JPH03506039A - 転移防止性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 転移防止性ペプチド 光ユ皇肢圭丘立 本発明は一般に、バイオテクノロジーおよび腫瘍学の分野に関する。より詳細に は本発明は、ラミニンＢ１ペプチドの発現および腫瘍細胞転移を処置するための その用途に関するものである。

光里立！景 腫瘍細胞転移（−次腫瘍からの細胞が最初の組織から循環系もしくはリンパ系に 移動して他の組織で二次腫瘍を確立する過程）は、基礎膜（すなわち上皮組織、 神経、脂肪細胞、並びに平滑筋、横絞筋および心筋を包囲する薄い細胞外マトリ ックス）に結合してこれを侵す細胞の能力に関係する。基礎膜は組織および血管 を包囲するので、このバリヤを転移の際に数回横断せねばならない。しかしなが ら最初に、特定の細胞−表面リセブタが各種のグリコ蛋白に結合して、基礎膜に 対する転移性細胞の付着を媒介せねばならない。３種の一般的な付着蛋白はラミ ニン、フィブロネクチンおよびコンドロネクチンである。

ラミニンは、基礎膜に局在しかつ細胞付着のためラミニンを使用する適性が各種 の癌（たとえば結腸癌および乳癌）により示されている（リオソタ（１９８６） 、キャンサー・リサーチ、第４６巻、第１〜７頁；テラノワ等（１，９８３）　 、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンスＵＳＡ、第８０巻、 第４４４〜４４８頁；テラノワ等（１９Ｂ２）、、キャンサー・リサーチ、第４ ２巻、第２２６５〜２２６９頁：並びにプロダウスキーおよびゴスボダロウィソ ッ（１９８１）、ネイチャー、第２８９巻、第３０４〜３０６頁］ので、特に興 味がある。ラミニンに対する抗体で成る種の転移細胞を処理すれば、その基礎膜 に対し相互作用する能力が減少すると共に、細胞をマウスに注射した際に発生す る転移数も低下する〔テラノワ等（１９Ｂ２）、上記］。

腫瘍細胞を基礎膜に付着させるラミニンの機能は、腫瘍細胞に対するＨｉｔｓ− 評議ラミニンの結合（ラオ等（１９８３）、バイオケミカル・バイオフィジカル ・リサーチ・コミュニケーション、第１１１　（３）巻、第８４３８４８頁〕ま たは基′ｇＩＩｌｌコラーゲンに対する腫瘍細胞のラミニン媒介結合〔テラノワ 等（１９Ｂ２）、上記〕のいずれかを測定する簡単なインビトロ分析により示す ことができる。これらの分析は、マウスもしくは人間からの腫瘍細胞を用いて行 なわれる。ラミニン分子の大断片（Ｍｒ　−３００，０００）は、ペプシンでの 蛋白分解切断によって分離することができる（Ｐ＋断片）。このＰ、断片はラミ ニンのための細胞リセブタ結合部位を有するが、コラ−・ゲン結合活性を持たな い〔シャロニス等（１９８５）、ジャーナル・セル・バイオロジー、第１００巻 、第８４３〜８４８頁〕。

Ｐｌは基礎膜に対する腫瘍細胞の結合を阻止し［バースキー等（１９８４）、ジ ャーナル・クリニカル・インベスチゲ・−ジョン第７４巻、第８４３〜８４８頁 ）、さらに基礎膜コラーゲンに対する結合をも阻止する（テラノワ等（１９８３ ）、上記〕。

マウス腫瘍細胞をＰ、で予備処理すれば、動物におけるこれら細胞の転移が著し く減少し、このことは処理細胞を静脈（ｉｖ）投与した後のマウスにおける肺転 移の低下によって示される〔バースキー等（１９８４）、、上記〕。したがって 、インビトロでのラミニン結合の阻止は、インビボでの転移防止活性を反映する 。

ヒトラミニンＢｌｔｌはクローン化されかつヌクレオチドのレベルで配列決定さ れているが〔ビンカライメン等（１９８９）、ジャーナル・バイオロジカル・ケ ミストリー、第２６２巻、第１０４５４〜１０４６２頁］、その大きい寸法（１ ７６５個のアミノ酸マイナスその信号ペプチド）は治療剤としてのその使用を妨 げる。マウスＢ、鎖の各領域から種々の配列まで合成ペプチドが作成され〔ササ キ等（１９８７Ｌプロシーデイング・ナショナル・アカデミ−・サイエンスＵＳ Ａ、第８４巻、第９８９〜９９９頁〕、成る種のこれらペプチドに対する特異的 抗体も作成されている。ドメイン■（すなわち相同反復物のシスティン・す・７ チな領域）からのペプチドに対する抗体はラミニンに対する細胞付着を阻止した が、ペプチド自身は不活性であった（グラフ等（１９８７）、セル、第４８巻、 第９８９〜９９６頁］、ドメイン■における配列に対応した他のペプチドも合成 されており、９−アミノ酸ペプチド（Ｃ［１ＰＧＹ　ＩＧｓＲ）はヒト繊維内１ ｊｌＨＴ−ｔｏｓｏおよび支那ハムスター卵細胞の細胞付着および６７ＫＤ付着 リセブタに対する結合において直接的に活性であることが判明した。このペプチ ドはモル基準で細胞付着におけるラミニンの活性の０，５〜１％しか示さず、こ れは効率的なラミニンリセブタ結合に必要な構造決定子の僅か〕部を示すに過ぎ ないことを示唆する。さらに、このペプチドは８１６ＦＩＯ黒色腫細胞の移動を 促進することも判明した。

予備研究が示唆するところでは、５−アミノ酸ペプチド（５置体）ＹＩＧＳＲお よび６−アミノ酸ペプチド（６量体）ＣＹＩＧＳＲは、細胞付着とリセブタ結合 と細胞移行活動とを可能にするのに充分な情報を有する（グラフ等（１９８７） 、バイオケミストリー、第２６巻、第６８９６〜６９００頁；イワモト等（１９ ８８）、ジャーナル・セル・フィジオロジー、第１３４巻、第２８７〜２９１頁 ）、アミド型のペンタペプチドはＹＩＧＳＲ自身のほぼ２倍の活性を有するが、 ５量体と６量体との両者はＣＤＰＣ；ＹＩＧＳＲと比較して低いが顕著な活性を 有すると思われる。

主里坐Ｉ左 本発明は、式 ％式％ 〔式中、Ｐｒｏ　、はＰｒｏもしくはｄｅｓ、ＮＨ２Ｐｒｏのいずれかであり、 ＸはＣｙｓであるか或いは中性脂肪族アミノ酸よりなる群から選択され、Ｙは− ０１１もしくは−１４１４，のいずれかである〕の新規なラミニンペプチドに関 するものである。

本発明による医薬組成物は、ラミニンペプチドおよびその同族体またはその無毒 性塩を医薬上許容しうる液体もしくは固体キャリヤに分散させて含有する。この 種の医薬組成物は、治療目的または診断目的で投与するため、人間および家畜の 両者に臨床医薬として使用することができる。

本発明のペプチドは、ラミニン細胞結合の阻止方法および転移病の処置に有用で ある。

口皿例１巣久説所 第１図はＣＴＡト（／　ＬａｍＢ＋　−４０融合蛋白に関する細菌発現系のヌク レオチドおよび主たるＩＩ遣的特徴を示し、第２図は（Ａ）臭化シアノゲン切断 の前および（Ｂ）臭化シアノゲン切断の後におけるＣＴＡＰ　　ｍ／　ＬａｍＢ １−４０の逆相ＨＰＬＣ精製経過を示す図面である。

光■π圧縦ｌ説所 ペプチドを定義するために使用する命名法は慣用の表示にしたがい１、Ｎ−末端 におけるアミノ基を左側にかつＣ−末端におけるカルボキシル基を右側に示す。

アミノ酸は、典型的にはＧｌｙ　、　Ａｌａ　、Ｖａｌ　、Ｌｅｕ　＋　Ｉｌｅ 　、　Ｓｅｒ　、　Ｔｈｒ　、　Ｌｙｓ　ｌｌｌｒｇ　＋Ａｓｐ　　、　　八ｓ ｎ　　ｌ　Ｇ！ｕ　　ｌ　Ｇｉｎ　　ｌ　Ｃｙ３　　、　　Ｍｅｔ　　、　　Ｐ ｈｅ　　、　　Ｔｙｒ　　、　　Ｐｒ潤@　、　　Ｔｒｐ および旧Ｓからなる蛋白に見られる天然アミノ酸の１種を意味すると理解される 。アミノ酸残基が異性体型を有する場合、これは特記し２ない限り示されるアミ ノ酸のし一型であるウベブチドに続く添字ｒ−０１１」およびｒ−ＮＯ□」は、 それぞれポリペプチドの遊離酸型およびアミド型を意味する。添字を使用しない 場合、両者の型を包含することを意図する。

本発明は、弐： Ｐｒｏ＋−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａ３ｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−＾５ｐ−５Ｐｒ−Ｇｌｙ −八ｒｇ−ＧｉｎＰｂｅ−へｌａ−Ａｒｇ−，５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ −Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−１，ｅｕ　　Δ１ａ−Ｘ −Ｖａ　１．−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌ　ｙ− ５ｅｒ−ｌｉｒｇ−Ｃｙｓ　−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｙ〔式中、Ｐｒｏ＋はＰｒｏも しくはｄｅｓ−Ｎ）ｌｚＰｒｏのいずれかであり、ＸはＣｙｓであるか或いは中 性脂肪族アミノ酸よりなる群から選択され、Ｙは０１１もしくは１＋１１□のい ずれかである］を有するラミニンペプチドをｌする。このペプチドは、ヒトラミ ニンＢ、蛋白のアミノ酸残基８９７〜９３６にまたがる領域に対し実質的な相同 性を有する。本明細書中に使用する中性脂肪族アミノ酸はアラニン、バリン、ロ イシン、イソロイシン、セリンおよびスレオニン、特にセリンとして規定される 。

