JPH0214033B2 - - Google Patents
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- JPH0214033B2 JPH0214033B2 JP56013425A JP1342581A JPH0214033B2 JP H0214033 B2 JPH0214033 B2 JP H0214033B2 JP 56013425 A JP56013425 A JP 56013425A JP 1342581 A JP1342581 A JP 1342581A JP H0214033 B2 JPH0214033 B2 JP H0214033B2
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本発明は、２−ハロゲノカルボン酸（以下２−
ハロ酸という。）のＤ体に作用する性質を有する
２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼ及びその製造法に
関するものである。 ２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、２−ハロ酸
から光学活性な２−ヒドロキシ酸を製造する際に
用いられる酵素である。この光学活性２−ヒドロ
キシ酸を製造する従来の方法としては、光学活性
アミン類などの光学分割剤を用いて、Ｄ体及びＬ
体の２−ヒドロキシ酸を得る方法が知られてい
る。しかしながら、この公知の方法は、用いられ
る光学分割剤が高価であり、さらにその操作がき
わめて煩雑であるため、工業的に有利な方法では
なかつた。そのため、２−ハロ酸ハリドヒドロラ
ーゼが用いられており、この酵素を用いると、２
−ハロ酸から光学的に純粋な２−ヒドロキシ酸を
容易に、かつ高収率で得られ、光学活性な２−ヒ
ドロキシ酸を、工業的に生産する方法として非常
に有利である。しかしながら、従来知られている
２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、ジヤーナル・
オブ・バイオロジカルケミストリー誌（J.Biol.
Chem.）第243巻、428頁（1968年）及びヨーロピ
アン、ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー誌
（Eur.J.Biochem.）第21巻、99頁（1971年）など
に記載されているように、いずれも２−ハロ酸の
Ｌ体のみに作用し、Ｄ体の２−ヒドロキシ酸を生
成し、Ｄ体の２−ハロ酸には作用しないものであ
つた。それゆえ、生化学的観点からＤ体と比較
し、より重要なＬ体の２−ヒドロキシ酸の製造
は、従来の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用い
ては不可能であつた。それに加え、原料である２
−ハロ酸は、Ｄ体とＬ体との混合物であるラセミ
体として存在するため、従来の２−ハロ酸ハリド
ヒドロラーゼを用いると、Ｄ体の２−ハロ酸は原
料のまま残存し、経済的にも不利であつた。すな
わち、２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを工業的に
使用するにあたつては、従来の２−ハロ酸ハリド
ヒドロラーゼが、２−ハロ酸のＬ体のみに作用
し、Ｄ体には作用しないという大きな欠点があつ
た。 そこで、本発明者らは、このような観点から２
−ハロ酸のＤ体に作用する新規な２−ハロ酸ハリ
ドヒドロラーゼを求めて鋭意研究した結果、シユ
ードモナス属に属する微生物菌体に２−ハロ酸の
Ｄ体に作用する性質を有する２−ハロ酸ハリドヒ
ドロラーゼが存在することを見い出し、本発明を
完成した。 すなわち、本発明は、次の理化学的性質を有す
る２−ハロゲノカルボン酸ハリドヒドロラーゼ及
びシユードモナス属に属する細菌を培養し、培養
物から次の理化学的性質を有する２−ハロゲノカ
ルボン酸ハリドヒドロラーゼを採取することを特
