は塩及び／又はそのラセミ体又はエナ
ンチオマーの形で使用し、又は特に反応条件下で生成せ
しめる態様をも包含する。

本発明の製造方法において、最初に特に価値あるものと
して記載した化合物（１）をもたらす出発物質を用いる
のが好ましい。本発明はまた、式（１）の製造のために
開発された新基な出発物質、その使用、及びその製造方
法に関し、ここでＲ３゜Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ８，Ｒ６
、Ｇ及びＬは、各場合において好ましい式（１）の化合
物の基について示した意味を有する。

これに関し、次の式（■）： により示される化合物を挙げるべきであり、式（１）の
化合物の塩について記載した事項がこの化合物にも通用
される。これらの化合物は、化合物（１）又はその塩の
製造のための出発物質として前記の方法に従って、特に
有利に使用することができる。

従って本発明はまた、Ｒ，が低級アルキル基であり、Ｒ
２が低級アルキル基であり、Ｒ１が水素、カルボキシ又
はスルホ基であり、Ｒ４がカルボキシ又はスルホ基であ
り、そしてＧが非置換のもしくは置換された１、４−フ
ェニレン基又は非置換のもしくは置換されたナフチレン
基である弐（ｎ）の化合物及びその塩、これらの化合物
及びその塩の使用、並びにこれらの化合物及びその塩の
製造方法に関する。

式（ｎ）中の基は、例えば、式（Ｉ）のもとで与えられ
た好ましい意味を有する。

本発明はこの観点において特に、Ｒ，が低級アルキル基
であり、Ｒ２が低級アルキル基であり、Ｒユが水素、カ
ルボキシ又はスルホ基であり、Ｒ４がカルボキシ又はス
ルホ基であり、そしてＧが非置換の、又はカルボキシに
より及び／又はスルホにより置換された１、４−フェニ
レン基であるか、又は非置換の、又はカルボキシにより
及び／又はスルホにより置換された１、４−ナフチレン
基である式（Ｉ［）の化合物、及びその塩に関する。

本発明はこの観点において特に、Ｒ７がＣＩ〜Ｃ４アル
キル、例えばメチル又はエチル基であり、Ｒ２がＣ２〜
Ｃ４アルキル、例えばメチル又はエチルであり、Ｒ３が
水素又はスルホ基であり、Ｒ４がスルホ基であり、そし
てＧが非置換の、又はスルホにより置換された１、４−
フェニレン基である式（ＩＩ）の化合物、及びその塩に
関する。

本発明はこの観点において特に、Ｒ１が０１〜Ｃ４アル
キル例えばメチル基であり、Ｒ２がＣＩ〜Ｃ４アルキル
、例えばメチル基であり、Ｒ３が水素であり、Ｒ１がス
ルホであり、そしてＧが非置換の１．４−フェニレン基
である式（ＩＩ）の化合物、及びその塩に関する。

本発明はこの観点において特に、例に記載する式（ｎ）
の新規化合物及びその塩に関する。

本発明はまた式（ＩＩ）の化合物及びその塩の製造方法
に関し、この方法においては例えば、次の式（■）： （式中、Ｙはアシル基である） で表わされる化合物、又はその塩を、例えば前記のよう
にして加水分解し、そして所望により、この方法により
得られる異性体の混合物をその成分に分離しそして所望
の異性体（ＩＩ）を単離し、この方法により得られるエ
ナンチオマー又はジアステレオアイソマーの混合物を個
々のエナンチオマー又はジアステレオアイソマーに分割
しそして所望のエナンチオマー又はジアステレオアイソ
マーを単離し、そして／又はこの方法によって得られる
遊離化合物（ｎ）を塩に転換し又はこの方法によって得
られる塩を遊離化合物（ＩＩ）又は他の塩に転換する。

化合物（ＩＩＩ）又はその塩の製造方法は、前記の通り
である。

前記の方法又は他の方法により得られる化合物（ＩＩ）
又はその塩に対して所望により行うことができる次の操
作は特に、エナンチオマー又はジアステレオアイソマー
の分離、及び化合物（１）について記載したのと同様の
塩及び遊離化合物（ＩＩ）への転換であり、これらの操
作は類似の方法により行われる。

本発明はまた、化合物（Ｉ）又はその塩の製造のための
出発物質としての化合物（ｎ）又はその塩の使用に関す
る。

蛋白質の化学修飾及びそのようにして化学修飾された蛋
白質の一次構造の分析のための前記の最適化された方法
、すなわち、化合物（１）又はその塩による化学修飾、
任意的変性、プロテアーゼ処理及びＨＰＬＣがら成る一
連の操作は、自動的に、この目的のために特に設計され
た装置を用いて行うことができる。