本発明の好適ラミニンペプチドは次の配列：１１８！　−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ　−Ｐ ｒｏ−Ａｓｐ−Ｇ　ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ −Ｐｈｅ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇ　ｌｎ−Ａｓｐ−Ｐ ｒｏ−Ｖａ　Ｉ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｎ−Ｌｅｕ−八Ｉａ−３ｅｒ−ＶａＩ −Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ａｒｇ −Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａ！ｇｐ−０１（ を有し、ここで位置９２３における天然Ｂ＋　ラミニン配列に存在するシスティ ンはセリンにより置換されて、特定ペプチド内の不正確なジスルフィド結合の発 生を最小化さセる。このペプチドを、ここでは’Ｌａｍ　Ｂ＋　　　４０　（Ｓ ｅｒ＊、）　Ｊと称する。

ここで用いる「結合組織−活性化用ペプチドｍ」または１’ｃＴＡＰ−ＩＩ［Ｊ は、結合＆ＩＩ繊細胞を活性化しうるヒト血小板から分離された天然ポリペプチ ドを意味する。ヒトＣＴＡＰ−■または位置２１におけるメチオニンがロイシン で置換されたＣＴＡＰ−１１［の同族体をコードする合成遺伝子が、１９８５年 ３月１４日付は公開の国際特許用ＩＪＷＯ８５１０１０６７号公報に記載されて おり、これを参考のため特にここに引用する。

本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成技術、液相ペプチド合成、または組 換ＤＮＡ法によって製造することができる。

これらペプチドは化学法により従来合成されているペプチドよりも実質的に長い ので、本発明のラミニンペプチドを製造するには組換ＤＮＡ技術が好適な方法で ある。

Ａ１級逸抜 １、二り叉二作成 本発明のラミニンＢ１ペプチドをコー１′するＤ　ＮＡを含んだハイブリッド遺 伝子を発現すべく用いられる細菌プラスミドヘクターは、ワ１／−およびジョン ソン（（１９８５）、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス ・ｔＪ　Ｓ　Ａ　、第８２巻、第８３８９〜８３９３頁およびＷＯ３５１０Ｒ＜ １６７号（上記）、その両者を参考のため特にここに引用する〕に記載されたｐ Ｔｈ・ｌ　Ｐ　６　＜フタ−の改変物である。このプラスミドは、コリシンＥ１ オペロンのサブ断片がｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位にクローン化されたｐ　Ｂ　 Ｒ３２２ｍ導体である。コリシ：／Ｅ１サブ断片は、プロモータとリブ！／ンナ 結合のためのオペレータ部位とリポソーム結合部位と翻訳開始コドンとコリシン Ｅ１構造遺伝子の１部と転写ターミネータとからなるコリシンＥ１発現制御配列 で構成される。この発現制御配列は誘導しうる転写開始制御領域を有し　ここで プロモータは感温性リプｌ／　７す一１５濱△１、温度誘導性リグ１／ソサ−失 活剤二匹Ａにより或いは化学誘導により制御することができる。

後記実施例で用いるラミニンＢ１ペプチドは、４０〜アミノ酸ポリペプチドをコ ードする合成りＮＡから産生される。後記実施例３で記載するように、合成遺伝 子はＤ　Ｎ　Ａの１４９塩基対よりなり、これらを組上げて２個の主サブ断片を 形成する。

ホスホルアミダイト化学を用いて、アプライド・ビオシステムス・Ｄ　Ｎ　Ａ合 成装置で６′１４のオリゴヌク１．／オ千ドを合成した。

慣用技術を用いて１、ベブチ１′をコードするＤＮＡを改変ｐＮＰ６−５クター にクローン化させ、得られたヘクターを用いてその後にペプチドをＣＴＡＰ−融 合蛋白として発現させるため細菌細胞を形質転換させる。以下の実施例にて特に 引用しない場合、組換ＤＮＡ法はマニアチス等（１９８２）、［モレキュラ・ク ローニング」、コールド・スプリング・ハ・−バー・ラボラトリ−、コールド・ スプリング・ハーバ−・ニューヨークに記載すれている。融合蛋白を細胞から夕 ）離し、次いで可溶化させ、精製しかつバイブ１ノソド蛋白を切断するための方 法も文献に記載されている〔たとえばイタクラ等（］、　９７７　）　、サイエ ンス、。

第１９８巻、第１０５６〜１０６３頁；シャイン等（１，９８０）、ネイチャ・ −３第２８５巻、第４５５〜４６１頁〕。必要ならば、蛋白生産物を折り重ねる ための方法も可能である（Ｔ、　　Ｅ、　クレイトン、プロシーディング・サブ ・ジエネノクスーｔＪ　ＣＬ　Ａシンポジウム（１９８５）、キングストン（印 刷中）］。これら全刊行物の教示を参考のためここに引用する。

２、盲ユ貫ｌ及刀１ クローン化および原核性発現に用いる宿主菌株は広範に人手でき、たとえばＭＣ ｉ　Ｏ６０，ＤＨ１，ＲＲ１，Ｃ６００ｈｆｌ　。

ＨＢ　１０１．　　ＪＡ、２２１．　ＭＭ２９４およびＪＭＩＯＩのようなイー ・コリ菌株を包含する。

ｐＮＰ６発現ベクターおよびその誘導体の制御メカニズムは５ＤＮＡを破壊する 化学薬剤もしくは物理薬剤によるイー・コリのコリシンＥ、オペロンの誘導性に 基づいている。当業界にて公知であるように、コリシンＥ、系以外のヘクター系 も同様に制御される。ミドマイシンＣは、最も効果的な化学誘導剤であることが 示されている。しかしながら、医薬用途を有する蛋白を生産するためのミドマイ シンＣの使用は、産生過程および精製過程におけるこの化学薬剤の完全除去もし くは失活を必要とし、これは面倒かつコスト高である。

コリシンＥ、プロモータは陰性比較（たとえばｌａｘ　Ａ遺伝子によりコードさ れ、オペレータに結合するりブレンサ蛋白）により制御されるので、温度変化に よる転写開始を用いることができる。代案として或いはそれに加えて、ｒｅｃ　 Ａ蛋白の温度誘導活性化により誘導を行ない、　ｌｅｘ　Ａリプレッサの失活を 与えることもできる。したがって、簡単かつ安価な誘導方式を開発するための対 策に合致するよう、感温性の宿主菌株が用いられる。この種の菌株はＤＭ５１１ ．ＤＭ９３６およびＤＭ１１８７（マウント等（１９７５）、ジャーナル・バク テリオロジー、第１２１巻、第１２０３〜１２０７頁）を包含する。これら菌株 は、温度が３０°Ｃから約４２°Ｃまで変化する際に、ＳＯ８機能が抑制解除さ れて所望のハイブリッド遺伝子をｐＮＰ６ヘクターにて高レベルで発現するｒｅ ｃ　Ａもしくは」Ａ遺伝子に突然変異を有する。当業者には了解されるように、 ｔｓ突然変異を有するプラスミドも本発明の目的に用いることができる。

所望のハイブリッド遺伝子を高し−・ルで発現させるための本発明による誘導方 式は、核酸塩基もしくはヌク（／オ千ド、特にプリン塩基（たとえばアデニンも しくはアデノノンであるが、遊離塩基チミンも同様に作用する）をユ匹Ａおよび 」竺Ａ怒温性突然変異体の作用を増幅する誘導の時点で培地に添加して向上させ ることもでき、ＳＯ３制御機能の一層高い発現をもたらす。改良は、感温性誘導 につき観察されるよりも少なくとも１０％高い発現である。

３、ＩＩＩ 形質転換された微生物を、適する増殖培地にて典型的には６５０ｎｍにて少なく とも約１０、好ましくは６５０ｎ−にて約２０〜４０もしくはそれ以上の光学密 度（ＯＤ）まで増殖させる。

増殖培地の組成は関与する特定微生物に依存し、典型的には炭素および窒素の資 化性原料と、たとえばグルコースのようなエネルギー源とマグネシウム、カリウ ムおよびナトリウムイオンと必要に応じアミノ酸、並びにプリンおよびピリミジ ン塩基とを含有する。

菌体を培地から回収した後、必要に応じこれらを濾過、遠心分離または他の慣用 の方法により約０．１〜１、Ｏｇ、／ｎｐ、好ましくは０．２〜０．５ｇ／ｎ／ ！まで濃縮する、二とができる。

ｆＡ縮後、菌体の溶菌は細胞膜の破壊によって達成される。この工程には、慣用 の細胞破壊技術、たとえばホモゲナイズ、音波処理または加圧サイクルを用いる ことができる。好適方法は音波処理、またはスタンステンド・セル・ディスラブ タを用いるホモゲナイズである。破壊工程の終点は、光学密度によって監視する ことができ１、懸ｉＩ！ｉｉ物の光学密度は典型的には約６５〜８５％低下する 。いずれにせよ、この破壊工程はほぼ全部の菌体を破壊して、完全菌体が殆んど 第１精製工程まで運ばれないようにする。破壊工程の前に、濃縮物の液相におけ るイオン強度および、＋１を必要に応し次の工程でイー・コリ蛋白の除去を容易 化させるレベルまで調整すると共に、融合蛋白を細胞残骸中に不溶性複合物とし て保持する。ｐｌ（は、適当な緩衝剤を添加し７て調節することができる。大抵 の場合、約７，５へ約９．０の範囲の篩が使用される。

融合蛋白の苛溶化は、たとえばグアニジン塩もしくは尿素のような強力な変性剤 を用いてケイ第１・ロープ環境にて行なわれるが、たとえばトリトン、ＳＤＳお よびチオシアン酸イオンの塩などの洗剤を用いることもできる。典型的には、グ アニジン塩については１〜７Ｍの濃度範囲にて操作可能であるが、４〜６Ｍが好 適であり、洗剤は１〜２％溶液の範囲で用いられる。

さらに、溶液のｐＨは融合蛋白の特性に対し適合性とせねばならない。

融合蛋白が可溶化された後、次いでこれを選択的に切断しろる部位の性質に応じ て選択的に切断することができる。選択的切断方法の１種は臭化シアノゲンであ る。この技術は、切断部位以外には筒便メチオニンが存在しないこと或いは切断 すべきメチオニンとポリペプチド配列内のメチオニンとの間で選択的に区別しう る能力を必要とする。或いは、特定種類のアミノ酸により同定される部位を認識 しかつここで切断するプロテアーゼを用いることもできる。一般的なプロテアー ゼはトリプシン、キモ［・リブシン、ペプシン、プロメレイン、バベインなどを 包含する。トリプシンは塩基性アミノ酸につき特異的であり、リジンもしくはア ルギニンのいずれかに対するペプチド結合のカルボキシル側にて切断する。さら に、アミノ酸の特定配列にて切断する酵素も存在する。牛エンテロキナーゼは、 アスパラギン酸、グルタミン酸またはカルボキシメチルシスティンの酸性残基に 続くリジンもしくはアルギニンのカルボキシル側で切断する。特定配列を認識し かつ切断する他の酵素はコラゲナーゼ、因子Ｘ、スロンビンおよびポリウビクイ チン処理酵素を包含する。

