JPH0212559B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法よるＬ−ヒスチジンの製造法に
関する。 従来、発酵法によるＬ−ヒスチジン（以下単に
ヒスチジンと略す。）の製造法としては、ブレビ
バクテリウム属に属しＬ−アルギニン、Ｌ−メチ
オニン等のアミノ酸を要求しかつ２−チアゾール
アラニンに耐性を有する変異株を使用する方法
（特公昭51−23593）、あるいはブレビバクテリウ
ム属に属する２−チアゾールアラニン及びサルフ
ア剤耐性変異株を使用する法（特公昭51−23594）
等が知られている。一方、パチルス属の微生物に
ついては２−チアゾールアラニン耐性変異株がヒ
スチジンを生産することが知られているが（特公
昭50−13358）、ヒスチジンの生成・蓄積量は0.1
ｇ／dl程度に止まりブレビバクテリウム属変異株
に比べ著しく劣つていた。 本発明者等はバチルス属に属しヒスチジンを著
量蓄積する能力を有する変異株を得ることを目的
として種々研究を重ねた結果、バチルス属に属す
るヒスチジンアナログ耐性のヒスチジン生産菌に
サルフア剤耐性及び／又はトリプトフアンアナロ
グ耐性を付与した変異株の中にヒスチジンを著量
蓄積する能力を有する変異株があることを見出し
た。本発明は、この知見に基づて完成されたもの
である。 以下、本発明について説明する。 本発明で使用するヒスチジンアナログとは、バ
チルス属の微生物の生育を阻止するが、この生育
阻害が、ヒスチジンの存在で回復されるような化
学物質を言い、例えば、２−チアゾールアラニ
ン、α−メチルヒスチジン、１，２，４−トリア
ゾールアラニン、３−アミノ−１，２，４−トリ
アゾールなどがある。 又、トリプトフアンアナログは、バチルス属の
微生物の生育を阻止するが、この生育阻害がＬ−
トリプトフアンの存在で回復されるような化学物
質を言い、例えば、DL−５−メチルトリプトフ
アン、DL−５−フルオロトリプトフアン、DL−
４−フルオロトリプトフアン、DL−６−フルオ
ロトリプトフアン、DL−７−アザトリプトフア
ンなどがあり、更に本発明でいうサルフア剤と
は、 (1) ｐ−アミノ安息香酸に化学構造が類似し、 (2) 微生物の生育を阻害するが、ｐ−アミノ安息
香酸の添加により解除されるような物質とい
い、例えば、スルフアダイアジン、スルフイソ
キサゾール、スルフアメラジン、スルフアグア
ニジン、スルフアフエナゾール、スルフアメト
キシビリダジン、スルフアチアゾールなどが挙
げられる。 本発明で使用する微生物はバチルス属に属し、
ヒスチジンアナログ及びサルフア剤若しくはトリ
プトフアンアナログに耐性を有し、かつヒスチジ
ン生産能を有する微生物が使用され、例えば、バ
チルス・ズブチリス AJ 11680 FERM−
P5967、AJ11684 FERM−Ｐ 6005及び
AJ11681FERM−P5968が挙げられる。 このAJ11680はヒスチジンアナログに耐性を有
するバチルス・ズブチリス Ｔ−100FERM−
P3800（特公昭50−13358）を親株として変異誘導
操作により得られた変異株であり、２−チアゾー
ルアラニン及びサルフアグアニジンに耐性を有す
る変異株であり、AJ11684は２−チアゾールアラ
ニン耐性及び５−フルオロトリプトフアンに耐性
を有する変異株である。更にAJ11681は、
AJ11680を親株として得られた変異株で２−チア
ゾールアラニン耐性、サルフアグアニジン耐性の
他に５−フルオロトリプトフアンに耐性を有する
変異株である。 本発明の変異株は、上記のようにヒスチジンア
ナログ耐性のヒスチジン生産性の変異株を親株と
して得られる他、バチルス属の野生味にこれら薬
剤耐性を順次付与する方法によつても得ることが
できる。 変異誘導法としては、例えば、紫外線照射法あ
るいはＮ−メチル−N′−ニトロソ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（以下NGと略す）、亜硝酸などの
化学薬剤処理による通常の方法に従えばよく、例
としてAJ11680、AJ11681の具体的な変異誘導法
を以下の実施例に示す。 実験例 ブイヨン寒天上斜面培地上に生育させたバチル
ス・ズブチリス Ｔ−100FERM−P3800の菌体
を250γ／mlのNGを含む1/30Ｍリン酸緩衝液
（pH7.0）に懸濁し（菌体数10⁹／ml）、30℃に30
分間保持して変異処理を施した。次いで遠心分離
して菌体を集め、同緩衝液で洗つた後サルフアグ
アニジン又は５−フルオロトリプトフアンを
500μｇ／ml含有する第１表に示す最少寒天平板
培地に塗布し、30℃で３〜10日間平板培養を行つ
た。