徴とする次の理化学的性質を有する２−ハロゲノ
カルボン酸ハリドヒドロラーゼの製造法を要旨と
するものである。 (a) 作用 Ｌ−Ｒ・CHX・COOH＋H2O →Ｄ−Ｒ・CHOH・COOH＋H+＋X- Ｄ−Ｒ・CHX・COOH＋H2O →Ｌ−Ｒ・CHOH・COOH＋H+＋X- Ｒ・CX2・COOH＋H2O →Ｒ・CO・COOH＋2H+＋2X- 上記反応を触媒する。なお、上記一般式中の
Ｒは、Ｈ、CH3、C2H5、C3H7などの原子団を
表し、Ｘは、塩素、臭素などのハロゲン原子を
表す。 (b) 基質特異性 炭素数が２〜５個までの２−ハロゲノカルボ
ン酸に作用する。 (c) 至適PH PH約9.5（DL−２−クロルプロピオン酸を基
質とし、30℃にて測定した。） (d) 作用適温 約45℃ (e) 分子量 約５万（セフアデツクスＧ−150ゲルクロマ
トグラフイーによる。） 本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、特
に２−ハロ酸のＬ体にも作用する性質を有してい
る。 本発明において、２−ハロ酸とは、一般式Ｒ・
CHX・COOH（Ｘはハロゲン原子を表わす。）又
はＲ−CX2COOHで示す化合物で、そのような具
体例としては、モノクロル酢酸、モノブロモ酢
酸、モノヨード酢酸、ジクロル酢酸、ジブロモ酢
酸あるいはトリクロル酢酸などの酢酸の誘導体、
２−クロルプロピオン酸、２−ブロモプロピオン
酸、２，２−ジクロルプロピオン酸などのプロピ
オン酸誘導体、２−クロル酪酸、２−ブロモ酪
酸、２，２−ジクロル酪酸などの酪酸の誘導体、
２−クロル吉草酸、２−ブロモ吉草酸、２，２−
ジクロル吉草酸などの吉草酸の誘導体があげられ
る。また、炭素数が５個以下のカルボン酸の２番
目の炭素原子に、塩素あるいは臭素などのハロゲ
ン原子が１個又は２個結合している化合物でもよ
いし、カルボン酸が酢酸の場合には、１〜３個結
合している化合物でもよい。 次に本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼの
理化学的性質を示す。 １ 作用 前記したとおり。また、水の存在下にＬ−２
−ハロ酸に作用して炭素−ハロゲン結合を加水
分解し、Ｄ−２−ヒドロキシ酸を生成する。２
−ハロ酸がＤ体の場合には、Ｌ体の２−ヒドロ
キシ酸を生成する。さらに基質が２−ジハロ酸
の場合には２−ケト酸を生成する。 ２ 基質特異性 前記したとおり。また、Ｄ，Ｌ及びDL−２
−クロルプロピオン酸に対するミカエリス定数
（Km値）は、それぞれ4.8、1.1、3.2ｍＭである。
このほかにDL−２−クロルプロピオン酸を100
とした場合の他の基質の反応速度は次表のとお
りである。
ハロ酸という。）のＤ体に作用する性質を有する
２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼ及びその製造法に
関するものである。 ２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、２−ハロ酸
から光学活性な２−ヒドロキシ酸を製造する際に
用いられる酵素である。この光学活性２−ヒドロ
キシ酸を製造する従来の方法としては、光学活性
アミン類などの光学分割剤を用いて、Ｄ体及びＬ
体の２−ヒドロキシ酸を得る方法が知られてい
る。しかしながら、この公知の方法は、用いられ
る光学分割剤が高価であり、さらにその操作がき
わめて煩雑であるため、工業的に有利な方法では
なかつた。そのため、２−ハロ酸ハリドヒドロラ
ーゼが用いられており、この酵素を用いると、２
−ハロ酸から光学的に純粋な２−ヒドロキシ酸を
容易に、かつ高収率で得られ、光学活性な２−ヒ
ドロキシ酸を、工業的に生産する方法として非常
に有利である。しかしながら、従来知られている
２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、ジヤーナル・
オブ・バイオロジカルケミストリー誌（J.Biol.