この装置の設計を第一図に模式的に示す。この装置は、
化合物（１）もしくはその塩により化学修飾されるべき
蛋白質の試料、溶剤、試薬及び／又は触媒であって式（
１）もしくはその塩による化学修飾、任意的変性及びプ
ロテアーゼ処理の前記諸工程のために必要なもの、不活
性ガス、及び洗浄液を連結部材（１）を介して反応器（
１５）〔該反応器はスクリューキャップ（１６）を有し
、そして加熱ジャケット（１４）に包囲されている〕に
供給するための構成要素（２４）を有するシリンジポン
プ（２４）、反応器（１５）の内容物の濃縮のための反
応器（１５）の真空を連結部材（２）によって可能にす
る構成要素（２５）から成る真空ポンプ（２５）　、化
学修飾又は任意的変性工程が行われた時にバルブ（２６
）　、連結部材（５）、バルブ（２７）及び連結部材（
９）を通して脱塩ユニット（１９）に反応器（Ｉ５）の
内容物を供給するために、又はプロテアーゼ処理が行わ
れた時にバルブ（２６）連結部材（５）、バルブ（２７
）及び連結部材（７）を通してＨＰＬＣ構成要素（２１
）　　（この構成要素（２１）にはプロッター（２２）
　、及び連結部材（８）を介してフラクションコレクタ
ー（２０）が連結されている〕に反応器（１５）の内容
物を供給するために、又は反応器（１５）中に収容され
た洗浄液をバルブ（２６）及び連結部材（１１）を通し
て廃液槽（１７）に供給するために、シリンジポンプ（
２４）により供給される不活性ガスのわずかな過剰圧に
よって機能する構成要素（３）からなる連結部材（３）
、溶離剤を連結部材（６）、バルブ（２７）及び連結部
材（９）を通して脱塩ユニソ）　（１９）に供給する構
成要素（２３）から成るポンプ（２３）　、脱塩ユニッ
ト　（１９）が？容出した溶出液を検出器（１８）に供
給する構成要素（ｌＯ）から成る連結部材（１０）〔前
記構成要素（１８）はバルブ（２８）を調節して、脱塩
ユニット（１９）から溶出する溶出液が化学修飾工程に
おいて調製された化学修飾された蛋白質又は場合によっ
ては任意的変性工程において調製された変性され化学修
飾された蛋白質を含有する場合に該溶出液が連結部材（
４）を通って反応器（１５）に供給されるようにし、そ
して前記溶出液がこの様に化学修飾された蛋白質又は変
性され化学修飾された蛋白質を含有しない場合には該溶
出液が連結部材（１２）を通って廃液槽（１７）に供給
されるようにする〕、並びに検出器（１８）からの溶出
液をバルブ（２８）に供給するために機能する構成要素
（１３）からなる連結部材（１３）　、を有する。

反応器（１５）はそのサイズ及び形状においてエッペン
ドルフ管に匹敵する。反応器（１５）は不活性材料、例
えばガラス、実質的に不活性なプラスナンド、例えばポ
リテトラフルオロエチレン、高品位ステンレス鋼、好ま
しくは透明材料、例えばガラス、又は透明で実質的に不
活性なプラスチックから作ることができる。化学修飾、
任意的変性及びプロテアーゼ処理の各工程は、該反応器
の先細の底部において、合計反応体積的１００〜３００
μ！として行うことができる。この反応器はスクリュー
キャップ（１６）により閉じることができ、このスクリ
ューキャンプは好ましくは反応器（１５）と同じ材料で
作られる。連結部材（１３）は、該反応器の底部にでき
る限り接近して、反応器（１５）を実質的に完全に空に
することができるようにすべきである。

シリンジポンプ（２４）は、材料物質（化学修飾される
べき蛋白質）、必要な溶剤、試薬、例えば化学修飾の段
階で使用される化合物（Ｉ）又はその塩、・及び／又は
触媒、並びに不活性ガス及び洗浄液を反応器（１５）に
供給することができる。シリンジポンプ（２４）は市販
の装置であり、このものは反応器（１５）に供給される
べき薬液の種類及び量が各時点で独立に選択できるよう
に構成されている。シリンジポンプ（２４）中に含まれ
ているバルブにより、反応器（１５）に導く連結部材（
１）は任意の時点で、例えば所望量の薬液が反応器（１
５）にポンプ輸送された時に、閉止することができる。

−段階で反応器（１５）にポンプ輸送することができる
量は、広い体積範囲で、例えば約ＩＩ〜約２００４の範
囲で変えることができる。

真空ポンプ（２５）として任意の市販のポンプを使用す
ることができ、好ましくはオイルポンプである。脱塩ユ
ニット　（１９）は、化学修飾段階及び任意的変性段階
からの反応混合物中に含まれる過剰の試薬又は副生成物
を除去するために機能する。

脱塩ユニット　（１９）として、通常のクロマトグラフ
分離装置、例えばカラムクロマトグラフィー例えば分子
排除クロマトグラフィー、例えばゲルクロマトグラフィ
ーのために使用される装置を使用することができる。検
出器（１８）は、好ましくは、分子の光吸収挙動、例え
ば紫外線、及び特に可視光線の波長における光吸収挙動
を評価する。

典型的に波長は、ＨＰＬＣ系について前に記載した波長
である。加熱シャケ７　ト（１４）　、廃液槽（１７）
、フラクションコレクター（２０）　、［’ＬＣ装置（
２１）、プロッター（２２）　、及び溶出液を脱塩ユニ
ット（１９）に供給するポンプ（２３）として、市販の
ものを使用することができる。

バルブ（２６）は一方において連結部材（３）及び（５
）を開（ことができ、そして同時に連結部材（１１）を
閉止することができる。他方、バルブ（２６）は連結部
材（３）及び（１１）を開くことができそして同時に連
結部材（５）を閉止することができる。バルブ（２７）
は（５）及び（９）を開くことができそして同時に（６
）及び（７）を閉止することができるか、あるいは（５
）及び（７）を開き同時に（６）及び（９）を閉止する
ことができるか、あるいは（６）及び（９）を開きそし
て同時に（５）及び（７）を閉止することができる。バ
ルブ（２８）は（４）及び（１３）を開くことができそ
して同時に（１２）を閉止することができるか、あるい
は（１２）及び（１３）を開くことができそして同時に
（４）を閉止することができる。

適当な型の市販のバルブを使用することができる。

連結部材（１）及び（３）〜（１３）は任意の不活性材
料、例えばガラス、又は実質的に不活性なプラスチック
、例えばポリテトラフルオロエチレン１．好ましくは透
明材料、例えばガラス、又は透明で実質的に不活性なプ
ラスチックで作られたものであることができる。

詳細には、一連の反応操作は次のようにして行われる。

化合物（Ｉ）又はその塩によって化学修飾されるべき蛋
白質の溶液はシリンジポンプ（２４）により連結部材（
１）を通して反応器（１５）に供給される。次に、試薬
〔化合物（１）又はその塩〕が同様にして反応器（１５
）に供給される。化学修飾が完了した後、わずかに過剰
な圧の不活性ガス、例えばアルゴンが反応２ｍ（１５）
に導かれる。〔この不活性ガスはシリンジポンプ（２４
）から連結部材（１）を通して供給される〕。この過剰
圧により、反応器（１５）の内容物が（３Ｌ　（２６Ｌ
　（５）。

