JPH0213372A

JPH0213372A - スーパーオキサイド・ジスムターゼの精製法

Info

Publication number: JPH0213372A
Application number: JP16286988A
Authority: JP
Inventors: Koichi Miyata; 宮田　孝一; Shohei Nakamura; 昌平中村
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-06-30
Filing date: 1988-06-30
Publication date: 1990-01-17

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、スーパーオキサイド・ジスムターゼ（以下Ｓ
ＯＤと略す）の新規な分離精製法に関する。

［従来の技術および課題］ＳＯＤは広く生物界に存在し、酸素分子が一電子還元を
受けて生じるスーパーオキサイド・アニオンラジカル（
Ｏｌ）を消去する酵素で、近年、抗炎症剤として種々の
炎症、変形性関節症、リウマチ性関節炎、虚血性疾患、
放射線照射による副作用、およびある種の泌尿器疾患な
どの治療等に薬理効果が認められている。これまでＳＯ
Ｄは加熱処理、硫酸アンモニウムによる塩析、有機溶媒
による分割、ＤＥＡＥ−セルロース［ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、）、　２４４．６０４９（１９６９）］、］
ＤＥＡＥ−セファデックスジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、８５．１３９
７（１９７９）］、］ＣＭＣルーロースＣＭ−セファデ
ックス［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

）　、２４８．３５ｇ２（１９７３）］等のイオン交換
樹脂やハイドロキシアパタイト［ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、）　、２５２゜６４２１（１９７７）］を用いて精製
する方法が知られているが、これらの方法では精製工程
中に脱塩操作を必要としたり、吸着や溶出に長時間を要
したりするなどの問題点がある。また、フェニル基やオ
クチル基の結合した架橋アガロースゲルを用いたＳＯＤ
の精製方法（特公昭６０−１２０２５号）およびブチル
基の結合したポリビニル系合成高分子ゲルを用いたＳＯ
Ｄの精製方法（特開昭６３−４９０７８号）も知られて
いるが、これらはゲルの機械的強度が弱いために高流速
操作が難しい、ゲル粒子が不均一になりやすいために高
分離能が得にくい、高価である、等の問題点がある。さ
らに、銅または亜鉛キレート基を結合させた多孔質不溶
性担体によるＳＯＤの精製方法（特公昭６０−１２０２
６号）も搗案されているが、これは担体使用毎に金属キ
レート基を担体に結合させなければならず、そのため操
作が煩雑である、クロマトグラフィーの再現性が得にく
い、等の問題点がある。従って、これら従来のＳＯＤの
精製方法は工業的にＳＯＤを大量精製するには不向きと
考えられる。本発明者らは、これら問題点を解決するた
め種々研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

［課題を解決する手段］本発明は、ＳＯＤを含有する溶液をポリアクリル酸エス
テル系非イオン性合成吸着剤に接触させてＳＯＤを吸着
させ、次いで、吸着されたＳＯＤを分別溶出することを
特徴とするＳＯＤの精製方法を提供するものである。

本発明で用いられるポリアクリル酸エステル系非イオン
性合成吸着剤としては、アクリル酸もしくはメタアクリ
ル酸等のアルキル置換アクリル酸のアルキルエステルの
重合物で巨大網状構造を有する多孔性の非イオン性合成
吸着剤が挙げられ、また、アルキルエステル部の一部に
スルホキサイド等が含まれていもよく、さらにエステル
結合のほかに一部アクリル酸アミド結合等を有している
もの、また、前記ポリアクリル酸エステル系の組成が約
５０％以上であれば、たとえばアクリロニトリル等との
共重合物でもよい。

また、これらの樹脂のうち、非極性のものよりは極性を
もったものがより好ましく使用できる。

ポリアクリル酸エステルのみからなる合成吸着剤として
は、例えば、商品名ダイヤイオンＩ（Ｐ−ＩＭＧ、ＨＰ
−２ＭＧＳＨＰ−３ＭＧ（三菱化成工業株式会社製）、
アンバーライトＸＡＤ−７、ＸＡＤ−８（米国ロームア
ンドハース社製）等で市販される吸着剤がある。また、
ポリアクリル酸エステルのアルキルエステル部の一部に
スルホキサイドが含まれている合成吸着剤としては、例
えば、商品名アンバーライトＸＡＤ−９（米国ロームア
ンドハース社製）の吸着剤がある。