可溶化された蛋白をイオン交換により精製すべき場合は、たとえば透析濾過また は逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＬＣ）のような透析または均等方法によ って可溶化剤を除去することができる。

切断工程に続く回収法の工程は主として、興味あるラミニンＢ、ペプチドをＣＴ ＡＰ−ＩＩＩおよび外来イー・コリ蛋白からさらに分離して、異質蛋白を高純度 レベル（好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９５％） で少なくとも約５０■／Ｉｌ、より好ましくは約５０〜５００■／Ｅの高密度収 量にて与えるよう設計される。

切断工程の後、融合蛋白のポリペプチド成分を、たとえばイオン交換クロマトグ ラフィーのような慣用のクロマトグラフ工程を用いて２はぼ純粋な形態で容易に 分離することができる。

２種のポリペプチド成分、すなわちＣＴ　Ａ　Ｐ　　ｍ　（Ｌｅｕｚｉ）および ラミニンＢ、ペプチドの帯電特性の差は、陰イオン交換クロマトグラフィーの便 用を好適にする。イオン交換クロマトグラフィーを用いてラミニンＢ、ペプチド を精製する場合は、固体支持体に付着した陽イオン基を有する強陰イオン型交換 樹脂が好適である。多糖類支持体が一般に好ましく、ごの種の一触的に用いられ るイオン交換樹脂、たとえばデキストラン１．アガロ・−スもしくはセルロース のビーズを包含する。

当業者が知っているように、強陰イオン交換樹脂は比較的広いｐｔｉ範囲にわた り正電荷を維持する陽イオン基を持った樹脂を意味する。支持体に結合する陽イ オン基は、たとえば−ｃＨｇｃｉＩ□Ｎ　”　（ＣＴｏＣＨｌ）　ｇｃｌ’１ｚ ｃＨ（ＯＨ）Ｃｔｌ、のような第四アンモニウム基から選択することができる。

本発明の実施に使用するのに適した市販の陰イオン交換樹脂の例はＱＡＥ−セフ ァデックスＡ、−２５，ＤＥ−５２，ＱＢ−５２セルロース、セレンクスＱ　Ａ 　Ｅ　、モノＱおよびＱ−セファロース・ファースＩ・・フローを包含する。

陰イオン交換樹脂は一般に、充填カラムの形態で用いられる。

楕用技術壱用いてカラムを平衡化させ、さらに切断反応生成物の溶液をカラム上 に充填する。アルカリ性ｐｌ（約７，８）を有するＣＴＡＰ−ｍ　（Ｌｅｕｚ＋ ）は約６．８未満のｐｔＩ値にて効率的に結合せず、酸性ｐｌを有するＬａＩＩ Ｂ＋　　　４０　（Ｓｅｒｇｔ）ペプチドはカラムに結合する。緩衝溶液のイオ ン強度を典型的には０から０．７５　ＭのＮａＣｊ２まで上昇させることにより 、ペプチドを溶出させる。Ｎ　ａ　Ｏｆｌおよび非イオン型洗剤の溶液で洗浄し て全ての残留汚染蛋白質もしくは可溶化剤を除去すると共にカラムを平衡化させ て、二〇カラムを再生することができる。

たとえばラミニンＢ、ペプチドをＣＴＡＰ−ｍ　（Ｌｅｕ□）に融合させる場合 、陰イオン型交換カラム（たとえばファルマシア社からのモノ−ＱまたはＱセフ ァロース）を用いて、その等電点の差（１，ａｎ　Ｂ　＋　　　４　Ｃ）　（５ ｅｒｚ＋）ペプチド−３，６５；ＣＴＡＰ−［１１１＝　７．８　）に基づき２ 種の蛋白を分離することができる。ｐＨ５，５の緩衝液において２．ペプチドは 陰イオン型交換カラムに結合するのに対し、ＣＴ　Ａ、　Ｐ−ＩＩＩは結合しな い。ペプチドの溶出は、ＮａＣｆｆ１の線状１１勾配（０〜０．５　Ｍ　）で行 なうことができる。典型的には、純度９０％よりも高いＬａｍ　Ｂ　、−４０の 貯蔵フラクションを必要に応し疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、 、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィーまたはその組合せ によりさらに精製にかけることができる。

ごれら蛋白試料をたとえばフチオスｌ／イトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエ タノ・−ル、グルタチオンもしくはシスティンのような還元剤と共に培養して、 還元するごとにより、その後のクロマトグラフ工程で用いる前に回収工程にて分 子間もしくは分子内のジスルフィド結合の形成を防止することができる。

疎水性相互作用クロマトグラフィーは、たとえばフェニル−セファロース、フェ ニル−ＴＳＫ　　ＨＰＬＣもしくはフェニル−・スーパーロースのような疎水性 支持体を用いる。この方法は、蛋白帯電特性に基づいて分離するイオン交換クロ マトグラフィーとは異なり、蛋白の疎水性に基づいて蛋白を分離する。適する緩 衝剤および溶出条件の選択は当業者に公知である。

ゲル濾過クロマトグラフィーは、所望の異質蛋白よりも高い或いは低い分子量を 持った発熱性成分および蛋白汚染物の両者を除去する２つの工程で行なうことが できる（例としてＬａｍ　Ｂ１−４０は約４．６００キロダルトンの分子量を有 する）、溶液を分別してペプチドをこれら汚染物から分離しうるゲルが市販され ている。ごのカラムを、所望成分の適当な分割を可能にするよ・う寸法決定する 。本発明の方法においては蛋白がイオン交換工程後に高レベルの純度（はぼ常に ８５％もしくはそれ以上の高さ）を有するので、一般的な欠点（たとえばイオン 交換と比較して低いゲル濾過の能力）はこの場合には関係しない。

たとえばＲＰ−ＨＰＬＣのような逆相液体クロマトグラフィーは、ゲル濾過の可 能な代案である。Ｒ１”ＬＣは、回収されたペプチドに近似する分子量を有し、 したがってゲル濾過により完全には除去されえないような分子を溶液から除去す ることができる。さらに１．たとえば細菌内生毒素のような汚染物もＲ，Ｐ　− １，、Ｃにより効果的に除去される。しかしながら、たとえば酢酸もしくはトリ フルオロ酢酸のような有機酸、並びにたとえばフロパノールもしくはアセトニト リルのような有機溶剤が溶出工程で使用されるので、これら溶出剤系の微量が精 製ペプチドに結合して見られることもある。

ペプチド′がクロマトグラフニ［程から回収された直後に、これを折り重ね、こ れには酸化条件および低い蛋白濃度におけるスルフヒドリル化合物での処理を必 要とする。折り重ね条件は、還元型および酸化型の両者のスルフヒドリル化合物 、たとえばβ−メルＩ−カプトエタノール、グルクチノン、システアミンもしく はシスティンを含有する’　ｌ／ド〉・クスコ型緩衝剤の使用を含み、これにつ いては米国特許第４．５１Ｌ５０２号公報に記載されている。

これら最終的蛋白調製物は全て分析）ＩＰＬｃ、ＵＶ分光光度法、アミノ酸組成 、Ｎ−末端アミノ酸配列分析および質量分光光度測定により日常的に特性化する ことができる。精製されノこ物質の最終収量は、培養物の少なくとも４０■／れ 好ましくは培養物の５０−１００■／、Ｉ２である。

Ｂ、ｌ舎人 たとえばメリフィールド（１９６３）、ジＰ−ナル・アメリカン・ケミカル・ソ ナユティ、第８５巻、第２１４９頁に記載されたような固相合成を用いてペプチ ドを作成しろるが、当業者に知られノこ他の均等な化学合成を用いることもでき る。固和合或は、保護されたアミノ酸を適する樹脂にカップリングさせることに よりペプチドのＣ−末端から開始する。アミン保護されたアミノ酸をベンジルエ ステル結合を介しクロルメチル化された樹脂またはヒドロキンメチル樹脂に付着 させ或いはアミド結合を介しベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂またはメチル ・ベンズヒドリルアミン（ＭＢＨ△）樹脂に付着させて作成することができる。

これら樹脂は市販されており、その製造も当業者に知られている。新規な同族体 の酸型は、ヘンシルエステル樹脂を固体支持体として用いることにより固相ペプ チド合成法で製造することができる。ポリペプチドは製造用高性能液体クロマＩ ・グラフィー　（ＨＰＬＣ）により精製することができ、次いで分析１−（Ｐ　 ｉ−Ｃおよび質量分光光度法により均質であることを示すことができる。アミノ 酸分析は、予想されたアミノ酸組成をｔ′借認するよう行なうことができる。対 応のアミドは、同相ペプチド合成用の固体支持体と１−でベンズヒドリルアミン もしくはメチルベンズヒドリルアミン樹脂を用いて製造することができる。当業 者が了解するよ・うに、、ＢＨＡもしくはＭ　Ｂ　ＨＡ樹脂を用いる場合、固体 支持体からポリペプチドを除去するための無水ＨＦによる処理は末端アミド基を 有するポリペプチドをもたらす。

Ｃ−一末端アミノ酸（たとえばＡｓｐ）を、適当に選択された保１１基により（ たとえばＡｓｐの場合には［ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）もしくはｐ −トルエンスルボニル（Ｔｏｓ）により〕ＱＪ　（α）−アミノ位置にて保護す る。先ず最初に、Ｂｏｃ−八５ｐ−ＯＨをベンズヒドリルアミン樹脂にカップリ ングさせることができ、その際ジシクロ・＼キシルカルボジイミドを攪拌しなが ら約２５°（：にて２時間使用する。樹脂支持体に対するＢｏｃ−保護アミノ酸 のカップリングの後、α−アミノ保ＩＩ基を塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸 （ＴＦＡ）またはＴＦＡのみを用いて除去する。保護解除は約Ｏ′Ｃ〜室温の温 度にて行なわれる。α−アミノ保護基を除去した後５残留するＢｏｃ、−保護ア ミノ酸を所望の順序で段階的にカップリングさせ、或いは合成に際し各アミノ酸 を別々に添加する代りに固相合成器に添加する前に互いにカップリングさせるこ ともできる。適するカンブリング剤の選択は当業者に公知である。ジシクロへキ シルカルボジイミド（ＤＣＣ）が特に適している。