Chem.）第243巻、428頁（1968年）及びヨーロピ
アン、ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー誌
（Eur.J.Biochem.）第21巻、99頁（1971年）など
に記載されているように、いずれも２−ハロ酸の
Ｌ体のみに作用し、Ｄ体の２−ヒドロキシ酸を生
成し、Ｄ体の２−ハロ酸には作用しないものであ
つた。それゆえ、生化学的観点からＤ体と比較
し、より重要なＬ体の２−ヒドロキシ酸の製造
は、従来の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用い
ては不可能であつた。それに加え、原料である２
−ハロ酸は、Ｄ体とＬ体との混合物であるラセミ
体として存在するため、従来の２−ハロ酸ハリド
ヒドロラーゼを用いると、Ｄ体の２−ハロ酸は原
料のまま残存し、経済的にも不利であつた。すな
わち、２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを工業的に
使用するにあたつては、従来の２−ハロ酸ハリド
ヒドロラーゼが、２−ハロ酸のＬ体のみに作用
し、Ｄ体には作用しないという大きな欠点があつ
た。 そこで、本発明者らは、このような観点から２
−ハロ酸のＤ体に作用する新規な２−ハロ酸ハリ
ドヒドロラーゼを求めて鋭意研究した結果、シユ
ードモナス属に属する微生物菌体に２−ハロ酸の
Ｄ体に作用する性質を有する２−ハロ酸ハリドヒ
ドロラーゼが存在することを見い出し、本発明を
完成した。 すなわち、本発明は、次の理化学的性質を有す
る２−ハロゲノカルボン酸ハリドヒドロラーゼ及
びシユードモナス属に属する細菌を培養し、培養
物から次の理化学的性質を有する２−ハロゲノカ
ルボン酸ハリドヒドロラーゼを採取することを特
徴とする次の理化学的性質を有する２−ハロゲノ
カルボン酸ハリドヒドロラーゼの製造法を要旨と
するものである。 (a) 作用 Ｌ−Ｒ・CHX・COOH＋H2O →Ｄ−Ｒ・CHOH・COOH＋H+＋X- Ｄ−Ｒ・CHX・COOH＋H2O →Ｌ−Ｒ・CHOH・COOH＋H+＋X- Ｒ・CX2・COOH＋H2O →Ｒ・CO・COOH＋2H+＋2X- 上記反応を触媒する。なお、上記一般式中の
Ｒは、Ｈ、CH3、C2H5、C3H7などの原子団を
表し、Ｘは、塩素、臭素などのハロゲン原子を
表す。 (b) 基質特異性 炭素数が２〜５個までの２−ハロゲノカルボ
ン酸に作用する。 (c) 至適PH PH約9.5（DL−２−クロルプロピオン酸を基
質とし、30℃にて測定した。） (d) 作用適温 約45℃ (e) 分子量 約５万（セフアデツクスＧ−150ゲルクロマ
トグラフイーによる。） 本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、特
に２−ハロ酸のＬ体にも作用する性質を有してい
る。 本発明において、２−ハロ酸とは、一般式Ｒ・
CHX・COOH（Ｘはハロゲン原子を表わす。）又
はＲ−CX2COOHで示す化合物で、そのような具
体例としては、モノクロル酢酸、モノブロモ酢
酸、モノヨード酢酸、ジクロル酢酸、ジブロモ酢
酸あるいはトリクロル酢酸などの酢酸の誘導体、
２−クロルプロピオン酸、２−ブロモプロピオン
酸、２，２−ジクロルプロピオン酸などのプロピ
オン酸誘導体、２−クロル酪酸、２−ブロモ酪
酸、２，２−ジクロル酪酸などの酪酸の誘導体、
２−クロル吉草酸、２−ブロモ吉草酸、２，２−
ジクロル吉草酸などの吉草酸の誘導体があげられ
る。また、炭素数が５個以下のカルボン酸の２番
目の炭素原子に、塩素あるいは臭素などのハロゲ
ン原子が１個又は２個結合している化合物でもよ
いし、カルボン酸が酢酸の場合には、１〜３個結
合している化合物でもよい。 次に本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼの
理化学的性質を示す。 １ 作用 前記したとおり。また、水の存在下にＬ−２
−ハロ酸に作用して炭素−ハロゲン結合を加水
分解し、Ｄ−２−ヒドロキシ酸を生成する。２
−ハロ酸がＤ体の場合には、Ｌ体の２−ヒドロ
キシ酸を生成する。さらに基質が２−ジハロ酸
の場合には２−ケト酸を生成する。 ２ 基質特異性 前記したとおり。また、Ｄ，Ｌ及びDL−２
−クロルプロピオン酸に対するミカエリス定数
