JPH05255372A - 新規ルブソシド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、より甘味質の良いルブソシド誘
導体を開発することを目的とする。 【構成】甘味配糖体ルブソシドにおいて、１９位カルボ
キシル基にエステル結合するβ−Ｄ−グルコピラノシル
基の６位水酸基にβ−Ｄ−フラクトフラノシル基が２位
の位置で結合し、更に１３位水酸基にエーテル結合する
β−Ｄ−グルコピラノシル基の４位水酸基に基〔α−Ｄ
−グルコピラノシル−（１→４）〕ｎ（ここで、ｎは１
ないし５を表す）がエーテル結合してなるルブソシド誘
導体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な甘味物質である
ルブソシド誘導体に関する。

【０００２】

【従来技術】甘味物質としては、甘味質の点で砂糖が最
も優れたものであるが、近年砂糖のとり過ぎによる健康
上の影響が問題にされ始めたため、低カロリーないし無
カロリーで、特に天然物系の甘味物質に対する関心が高
まっている。一方、南米パラグアイ原産のキク科植物で
あるステビアから得られるステビオシドや中国南部、広
西、広東地方に野生するバラ科、キイチゴ属の灌木、甘
葉懸鈎子の葉から得られるルブソシドに代表されるステ
ビオール配糖体は、砂糖と異なり低カロリーで、甘味度
は砂糖の約１１４〜１４５倍と高いことから注目されて
いるが、その甘味質には苦味、嫌味があり、更には残味
が長く尾を引くという欠点がある。

【０００３】これまでステビオール配糖体の味質を改善
するための数多くの研究がなされており、例えば、ルブ
ソシドにサイクロデキストリンを添加する方法（特開昭
５８−７１８６７号公報）、ステビオシド又はルブソシ
ドにα又はβ−グルコシル糖化合物存在下にα又はβ−
グルコシル転移酵素を作用させてグルコシル基を導入す
る方法（特開昭５４−５０７０号公報）、ステビオシド
又はルブソシドにバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）が生産する酵素シクロ
デキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（以下ＣＧ
Ｔａｓｅと略す）を用い、澱粉を糖供与体としてグルコ
シル基を転移させる方法（特開昭５４−５０７０号公
報）等が提案されており、現在ＣＧＴａｓｅの作用によ
りステビオシドにグルコシル基を数分子α−１，４結合
で転移したグリコシル転移ステビオシドが上市されてい
る。しかし、これらの研究は、未だその味質の改善に十
分な成果を収めるには至っていない。

【０００４】ステビオール配糖体の甘味質改善に関する
これまでの一連の研究によると、ステビオール骨格の１
３位水酸基にエーテル結合するβ−Ｄ−グルコピラノシ
ル基又はソホロシル基に１〜４個のグルコース分子がα
−１，４結合した化合物には味質の改善がみられるが、
１９位カルボキシル基にエステル結合するβ−Ｄ−グル
コピラノシル基に１〜４個のグルコース分子が結合した
化合物では逆に甘味度、味質が低下することが報告され
ており（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８（１
０），２４８３〜２４８８頁，１９８４年；Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（６），１６０３〜１
６０７頁，１９８９年）、１３位グルコシル基のみへの
グルコースの選択的導入が課題となっている。

【０００５】かかる課題を解決する手段として、ルブソ
シド又はステビオシドの１９位グルコシル基にβ−ガラ
クトシル転移酵素の作用によりガラクトース基を転移さ
せ、続いて１３位のグルコシル基又はβ−ソホロシル基
の末端グルコースにα−グルコシル転移酵素の作用によ
りグルコースを選択的に転移させた後、先に１９位グル
コシル基に転移させたβ−ガラクトシル基をβ−ガラク
トシダーゼの作用により除去する方法（特開平２−１３
１５９２）、ルブソシド又はステビオシドの１９位グル
コシル基にβ−フラクトシル転移酵素の作用によりβ−
Ｄ−フラクトフラノースを転移させる方法（特開平３−
９９０９２）が提案されている。しかし、前者は３回の
酵素反応が必要で且つ工程が煩雑なため実用的ではな
く、又後者はステビオシドについては味質の向上が見ら
れるが、ルブソシドについては味質の改善がみられてい
ない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、より甘味質
の良いルブソシド誘導体の開発を目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究の結果、甘味配糖体ルブソシドに
おいて、１９位グルコシル基にグルコースやフラクトー
ス等の糖を転移させた際、該グルコシル基の４位に転移
させたものより６位に転移させたものの方が味質が良い
ことを見いだした。また、１９位グルコシル基の６位に
糖を転移させ４位が空いたものにあっては、次のα−グ
ルコシル転移酵素の作用によるグルコースの転移反応は
４位にも起こると報告されているが、最初に転移させた
糖がβ−Ｄ−フラクトフラノースである場合には酵素の
種類と反応条件を調整することにより、１３位のグルコ
シル基にのみ選択的にグルコースをα−１，４結合で転
移させうるを見いだした。この様にして得られるルブソ
シド誘導体は、苦味、渋味がなく円やかで、優れた甘味
質となることを見いだし、本発明を完成した。