それぞれ保護されたアミノ酸もしくはアミノ酸配列を過剰に固相反応器に導入し 、カップリングをジメチルボルムアミド（ＤＭＦ）もしくは塩化メチレン（（Ｊ ｌｚＣＬ　）またはその混合物の媒体にて行なうことができる。カップリング反 応の成功は、たとえばニンヒドリン反応によって監視することができる。

樹脂からのペプチドの切断は、ペプチド化学で周知された方法を用いて行なうこ とができる。本発明によるポリペプチドの精製は製造用ＨＰ　Ｌ　Ｃを用いて行 ないうるが、たとえばゲル透過、イオン交換および分配クロマトグラフィーのよ うな他の公知のクロマトグラフ法も用いることができる。

Ｃ，１ｆｆｉ 本発明のポリペプチドは転移防止活性を有する。ラミニン基質に対するインビト ロでの転移性細胞の結合（たとえばグラフ等（１９８７）、上記参照）を測定し かつインビボにおける腫瘍細胞の侵食活性［たとえばテレノワ等（＋、　９８６ 　）　、ジャーナル・ナショナル・キャ／サー・インスティチュート、第７７巻 、第３１１〜３１６頁］を測定するには、多くの分析法が開発されている。

細胞−付着分析は、培養皿の表面に固定化されたラミニンに対する腫瘍細胞の結 合を測定する。本発明のペプチドを固定化ラミニンの代りに用いて、ペプチドの 結合恒数を測定すると共に本発明によるペプチドの結合恒数をラミニンまたは他 の公知のラミニンペプチドと比較することができる。この分析においては、可溶 化されたペプチドを組織培養ウェル仮で培養し、非特異性の細胞結合を牛血清ア ルブミン（ＢＳＡ）の添加によって阻止する。Ｉ１ｍ瘍細胞をウェルに添加し、 非付着性細胞を燐酸塩緩衝塩水ＣＰＢＳ）での洗浄によって除去する。付着した 細胞をトリプシン処理し、かつ電子的に計数することができ、或いは細胞を固定 すると共にたとえば結晶バイオレットｉｕ液のような化学物質で染色し、溶液の 光学密度を５９０〜４０５ｎｍの範囲のミクロ測定仮読取器で測定することがで きる。結合ｊ−た細胞数に対するＯＤ外挿は測定値を標準曲線と比較して得るこ とができ、この標準曲線は種々の個数の細胞を組織培養ウェルにて堅固に付着さ せうるが顕著な細胞分裂を可能にしない時間（約５時間）にわたり培養すると共 に上記のように洗浄しかつ染色して得られる。

競合結合分析として知られるこの改変分相は、さらにラミニン細胞リセプタ結合 に関しラミニンと競合するペプチドの能力を測定することを可能にする。この分 析においては、細胞を問題とする可溶化ペプチドと共に予備培養し、この混合物 を予め培養皿に固定化されているラミニンと共に培養する。ペプチド拮抗剤と共 に予備培養された細胞および媒体のみにて予備培養した比較細胞を用い、固定化 ラミニンに付着１−た細胞個数の減少を定量化することにより細胞結合に関しラ ミニンと競合するペプチドの能力を測定することができる。ケモタクシス分析は ｊｌ腫瘍細胞「侵食性」の評価を可能にし、これは培養室の２つの分室を隔離し た組織「膜」を横断する能力を測定して行なわれる〔グラフ等（１９８７）、上 記］。マウスＥｌ−Ｉｓ−ＩＩＩ瘍（マウスラミニンに関する主たる原料）に存 在する基ｖｌ膜の抽出物から得られる再編成された基礎膜を小さい多孔質フィル タに吸着させ、これをボイデン室に入れて培養室の上部と下部とを分離する。マ ウスもしくはヒトの繊維芽細胞を血清フリーの培地で培養して得られる状態調節 された培地を、培養室の下側分室に入れて化学吸引剤として作用される。腫瘍細 胞を上側室で培養し、ここで膜中に付着させかつ侵食させ、最終的にフィルタの 反対側まで移動させ、ここで回収すると共に計数する。

回収された細胞の個数および膜バリヤを横断するのに要する時間が、転移能力の 尺度となる。この分析による結果は、種々異なる転移能力を持った一連のマウス ＭＩＩＧ細胞ラインを用いるインビボ分析の結果と相関する。

ラミニン結合の拮抗剤は、化合物を試験Ｉｌｌ胞と共に１〜２時間にわたり培養 した後に、これらを侵食室の頂部分室に添加して試験される。基礎膜侵食の阻止 は、細胞が膜を横断するのに要する時間の増加および移動する細胞の個数の減少 によって決定される。

本発明による医薬組成物はラミニンペプチドお１よびその同族体、並びにその無 毒性塩を医薬上もしくは獣医学上許容し・うる液体もしくは固体キャリヤに分散 させて含有する。この種の医薬組成物は、ヒトおよび家畜における臨床医薬とし て治療もしくは診断目的に使用することができる。たとえば、これらはラミニン 細胞結合の有用な阻止剤であり、したがって腫瘍細胞転移の処置に有用である。

これら組成物は静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内のルートにより或いは肺吸収によ り投与することができる。

人間に投与するには、ペプチドは少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約 ９５％もしくはそれ以上の純度を持たねばならない。この純度は、所定のペプチ ドが上記重量％の全ゆるペプチドおよびペプチド断片を構成することを意味する 。

この種のペプチドは、しばしば医薬上許容しうる無毒性塩、たとえば酸付加塩も しくはたとえば亜鉛５鉄などとの金属錯体（これらはこの用途の目的で塩として 考えられる）として投与される。この種の酸付加塩の例は塩酸塩、臭化水素酸塩 、硫酸塩、燐酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸 塩、マロン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。他方、本発明のペプ チドは遊離カルボキシル基を有するので、塩基の塩として（たとえばナトリウム 、カリウム、カルシウム、マグネシウムもしくはアンモニウムの塩として）存在 することもできる。投与を静脈内注射で行なう場合は、ペプチドを等強性塩水、 燐酸塩緩衝溶液などと共に処方することができる。

投与すべき本発明によるポリペプチドの適する投与量は個々の患者、処置される 症状および症状の程度に若干依存し７て変化する。一般に、経口投与量は宿主の 体重１ｋｇ当り約０．０１〜約５■のペプチドである。

本発明の実施を例示するため以下に実施例を示すが、これらは決して本発明の範 囲を限定するものと解釈してはならない。

ｆｉ 実施例Ｉ ＩＮＬ団誘１」０１現企ノーｌ二切竺虜コリシンＥ１発現制御配列からなるｐＮ ’Ｐ６．、すなわちｐ　ＢＲ３２２誘導体−＜　フタ−［７）作成は、ＷＯ３５ １０１０６７（上記）、並びにワＩ／−およびジョンソン（１９８５）（上記） に記載されており、二のベクターで形・質転換されたイー・コリ菌株ＭＭ２．９ ４はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣＮ（１３９４１ ，８として寄託されている。本発明を実施するのに有用な、ここにはｐ、ＮＰ６ ／ＣＴＡＰ−ｍ−ＮＭＯ，、Ｄと称する、たとえばｐ　Ｎ　Ｐ、、６ΔＲ■／　 、Ｃｏ　’ｌ　、Ｃ４）／ＣＴＡ　Ｐ　（Ｌｅｕ、）のようなこのベクターの誘 導体もＷｏ、８５１０ＩＯ・６７に記載されており、或いはこの発明にて提供さ れる。

Ａ、プラスミドＰ　Ｎ　Ｐ、、６ΔＲＩを作成して、元来のＰＢＲ３２’２配列 におけるテトラサイクリン耐性遺伝子の近くに位置するＥｃｏＲ１部位を除去す ることによりコリシン遺伝子内に独特なＥｃｏＲ１部位を形成した。ベクターｐ ＮＰ６を制限された反応条件下でＥｃｏｌ？ｌ　により切断して、線状針ＬＰ（ ２・つの部位の一方においてのみ切断：）を作成した。ｐＮＰ６の線状分子をア ガロースゲル電気泳動により精製し、次いでＤＮＡポリメラーゼ１および４１の 全てのデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートと反応させて、一本鎖末端を 充填した。得られた分子をＴ４リガーゼにより平滑末端結合反応で環化させ、次 いでこれらを用いてイー・コリ２９４を形質転換させた。

イー・コリ２９４に形質転換させるため、Ｌ−ブロスにて増殖させた１晩の培養 物を新たなし一ブロス培地で１　：　］、　ＯＯに希釈し、振盪（７ながら００ ６００が０．６になるまで３７゛ｃにて培養した。この時点で３５ｍｆの培養物 を６．０００ｒｐｍで４°Ｃにて１０分間遠心分離し、ベレットを２０ｎ／！の ０．０５　ＭのＣａＣｌ　２に再懸濁、させた。菌体を氷上で１５分間培養した 後、これらを４．、、　ＯＯＯｒｐｍでの１０分間にわたる遠心分離により回収 した。菌体を４　ｍｌの０．０５　ＭのＣａＣＱ、に再懸濁させ、５０μｌの融 合用混合物と１．ＯｒｒｒＭのＭｇＣｌｚおよびｉｏｍＭのＣａＣ，ｅｇを含有 するｌ　５０　ｕ　１２’の１０ｍＭ１−リス−１４Ｃ１（ｐＨ７，５）とを添 加して作成されたＤＮＡ溶液２００　ｕＩｔと混合した。この混合物をＯ″Ｃに て２５分間培養した後、５０゛Ｃにて１０秒問および室温にて１０分間培養した 。この時点で１４−１のＬ５−ブロスを添加し、培養物を３７゛Ｃにて３０分間 振盪した。

次いで、４８０μ！のテトラサイクリン溶液（ｌ、２５■／ｍｆ２）を培養物に 添加すると共に、培養をさらに３０分間続けた。

１００μ２の部分を新たに作成された２５ｍ６のし一ブロスと１．５％の寒天と ２５μｇ　／’　ｍ’ｌのテトラサイクリンとを含有する寒天板に塗沫した。テ Ｉ・ラサイクリン耐性（ＴＣ’）形質転換体をさらに、２５μｇ／ｍｌのアンビ ンリンを含有する寒天に塗沫することによりアンピシリン（、Ａ、’　）に対す る感受性につき試験した。