（２７）及び（９）を介して脱塩ユニット（１９）に供
給される。こうなるようにバルブ（２６）及び（２７）
が調整される。連結部材（４）がバルブ（２８）により
閉止される。反応器（１５）の全内容物が脱塩二二ッｌ
−（１９）移された時、過剰圧が放棄される。次に、サ
ンプルを脱塩ユニット（１９）に通すことによりそれを
精製する。ポンプ（２３）は溶離剤を、（６）、　（２
７）及び（９）を介して供給する〔バルブ”（２７）が
そのように８周整される〕。

（１０）、　（１Ｂ）、　（１３）、　（２８）及び（
４）により、化学修飾され精製された蛋白質が反応器（
１５）に返還され、バルブ（２８）はそのように調整さ
れる。

検出器（１８）はバルブ（２８）を次のごとく調整する
のに役立つ。すなわち、所望の生成物を含有する溶出液
が反応器（１５）に供給され、他方、その他の両分は連
結部材（１２）を介して廃液槽（１７）に直接供給され
る。反応器（１５）の内容物（化学修飾され精製された
蛋白質を含有する溶出液）は、真空ポンプ（２５）を用
いて連結部（２）を介して真空を適用することにより濃
縮される。真空を適用する間、連結部材（１）はシリン
ジポンプ中に含まれるバルブにより閉止される。さらに
、連結部材（３）及び（５）は〔バルブ（２７）により
〕閉止され、そして（４）は（バルブ（２８）により〕
閉止される。

変性工程が行われる場合には、これは化学修飾工程につ
いて記載したのと同様にして、適切な溶剤及び試薬を用
いて行われる。この変性工程の後、同様にして脱塩ユニ
ット（１９）を用いて精製工程を行う。得られる溶出液
を反応器（１５）に供給し、そして濃縮する。

最後に、プロテアーゼ処理工程を、反応器（１５）中で
化学修飾工程について記載したのと同様にして、やはり
適切な試薬及び溶剤を用いて行う。プロテアーゼ処理が
終った時、反応器（１５）の内容物を、ＨＰＬＣ装置（
２１）に、（３）、　（２６）、　（５）。

（２７）及び（７）を介して〔バルブ（２６）及び（２
７）はその様に調整される〕、前に記載したようにして
（不活性ガスのわずかな過剰圧により）供給される。Ｉ
ＩＰＬｃが行われた時、プロッター（２２）上にクロマ
トグラムが得られる。ＩＩＰＬＣからの両分をフラクシ
ョンコレクター（２０）により集めることができる。

反応条件（温度、体積、反応時間、等々）、及びＩＩＰ
Ｌｃのグラジェントはあらかじめセントされたプログラ
ムにより制御される。記載された反応において必要なす
べての触媒及び他の添加剤はシリンジポンプ（２４）に
より（１）を介して反応器（１５）に供給することがで
きる。

この装置は次のように操作される。すなわち、一方にお
いて、反応（化学修飾、任意的変性、及びプロテアーゼ
処理）が反応器（１５）中で行われている間に脱塩ユニ
ット（１９）がポンプ（２３）から供給される溶離剤に
より連続的に洗浄され、他方において、サンプル（化学
修飾された蛋白質、又は化学修飾され場合によっては変
性された蛋白質）が脱塩ユニット（１，９）において精
製されている間に反応器（１５）が洗浄液〔シリンジポ
ンプ（２４）から（１）を介して供給される］により洗
浄にされる。脱塩ユニット（１９）の洗浄溶液は（１０
）、　（１８）、　（１３）、　（２８）及び（１２）
を介して廃液槽（１７）に供給され、そして反応器（１
５）の洗浄溶は（３）、　（２６）及び（１１）を介し
て廃液槽（１７）に供給され、各場合に、生成物及び溶
出液の輸送について前に記載したのと同様にして行われ
る。

本発明はまた、化合物（１）又はその塩による蛋白質の
化学修飾、該化学修飾された蛋白質の任意的脱塩、化学
修飾されそして場合によっては変性された蛋白質のプロ
テアーゼ処理、及びプロテアーゼ処理工程から生ずるペ
プチド混合物の１１　Ｐ　Ｌ　Ｃから成る一連の操作を
自動的に行うために特に設計された型の本明細書に記載
する装置に関する。

本発明はまた、前記の装置の構成部材を前記のように組
み合わせて目的の装置を得ることを特徴とする前記の装
置の製造方法に関する。

本発明はまた、蛋白質を前記の装置を用いて処理するこ
とを特徴とする、前記の一連の工程から成る蛋白質の自
動的化学修飾のため及び該化学修飾された蛋白質の一次
構造の自動的分析のための方法に閉する。

本発明はまた、前記の一連の工程の自動的実施のための
前記の装置の使用、及び該装置中で行われる化学修飾工
程における試薬としての化合物（Ｎ又はその塩の使用に
関する。

本発明はまた、前記の本発明を例示する下記の例に関す
るが、本発明の範囲はなんらこれに限定されるものでは
ない。例において、温度は°Ｃで示す。ＩＩＰＬｃは高
速液体クロマトグラフィーを意味する。１．ｙｓはリジ
ンを表わし、Ｖａｌはバリンを表わす。

炎よ ２５戒の０．２４Ｍ炭酸ナトリウム溶液及び０．９１ｇ
（７，９ｍｍｏｌ　；　０．６　ｍｌ＞のチオホスゲン
を１ｇ（３，１ｍｍｏｌ　）の４−アミノ−４’−（Ｎ
、Ｎ−ジメチルアミノ）−アゾベンゼン−２−スルホン
酸に加える。この反応混合物を７０°Ｃにて３０分間撹
拌する。室温に冷却した後、反応生成物をフリットガラ
スフィルターで濾別し、そしてｌＮ塩酸、トルエン及び
再びｌＮ塩酸により次々と洗浄する。