【０００８】本発明は、甘味配糖体ルブソシドにおい
て、１９位カルボキシル基にエステル結合するβ−Ｄ−
グルコピラノシル基の６位水酸基にβ−Ｄ−フラクトフ
ラノシル基が２位の位置で結合し、更に１３位水酸基に
エーテル結合するβ−Ｄ−グルコピラノシル基の４位水
酸基に基〔α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）〕ｎ
（ここで、ｎは１ないし５を表す）がエーテル結合して
なるルブソシド誘導体に関するものである。

【０００９】より詳細には本発明は、下記式（Ｉ）

【００１０】

【化１】

【００１１】（式中、β−Ｄ−ｇｌｃは、β−Ｄ−グル
コピラノシル基を示す）で表される甘味配糖体ルブソシ
ドにおいて、１９位グルコシル基の６位水酸基にβ−Ｄ
−フラクトフラノースが２位の位置で結合し、更に１３
位グルコシル基の４位水酸基にＤ−グルコース、Ｄ−マ
ルトース、Ｄ−マルトトリオース、Ｄ−マルトテトラオ
ース又はＤ−マルトペンタオースがα−１，４結合で結
合したルブソシド誘導体（以下、それぞれ化合物Ｂ、化
合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ及び化合物Ｆと命名する）
に関する。

【００１２】本発明のルブソシド誘導体は、例えば次の
様にして製造することができる。先ずルブソシドとβ−
フラクトフラノシル糖化合物、好ましくはショ糖を含む
水溶液又は懸濁液に、β−フラクトシル転移酵素を作用
させることによりβ−Ｄ−フラクトフラノシル基がルブ
ソシドの１９位カルボキシル基にエステル結合するβ−
Ｄ−グルコピラノシル基の６位水酸基に転移したフラク
トフラノシルルブソシドを製造する。

【００１３】本酵素反応に用いることができるβ−フラ
クトシル転移酵素としては、ルブソシドの１９位カルボ
キシル基にエステル結合するβ−Ｄ−グルコピラノシル
基の６位水酸基にβ−Ｄ−フラクトフラノースを２位の
位置で結合させるものであればいずれも使用可能であ
り、例えばアルスロバクター・パセンス（ＩＡＭ第１２
３４３号）やアルスロバクター・ラモサス（ＩＡＭ第１
２３４４号）の生産する酵素を挙げることができる。

【００１４】本反応に使用できるルブソシドは、精製品
に限定されるものではなく、例えば甘葉懸鈎子の抽出液
や粗精製品であってもよく、反応に際しては、ルブソシ
ドの精製度によっても異なるが通常ルブソシドに対して
β−フラクトフラノシル糖化合物を１〜５０倍の範囲で
使用するのが好ましい。又、反応はｐＨ４〜８、温度２
０〜７０℃で５〜１５０時間行うのが好ましく、使用す
る酵素量は、反応時間や反応温度により適宜調節して時
間内で反応がほぼ終結する量が選ばれる。

【００１５】反応終結後、反応液を吸着樹脂、例えばダ
イヤイオンＨＰ−２１（三菱化成（株）製、登録商標）
を充填したカラムに負荷する。該カラムを良く水洗した
後、溶媒、例えば含水アルコールを用いて溶出すると、
未反応ルブソシドを含むフラクトフラノシルルブソシド
を得ることができる。この混合物中からの目的物フラク
トフラノシルルブソシドの単離・精製は、その必要性に
応じ通常の各種液体クロマト法を用いて精製することが
できる。

【００１６】この様にして得られるフラクトフラノシル
ルブソシドは、次いでα−グルコシル糖化合物、例えば
澱粉部分分解物の共存下にα−グルコシル転移酵素を作
用させることにより、ルブソシドの１３位水酸基にエー
テル結合するβ−Ｄ−グルコピラノシル基の４位水酸基
に基〔α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）〕ｎ（こ
こで、ｎは１ないし５である）が転移してなる本発明の
ルブソシド誘導体へと導くことができる。