（Km値）は、それぞれ4.8、1.1、3.2ｍＭである。
このほかにDL−２−クロルプロピオン酸を100
とした場合の他の基質の反応速度は次表のとお
りである。
【表】
３ 至適PH
PH約9.5（DL−２−クロルプロピオン酸を基
質とし、30℃にて測定した。） ４ 安定PH範囲 PH約６〜12（４℃、24時間経過後、もとの活
性の90％以上が存在。） ５ 作用適温及び耐熱性 PH9.5で20℃より45℃まで温度の上昇ととも
に活性は増大するが、45℃で15分間処理する
と、活性は50％以下に低下する。 ６ 力価の測定法 50マイクロモルのＤ，Ｌ−２−クロルプロピ
オン酸を含む0.1Mトリス硫酸緩衝液（PH9.5）
２mlに酵素液１〜100μを加え、30℃にて10
分間反応後、3.6規定硫酸0.1mlを添加し反応を
停止した。この反応混合液中の塩素イオンをチ
オシアン酸法により定量した。すなわち、反応
混合液あるいはその希釈溶液１mlに対し、チオ
シアン酸水銀0.1％を含む10％エタノール含有
ジオキサン溶液１ml、さらに８％の鉄明バンを
含む６規定硝酸溶液0.4mlを加え、460nｍの吸
光度を測定し、検量線から塩素イオン濃度を求
めた。30℃で１分間に１マイクロモルの塩素イ
オンを生成する酵素量を１単位とした。 ７ 分子量 セフアデツクスＧ−150ゲルクロマトグラフ
イーにより、約５万の分子量であつた。 ８ 阻害、活性化及び安定化剤。 種々の金属イオン又は添加物を加え、酵素活
性を測定したところ、下表に示すごとく塩化第
二水銀、亜鉛、マンガン及びニツケルなどによ
り阻害された。また、今のところ本酵素に特異
的な活性化剤あるいは安定化剤は見出されてい
ない。
質とし、30℃にて測定した。） ４ 安定PH範囲 PH約６〜12（４℃、24時間経過後、もとの活
性の90％以上が存在。） ５ 作用適温及び耐熱性 PH9.5で20℃より45℃まで温度の上昇ととも
に活性は増大するが、45℃で15分間処理する
と、活性は50％以下に低下する。 ６ 力価の測定法 50マイクロモルのＤ，Ｌ−２−クロルプロピ
オン酸を含む0.1Mトリス硫酸緩衝液（PH9.5）
２mlに酵素液１〜100μを加え、30℃にて10
分間反応後、3.6規定硫酸0.1mlを添加し反応を
停止した。この反応混合液中の塩素イオンをチ
オシアン酸法により定量した。すなわち、反応
混合液あるいはその希釈溶液１mlに対し、チオ
シアン酸水銀0.1％を含む10％エタノール含有
ジオキサン溶液１ml、さらに８％の鉄明バンを
含む６規定硝酸溶液0.4mlを加え、460nｍの吸
光度を測定し、検量線から塩素イオン濃度を求
めた。30℃で１分間に１マイクロモルの塩素イ
オンを生成する酵素量を１単位とした。 ７ 分子量 セフアデツクスＧ−150ゲルクロマトグラフ
イーにより、約５万の分子量であつた。 ８ 阻害、活性化及び安定化剤。 種々の金属イオン又は添加物を加え、酵素活
性を測定したところ、下表に示すごとく塩化第
二水銀、亜鉛、マンガン及びニツケルなどによ
り阻害された。また、今のところ本酵素に特異
的な活性化剤あるいは安定化剤は見出されてい
ない。
【表】
糖 類 酸 ガス
(1) Ｌ−アラビノース ＋ −
(2) Ｄ−キシロース ＋ −
(3) Ｄ−グルコース ＋ −
(4) Ｄ−マンノース ＋ −
(5) Ｄ−フラクトース ＋ −
(6) Ｄ−ガラクトース ＋ −
(7) 麦芽糖 − −
(8) シヨ糖 − −
(9) 乳 糖 ＋ −
(10) トレハロース ＋ −
(11) Ｄ−ソルビツト ＋ −
(12) Ｄ−マンニツト ＋ −
(13) イノシツト ＋ −
(14) グリセリン ＋ −
(15) デンプン − −
〔炭素化合物の資化性〕
(1) 資化するもの；Ｄ−２−クロルプロピオン酸
グルコース、２−ケトグルコン酸、イノシツ
ト、トレハロース、乳糖、ベンジルアミン、β
−アラニン、Ｌ−バリン、DL−アルギニン、
ベタイン、クロル酢酸、２−クロルプロピオン
酸、パラヒドロキシ安息香酸。 (2) 資化しないもの；シヨ糖、ゲラニオール、メ
タノール、メチルアミン、シユウ酸。 以上の菌学的性質から、バージエイのマニユア
ル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジ
ー（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）第７版及び第８版に基づき検索