次に、黒色の結晶を室温にて真空乾燥して４′（Ｎ　、
　Ｎ−ジメチルアミノ）−４−イソチオシアナト−アゾ
ベンゼン−２−スルホン酸を得る。生成物は加熱に際し
て分解し、そして明瞭な融点を有しない。赤外線スペク
トルにおいて２１１０ｃｍ−’に不斉Ｎ＝Ｃ＝Ｓストレ
ッチ振動により生ずる強いハンドが存在する。

４−アミノ−４’−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）アゾベ
ンゼン−２−スルホン酸は例えば次の様にして得ること
ができる。

０．９ｇ（８，５開ｏ１）の無水炭酸す１−リウム及び
３８ｍｆの水を３．８　ｇ　（１５ｍｍｏｌ）の−５−
（Ｎ−７セチルアミノ）−２−アミノベンゼンスルホン
酸に加える。この反応混合物を、透明な溶液が得られる
まで撹拌する。次に、この溶液を水浴により＋１０°Ｃ
に冷却する。１．２２ｇ　（１７，７ｍｍｏｌ）の固体
亜硝酸ナトリウムを添加した後、混合物をさらに２分間
撹拌する。次に、この反応混合物を３．５　ｄの濃塩酸
と２５ｇの砕氷との混合物上に注ぐ。さらに３０分間０
°Ｃにて撹拌を続け、そして次に３蔵の氷酢酸中２．０
１　ｇ　（１６，６ｍｍｏｌ　；　２．１　ｍ）のＮ。

Ｎ−ジメチルアニリンの溶液を前記反応混合物に加える
。反応混合物の温度を３〜４時間にわたり室温まで放置
上昇せしめる。沈澱した生成物を濾別し、そして真空中
室温にて一夜乾燥せしめることにより４−（Ｎ−アセチ
ルアミノ）−４′（Ｎ　、　Ｎ−ジメチルアミノ）−ア
ゾベンゼン−２−スルホン酸を黒色〜紫色の結晶として
得る。このものは加熱に際して分解し、そして明瞭な融
点を有しない。

２　ｇ　（５，５ｍｍｏｌ）の４−（Ｎ−アセチルアミ
ノ）−４’　−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−アゾベン
ゼン−２−スルホン酸を８戚のエタノールに溶解する。

４ｄのＩＩＮ水酸化ナトリウム溶液を添加した後、この
混合物を９０°Ｃにて６０分間撹拌する。次に、この混
合物を室温に放冷し、そして次に５　ｍｌ、の１１．５
Ｎ塩酸を加える。次に、反応混合物を＋４°Ｃにて一夜
放置する。沈澱した生成物を濾別し、そしてＩＮ塩酸に
より十分に洗浄する。室温にて真空乾燥した後、４−ア
ミノ−４’−（Ｎ。

Ｎ−ジメチルアミノ）−アゾベンゼン−２−スルホン酸
を黒色〜紫色の結晶として得る。このものは加熱に際し
て分解しそして明瞭な融点を有しない。

±１ ０．６７　ｇ　（２，１ｍｍｏｌ　）の４−アミノ−４
’−（Ｎ。

Ｎ−ジメチルアミノ）−アゾベンゼン−２−スルホン酸
（例１）を５７の純ピリジンに溶解する。

次にこの溶液を、４２４ｍｇ　（２，１ｍｍｏｌ）のＮ
、Ｎ’ジシクロへキシルカルボジイミド、５　ｍｌの無
水ピリジン及び１．２６ｇ　（１６，６ｍｍｏｌ　；　
１　ｍ（１）の二硫化炭素の混合物に、撹拌しながら且
つ氷／塩化すトリウムで冷却しながら滴加する。次に、
この反応混合物を冷却を続けながら３〜４時間撹拌する
。

この混合物を室温にて１７時間放置する。次に、ピリジ
ン及び過剰の二硫化炭素を減圧下で可能な限り完全に除
去する。残渣をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフ
ィーにより溶剤としてベンゼンを用いて処理し、４’−
（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−４−イソチオシアナト−
アゾベンゼン２−スルホン酸を得る。このものは溶出液
の蒸発濃縮により結晶化する。

貫主 ０．６７　ｇ　（２，１ｍｍｏｌ　）の４−アミノ−４
’−（Ｎ。

Ｎ−ジメチルアミノ）−アゾベンゼン−２−スルホン酸
（例１）を５ｄの純ピリジンに溶解する。

撹拌しそして氷冷しながら、この溶液に１．２６ｇ（１
６，６ｍｍｏｌ　；　１　ｒｎｌ）の二硫化炭素及び０
．２２ｇ（２，２ｍｍｏｌ　；、０．３　ｍｌ）のトリ
エチルアミンを加える。次に、この反応混合物を、冷却
を続けながら３〜４時間撹拌する。次に、この混合物を
室温にて１７時間放置し、そして次に蒸発濃縮乾燥する
。

残渣として後に残るジチオカルバミン酸トリエチルアン
モニウムを一夜真空乾燥し、そして次に１２ｍ１のトリ
クロロメタン中に溶解する。水冷しながら、０．２２　
ｇ　（２，２ｍｍｏｌ　；　０．３戚）のトリエチルア
ミンをこの溶液に加える。次にこの混合物に、０．３４
ｇ　（３，１ｍｍｏｌ　；　０．３ｍｆ）のクロロ炭酸
エチルエステルを、撹拌及び氷冷しながら４分間以内に
滴加する。この反応混合物を、冷却を続けながら３〜４
時間放置し、そして次に減圧蒸発により濃縮乾燥する。