本発明の対象とするＳＯＤとしては、例えば、哺乳動物
由来のＳＯＤや微生物由来のＳＯＤ等、生物界において
広い範囲で分布しているものを適宜使用でき、特に起源
を限定するものではないが、好ましくは微生物由来のＳ
ＯＤを用いるとよい。

本発明においてポリアクリル酸エステル系非イオン性合
成吸着剤に吸着させるＳＯＤ溶液はあらかじめ、２〜３
Ｍの塩類を加えてから使用する。

ここで、用いられる塩類は、アンモニウムイオンあるい
は金属イオン等の陽イオンと各種無機酸あるいは有機酸
等の陰イオンよりなる比較的水溶性の高い塩類が挙げら
れ、陽イオンとしてはアンモニウムイオン、ナトリウム
、カリウム、リチウム等のアルカリ金属イオン、マグネ
シウム、カルシウム等のアルカリ土類金属イオンおよび
亜鉛、コノ（ルト等の金属イオンよりなる水溶性塩類が
より好ましい。また、陰イオンとしてはクロルイオン、
硫酸、リン酸、硝酸イオン等の無機酸イオンおよび酢酸
、酒石酸、クエン酸イオン等の有機酸イオンよりなる水
溶性塩類がより好ましく用いられる。

水溶性塩類の具体例としては、例えば、硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム
、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニ
ウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化アンモ
ニウム等がある。塩類の添加によりｐＨが５〜９の範囲
外になる場合には、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム
、塩酸および硫酸等で調整する。

ＳＯＤの該合成吸着剤への吸着は、合成吸着剤を充填し
たカラムを通液して吸着させるカラム法、あるいはＳＯ
Ｄ溶液に合成吸着剤を入れ、攪拌しながら吸着させるバ
ッチ法等の方法によって行なわれるが、カラム法を用い
る方がより好ましい。

カラム法による吸着の流液の比速度（１時間当りの流量
／吸着剤量）は１以下が望ましい。

吸着したＳＯＤの溶出は水あるいは水溶性塩類を含む水
溶液の塩類濃度を段階的に減少させることにより行なう
。また、水溶性の有機溶媒（例えば、メタノール、エタ
ノール、ブタノール、プロパツール、アセトン、酢酸メ
チル、ジオキサン等）あるいは水溶性の有機溶媒に水溶
性塩類を共存させたものでも溶出することができる。こ
こで用いる水溶性塩類は吸着時に共存させてもよい水溶
性塩類と同様のものが挙げられる。

吸着および溶出操作は約０〜３０℃の温度で、さらに好
ましくは約０〜ｌＯ℃で行なわれる。使用後の合成吸着
剤は水酸化ナトリウム洗浄、水洗浄をすることにより繰
り返し使用できる。また、本発明の精製法を従来の塩析
法、溶媒分画法、クロマトグラフィー法、さらには膜分
離法等と組み合わせて行なうことももちろん可能である
。

本発明の精製法の特徴的利点としては、（１）合成吸着
剤のＳＯＤ吸着能か高い。

（２）高塩濃度で吸着させるため試料の脱塩や透析等の
前操作が必要でなく、精製工程がかなり短縮できる。

（３）早い流速が得られ、大量精製することができる。

（４）分離能力が高く、ＳＯＤ比活性を大幅に高めるた
めＳＯＤの精製が容易である。

（５）夾雑物の多い粗ＳＯＤ溶液に直接応用できる。

等が挙げられ、本発明は工業的にＳＯＤの大量精製法と
して極めて有用である。

［実施例］以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施例の範囲
に限定されるものではない。

ＳＯＤの活性測定法はヒボキサンチンとキサンチンオキ
シダーゼとの反応により生じたスーパーオキサイド（０
？）によるネオテトラゾリウムの還元をＳＯＤが阻害す
ることを利用した石黒らの方法［ケミカル・アンド・フ
ァーマシューティカル・ブレティン（Ｃｈｅｗ、　Ｐｈ
ａｒｎ、　Ｂｕｌｌ、）　、２２．２９３５（１９７４
）］に基づいて行なった。蛋白質は２８０ｎｍにおける
吸光度で表わした。