【００１７】この酵素反応に用いることができるα−グ
ルコシル転移酵素としては、６位にフラクトースあるい
はガラクトース等のグルコース以外の糖が転移したグル
コシル基は受容体となり得ない酵素、例えばバシラス・
マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）又
はバシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の生産す
るＣＧＴａｓｅが好ましく、使用する酵素量は、反応温
度や反応時間により適宜調節し、その時間内で反応がほ
ぼ終結する量が選ばれる。

【００１８】反応に用いるフラクトフラノシルルブソシ
ドは、精製されたものに限定されるものではないが、後
の精製工程を考えると精製品を使用するのが好ましく、
反応に際してのフラクトフラノシルルブソシドとα−グ
ルコシル糖化合物との比率は、フラクトフラノシルルブ
ソシドの精製度によっても異なるが、好ましくは１〜５
倍の範囲である。又、反応はｐＨ４〜８、温度２０〜７
０℃で５〜２４時間行うのが好ましい。

【００１９】反応終結後、反応液を吸着樹脂、例えばダ
イヤイオンＨＰ−２１（三菱化成（株）製、登録商標）
を充填したカラムに負荷する。該カラムを良く水洗した
後、溶媒、例えは含水アルコールを用いて溶出すると、
未反応フラクトフラノシルルブソシドと本発明ルブソシ
ド誘導体の混合物を得ることができる。

【００２０】この混合物は、甘味度及び甘味質の両面で
著しく改善されたものであり、このままでも使用に供す
ることができるが、必要により液体クロマト法を用いて
化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ及び化合物Ｆ
に分離、精製するとことができる。

【００２１】本発明の甘味料ルブソシド誘導体は、甘味
料として単独で使用してもよく、又他の甘味料、調味料
等と混合して使用することもできる。

【００２２】

【実施例】以下、実施例をもって本発明をより具体的に
説明する。β−フラクトシル転移酵素の調製 普通寒天平板培地にアルスロバクター・パセンス（ＩＡ
Ｍ第１２３４３号）を接種し、２８℃で２日間培養し
た。この菌の１白金耳をとり液体培地（酵母エキス：
０．５％、ショ糖：５．０％、Ｋ_２ＨＰＯ_４：０．１
％、ＮａＣｌ：０．３５％、ｐＨ：７．０）（８０ｍｌ
試験管、培地１０ｍｌ）に移植し、２８℃で２日間培養
した。これを種菌として同組成からなる液体培地（５０
０ｍｌ坂口フラスコ、培地１２０ｍｌ）に移植し、２８
℃で２日間震盪培養した。更にこれを種菌として同組成
からなる液体培地（５０リットル培養タンク、培地３０
リットル）に移植し、２８℃、１／２ｖｖｍ、２５０ｒ
ｐｍで２日間通気攪拌培養した。培養終了後培養液を遠
心分離し、上清をイオン交換樹脂セパビーズＦＰ−ＤＡ
１３（三菱化成（株）製）の液体クロマトに付して精
製、限外濾過膜で濃縮して粗酵素液を得た。本酵素液
は、ｍｌ当たり１０単位のβ−フラクトフラノシダーゼ
を含有していた。

【００２３】尚、酵素活性の測定は、次の方法により行
った。２０％ショ糖溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ
６．０）１００μｌに酵素液１００μｌを添加し、４０
℃で１０分間反応させる。反応液の一定量をとり、沸騰
水中に入れて酵素を失活させた後Ｆキットにより遊離す
るグルコース量を定量する。酵素の１単位は、１分間に
１μＭのグルコースを生成させる酵素量とする。

【００２４】ルブソシド誘導体の製造 甘葉懸鈎子の葉から抽出、精製したルブソシド（純度９
７％）２０ｇとショ糖４９８．４ｇとを５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し（液量１２４６ｍｌ）、
先に調整した酵素β−フラクトフラノシダーゼ１００単
位を添加して４０℃で１２０時間反応させた。反応液を
吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２１（三菱化成（株）製、
登録商標）４００ｍｌを充填したカラムに負荷し、該カ
ラムを３倍量の水で洗浄後８０％メタノールで溶出し
た。溶出液を減圧下に濃縮すると未反応ルブソシド及び
糖転移生成物の混合物が得られた。この混合物を液体ク
ロマト〔カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−１０／
２０ １０ｃｍφ×４０ｃｍ（野村化学（株）製）、溶
媒：アセトニトリル／水＝２：８〜１：１、流速：１０
０ｍｌ／ｍｉｎ．、検出：ＵＶ２１０ｎｍ〕に付して分
画、分取してβ−Ｄ−フラクトフラノシル基がルブソシ
ドの１９位カルボキシル基にエステル結合するβ−Ｄ−
グルコピラノシル基の６位水酸基に転移したフラクトフ
ラノシルルブソシド（Ｒｕ−Ｆ）１．２５ｇを得た。