した結果、この菌株は、グラム陰性桿菌、極
鞭毛を有し、運動性がある、好気性、オキシ
ダーゼ陽性、グルコースを酸化的に分解するこ
とから、シユードモナス（Pseudomonas）属に
含まれる細菌であると考えられる。そこで、シユ
ードモナス属に含まれる種について検索を行なつ
たところ、栄養要求性がなく、ポリ−β−ヒドロ
キシ酪酸を著積せず、蛍光性色素を生産せず、さ
らに脱窒反応が陰性であることから、シユードモ
ナス・アルカリゲネス（Pseudomonas
alcaligenes）に属すると考えられるが、41℃で
生育しない、ゼラチンを加水分解しない、グルコ
ース、トレハロース、２−ケトグルコン酸、イノ
シツト、Ｌ−バリンを資化するなどの諸性質が異
なつている。さらに、シユードモナス−プチダ
（Pseudomonas Putida）に属するとも考えられ
るが、蛍光性色素を生産しない、トレハロース、
イノシツトを資化するなどの諸性質が異なつてお
り、本菌株と菌学的諸性質が一致する公知の菌株
は見出せなかつた。特にＤ体の２−ハロ酸を資化
する性質を有する菌株の報告はなかつた。以上の
ことから、本菌株は、シユードモナス属に属する
新菌株であると考えられるので、シユードモナス
Uk113株と命名し、昭和55年７月30日に通産省工
業技術院技術研究所に寄託した。その微生物受託
番号は微工研菌寄第5666号である。 本発明における細菌を培養するに際して用いら
れる培地の栄養源としては、細菌が資化可能な栄
養源であればいかなるものでも使用でき、炭素源
としては、たとえば、グルコース、グリセリン、
アルコール類、油脂、脂肪酸、さらに２−ハロ酸
等が使用でき、窒素源としては、たとえば、硫酸
アンモニウム、アンモニア、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム、各種アミノ酸、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス等の無機又は有機物が使用
できる。さらに無機塩類として、たとえば、カリ
ウム、ナトリウム、リン酸、鉄、亜鉛、マグネシ
ウム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト、モ
リブデン等の各塩類、必要に応じて微量金属塩、
コーン・ステイープ・リカー、ビタミン類、核酸
等を使用してもよく、細菌の一般的栄養培地が使
用できる。 これらの培地を用いて、本菌株を、好ましくは
10〜36℃、さらに好ましくは20〜33℃、最適には
20〜30℃で約５〜48時間、好気的に培養し、得ら
れた培養物から本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロ
ラーゼが採取されるが、培養物、分離生菌体、分
離菌体の処理物、粗製酵素、精製酵素等のあらゆ
る段階で採取できる。 精製法としては、通常の酵素精製法を用いるこ
とができる。すなわち、遠心分離等により菌体を
得た後、菌体をマントンゴーリン、ダイノミル、
フレンチプレス、超音波処理等により細胞破砕
後、遠心分離により細胞片を除去し、細胞抽出液
を得、これに硫酸ストレプトマイシン又は硫酸プ
ロタミン処理を行ない、さらには、硫酸アンモニ
ウムなどによる塩析処理、又は、アセトンなどに
よる有機溶媒処理等を行ない、精製するために、
DEAEセルロースカラム等のイオン交換クロマト
グラフイー、ヒドロキシアパタイトカラム等の吸
着クロマトグラフイー、セフアデツクスクロマト
グラフイー等によるゲルクロマトグラフイーを組
合わせて行なうことができる。このようにして、
本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを単離、
精製することができる。 本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、２
−ハロ酸のＤ体に作用するためにＬ−２−ハロ酸
に作用してＤ−２−ヒドロキシ酸を生成し、さら
にＤ−２−ハロ酸に作用してＬ−２−ヒドロキシ
酸を生成する。そのため、Ｌ−２−ハロ酸にのみ
作用し、Ｄ−２−ハロ酸には作用しない従来の２
−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いては、不可能