次いで、ＴＣ′　・Ａ、″形質転換コロニーを１．コリシンの自然産生につきス クリーニングｊ−だ。単一コロニーをＬ−寒天板上にスポットし、３７゛Ｃにて １晩培養した。これらコロニーをクロロホルム蒸気に露呈して死滅させ、次いで ０．７％寒天と０．１ｍｊ！のイー・コリに−１２の１晩培養物とを含有する５ ｔｍｌのＬ−ブロスを載せた。寒天を硬化させた後、これらプレートを３７°Ｃ にて１晩培養した。その周囲に阻止領域を有するコロニーをコリシン生産体とし て記録した。

コリシン−生産性形質転換体を選択し、プラスミドＤＮＡを個々のクローンから 分離すると共に、ＢＣｏＲＩ　で切断してコリシン遺伝子内に単一の完全Ｅｃｏ ＲＴ部位を有するものを同定した。

単−Ｉ！ｃｏＲ１部位の位置は、さらに制限エンドヌクレアーゼマツピングによ って確認した。

Ｂ、ＰＮｔ）６ΔＲＩをＳｓｔ’ｔｌ　（５ａｃＵ　）およびＥｃｏＲＩ制限酵 素で切断することにより、プラスミドＰＮＰ６ΔＲ１／Ｃｏ１（４）／　ＣＴ　 Ａ　Ｐ　（Ｌｅｕｚ＋　）を作成した。複製−およびコリシン遺伝子−制御配列 を有する大型断片を、コリシン遺伝子を含有する小型断片から電気泳動によって 分離すると共に、アミノ末端コード用末端にて５ｓｔｌｌ結合性末端によりかつ カルボキシ−末端コード代用末端にてＥｃｏＲＩ結合性末端により下記するよう に合成りＮＡ、　（ＣＴＡ、Ｐ　　ｕｌ　（Ｌｅｕｔ＋）コード化配列を有する ）に結合させたニ ー−＾ＴＧ　　ＧＡＡ　　ＡＣＣＧＣＧ　　ＡＴＧ−−−−−−〜ＴＡＡ　　Ｔ ＧＡ　　ＣＴＧＣＡＧ　　　　ＡＡＴＴＣ−−Ｍｅｔ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　 Ａｌａ　　　　　Ｍｅｔ　　ＣＴＡＰ−１１１（Ｌｅｕｚ＋）−ＴＡＣＣＴＴ　 ＴＧＧ　　　ＣＧＣＴＡＣ−−−−−−−ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＧＡＣＧＴＣＴＴＡ Ａ　　Ｇ−一得られた＆ｌｌｌｌラプラスミドＤＮＡいてイー・コリ２９４菌体 を形質転換させた。テトラサイクリン耐性につき選択されたコロニーを、ＣＴＡ Ｐ−Ｉ１１蛋白発現につき試験した。ＤＮＡを正の発現を示すクローンから分離 し、作成物の正値な構造をＤＮＡ配列分析により証明した。用いた方法の詳細に つき以下の実施例に示す。

実施例２ ＢＲ−ＣＲＭ　　ＣＴＡＰ　　Ｌｅｕ　、Ｊｌ皮韮哀Ａ、改変コリシン制御（プ ロモータ）　ｗＩ域（ＣＲＭ）の作成コリシンＥｌのプロモータの改変制御領域 を設計すると共に作成した。導入したヌクレオチド変化を第１図に要約する。プ ロモータ領域における初期のヌクレオチド配列を括弧内に示す。

合成１５１塩基長さのオリゴマーをアプライド・ビオシステムス３８０Ａ型ＤＮ Ａ合成装置で８種の断片（４種の断片は他の４種の断片と相補的である）として 合成し、これらはその重なり端部にて７〜１０個の塩基対相補配列を有するよう 設計した。

これら合成断片をゲル電気泳動により精製した。ポリヌクレオチドの５°末端を Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりホスホリル化すると共に、（ｙ−Ｐ”）　 −ＡＴＰで標識した。相補的ストランドを融合させると共に結合させた。

１５１−塩基対のＤＮＡをゲル精製し、かつＥｃｏＲＩ　−ｔ（ｔｎｄｌｎ切断 されかつ精製された細菌プラスミドｐＢＲ３２２の大型断片に結合させて、切断 されたＴｅｔプロモータ配列を交換した。

得られた作成物をｐＢＲＧ８七称する。合成プロモータは切断Ｔｅｔプロモータ 配列を交換したので、アンピシリン耐性形質転換体をミドマイシンＣ処理（コリ シンプロモータの誘導）の後にテトラサイクロン耐性につきスクリーニングした 。選択コロニーからのプラスミドＤＮＡを精製すると共に、制限酵素切断により 並びにプロットハイブリッド化により合成りＮＡ配列の存在につき分析した。合 成プロモータ配列については、二本鎖ＤＮＡ配列決定によって証明し、これは次 の通りであった：ＡＧＣＧＧＣＣＴＡＴ　　ＡＡＴＧＴＧＴＧＣＴ　　ＧＴＡＴ ＡＴＡＡＡＡ　　ＣＣＡＧＴＧＧＴＴＡＴＣＧＣＣＧＣＡＴＡ　　ＴＴＡＣＡＣ ＩＩＣＧＡ　　ＣＡＴＡＴＡＴＴＴＴ　　ＧＧＴＣＡＣＣＡＡＴＴＡＴＧＴＡＣ ＡＧＴ　ＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴ　ＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴ　ＧＴＴＴＴＡ＾＾＾Ｇ ＡＴＡＣＡＴＧＴＣＡ　　ＴＡＡＡＴＡＡＡＣＡ　　ＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡ　　 ＣＡＡ＾＾ＴＴＴＴＣＴＣＡ＾＾ＧＡＧＧＡ　ＴＴＴＴＡＴ＾＾ＴＧ　ＧＡＡＡ ＣＣＧＣＧＧ　Ａ−５’ＡＧＴＴＴＣＴＣＣＴ　ＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＣＴＴＴ ＧＧＣＧＣＣＴＴＣＧＡ−３’Ｂ、改変されたコリシン制？ｉｌ　Ｓｆｆ域（Ｃ ＲＭ）を制限酵素切断によりプラスミドｐＢＲＣ；８から除去すると共に、プラ スミドｐＮＰ６ΔＲＩ／Ｃｏ　１（４）／ＣＴＡＰ　（Ｌｅｕｚ＋）にクローン 化させて古いコリシンＥ１制御領域を置換した。新たな作成物をｐＮＰ６ΔＲｌ −ＣＲＭ／ＣＴＡＰ　（Ｌｅｕｔ＋）と称する。

Ｃ，プラスミドｐＮＰ６ΔＲＩ　−ＣＲＭ／ＣＴＡＰ　（Ｌｅｕｔ＋）をＡａｔ ｌｌおよびＳｃａ　Ｉ制限酵素で切断すると共に、コリシン制御領域とＣＴＡＰ −Ｉ［遺伝子とを含有する断片を精製した。プラスミドｐＢＲ３２２をＡａｔｌ ｌおよびＮｒｕ　Ｉ制限酵素で切断すると共に、アンピシリン耐性遺伝子と復製 オリジンとを有する大型断片を精製した。これら２種の断片を結合させ（Ｓｃａ ｌおよびＮｒｕ　Ｉは平滑末端を形成し、したがって互いに結合することができ る）　、ｐ　ＢＲ−ＣＲＭ／ＣＴＡＰ　（Ｌｅｕｚ＋）と称する新たなプラスミ ド発現ヘクターを生成させた。

実施例３ 遺伝ヱ詐底 ラミニンＢ＋　　４０　（５ｅｒｔ、）ペプチドのための合成遺伝子は、６種の オリゴヌクレオチドから組立てられた１４９−塩基対のＤＮＡで構成される。６ 種のオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト化学を用いてアプライド・ビオ システムス・ＤＮＡ合成装置で合成した。断片２．３．５および６をキナーゼ処 理すると共に、断片１および４はその３゛末端が互いに結合して２Ｍ体を形成す るのを防止するようキナーゼ処理しなかった０次いで６種の合成オリゴヌクレオ チドを精製し、特性化しかつ結合させて下記するようにＬａｍＢ＋　−４０ペプ チドを作成した。

（１）　　ＣＴＡＰを遺伝子融合につきラミニンと整列させ、（２）旧ｎｄｎ１ 部位を除去しく独特の制限部位として使用するよう新たなプラスミドに１個の旧 ｎｄｌＩ［部位を残す）、かつ（３）その後のラミニン遺伝子カセット突然変異 のため３種の新規な独特の制限部位（ＳＬｕｌ、　　５ｌｌａｌおよびＳａｌ　 Ｉ　）を添加するよう、ラミニン遺伝子を作成した。オリゴヌクレオチドおよび 結合手段を下記に示す： ５’−ＡＡＴＴＣＧＴＡＴ　ＧＣＣＧＴＧＣＣＣＧ　ＧＡＴＧＧＴＣＣＧＧ　Ａ ＣＴＣＣＧＧＣＣＧ３’−ＧＣＡＴＡ　　ＣＧＧＣＡＣＧＧＧＣＣＴＡＣＣＡＧ ［；ＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴ　　ＣＧＴＴＣＴＴＧＣＴ 　　ＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＧＧＴＴＡＣＣＣＴＧＡＧＴＣＡＡＧＣＧＡ　　ＧＣ ＡＡＧＡＡＣＧＡ　　ＴＧ［；ＴＣＣＴＧＧＧ　　ＣＣ八へＴＧＧＧＡＣＣＡＧ ＣＴＧＧＣＴＡ　　ＧＣＧＴＴＴＧＣＧＡ　　ＣＣＣＧＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧ ＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＣＧＡＴ　ＣＧＣＡＡＡＣＧＣＴ　ＧＧＧＣＣＣＧＡＴ ［；　ＴＡＧＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＧＣＧＡＣＧＡ　ＣＴＡＡＴＧＡＧＴＣＧＡ ＣＡＧＧＣＣＴＣ−３’ＣＡＡＣＧＣＴＧＣＴ　　ＧＡＴＴＡＣＴＣＡＧ　　Ｃ ＴＧＴＣＣＧＧＡＧ　　ＴＴＡＡ−５’５“ＥｃｏＲＩ　は活性であるのに対し 、３　’　ＥｃｏＲ［部位は突然変異しくＧＡＡＴＴＣ−−−＞ＣＡＡＴＴＣ） 　、独特のＥｃｏＲ１部位を残した。