残渣として後に残る粗生成物を例２に記載したようにし
てカラムクロマトグラフィーにより精製して４’　−（
Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−４−イソチオシアナト−ア
ゾベンゼン−２−スルホン酸を得る。

±↓ 例１〜３に記載したのと同様にして、Ｎ−アミノ−４’
−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−アゾベンゼン−２，６
−ジスルホン酸及び４−（Ｎ、Ｎジメチルアミノ）−ナ
フタレン−１−アゾ−（４′−アミノベンゼン−２′−
スルホン酸から出発して、それぞれ４’−（Ｎ、Ｎ−ジ
メチルアミノ）−４−イソチオシアナトアゾベンゼン−
２゜６−ジスルホン酸及びＮ−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミ
ノ）−ナフタレン−１−アゾ−（４′−イソチオシアナ
トベンゼン−２′−スルホン酸）を得る。

出発物質は、例１に記載したのと同様にして、それぞれ
Ｎ−（Ｎ−アセチルアミノ）−４′（Ｎ、Ｎ−ジメチル
アミノ）−アゾベンゼン−２゜６−ジスルホン酸及び４
−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−ナフタレン−１−アゾ
−（４’　−（Ｎ−アセチルアミノ）−ベンゼン−２′
−スルホン酸〕から出発して得る。

±工 ２０ｍ１のクロロベンゼンを氷／塩化ナトリウムで冷却
することにより０°Ｃに冷却する。通常の注意をしなが
ら、１．１．　ｇ　（１１，１ｍｍｏｌ）のホスゲンを
冷却されたクロロベンゼン中に凝縮により導入する。冷
却を維持しながら且つ激しく撹拌しながら、３０ｍ１の
クロロベンゼン中１．７９　ｇ　（５，６ｍｍｏｌ）の
４−アミノ−４’−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）アブベ
ンゼン−２−スルホン酸（例１）の溶液を、反応混合物
の温度が＋２５°Ｃを越えないような速度で滴加する。

この滴加が完了した時、冷却浴を加熱浴と取り替え、こ
れによって反応混合物を９０分間以内に１３０°Ｃに加
熱し、この間一定撹拌を続ける。この方法の過程で、反
応混合物が７５°Ｃの温度に達するとすぐ、透明な溶液
が得られるまで追加のホスゲンを徐々に導入する。次に
、この混合物に窒素を通しながら該流出するガス中にホ
スゲンがもはや検出されなくなるまで、該混合物を還流
加熱する。室温に冷却した後、反応混合物を減圧下でで
きるだけ完全に濃縮する。残渣をシリカゲル（１５０〜
２００メツシユ）上でのカラムクロマトグラフィーによ
り溶離剤としてベンゼンを用いて処理することによりＮ
’−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−４−イソシアナト−
アゾベンゼン−２−スルホン酸を得る。このものは溶出
液を蒸発濃縮した場合に結晶化する。

拠１ 例５に記載したのと同様にして、４−アミノ−４’−（
Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−アゾベンゼン−２，６−ジ
スルホン酸及びＮ−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−ナフ
タレン−１−アゾ−（４′−アミノベンゼン−２′−ス
ルホン酸から出発して、それぞれ４’−（Ｎ、Ｎ−ジメ
チルアミノ）４−イソシアナト−アゾベンゼン−２，６
−ジスルホン酸及び４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ナ
フタレン−１−アゾ−（４′−イソシアナトベンゼン−
２′−スルホン酸）を得る。

出発物質は例４に記載したのと同様にして得られる。

倒ｊ− １，８ｇ　（９，７ｍｍｏ＋）のヨード酢酸及び１．２
ｇ（６，３ｍｍｏｌ　）のＮ−（３−（Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルアミノ）−プロピル〕−Ｎ’　−エチル−カルボジイ
ミド塩酸塩を９　ｔｄの水に溶解する。この溶液をすぐ
に、撹拌しながら、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム及び５
０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液から成るｐｌ！９の緩衝液７
．６　ｄ中０．５　ｍｇ　（１，６ｍｍｏｌ）の４−ア
ミノ−４’−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−アゾベンゼ
ン−２−スルホン酸（例１）の溶液と混合する。

次に、この混合物に０．４　ｍｌのＩＩＮ水酸化ナトリ
ウム溶液を滴加し、次に室温にて１０分間撹拌する。こ
の混合物が紫色に変るまでＩＮ塩酸を滴加する。沈澱す
る生成物を濾別し、１００ｍｆｆ１の０．ＩＮ塩酸によ
り十分に洗浄し、そして真空乾燥する。

乾燥した粗生成物を１６ｄのＮ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミドと０．４　ｍｆｌのトリエチルアミンとの混合物に
溶解する。前記のようにしてＩＮ塩酸によりさらに沈澱
せしめ、濾別し、そして濾別物を真空乾燥することによ
り純粋な４’−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−４−ヨー
ドアセチル）−アミノ−アゾベンゼン−２−スルホン酸
を得る。このものは加熱に際して分解し、そして明瞭な
融点を有しない。

桝１ 例７に記載したのと同様にして、４−アミノ−４’−（
Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−アゾベンゼン−２，６−ジ
スルホン酸及びＮ−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−ナフ
タレン−１−アゾ−（４′−アミノベンゼン−２′−ス
ルホン酸）から出発して、それぞれ４’−（Ｎ、Ｎ−ジ
メチルアミノ）４−ヨードアセチル）−アミノ−アゾベ
ンゼン−２，６−ジスルホン酸及び４−（Ｎ、Ｎ−ジメ
チルアミノ）−ナフタレン−１−アゾ−〔４′（Ｎ−ヨ
ードアセチル）−アミノベンゼン−２′スルホン酸］を
得る。