であつたＬ−２−ヒドロキシ酸の製造を可能にす
ることができる。たとえば、２−ハロ酸として、
DL−２−クロルプロピオン酸を用いて、光学活
性な乳酸を採取するためには、まず従来知られて
いるＬ体にのみ作用する２−ハロ酸ハリドヒドロ
ラーゼを用いて、Ｌ−２−クロルプロピオン酸を
Ｄ−乳酸に変換した後、Ｄ−乳酸と残存するＤ−
２−クロルプロピオン酸とを分離する。その際の
分離方法としては、たとえば、溶媒に対する溶解
度の差あるいはイオン交換法などが適用できる。 次に分離したＤ−２−クロルプロピオン酸を本
発明の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いて、
Ｌ−乳酸に変換すればよい。このようにして、原
料として、DL−２−クロルプロピオン酸を用い
た場合には、光学活性な乳酸を高収率で採取する
ことができ、従来の酵素で不可能であつたＬ−乳
酸の生産が可能となる。さらに従来のＬ−乳酸の
製造は、主として、乳酸菌を用いた醗酵法で行な
われているが、本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロ
ラーゼを用いて製造する場合には、原料の価格が
安価であること、酵素法の利点である無公害、省
エネルギー等の点で従来法と比較して優れてお
り、光学活性な乳酸製造法として非常に有利であ
る。 また、２−ハロ酸を原料として得られる光学活
性な２−ヒドロキシ酸は、医薬品又はアミノ酸の
合成中間体として有用であり、さらには生化学的
試薬としても使用できる。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 実施例 １ 硫酸アンモニウム５ｇ／、リン酸−カリウム
１ｇ／、リン酸二ナトリウム１ｇ／、硫酸マ
グネシウム0.05ｇ／、硫酸第一鉄0.005ｇ／、
水酸化カルシウム0.005ｇ／、硫酸マンガン
0.0015ｇ／、モリブデン酸ナトリウム0.0015
ｇ／、PH7.0に調整した培地248を、120℃、
30分間加熱殺菌した後、DL−２−クロルプロピ
オン酸750ｇを水酸化ナトリウムにてPH７に調整
後、除菌濾過したもの２を加え、シユードモナ
スUK113株（微工研菌寄第5666号）を接種し、
30℃で18時間通気撹拌倍養した。次いで培養後、
シヤープレスを用いて遠心分離により菌体を採取
して600ｇの菌体を得た。得られた菌体を凍結状
態で保存した。 次に凍結菌体600ｇを1.2の0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.5）に懸濁し、ダイノミルを用いて細胞
を破壊後、遠心分離により細胞片を除去し、２−
ハロ酸ハリドヒドロラーゼを含む粗抽出液を得
た。この粗抽出液１当り２％の硫酸プロタミン
水溶液200mlを添加し、十分撹拌した後、生じた
沈殿を遠心分離により除去し、プロタミン上清を
得た。この上清に固形硫酸アンモニウムを徐々に
加えて40％飽和（４℃）とした。生成した沈殿を
遠心分離により除去し、上清にさらに固形硫酸ア
ンモニウムを徐々に加えて70％飽和（４℃）とし
た。生成した沈殿を遠心分離により集め、再び50
ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）にとかし、ついで30
倍量の50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）に対して透
析、脱塩して粗酵素液を得た。この粗酵素液をあ
らかじめ50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）で平衡化
したDEAEセルロースカラムに通じ、リン酸緩衝
液の濃度を徐々に増して溶出せしめると、リン酸
濃度100ｍＭの近くで目的の２−ハロ酸ハリドヒ
ドロラーゼが溶出した。この区分を集め、濃縮、
脱塩後、さらに５ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）で
平衡化したヒドロキシアパタイトカラムにその溶
出液を通し、５ｍＭリン酸緩衝液から100ｍＭリ
ン酸緩衝液の直線勾配の溶出を行なつたところ、
25ｍＭ濃度近くに目的の２−ハロ酸ハリドヒドロ
ラーゼが溶出した。この溶出区分を濃縮後、50ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH7.5）を溶出液に用いたセフ