第１ゴヌ　レオ　゛の　　゛よ　。

１、ｕ ７Ｍの尿素と９０ｍＭのトリス−硼酸塩と２ｍＭのＥＤＴＡ緩衝剤とを用いて、 ポリアクリルアミドゲル（１２％）を作成した。試料ウェルを、少なくとも２ｃ ｍ巾の菌を有する櫛で作成した。３時間静置した後、ゲルを３０分間にわたり予 備電気泳動させた。等しい容積の１〜５Ａｚｉ。単位の未精製オリゴヌクレオチ ド試料と７Ｍの尿素とを１０ｍＭのトリス−ＨＣ１Ｉｌ衝液（ｐＨ７，５）中に て混合した。ＤＮＡ試料をゲルに添加し、ウェルの１つに染料混合物（０，１７ ％のブロムフェノール・ブルー、０．２７％のキシレンシアツール、１０ｍＭの トリス−）ＩＣ１，ｐＨ７，５）を添加して、オリゴヌクレオチドの移動速度を 監視した。

電気泳動は、ブロムフェノールブルーがゲルの頂部から３０ｃｍ移動するまで４ ００〜６００ポルトにて行なった。両プレートを外し、ゲルをプラスチックラン プで包み、かつＤＮＡを短波長ＵＶ光により可視化させた。所望のバンドを慎重 に剃刀で切除した。ゲル片をエッベンドルフ管に入れ、ガラス棒で破砕した。次 いで、０．５＋ａｆｆのＴＥ（］、ＯｍＭのトリス−１１Ｃｆｆｉ、１ｍ、Ｍの ＥＤＴＡ、ｐＨ７，５）をチューブに添加し、これをＤＮＡ抽出すべく１時間回 転させた。チューブを１５，０００ｒｐ＋ｍにて１０分間遠心分離し、上澄液を 回収した。このＤＮＡ試料をＴＥで１０倍希釈し、Ｃ−１８５ｅｐ−Ｐａｋカラ ムに添加すると共に、２０端ｉの）１２０で洗浄して脱塩した。アセトニトリル 溶出によるＤＮＡの回収率は、一般に５０〜８０％であった。溶出液を凍結乾燥 し、次いで０．５ｍｌの８２０に再懸濁させた。

２、、ＩＪ　　　　　　　ノ゛ル　　２′　　　　・　−二ε那し１」化２丁」 【ＬＯＰモルの試料を凍結乾燥させた。乾燥した試料を、少なくとも７０結合末 端単位（ＮＥＢ）の活性を有する１μ２の１０Ｘ濃縮キナーゼ緩衝液（７００ｍ Ｍのトリス−Ｈｌ、（ｐ）１７．６）、１００ｍＭのＭｇＣｊ！ｚ、１ｍＭのＫ Ｃｌ、５０ｍＭのジチオスレイトール〕と５μ２のＨ２Ｏと６６Ｐモルの冷ＡＴ Ｐと０．６　ｐモルのＣｒ−Ｐ”）−ＡＴＰとＬｕ１ｌのスペルミン７（１ｍＭ ）と１μ２のＴ４キナーゼとの溶液に溶解させた。この試料を３７°Ｃで３０分 間培養した。５μβの染料混合物を添加した後、試料をポリアクリルアミドゲル （２０％、厚さ０．４ｍ、長さ１５ｃｍ）に添加し、ブロムフェノールブルーが ゲルの底部に移動するまで電気泳動させ、さらにゲルをＸ線フィルムに１０〜３ ０分間にわたり露出して放射能写真にかけた。

３、第１ゴヌ　レオチ゛の　ム゛よび　人これら断片をインビトロで組上げ、さ らに下記するようにＭｊ３ベクターにサブクローン化させた。

６種の精製されたオリゴヌクレオチドを融合させ、結合し、かつ２個の断片とし てＭ１３ヘクター中にサブクローン化させた。断片（Ｉもしくは■）については ５“末端ホスホリル化オリゴヌクレオチドの相補対を混合し、９５゛Ｃまで２分 間加熱し、次いで徐々に４０°Ｃまで冷却して融合させた。各断片につき３種の 二本鎖オリゴヌクレオチド（重り端部を有する）を混合し、次いで３７°Ｃにて １時間にわたり培養して結合させた。

結合用の反応混合物は、全容積１００μρにおける５０ｍＭのトリス−）１ｃｊ ２　（ｐＨ７，５）と１０ｍＭのＭｇ（：　Ｎ　２と２０ｍＭのジチオスレイト ールと１ｍＭのＡＴＰと１００ｐモルのＤＮＡ（５°末端の濃度）と１００個の 凝集末端単位（ＮＥＢ）のＴ４リガーゼとで構成した。これら反応混合物を１６ ゛ｃにて１晩培養した。

４、旭１転換糸 イー・コリを、０Ｄ６ａｏが０．６〜０．７になるまで２ＸＹＴブロスで培養し た。菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＭのＣａＣｊ！ｚ　　（培養容積の半 分）に再懸濁させ、さらに氷上に２０分間保った。競合細胞を集め、ｌ／１０容 量の５０ｍＭのＣａＣＬｌ　ｔに再懸濁させた。

予めエンドヌクレアーゼＥｃｏＲ［およびＢａｍ旧で切断された市販のＭ１３７ ！製型（ＲＦ）ＤＮＡをペプチド断片Ｉもしくは■と結合させ、さらに競合、Ｊ 　Ｍ　ｌ　０１細胞と混合して氷上で４０分間保った。この混合物に４２゛ｃに て２分間にわたり熱シボツクを与え、次いでｌ　Ｐ　Ｔ　Ｇ　Ｂｌｕｏ　−ｇａ ｌ　、軟質塞天（４６°Ｃ）および新たに成長しているＪＭＩＯＩ菌体と混合し た。この混合物をＹＴ寒天板に塗床し、３７゛ｃにて１晩培養した。

完全Ｍ１３により形質転換されたＪ　Ｍ　］、　０１細胞はβ−ガラク１−ノダ ーゼを合成すると共に青色プラークを生成した。ペプチド断片を含有するＭ　ｌ 　３により形質転換された菌体はβ−ガラクトシダーゼを伴産せず、白色プラー クを生成した。

、１）”　、　Ｍ−１−３復製上工ｌ取）−■−川用へルーＧυラー不〕−上− ＤＮ人夏詐−成 Ｌａｍ　Ｂ、　−４，０断片を含有する１！の菌体を２５μｇ、／ｎ／！のテト ラ４）イクリンの存在下に１晩増殖させ、１００μｇ／ｍ１２のクロラムフェニ コール（プラスミド増殖のため）を適当な細胞密度にて添加し、さらに１晩増殖 させた。５０００Ｘｇで４　’Ｃにて２０分間にわたり遠心分離することにより 菌体を回収し、次イテ２００　ｍｆｆノＴＥＮ　（１０，１，４５−０）　ニ懸 濁し、次いで再遠心分離した。これら菌体を５１１１２の５０ｍＭのグルコース 、１０ｍＭのＥ　Ｄ　ＴＡおよび２５ｍＭのトリス（ｐＨ８，０）に再懸濁させ 、次いで２本の３０精ρネジ栓付き遠沈管にｆ多した。

上記緩衝液における５　ｎｕ　（各チューブにつき２．５ｍｆｆ）の４ｍｇ／＊ ｆリゾチームを添加し、これらチューブを転倒して緩和に混合すると共に、室温 にて１０分間または氷上で３０分間培養した。次いで、２０ｍｆ（各ナユーブに 対し１ｏＩＩＩＮ）の０．２ＮのＮａＯＨおよび１％のＳＤＳを各チューブに添 加した。この溶液を転倒（２０〜３０回）により或いは緩和な回動により混合し 、次いで室温にて１０分間培養した。次いで約１．５ｍＪ２（各チューブにつき ７．５ｍｆｆ）の３Ｍ酢酸カリウムと４．４％の蟻酸（ｐ）１４．８）とを添加 し、緩和に混合して粘性染色体ＤＮＡと蛋白とを凝固させた。この溶液を氷上で １時間培養し、次いでＪ、０．ＯＯＯｘｇにて２０分間遠心分離した。１容量の イソプロパツールを上澄液に添加し、この溶液を１．０．０００ｘｇにて１０分 間遠心分離した。上澄液をデカントし、ベレットを１０１１Ｉｌの一２０°Ｃの ７０％エタノールで洗浄した。ベレットを１０．０００ｘｇにて５分間遠心分離 し、エタノールを除去し、次いでベレットを減圧下で風乾した。次いでベレット を１．０ＬｌｌのＴＥに溶解し、２０μｇ／ｍｌのＤＮＡアービフリーのＲＮア ーゼＡにより３７°Ｃで３０分間処理した。

次いで反応混合物をクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し 、さらに２．５ｃｎＸ２５ｃｍのビオゲル八−５０Ｍアガロースカラムに施した （５％グリセリンおよび００Ｏ２％染料と共に）。ＤＮＡフラクションを集めて エタノールで沈澱させ、フェノールで抽出し、エーテルで再抽出し、エタノール により再沈澱させ、洗浄し、脱水し７かつ１．Ｏｍｆの　ＴＥに再懸濁させた。

６、調片夏慧１圭−よだ溢１ゴヒ 組換ファージを１．ａｌｌＩＢ＋　　　４０遺伝子断片ＩおよびＨの存在につき 次のようにスクリーニングした。ファージ壇養物を１、Ｊ　Ｍ　１０１宿主細胞 を含有するＹＴ培地にて増殖させた。Ｍ１３ファージの二本鎖複製型（ＲＦ）Ｄ ＮＡを上記したように分離した。一本領雛型ＤＮＡを、２．５ＭのＮａＣｆｆと ２０％ＰＥＧ（６０００）とにおける氷上での３０分間の沈澱により溶菌上澄液 から分離し、フェノールで抽出し、次いでエタノールと酢酸ナトリウムどで沈澱 させた。再断片の配列を、Ｍ　］、　３ジデオキシ配列決定により確認した。こ れら断片をＥｃｏＲｌおよびＢａ１ＩＩＩＩでの制限エンドヌクレアーゼ切断に よりＲＦ　　Ｄ　Ｎ　Ａから除去すると共に、５０　ｍ　Ｍ　Ｉ−リス−酢酸の 緩衝液（ｐＨ８，２）におけるジ−プラク（登録商標）アガロース（マリン・コ ロイド社）電気泳動により精製した。臭化エチジウムでの染色の後に長波長紫外 光により可視化させたラミニンＢ１−４０ペプチド断片を剃刀によりゲルから切 除した。