出発物質はそれぞれ例４に記載したようにして得ること
ができる。

劃Ｊ− ニグリンＣに対して特異的に作用するモノクロナル抗体
を室温にて１８時間、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液
中で、４’−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−４−イソチ
オシアナト−アゾベンゼン−２−スルホン酸の２ｍＭ溶
液の作用により化学修飾する。これに続く構造分析によ
り、各抗体分子が３０分子の４’−（Ｎ、Ｎ−ジメチル
アミノ）−４−イソチオシアナト−アゾベンゼン−２−
スルホン酸により化学修飾されていることが示された。

この程度の修飾をもって、この抗体は、組換えニグリン
Ｃに対して、未修飾の抗体と比較して変化していない特
異性及び親和性を示す。これらの化学修飾され同時に着
色された抗体は、サンドインチドツトアッセイによって
ニグリンＣの存在を示ために使用することができる。こ
のアッセイにおいて、１μｇ　／　ｒｔｄ１以上を肉眼
で検出することができる。

働１０ スロンビンの特異的阻害剤であるヒルジンを３７“Ｃに
て７時間にわたり５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液中で
４’−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）４−イソチオシアナ
ト−アゾベンゼン−２−スルホン酸の２　ｍＭ？容液の
作用により化学修飾する。

こうして修飾されたヒルジンをセファデックスＧ２５カ
ラム上でのゲルクロマトグラフィーにかける。この阻害
剤の修飾において、１．９６ｍｏｌの４′（Ｎ　、　Ｎ
−ジメチルアミノ）−４−イソチオシアナト−アゾへン
ゼンー２−スルホン酸が１モルのヒルジンと反応する。

この修飾された阻害剤の構造及びその生物学的活性を分
析し、そして次の知見が得られる。

ａ）対応する解離定数に、が３００倍大きいことかられ
かるように、化学修飾されたヒルジンはスロンビンに対
する低下した阻害活性を有する。

ｂ）生来のヒルジンに対するモノクローナル抗体は化学
修飾だヒルジンに対しても作用する。

Ｃ）化学修飾されたヒルジンをカルボキシメチル化しそ
してプロテアーゼｖ８と反応せしめる。

生ずるペプチドをＨＰＬＣにかける５３６ｎｍにおいて
２つのペプチドが検出される。構造分析が示すところに
よれば、これらの２つの着色されたペプチドはアミノ酸
構成ブロック１〜７及び１８〜３７に対応し、そして構
成ブロックＶａｌ−１及びＬｙｓ−２７が選択的に４’
−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）−４−イソチオシアナト
−アゾベンゼン−２−スルホン酸により修飾される。

■土工 ヒト・アンチスロンビンを室温にて１５分間にわたり５
０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液中で、４′（Ｎ　、　Ｎ
−ジメチルアミノ）−４−イソチオシアナトーアソ゛ベ
ンゼン−２−スルホン酸の１　ｍＭ？容液の作用により
化学修飾する。こうして修飾されたアンチスロンビンを
セファデックスＧ２５カラム上でのゲルクロマトグラフ
ィーにかける。この修飾されたアンチスロンビンの構造
及びその生物学的活性を分析し、そして次の知見を得る
。

ａ）化学修飾されたアンチスロンビンはそのヘパリン補
因子活性のわずか２５％を保持するが、ヘパリンの非存
在下でのスロンビンに対するその阻害活性〔プログレッ
シブ（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）阻害剤活性〕は実質上
変化しない。

ｂ）化学修飾されたアンチスロンビンをカルボキシメチ
ル化しそしてトリプシンにより処理する。

生ずるペプチドをＨＰＬＣにかける。４３６ｎｍの波長
において３つのペプチドが検出される。構造分析が示す
ところによれば、これらの３つの着色されたペプチドは
アミノ酸構成ブロック９１〜１１１．　１１５〜１２９
及び１３３〜１３９に対応し、そして構成ブロックＬｙ
ｓ−１０７，Ｌｙｓ−１２５及びＬｙｓ−１３６が選択
的に４′（Ｎ　、　Ｎ−ジメチルアミノ）−４−イソチ
オシアナト−アゾベンゼン−２−スルホン酸により修飾
される。

Ｃ）アンチスロンビンを、４’−（Ｎ、Ｎ−ジメチルア
ミノ）−４−イソチオシアナト−アゾベンゼン−２−ス
ルホン酸により作用される前にヘパリント共にインキュ
ベートした場合、構成ブロックＬｙｓ−１０７，Ｌｙｓ
−１２５及びＬｙｓ−１３６の化学修飾がそれぞれ９８
％、８８％及び９３％阻害される。

ｄ）例って、ヒト・アンチスロンビンの構成ブロックＬ
ｙｓ−１０７，Ｌｙｓ−１２５及びＬｙｓ４３６はヘパ
リンの結合に対して特に重要である。

貴重Ｉ 例９〜１１に記載したのと同様にして、式（Ｉ）の化合
物又は弐Ｎ）の化合物の塩、例えば例１〜８において製
造した化合物を用いて蛋白質の化学修飾することができ
る。

■土主 第１図に示す型の装置を用いてヒト・アンチスロンビン
のヘパリン結合部位の研究を次の様にして行うことがで
きる。

ａ）ヒト・アンチスロンビン（４３２アミノ酸）及びヘ
パリンーアンチスロンビン複合体を行い、各場合に工程
ｂ）ｍｇ）の工程を次の様にして行う。

これらの工程において使用される装置を第１図に模式的
に示した装置により行う。反応器（１５）はガラス製で
ある。検出器（］８）は４３６ｎｍの波長の光の吸収に
基いて働く。連結部材（１）及び（３）〜１３はガラス
製である。連結部材（２）は真空耐性チューブ作る。真
空ポンプ（２５）としてオイルポンプを使用する。脱塩
ユニット（１９）はセファデックス０２５カラムから成
る。