アデツクスＧ−150カラムクロマトグラフイーを
行なうことにより、精製された２−ハロ酸ハリド
ヒドロラーゼを得ることができた。このようにし
て得た２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、PH9.4
の7.5％アクリルアミドデイスク電気泳動で陽極
側に移動し、単一なバンドを与え、セフアデツク
スＧ−150ゲルクロマトグラフイーより、分子量
は約５万であつた。 その収量は約100mgで、酵素１mg当り、約35単
位の力価を示し、その精製度は粗抽出液を１とす
ると約60であつた。 参考例 １ Ｄ−又はＬ−２−クロルプロピオン酸50マイク
ロモルを含む0.1Mトリス硫酸緩衝液（PH9.5）２
mlに、実施例１にて採取した精製酵素1.5ユニツ
トを添加し、30℃にて２時間反応を行なわしめた
後、反応液中のＤ及びＬ−乳酸を定量した。この
場合、0.4Mのヒドラジンを含む0.5Mグリシン緩
衝液（PH9.0）0.5mlに、30ｍＭのNAD（ニコチン
アミド、アデニン、ジヌクレオチド）及び被検液
をそれぞれ50μ添加し、ＤあるいはＬ−乳酸脱
水素2.5ユニツトを加え、25℃において、340nｍ
における単位時間あたりの吸光度の増加を測定
し、濃度既知の乳酸カルシウム溶液を用いて、あ
らかじめ作製した検量線から、被検液中の乳酸を
定量した。 その結果を第１表に示す。
グルコース、２−ケトグルコン酸、イノシツ
ト、トレハロース、乳糖、ベンジルアミン、β
−アラニン、Ｌ−バリン、DL−アルギニン、
ベタイン、クロル酢酸、２−クロルプロピオン
酸、パラヒドロキシ安息香酸。 (2) 資化しないもの；シヨ糖、ゲラニオール、メ
タノール、メチルアミン、シユウ酸。 以上の菌学的性質から、バージエイのマニユア
ル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジ
ー（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）第７版及び第８版に基づき検索
した結果、この菌株は、グラム陰性桿菌、極
鞭毛を有し、運動性がある、好気性、オキシ
ダーゼ陽性、グルコースを酸化的に分解するこ
とから、シユードモナス（Pseudomonas）属に
含まれる細菌であると考えられる。そこで、シユ
ードモナス属に含まれる種について検索を行なつ
たところ、栄養要求性がなく、ポリ−β−ヒドロ
キシ酪酸を著積せず、蛍光性色素を生産せず、さ
らに脱窒反応が陰性であることから、シユードモ
ナス・アルカリゲネス（Pseudomonas
alcaligenes）に属すると考えられるが、41℃で
生育しない、ゼラチンを加水分解しない、グルコ
ース、トレハロース、２−ケトグルコン酸、イノ
シツト、Ｌ−バリンを資化するなどの諸性質が異
なつている。さらに、シユードモナス−プチダ
（Pseudomonas Putida）に属するとも考えられ
るが、蛍光性色素を生産しない、トレハロース、
イノシツトを資化するなどの諸性質が異なつてお
り、本菌株と菌学的諸性質が一致する公知の菌株
は見出せなかつた。特にＤ体の２−ハロ酸を資化
する性質を有する菌株の報告はなかつた。以上の
ことから、本菌株は、シユードモナス属に属する
新菌株であると考えられるので、シユードモナス
Uk113株と命名し、昭和55年７月30日に通産省工
業技術院技術研究所に寄託した。その微生物受託
番号は微工研菌寄第5666号である。 本発明における細菌を培養するに際して用いら
れる培地の栄養源としては、細菌が資化可能な栄
養源であればいかなるものでも使用でき、炭素源
としては、たとえば、グルコース、グリセリン、
アルコール類、油脂、脂肪酸、さらに２−ハロ酸
等が使用でき、窒素源としては、たとえば、硫酸
アンモニウム、アンモニア、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム、各種アミノ酸、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス等の無機又は有機物が使用
できる。さらに無機塩類として、たとえば、カリ
ウム、ナトリウム、リン酸、鉄、亜鉛、マグネシ
ウム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト、モ