７、釦！−Ｗエーニ４０−１■Ｌ子−断片−１４名よで一１４１３合Ｌａｍ、Ｂ ）−４０遺伝子断片を含有するゲルスライス物を７０°Ｃにて５〜１５分間にわ たり溶融させ、次いで３７°Ｃに平衡化させた。等容量の水冷された２倍濃縮の Ｔ４リガーゼを含有する緩衝液を添加した後、結合混合物を２０°Ｃにて１晩培 養した。

ｎ、、ｃｐ、を等モルのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａでキレ−１・化すると共にリガーゼを７ ０°Ｃにて１５分間失活させることにより、結合を終了させた。この反応混合物 をＥｃｏＲＩで切断して、Ｌａｗ　Ｂ＋　−４０遺伝子のモノマーを得た。

８゜６゛−の多− ＥｃｏＲＩ制限反応を上記のように終了させ、かつエンドヌクレ７−セＥｃｏＲ Ｉで予め切断されたデホスホリル化Ｍ１３クローン化用ベクターと結合させた。

ジ−プラーク（登録商標）アガロースにおける結合混合物を再溶融させ、１０〜 ５０倍の程度にて水冷ＴＣＭ　（１０ｍＭのトリス（ｐＨ７，５）　、１０ｙｎ ＭのＣａ　Ｃ１ｚ　、１０　ｍＭの門ｇｃｆｆｉｚ）に希釈した後１．ＪＭ１０ １細胞に形質転換させた。

９、文旦：ンのスクリーニング占 組換フ・アージを１、ａｎＢ、−４０配列の存在につき次のよ・うに迅速にスク リーニングした。ＲＦ　　ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＴで制限し、正 確な診断ＥｃｏＲ１制限パターンをもたらすクローンからの一本鎖ファージＤ　 Ｎ　Ａを上記のように分離し１、かつＭ　］、　３ジデオキシ配列決定のための 雛型として用いた。

ハ、ＬＩＬ 上ＢＲ−ＣＲＭ　　Ｃ−工Ａ」−は１吋Ω、、、ｌＡ−ａ　Ｌｌに１側車重或Ｃ ＴＡＰ／Ｌａｗ　Ｂ＋　　　４０融合のクローン化を次のように行なった。ベク ターｐＢＲ−ＣＲＭ／ＣＴＡＰ　（Ｌｅｕ２１）におけるＣＴＡＰ−ｍの３゛末 端の１部をＸｂａ　ｉおよびＥｃｏＲＩでの二重切断によって除去し、ヘクター 断片Ｄ　Ｎ　Ａをジ−プラーク（登録商標）ゲル電気泳動により精製した。

この分離された断片に、新たなＣＴＡＰ−Ｉ１１３“−末端を有する合成７１　 ｂｐＸｂａ　ｒ　−ＥｃｏＲＩ　リンカ−断片を翻訳停止コドンなしに添加した 。合成リンカ−を上記のように合成し、精製し、キナーゼ処理し、さらに結合さ せ、これを下記に示ず：５’−ＣＴＡＧＡＣＣＣＧＧ　　ＡＣＧＣＴＣＣＡＣＧ 　　ＴＡＴＣ八八ＧへへＧ　　ＡＴＣＧＴＴＣＡＧ／１３’−ＴＧＧＧＣＣＴＧ ＣＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＴＴＣＴへＧＣＡＡＧＴＣＴＡＡ面ＡＣＴＧＧ ＣＴＧＧＴＧＡＣＧＡＡ　　ＴＣＴＧＣＴＧＡＣＡ　　Ｇ−３’ＴＴＴＴＴＧＡ ＣＣＧ　ＡＣＣＡＣＴＧＣＴＴ　ＡＧＡＣＧＣＴＴＧＴ　ＣＴＴＡＡ−５’次い で２種の断片を、１．、　ＯＰモルのリンカ−とＯ，ｌ　ｐモルの−・フタ−と を１７２μ２の反応容積で用いて上記の条件下で互いに結合させた。１００　ｔ ｉ　ｌの凍結競合イー・コリ２９４菌体を１〜Ｌｏｎｇの結合混合物で形質転換 させて、中間クローン化ヘクターを作成した。得られたクローンを、上記したよ うな制限酵素分析によりスクリーニングした。代表的クローンのＤＮＡを配列決 定して、正確なりＮＡ配列を確認した。このクローンを増殖させて、その後にラ ミニン遺伝子を挿入するのに充分な量で生成させた。

このＬａｍ　Ｂｔ　−４０遺伝予断片を次のように、この中間ヘクター作成物に 独特のＥｃｏＲ１部位にて挿入することにより、ＣＴＡＰコード化配列の末端と 整列してラミニンコード化配列を導入した。

中間プラスミドをＥｃｏＲｌで切断し２牛の腸ホスファターゼ（ＣＡ　Ｐ　）で 処理して５′−燐酸基を除去することにより、ヘクター自身が再結合するのを防 止すると共にアガロースゲル電気泳動により精製した。次いでラミニン遺伝子と ヘクター断片とを互いに結合させ、次いで結合混合物を用いて競合イー・コ’Ｊ 　２９４菌体を形質転換させた。６種のクローンを釣り上げ、ミドマイシンＣで の誘導により分析して、正確な寸法（１３５個のアミノ酸、約１５．０００ダル トン）の部分が産生されたかどうかを決定した。６種のクローンのうち２種が特 にこの寸法の蛋白を誘導させた。

次いで、これらクローンを、ＥｃｏＲｌおよびＸｈｏｌでの二重切断によりラミ ニン遺伝子挿入物の正確な配向につきスクリーニングした。正確な配向は、３ｏ ｓｂｐおよび３９４０ｂｐの２種の断片を与えた。不正確な配向は４５７ｂｐお よび３７９１ｂｐの２種の断片を与えた。６種のクローンのうら２種は正確な配 向を有し、遺伝子の正値な構造を二本鎖配列決定により確認ｊ、た。

実施例５ 立主三７１Ｌ二（ｌ凶ブｊｕ■以発四−１盈よグ豆訴振と・うフラスコもしくは 発酵槽の培養物におけるＣ　Ｔ　Ａ　Ｐ　、／１、ａｎＢ、　−４０ペプチド融 合の発現を上記したように行なった。

１．８ｍＢ１　　４０ベブナドの精製を下記に説明する。菌体をＬａｗ　Ｂ＋　 −４０につき上記したように回収し、かつ初期培養物の１７１０容量の２５ｍＭ １・リス−ＨＣｆｆ１　（ｐｉ’１８．　Ｏ）、１ｍ、ＭＥＤＴＡおよび５Ｑｒ ｎＭグルコース（ＴＥＧ）に溶菌させた。

不溶性の融合ペプチドを、５Ｓ−＝３４０−夕における１５．００Ｏｒｐｍにて ４°Ｃで２０分間遠心分離することにより回収した。へζＩ／ノドを初朋焙養容 積の１／１．０の７Ｍ尿素と２５　ｍ　Ｍのトリス−ＨＣ７０（ｐＨ８，０）と １ｍＭのＦ、ＤＴＡ（もしくは６ＭのＧｎｔｌＣｊ！、２５　ｒ：ｎ　Ｍのトリ ス−Ｉ　Ｃｆ　（ｐＨ８，０）、１ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ、、　）に再懸濁さ一 層、さらに氷上で５分間の静止を伴いながら２分間にわたり６回音波処理した（ 設定Ｎｏ、　８、大型チップ、ブランラン３５０ワツトの音波処理器）。（成る 調製物は溶菌および可溶化工程の際にプロテアーゼを阻止ずべく１ｍＭのｒ’ｌ Ｉ　ＳＦを用いて作成した］。懸濁物を上記のようにＳ　Ｓ−，３４０−タにて １．５．　ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心分陣した。上澄溶液（約５００ｍｊ２） を、１〜３０間にわたり５０尼のｌ　（ｌ　ｍ　Ｍ酢酸に対し４゛Ｃにて透析袋 内に重質沈澱物（分子量３．５０（＋）が形成されるまで透析した。この懸濁物 を遠心分離した（１５分間、１５．００Ｏｒｐｍ、５Ｓ−３４０−タ、４°Ｃ） 。ベレットと上澄液とを、Ｓ　Ｄ　Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により 約２１，０００ダルトンのハンドの存在につき分析した。一般に、融合蛋白の大 部分（＞９０％）がベレット中に見られた。そうでなければ、全懸濁物を凍結乾 燥さけた。第２Ａ図は、臭化シアノーゲン切断の前のＣＴＡＰ−ラミニン融合蛋 白のＨＰ　Ｌ　Ｃ精製経過を示している。

粗製の蛋白混合物を７０％蟻酸に溶解させ（細胞培養物１ｊ２当す約５０ｍｆｆ １）、、アルゴンガスでパージすると共に、室温ニて約２０分間、或いは物質の 大部分が溶解するまでゆっくり撹拌した。チオ硫酸ナトリウム（培養物１１当り 約６５■）を添加し、さらυこ４０分間攪拌した。最後に、ＣＮＢｒを０．１〜 ０．４Ｍの最終濃度まで添加し、反応混合物を６〜２０時間培養した。

代案として、ＣＮＢｒ反応を、０．２　Ｎの１１Ｃ！およ、び６ＭのＧｎｌｌＣ ｆ！を反応溶剤として用いることにより行なった。反応が経過した後、パイｌ： ’ｌ　ｙ　）規模の反応物のｉ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ分析（下記する）を行なった。