ｂ）化学１珪工程 溶剤：５０ｍＭ　　炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ＝８
．３）； サンプルｌ：アンナスロンビン２５０μｇ；サンプル２
：ヘパリンーアンチスロンビン（２：１重量比）７５０
ｘ（２５０Ｉｒｇのアンチスロンビン及び５００ＩＪｇ
のヘパリン）； 化学修飾用式（■）の試薬二上記の溶剤中４′−（Ｎ、
Ｎ−ジメチルアミノ）−４−イソチオシアナト−アジへ
ンゼンー２−スルホン酸の１ｍＭ？８液； 反応体積：２００Ｉｉ； 反応温度：＋２５°Ｃ； 反応時間ニア、５分間。

Ｃ）股塩工■ カラム：セファデックスＧ２５（長さ３．５　ｃｍ　；
内部直径ｔｃｍ）； 溶離液：５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液（ｐｌ（＝
　８．０　）。

ｄ）変オしＬ附 溶離剤：　０．５　Ｍ　　α、α、α−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチルアミン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣ４）
溶液（ｐＨ＝　ｓ、　４　）及び５Ｍグアニジン塩酸塩
溶液；反応体積：２００μ！； 反応試薬ニスレオ−１，４−ジメルカプト−２゜３−ブ
タンジオール（ジチオスレイトール；　ＤＴＴ）ｌＩＩ
Ｉｇ； 反応温度：＋３７°Ｃ； 反応時間：２時間； カルボキシメチル化試薬：ヨード酢酸２　ｍｇ　；カル
ボキシメチル化温度：＋３７°Ｃ；カルボキシメチル化
時間：１５分間。

ｅ）股塩工丘 カラム：セファデックスＧ２５（長さ３．５　ｃｍ　；
内部直径１ｃｍ）； 溶離剤：５０ｍＭ　　炭酸水素アンモニウム溶液（ｐＨ
＝８．０）。

ｆ）プロテ１ニゴ０Ｕ１１程 プロテアーゼ：トリプシン１０μｇ； 溶離剤：５０ｍＭ　　炭酸水素アンモニウム溶液（ｐ）
Ｉ＝８．０）　　； 反応体積：１００μ！； 反応温度：＋３７°Ｃ； 反応時間：２時間。

ｇ）肚匹工程 カラム；ペプチド及び蛋白質のためＶｙｄａｃ　Ｃ−１
８；カラム温度：＋２５°Ｃ 溶剤Ａ　：　１７．５ｍＭ　　酢酸ナトリウム（ｐｏ＝
５．０）　　；溶剤Ｂニアセトニトリル； グラジェント：３０分間で１０％Ｂから７０％Ｂへ直線
的； 流速：１ｍ１７分； 検出器：　　４３６ｎｍの波長における光の吸収。

ｈ）サンプル１及びサンプル２からの２つのクロマトグ
ラムのピクパターンの比較、及びサンプル１のクロマト
グラムのみに現われるピークに対応する着色されたペプ
チドの配列分析により、アミノ酸構成ブロックＬｙｓ−
１７０，Ｌｙｓ−１２５及びＬｙｓ−１３９がヒト・ア
ンチスロンビンのヘパリン結合部位内に存在することが
示される。

■土工 例１３に記載したのと同様にして、例１３に記Ｒさｈた
装置ヲ用いてヒトスロンビンのヒルジン結合部位の研究
を行うことができる。ヒト・スロンビン（サンプル１　
：　　２５０ｇ）及びヒルジンニスロンビフフ１体（サ
ンプル２　：　　７５０ｕ　；モル比（ヒルジンニスロ
ンビン）＝（１，２：１））を、例１３の工程ｂ）〜ｇ
）に記載したようにして処理する。サンプル１及びサン
プル２からの２つのプロマドグラムのピークパターンの
比較、及びサンプル１のクロマトグラム中にのみ現われ
るピークに対応する着色されたペプチドの配列分析から
、アミノ酸構成結合ブロックＬｙｓ−２１，Ｌｙｓ−５
２，Ｌｙｓ−６５、Ｌｙｓ−１０６，Ｌｙｓ−１０７及
びＬｙｓ−１５４がヒト・スロンビンのヒルジン結合部
位内に存在することが明らかである。