実施例１セラチア・マルセッセンス（ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓ　ＡＴＣＣ２１０７４）をアグリカルチュ
ラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー［Ａｇｒ
ｉｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　３４．３１０（１９７０）
コに記載の方法に従って培養して得られた培養液から遠
心分離法で菌体を集めた。この菌体を水に懸濁し、ダイ
ノミル（スイス、ウィリー・工・バッコーフェン社製）
装置で菌体を破砕した。この破砕液に硫酸アンモニウム
を３０％（ｗ／Ｖ）ｉ１１度に加え溶解後、遠心分離法
でＳＯＤを含む透明な上清液を得た。この上清液１２１
２をあらかじめ３０％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム水（
水酸化ナトリウムでｐＨ７，５に修正）で平衡化したア
ンバーライトＸＡＤ−８カラム（直径６Ｃ１、長さ３６
ｃｚ、充填ｍ　１１２）に５００ｘＣ／時間の流速で通
過させＳＯＤを吸着させた。次いで、カラムを前記３０
％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム水で洗浄した後、水で５
００　ｍ１２／時間の流速で溶出しＳＯＤ活性のあるフ
ラクションを集めた。この溶出パターンを第１図に示す
。この操作で溶出液の比活性は４０５（Ｕ／Ａ２８０）
となり、上清液から１８．４倍上昇していた。また、活
性収率は９６％であった。

実施例２実施例１で用いたと同じＳＯＤを含む上清液１２＆をあ
らかじめ３０％（Ｗ／　Ｖ）硫酸アンモニウム水（水酸
化ナトリウムでｌ）８７　、５に修正）で平衡化したア
ンバーライトＸＡＤ−８カラム（直径６ｃｍ、長さ３６
ｃｍ、充填量１（２）に５００３１１２／時間の流速で
通過させＳＯＤを吸着させた。次いで、カラムを前記３
０％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム水で洗浄した後、２０
％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム水で５００　ｙＱ／時間
の流速で溶出しＳＯＤ活性のあるフラクションを集めた
。この溶出パターンを第２図に示す。この溶出液の比活
性は＋２７０（Ｕ／Ａ２８０）で上清液のそれに比べ５
７．７倍上昇していた。この操作における活性収率は８
７％であった。

実施例３実施例１で得られたと同じ上清液３０ｆ２をあらかじめ
３０％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム水（水酸化ナトリウ
ムでｐＨ７、５に修正）で平衡化したアンバーライトＸ
ＡＤ−８カラム（直径１０ｃｍ、長さ４０ｃ肩、充填量
３ｇ）に１．５１２／時間の流速で通過させＳＯＤを吸
着させた。次いで、カラムを前記３０％（Ｗ／Ｖ）硫酸
アンモニウム水で洗浄した後、２０％（ｗ／ｖ）硫酸ア
ンモニウム水で１　、５　Ｑ／待時間流速で溶出しＳＯ
Ｄ活性のあるフラクシフンを集めた。この操作における
活性収率は８５％で、溶出液の比活性は１４００（Ｕ／
Ａ２８０）となり上清液から６３．６倍上昇していた。

さらにこの溶出液を限外濾過装置（米国アミコン社製、
濾過膜ＹＭ−５、万両分子ｆｉ５０００）で濃縮および
加水の操作を５回繰り返すことによりその比活性は２７
５０　（Ｕ／Ａ２８０）となり、上清液から１２５倍上
昇していた。

実施例４アンバーライトＸＡＤ−８の代わりにダイヤイオンＨＰ
−２ＭＧを使用するほかは実施例１と同様の操作を行な
った。この操作で溶出液の比活性は３９０（Ｕ／Ａ　２
８０）となり、上清液から１７．７倍上昇し、活性収率
は９２％であった。

実施例５溶出剤とし“Ｃ水の代わりに５％（ｗ／　ｖ）硫酸アン
モニウムを含む４０％（ｖ／　ｖ）エタノール水で溶出
するほかは実施例１と同様の操作を行なった。この操作
で溶出液の比活性は３６５（Ｕ／Ａ２８０）となり上清
液から１６．６倍上昇し、活性収率は９０％であった。

［発明の効果］本発明によれば、工業的なＳＯＤの大量精製に適した精
製法が提供出来る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例１における水による溶出パター
ンを示す図面、第２図は実施例２における２０％（Ｗ／
Ｖ）硫酸アンモニウム水による溶出パターンを示す図面
である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）スーパーオキサイド・ジスムターゼを含有する溶
液をポリアクリル酸エステル系非イオン性合成吸着剤に
接触させてスーパーオキサイド・ジスムターゼを吸着さ
せ、次いで、吸着されたスーパーオキサイド・ジスムタ
ーゼを分別溶出することを特徴とするスーパーオキサイ
ド・ジスムターゼの精製法。