JPH0212560B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法よるＬ−ヒスチジンの製造法に
関する。 従来、発酵法によるＬ−ヒスチジン（以下ヒス
チジンと略す。）の製造法としてはブレビバクテ
リウム属に属し、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニ
ン等のアミノ酸を要求しかつ２−チアゾールアラ
ニンに耐性を有する変異株を使用する方法（特公
昭51−23593）、あるいはブレビバクテリウム属に
属する２−チアゾールアラニン及びサルフア剤耐
性変異株を使用する方法（特公昭51−23594）等
が知られている。一方、パチルス属の微生物につ
いては２−チアゾールアラニン耐性変異株がヒス
チジンを生産することが知られているが（特公昭
50−13358）、ヒスチジンの生成・蓄積量は0.1
ｇ／dl程度に止まりブレビバクテリウム属変異株
に比べ著しく劣つていた。 本発明者等はバチルス属に属しヒスチジンを著
量蓄積する能力を有する変異株を得ることを目的
として種々研究を重ねた結果、バチルス属に属す
るヒスチジンアナログ耐性のヒスチジン生産菌に
プリンアナログ耐性を付与した変異株の中にヒス
チジンを著量蓄積する能力を有する変異株がある
ことを見出した。本発明は、この知見に基づいて
完成されたものである。 以下、本発明について説明する。 本発明でいうヒスチジンアナログとは、バチル
ス属の微生物の生育を阻止するが、この生育阻害
が、ヒスチジンの存在で回復されるような化学物
質を言い、例えば、２−チアゾールアラニン、α
−メチルヒスチジン、１，２，４−トリアゾール
アラニン、３−アミノ−１，２，４−トリアゾー
ルなどがある。 又、プリンアナログとは、バチルス属の微生物
の生育を阻害するが、この生育阻害がアデニン、
グアニン、イノシン等のプリンの存在で回復され
る化学物質をいい、例えば８−アザキサンチン、
８−アザヒポキサンチン、６−メルカプトプリ
ン、６−メルカプトグアノシン、６−アザチオプ
リン、６−メトキシプリン、６−メチルメルカプ
トプリン、２−クロロアデノシン、８−ブロモグ
アニン、８−メルカプトグアニシン、２，６−ジ
アミノプリンなどがある。 本発明で使用する微生物はバチルス属に属し、
ヒスチジンアナログ及びプリアナログに耐性を有
しかつヒスチジン生産能を有する変異株であり、
例えば、以下に示すような変異株が使用される。 バチルス・ズブチリス AJ 11755 FERM−
P6272 （2TA〓，8AG〓） バチルス・スブチリス AJ 11756 FERM−Ｐ
6273 （２−TA〓，
6MP〓） バチルス・スブチリス AJ 11757 FERM−Ｐ
6274 （２−TA〓，２，
6DAP〓） 2TA〓：２−チアゾールアラニン耐性 8AG〓：８−アザグアニン耐性 6MP〓：６−メルカプトプリン耐性 ２，6DAP〓：２，６−ジアミノプリン耐性 上記変異株はいずれもヒスチジンアナログ
（2TA）に耐性を有するヒスチジン生産菌、バチ
ルス・ズブチリスＴ−100 FERM−P3800（特公
昭50−13358号公報）を親株とて通常の変異誘導
操作により得られた変異株である。 本発明の変異株は、上記のようにヒスチジンア
ナログ耐性のヒスチジン生産性の変異株を親株と
して得られる他、バチルス属の野生味にこれら薬
剤耐性を順次付与する方法によつても得ることが
できる。 変異誘導法としては、例えば、紫外線照射法あ
るいはＮ−メチル−N′−ニトロソ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（以下NGと略す）、亜硝酸などの
化学薬剤処理による通常の方法に従えばよく、例
としてAJ11755、AJ11756及びAJ11757の具体的
な変異誘導法を以下の実験例に示す。 実験例 ブイヨン寒天上斜面培地上に生育させたバチル
ス・ズブチリス Ｔ−100FERM−P3800の菌体
を250γ／mlのNGを含む1/30Ｍリン酸緩衝液
（pH7.0）に懸濁し（菌体数10⁹／ml）、30℃に30
分間保持して変異処理を施した。次いで遠心分離
して菌体を集め、同緩衝液で洗つた後８−アザグ
アニン、６−−メルカプトプリン又は２，６−ジ
アミノプリンを2.00μ／ml含有する第１表に示す
最少寒天平板培地に塗布し、30℃で３〜10日間平
板培養を行つた。