廿ロー影 例１３及び１４に記載したのと同様にして、例えば例１
〜８により製造される式（１）の異る化合物又は式（１
）の化合物の塩を、例１３に記載した装置中で行われる
一連の工程中の工程ｂ）における化学修飾のための試薬
として用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置の模式図である。 １５・・・反応器 １７・・・廃液槽 １８・・・検出器 １９・・・脱塩ユニット ２１・・・レコーダー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒ＿１は低級アルキル基であり、Ｒ＿２は低級
   アルキル基であり、Ｒ＿３は水素、カルボキシ基又はス
   ルホ基であり、Ｒ＿４はカルボキシ基又はスルホ基であ
   り、Ｇは非置換のもしくは置換された１，４−フェニレ
   ン基、又は非置換のもしくは置換された１，４−ナフチ
   レン基であり、Ｒ＿５とＲ＿６は一緒になって追加の結
   合でありそしてＬは酸素原子もしくは硫黄原子であるか
   、又はＲ＿５が水素であり、Ｒ＿６がＲ＿６がハロメチ
   ル基でありそしてＬが酸素原子である） で表わされる化合物、又はその塩。 ２、４′−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−４−イソチオ
   シアナト−アゾベンゼン−２−スルホン酸もしくは４′
   −（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−４−（Ｎ−ヨードアセ
   チル）−アミノ−アゾベンゼン−２−スルホン酸又はこ
   れらの塩。 ３、請求項１又は２に記載の式（ I ）の化合物又はそ
   の塩の製造方法であって、次の式（II）：▲数式、化学
   式、表等があります▼（II） で表わされる化合物又はその塩中のＮＨ＿２基を次の式
   （ I ｃ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ｃ） で表わされる基に転換し、そして所望により、この方法
   により得られる異性体の混合物をその成分に分離しそし
   て所望の異性体（ I ）を単離し、この方法により得ら
   れるエナンチオマー又はジアステレオアイソマーの混合
   物を個々のエナンチオマー又はジアステレオアイソマー
   に分割しそして所望のエナンチオマー又はジアステレオ
   アイソマーを単離し、そして／又はこの方法によって得
   られる遊離化合物（ I ）を塩に転換し又はこの方法に
   よって得られる塩を遊離化合物（ I ）又は他の塩に転
   換する、ことを含んで成る方法。 ４、次の式（II）： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｒ＿１は低級アルキル基であり、Ｒ＿２は低級
   アルキル基であり、Ｒ＿３は水素、カルボキシ基又はス
   ルホ基であり、Ｒ＿４はカルボキシ基又はスルホ基であ
   り、そしてＧは非置換のもしくは置換された１，４−フ
   ェニレン基又は非置換のもしくは置換された１，４−ナ
   フチレン基である）で表わされる化合物、又はその塩。 ５、４−アミノ−４′−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−
   アゾベンゼン−２−スルホン酸又はその塩。 ６、請求項４又は５に記載の式（II）の化合物又はその
   塩の製造方法であって、次の式（III）：▲数式、化学
   式、表等があります▼（III） （式中、Ｙはアシル基である） で表わされる化合物又はその塩を加水分解し、そして所
   望により、この方法により得られる異性体の混合物をそ
   の成分に分離しそして所望の異性体（II）を単離し、こ
   の方法により得られるエナンチオマー又はジアステレオ
   アイソマーの混合物を個々のエナンチオマー又はジアス
   テレオアイソマーに分割しそして所望のエナンチオマー
   又はジアステレオアイソマーを単離し、そして／又はこ
   の方法によって得られる遊離化合物（II）を塩に転換し
   又はこの方法によって得られる塩を遊離化合物（II）又
   は他の塩に転換する、ことを含んで成る方法。 ７、請求項１もしくは２に記載の化合物又はその塩によ
   り蛋白質を処理することを特徴とする蛋白質の化学修飾
   の方法。 ８、蛋白質のリジン構成ブロックの化学修飾の方法であ
   って、蛋白質を４′−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−４
   −イソチオシアナト−アゾベンゼン−２−スルホン酸に
   より処理することを特徴とし、あるいは蛋白質のシステ
   イン構成ブロックの化学修飾の方法であって、蛋白質を
   ４′−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−４−（Ｎ−ヨード
   アセチル）−アミノアゾベンゼン−２−スルホン酸によ
   り処理することを特徴とする方法。 ９、請求項１もしくは２に記載の式（ I ）の化合物又
   はその塩による蛋白質の化学修飾、該化学修飾された蛋
   白質の任意的変性、該化学修飾されそして場合によって
   は変性された蛋白質のプロテアーゼ処理、及び該プロテ
   アーゼ処理工程から生ずるペプチド混合物の高速液体ク
   ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）から成る一連の工程を自
   動的に行うために設計された装置であって化合物（ I
   ）もしくはその塩により化学修飾されるべき蛋白質の試
   料、溶剤、試薬及び／又は触媒であって式（ I ）もし
   くはその塩による化学修飾、任意的変性及びプロテアー
   ゼ処理の前記諸工程のために必要なもの、不活性ガス、
   及び洗浄液を連結部材（１）を介して反応器（１５）〔
   該反応器はスクリューキャップ（１６）を有し、そして
   加熱ジャケット（１４）に包囲されている〕に供給する
   ための構成要素（２４）を有するシリンジポンプ（２４
   ）、反応器（１５）の内容物の濃縮のための反応器（１
   ５）の真空を連結部材（２）によって可能にする構成要
   素（２５）から成る真空ポンプ（２５）、化学修飾又は
   任意的変性工程が行われた時にバルブ（２６）、連結部
   材（５）、バルブ（２７）及び連結部材（９）を通して
   脱塩ユニット（１９）に反応器（１５）の内容物を供給
   するために、又はプロテアーゼ処理が行われた時にバル
   ブ（２６）、連結部材（５）、バルブ（２７）及び連結
   部材（７）を通してＨＰＬＣ構成要素（２１）〔この構
   成要素（２１）にはプロッター（２２）、及び連結部材
   （８）を介してフラクションコレクター（２０）が連結
   されている〕に反応器（１５）の内容物を供給するため
   に、又は反応器（１５）中に収容された洗浄液をバルブ
   （２６）及び連結部材（１１）を通して廃液槽（１７）
   に供給するために、シリンジポンプ（２４）により供給
   される不活性ガスのわずかな過剰圧によって機能する構
   成要素（３）からなる連結部材（３）、溶離剤を連結部
   材（６）、バルブ（２７）及び連結部材（９）を通して
   脱塩ユニット（１９）に供給する構成要素（２３）から
   成るポンプ（２３）、脱塩ユニット（１９）が溶出した
   溶出液を検出器（１８）に供給する構成要素（１０）か
   ら成る連結部材（１０）〔前記構成要素（１８）はバル
   ブ（２８）を調節して、脱塩ユニット（１９）から溶出
   する溶出液が化学修飾工程において調製された化学修飾
   された蛋白質又は場合によっては任意的変性工程におい
   て調製された変性され化学修飾された蛋白質を含有する
   場合に該溶出液が連結部材（４）を通って反応器（１５
   ）に供給されるようにし、そして前記溶出液がこの様に
   化学修飾された蛋白質又は変性され化学修飾された蛋白
   質を含有しない場合には該溶出液が連結部材（１２）を
   通って廃液槽（１７）に供給されるようにする〕、並び
   に検出器（１８）からの溶出液をバルブ（２８）に供給
   するために機能する構成要素（１３）からなる連結部材
   （１３）、を有する前記装置。 １０、蛋白質の研究における付属物としての、着色に関
   連する蛋白質の化学修飾用試薬としての、及び／又は請
   求項９において記載されそして請求項９の装置において
   実施される化学修飾工程の試薬としての、請求項１もし
   くは２に記載の化合物又はその塩の使用方法。