反応を典型的には９０％より高く完了するまで進行させ、この時点で溶液を脱イ オン化／蒸留水で３〜５倍に希釈し、＋３析しかつ凍結乾燥した。

透析されかつ凍結乾燥されたＣＮＢｒ反応生成物を約２００ｍ、ｅ０６Ｍ　　Ｇ ｎＨＣｌに溶解させ、２Ｍのトリス塩基でｐＨ９〜１０まで滴定した。ＤＴＴを ０．１　Ｍまで添加し、反応混合物を３７°Ｃにて１時間培養することにより、 全蛋白質を還元した。反応物のｐａｌを１．約１．１５容積の８８％蟻酸を添加 するごとにより２．５〜３．５に調整して、システィンを還元状態に維持した。

この物質をアセＩ・ニトリル中でＩ−Ｉ　Ｐ　＋、、、　Ｃ分析用に１５％とし た。形成した沈澱物を全て遠心分離および濾過によって除去しまた。

分析ＨＰ　Ｌ　Ｃをウォータ６８０ノステム（６８０コンＩ−ローラ、２−５１ ０個のポンプ、４９０Ｅの検出Ｂ）にζ行ない、その際溶剤已における１５〜４ ０％の濃度勾配を０．５％／＋ｍｉｎ。

２ｍｊ２／Ｉｎ１ｎで用い、ここでＡ　＞、＝剤は７に中０．０６５％（Ｖ　／ 　））ＴＦＡ（ピアス・セファノールアングル）［ミリク・オア・ブルシン・ア ンド・ジャクソン社］とし、溶剤Ｂはアセト；−トリル中の０．０６５％（ｖ／ ｖ）ＴＦＡ、　（Ｃ１１３ＣＮ　、プルシック・アンド・ジャタソン社、Ｕ　Ｖ 級）とし、その際バイダック２１４”ｒＰ５４カラム（Ｃａ　、３００人の孔径 、５μビーズ、４．６国ｘ２５０ｍ）を使用し７た。監視用波長は２１５ｎｍと した。結果（第２Ｂ図）は２個の主ピークを示し、その第１のピークはラミニン Ｆ３＋−／’、０ベブチ（・である、二とが示され（アミノ酸配列決定および組 成分析による）、さらに第２のピークはＣＴ　Ａ、　Ｐ−ｍ蛋白プラス３種の結 合アミノ酸（Ａｒｇ−１ｉｐ−Ａｒｇ）であることがＣＴ　Ａ、　Ｐ　＝−Ｔｆ ｌに対する保持時間によって確認された。

代案として、ト記したよ・うにＬａｆｆ１Ｂ＋　−４０ペプチドを製造用ＨＰ　 Ｌ　Ｃの前の陰イオン交換クロマトグラフ工程により一層大きい程度まで精製す ることができる。

製造用ＨＰＬＣを、約１０００１００Ｏのハイタンク２１４ＴＰＢ１５２０　（ Ｃ，，３００人孔径、１５〜２０μビ一ズ寸法）の約１００１００Ｏを充填した ７　５　ｍｆｆＸ２５０ｍＡ／Ｅ　（環状拡大部）を備えるセバレーシジンス・ テクノロジー８００Ｂ型装置で行なった。試料を１５％溶剤Ｂにて充填し、短い １５〜２０％Ｂ濃度勾配で操作すると共にラミニンＢ１−４０およびＣＴＡＰｍ 　（Ａｒｇ−１１ｅ−Ａｒｇ）を８０分間の２０〜４０％Ｂ１１１度勾配（３２ ０ｍｊ２／ｎｉｎ　）で溶出して２１５ｎｍで監視することにより分離を行なっ た。分析用）１　Ｐ　Ｌ　Ｃ分離の場合と同様に、２つの同し主ピークが観察さ れた。通ずるフラクシゴンを分析ＲＰ−１−（Ｐ　Ｌ　Ｃにより同定し、集めか つ凍結乾燥させた。

ペプチドを６ＭのＧｎＨＣ（２中に約１００ｍｇ／ｍｆｆ１の濃度で溶解させる ことにより、ラミニュ／Ｂ、−４０ペプチドを折り重ねた。

β−メルカプＩ・エタノールを０．１〜・０．１．５　Ｍの最ｔＰ３！：ｉ４度 まで添加し、５この溶液を５０ｍＭの（〜リス塩基によりｐＨ８，２に調整し、 或いは５０ｍＭの重炭酸ナトリウムと１ｍＭのＥＤＴＡとによりｐｉｔ　１．　 Ｏまで調整した。Ｖ温にて約１〜２時間にわたり培養した後、？ａ　？ｆｌを５ ０　ｍ　Ｍの級ｆＪｉ　ｆｌ、ＩｍＭのＥ　Ｄ　ＴＡにて６ＭのＧｎＨＣｆ２に より５〜１０倍希釈し、次いで約４−６時間にわたり１０倍容積の１０ｍＭβ− メルカプトエタノール（ＧｎｌｌＣｐ、を含まづ″）を含有する５０（１）緩衝 液に対して透析し、その間に天然配置までの折り重なりが住した。或いは、酸化 型Ａ６よび還元型ノクルタチオンの２：ｌ混合物をメルカプトエタノールの代す に折り重ね反応で用いることもできる。最後に、溶液を水に対し透析した。

実施例６ 旺■ ラミニンＢ１−４０ペプチドを上記ＹＩＧＳＩＩおよびＣＤＰＧＹＩにＳＲペプ チドと一緒に燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）に溶解させ、ファルコンＮα３９１５ポ リスチレン９６穴プレートに３７°Ｃにて６０分間被覆した。ペプチド溶液を除 去し、ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。２００＃Ｒの０．１％牛血清アルブミン （ＢＳＡ）（シグマに４９６５）をＰＢＳにてウェルに添加し、がっ３７°Ｃで ６０分間培養することにより、非特異性の細胞結合を防止した。ＰＢＳで２回洗 浄してＢＳＡを除去した。対数増殖期におけるＢ　１６／Ｆ　１０菌体（ネズミ 黒色１ｌｌ）を１、ＰＢＳ中の０．０５％トリプシン１０．Ｉ％ＥＤＴＡに２分 間露出させた後に回収し、増殖培地（ＤＭＥＭ＋　１０％ＦＢＳ）に懸濁させ、 遠心分離し、次いで結合培地（ＤＭＥＭ＋　２０　ｍ、Ｍ　１ｔＥＰＥｓ＋０． １％Ｂ　Ｓ　Ａ、　）に再懸濁させた。１００μ２の菌体（３〜４Ｘ１０’個の 細胞）を各つＪ、ルに添加すると共に、３７°Ｃにて６０分間培養した。非付着 性菌体をプレートの急速回転、ＰＢＳの添加、ウェルの内容物の全部で５０μｉ の吸引によって除去し、洗浄過程をさらに２回反復した。最絽洗浄の後、全溶液 をゆっくり吸引し、菌体を１００μρのメタノールの添加により１５分間固定し た。メタノールを除去（７、菌体を風乾した後に１００μｉの０．１％結晶バイ オレット溶液で５分間束色した。染色を除去し、かつウェルを２００　ｇ　Ｎの 水で洗浄して風乾した。

１００１１１の２％デオキシコリン酸を添加し、超短波オーブン内で緩和に加熱 して菌体を可溶化させた。溶液の光学密度をモレキュラ・デバイス・コ・−ボレ ーション社のブレート測定器で５９０ｒ＋ｍ〜４０５ｎｍの波長にて測定した。

結合した細胞数に列する光学密度の外挿は測定値を標準曲線と比較して行ない、 この標準曲線は種々異なる個数の細胞をミクロ測定板ウェルにて５時間培養しく ′６Ｎ実に付着させるが、顕著に分裂させない）かつ上記のように洗浄し、さら に染色して得られたつ第１表は、組換ラミニンペプチ［”　（１，、ａｍ　Ｂ　 １４０　）が従来報告されている小型合成ベブチ）”ＹＩＧＳＲもしくはＣＤＰ ＧＹＩＧＳＲよりもこの分析にて一層効果的に転移性腫瘍細胞を結合することを 示し２ている。Ｐ、ば、陽性比較として用いたマウスラミニンのプロテアーゼ切 断生成物である。

第　　１　　表 結合細胞の相対数 ０゜０００６３　０．１ ０．００２　　１．９５ ０．００６３　２．３ ０．０２　　２．３　０．８５　　　　０．１５　０．２０．０６３　　　０． ９５　　０．０２５０．２０　　　　１゜３５　　０．６　　０．１　　０．３ ０．６３　　　　２．２０　　０．５ ２．００　　　　１８５　　０．４５　０．１．　　０．４５註　＊：ミクロ測 定板のウェルを被覆ずべく用いたペプチドの濃度。

本発明の種々の特徴を以下の請求の範囲に示す；ＦＩＧ。２Ａ 国際調査報告 国際調査報告 特表平３−５０６０３９　（１３）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．式 【配列があります】 〔式中、Ｐｒｏ１はＰｒｏもしくはｄｅｓ−ＮＨ２Ｐｒｏのいずれかであり、Ｘ はＣｙｓであるかまたは中性脂肪族アミノ酸よりなる群から選択され、Ｙは−Ｏ Ｈもしくは−ＮＨ２のいずれかである〕を有する新規なラミエンＢ１ペプチドま たはその無毒性塩。
2. ２．Ｐｒｏ１がＰｒｏである請求の範囲第１項記載のペプチド。
3. ３．Ｘが中性脂肪族アミノ酸よりなる群から選択される請求の範囲第１項記載の ペプチド。
4. ４．中性脂肪族アミノ酸がＡｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，ＳｅｒおよびＴｈ ｒである請求の範囲第３項記載のペプチド。
5. ５．ＸがＳｅｒてある請求の範囲第１項記載のペプチド。
6. ６．Ｙが−ＯＨである請求の範囲第１項記載のペプチド。
7. ７．Ｐｒｏ１がＰｒｏであり、ＸがＳｅｒであり、Ｙが−ＯＨである請求の範囲 第１項記載のペプチド。
8. ８．細胞基礎膜に対するラミエンの結合を阻止するのに有効な量の請求の範囲第 １項記載のペプチドもしくはその無毒性塩と、医薬上許容しうる液体もしくは固 体キャリヤとからなることを特徴とする動物における腫瘍細胞転移を阻止するた めの医薬組成物。
9. ９．有効量の請求の範囲第８項記載の医薬組成物を動物に投与することを特徴と する動物における細胞基礎膜へのうミエンの結合を阻止する方法。
10. １０．投与を静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内のルートにより、または肺吸収によ り行なう請求の範囲第９項記載の方法。