【表】 これらプリンアナログを含む平板上に出現した
コロニーのヒスチジン生産能を調べたところ、親
株に比べ明らかにヒスチジン蓄積能が高い変異株
が数多く存在し、中でも８−アザクアニンに耐性
を示す変異株AJ11755、６−メルカプトプリンに
耐性を示す変異株AJ 11756、２，６−ジアミノ
プリンに耐性を示す変異株AJ 11757は高いヒス
チジン生産能を示した。このようにして得られた
耐性変異株の各種薬剤に対する耐性度を第２表に
示す。

【表】 尚、第２表の生育度は、夫々の変異株の菌体を
最少培地でよく洗滌した後、２−チアゾールアラ
ニン、８−アザグアニン、６−メルカプトプリン
又は２，６−ジアミノプリンを含む最少培地に５
×10⁶／ml宛接種し、30℃で40時間振盪培養し、
得られた培養液の562hｍの吸光度を測定して得
られた値で、相対値で示されている。 これらの変異株を用いてヒスチジンを生産する
には炭素源、窒素源、無機塩類、更に必要ならば
有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用い
て培養すればよく、特に困難な点はない。 炭素源としては、グルコース、シユークロー
ス、糖蜜、デンプン加水分解物などの糖類、安息
香酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノ
ール、プロパノールなどのアルコール類、更に菌
を選べば、炭化水素なども使用できる。 窒素源としては、硫安、硝安、塩安、リン安、
尿素、アンモニア水、アンモニアガスその他の通
常の窒素源を使用できる。 本発酵の条件は通気培養がよく、発酵温度は24
ないし37℃、発酵日数は通常２ないし７日であ
る。発酵開始時及び培養中のpHは5.0及至9.0がよ
く、pHの調整には、無機あるいは有機の酸性あ
るいはアルカリ性物質、更には尿素、炭酸カルシ
ウム、アンモニアなどを使用することができる。 発酵液からのヒスチジンの採取は、通常イオン
交換樹脂法、その他の公知の方を組合せることに
より行われる。 このようにして培養するとヒスチジンが培養援
中に0.4〜0.8ｇ／dl蓄積される。この蓄積量はバ
チルス属変異株について知られている従来の蓄積
量が0.1ｇ／dl程度であるのに比べて著しく増大
されており、本発明の方法は、バチルス属の微生
物を使用するヒスチジンの工業的生産を可能なら
しめるものとして重要なものである。 尚、Ｌ−ヒスチジンの定量は、Kapeiler−
Alder反応〔Biochem Z.，264 131（1933）〕を用
いる比色法によつた。 以下実施例により本発明を具体的に説明する。 実施例 １ グルコース 10ｇ／dl、KH₂PO₄ 0.1ｇ／、
NH₄Cl 2.0ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／dl、
KCl 0.2ｇ／dl、Fe及びMnイオン各
2ppmCaCO₃4.0ｇ／dl（別殺菌）を含み、pH7.0
に調節した培地を調製し、その20ml宛を500ml振
盪フラスコに分注した。殺菌後、予めブイヨンス
ラント上で生育させた第３表中に示した各種菌株
をそれぞれ１白金耳接種し、31℃にて96時間振盪
培養した。得られた培養液中のヒスチジンの蓄積
量は第３表に示す通りであつた。

【表】 AJ11755の培養液から遠心分離によつて菌体及
びカルシウム塩を除いて得た上清液１を強酸性
イオン交換樹脂「アンバーライト」IR−120（H⁺
型）に通過させヒスチジンを吸着させた。次いで
３％アンモニア水で吸着したヒスチジンを溶出
し、溶出液を減圧濃縮した。濃縮液を冷却し、放
置したところヒスチジンの結晶が析出した。結晶
を乾燥し5.0ｇの結晶を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バチルス属に属し、ヒスチジンアナログ及び
   プリンアナログに耐性を有しかつＬ−ヒスチジン
   生産能を有する変異株を液体培地内で培養してＬ
   −ヒスチジンを生成蓄積せしめ、これを採取する
   ことを特徴とする発酵法によるＬ−ヒスチジンの
   製造法。