【００２５】続いて、このフラクトフラノシルルブソシ
ド（Ｒｕ−Ｆ）粉末１ｇを１０％パインデックス＃１０
０（松谷化学（株）製、登録商標）４．９７ｇとともに
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し（液量４
６．７ｍｌ）、コンチザイム（天野製薬（株）製：水で
３．５倍に希釈したもの）４．９７ｍｌを添加して４０
℃で２４時間反応させた。反応液を吸着樹脂ダイヤイオ
ンＨＰ−２１（三菱化成（株）製、登録商標）１６．０
ｍｌを充填したカラムに負荷し、該カラムを３倍量の水
で洗浄後１０倍量の８０％メタノールで溶出した。溶出
液を減圧下に濃縮すると、未反応フラクトフラノシルル
ブソシド（Ｒｕ−Ｆ）を含む糖転移混合物（１．３５
ｇ、試料−１）を得た。

【００２６】試料−１につき、前記と同条件での液体ク
ロマトに付して分画、分取して画分Ａ〜Ｆを得た。各画
分より得られる化合物（化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、
Ｆ）は、Ｃ^１３核磁気共鳴スペクトル及び質量分析スペ
クトルの解析結果、及び各々を選択的部分加水分解した
ものの構造解析の結果から、化合物Ａは未反応のフラク
トフラノシルルブソシド、化合物Ｂ〜Ｆはフラクトフラ
ノシルルブソシドの１３位グルコシル基の４位水酸基に
それぞれＤ−グルコース、Ｄ−マルトース、Ｄ−マルト
トリオース、Ｄ−マルトテトラオース、又はＤ−マルト
ペンタオースがα−１，４結合で結合したルブソシド誘
導体と同定することができた。また、試料−１を同条件
で液体クロマトし、粗分画することにより未反応フラク
トフラノシルルブソシド画分と化合物Ｂ〜Ｆを含む画分
（試料−２）を得た。

【００２７】評価試験 実施例で得られた本発明のルブソシド誘導体（化合物
Ｃ、試料−２）、並びに比較例としてフラクトフラノシ
ルルブソシド及びフラクトフラノシルステビオシドを用
い、甘味度及び甘味質試験について１１人のパネラーに
より下記の方法により行った。

【００２８】評価方法 甘味度：各サンプルの水溶液及びしょ糖水溶液の５水準
をブラインドで同時に呈示し、同強度の甘味を有するし
ょ糖溶液を選ぶ。 甘味質：各サンプルの蔗糖５％等価濃度水溶液をそれぞ
れブラインドで呈示し、渋味、苦味、刺激性、しつこ
さ、くせ、まろやかさ、スッキリさ、後味（残味）の８
評価項目について、しょ糖を基準（０）として次の７段
階で評価する。 非常にない：−３ かなりない：−２ ややない ：−１ 普通 ： ０ ややある ：＋１ かなりある：＋２ 非常にある ＋３ 得られた結果を第１表に示す。尚、表中Ｒｕ−Ｆ及びＳ
ｔ−Ｆは、それぞれ比較例としてのフラクトフラノシル
ルブソシド及びフラクトフラノシルステビオシドを示
す。

【００２９】

【表１】

【００３０】

【効果】本発明のルブソシド誘導体は、これまでのステ
ビオール系甘味料に比べ甘味度、甘味質ともに優れたも
のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 堀 尚代 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社基礎研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】甘味配糖体ルブソシドにおいて、１９位カ
   ルボキシル基にエステル結合するβ−Ｄ−グルコピラノ
   シル基の６位水酸基にβ−Ｄ−フラクトフラノシル基が
   ２位の位置で結合し、更に１３位水酸基にエーテル結合
   するβ−Ｄ−グルコピラノシル基の４位水酸基に基〔α
   −Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）〕ｎ（ここで、ｎ
   は１ないし５を表す）がエーテル結合してなるルブソシ
   ド誘導体。