【表】 サルフアグアニジンを含む平板上に出現したコ
ロニーの内生育の良いものを選びヒスチジン生産
能を調べたところ、いずれもヒスチジンを0.4〜
0.5ｇ／dl蓄積し親株に比べて明らかに高い蓄積
能を示した。この内ヒスチジン生産能の最も高い
変異株AJ11680を選んだ。同様に５−フルオロト
リプトフアンを含有する平板上に出現したコロニ
ーの内からヒスチジン生産能の高い菌株AJ11684
を選んだ。次に、AJ11680を親株とて同様のNG
処理による変異操作を施し、５−フルオロトリプ
トフアンを500μｇ／ml含有する第１表に示す組
成の最少寒天培地に出現するコロニーを分離し
た。この内、生育の良好なものについてヒスチジ
ン生産能を調べ、特にヒスチジン生産能の高い菌
株AJ11681を分離した。 このようして得られた耐性変異株の各種薬剤に
対する耐性度を第２表に示す。

【表】 尚、第２表の生育度は、夫々の変異株の菌体を
最少培地でよく洗滌した後、２−チアゾールアラ
ニンン、サルフアアニジン又はDL−５−フルオ
ロトリプトフアンを含む最少培地に５×10⁶／ml
宛接種し、30℃で40時間振盪培養し、得られた培
養液の562nmの吸光度を測定し得られた値で、相
対値で示されている。 これらの変異株を用いてヒスチジンを生産する
には炭素源、窒素源、無機塩類、更に必要ならば
有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用い
て培養すればよく、特に困難な点はない。 炭素源としては、グルコース、糖蜜、デンプン
加水分解物などの糖類、安息香酸、酢酸、プロピ
オン酸などの有機酸、エタノール、プロパノール
などのアルコール類、更に菌を選べば、炭化水素
なども使用できる。 窒素源としては、硫安、硝安、塩安、リン安、
尿素、アンモニア水、アンモニアガスその他の通
常の窒素源を使用できる。 本発酵の条件は通気培養がよく、発酵温度は24
ないし37℃、発酵日数は通常２ないし７日であ
る。発酵開始時及び培養中のpHは5.0及至9.0がよ
く、pHの調整には、無機あるいは有機の酸性あ
るいはアルカリ性物質、更には尿素、炭酸カルシ
ウム、アンモニアガスなどを使用することができ
る。 発酵液からのヒスチジンの採取は、通常イオン
交換樹脂法、その他の公知の方を組合せることに
より行われる。 このようにして培養するとヒスチジンが培養援
中に0.5〜0.8ｇ／dl蓄積される。この蓄積量はバ
チルス属変異株について知られている従来の蓄積
量が0.1ｇ／dl程度であるのに比べて著しく増大
されており、本発明の方法は、バチルス属微生物
を使用するヒスチジンの工業的生産を可能ならし
めるものとして重要なものである。 尚、Ｌ−ヒスチジンの定量は、Kapeiler−
Alder反応〔Biochem Z.，264 131（1933）〕を用
いる比色法によつた。 以下実施例により本発明を具体的に説明する。 実施例 １ グルコース 10ｇ／dl、KH₂PO₄ 0.1ｇ／、 NH₄Cl 2.0ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／
dl、 KCl 0.2ｇ／dl、Fe及びMnイオン 各2ppm CaCO₃ 4.0ｇ／dl（別殺菌）を含み、pH7.0に
調節した培地を調製し、その20ml宛を500ml振盪
フラスコに分注した。殺菌後、予めブイヨンスラ
ント上で生育させた第３表中に示した各菌株をそ
れぞれ１白金耳接種し、31℃にて96時間振盪培養
した。得られた培養液中のヒスチジンの蓄積量は
第３表に示す通りであつた。

【表】 AJ11681の培養液から遠心分離によつて菌体及
びカルシウム塩を除いて得た上清液１強酸性イ
オン交換樹脂「アンバーライト」IR−120（H⁺
型）に通過させヒスチジンを吸着させた。その後
３％アンモニア水で吸着したヒスチジンを溶出
し、溶出液を減圧濃縮した。濃縮液を冷却し、放
置したところヒスチジンの結晶が析出した。結晶
を乾燥し5.7ｇを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バチルス属に属し、(1)ヒスチジンアナログ及
   び(2)サルフア剤若しくはトリプトフアンアナログ
   に耐性を有し、かつＬ−ヒスチジン生産能を有す
   る微生物を液体培地中で培養してＬ−ヒスチジン
   を生成・蓄積せしめ、これを採取することを特徴
   とするＬ−ヒスチジンの製造法。