リブデン等の各塩類、必要に応じて微量金属塩、
コーン・ステイープ・リカー、ビタミン類、核酸
等を使用してもよく、細菌の一般的栄養培地が使
用できる。 これらの培地を用いて、本菌株を、好ましくは
10〜36℃、さらに好ましくは20〜33℃、最適には
20〜30℃で約５〜48時間、好気的に培養し、得ら
れた培養物から本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロ
ラーゼが採取されるが、培養物、分離生菌体、分
離菌体の処理物、粗製酵素、精製酵素等のあらゆ
る段階で採取できる。 精製法としては、通常の酵素精製法を用いるこ
とができる。すなわち、遠心分離等により菌体を
得た後、菌体をマントンゴーリン、ダイノミル、
フレンチプレス、超音波処理等により細胞破砕
後、遠心分離により細胞片を除去し、細胞抽出液
を得、これに硫酸ストレプトマイシン又は硫酸プ
ロタミン処理を行ない、さらには、硫酸アンモニ
ウムなどによる塩析処理、又は、アセトンなどに
よる有機溶媒処理等を行ない、精製するために、
DEAEセルロースカラム等のイオン交換クロマト
グラフイー、ヒドロキシアパタイトカラム等の吸
着クロマトグラフイー、セフアデツクスクロマト
グラフイー等によるゲルクロマトグラフイーを組
合わせて行なうことができる。このようにして、
本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを単離、
精製することができる。 本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、２
−ハロ酸のＤ体に作用するためにＬ−２−ハロ酸
に作用してＤ−２−ヒドロキシ酸を生成し、さら
にＤ−２−ハロ酸に作用してＬ−２−ヒドロキシ
酸を生成する。そのため、Ｌ−２−ハロ酸にのみ
作用し、Ｄ−２−ハロ酸には作用しない従来の２
−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いては、不可能
であつたＬ−２−ヒドロキシ酸の製造を可能にす
ることができる。たとえば、２−ハロ酸として、
DL−２−クロルプロピオン酸を用いて、光学活
性な乳酸を採取するためには、まず従来知られて
いるＬ体にのみ作用する２−ハロ酸ハリドヒドロ
ラーゼを用いて、Ｌ−２−クロルプロピオン酸を
Ｄ−乳酸に変換した後、Ｄ−乳酸と残存するＤ−
２−クロルプロピオン酸とを分離する。その際の
分離方法としては、たとえば、溶媒に対する溶解
度の差あるいはイオン交換法などが適用できる。 次に分離したＤ−２−クロルプロピオン酸を本
発明の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いて、
Ｌ−乳酸に変換すればよい。このようにして、原
料として、DL−２−クロルプロピオン酸を用い
た場合には、光学活性な乳酸を高収率で採取する
ことができ、従来の酵素で不可能であつたＬ−乳
酸の生産が可能となる。さらに従来のＬ−乳酸の
製造は、主として、乳酸菌を用いた醗酵法で行な
われているが、本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロ
ラーゼを用いて製造する場合には、原料の価格が
安価であること、酵素法の利点である無公害、省
エネルギー等の点で従来法と比較して優れてお
り、光学活性な乳酸製造法として非常に有利であ
る。 また、２−ハロ酸を原料として得られる光学活
性な２−ヒドロキシ酸は、医薬品又はアミノ酸の
合成中間体として有用であり、さらには生化学的
試薬としても使用できる。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 実施例 １ 硫酸アンモニウム５ｇ／、リン酸−カリウム
１ｇ／、リン酸二ナトリウム１ｇ／、硫酸マ
グネシウム0.05ｇ／、硫酸第一鉄0.005ｇ／、
水酸化カルシウム0.005ｇ／、硫酸マンガン
0.0015ｇ／、モリブデン酸ナトリウム0.0015
ｇ／、PH7.0に調整した培地248を、120℃、
30分間加熱殺菌した後、DL−２−クロルプロピ
オン酸750ｇを水酸化ナトリウムにてPH７に調整
後、除菌濾過したもの２を加え、シユードモナ
スUK113株（微工研菌寄第5666号）を接種し、
30℃で18時間通気撹拌倍養した。次いで培養後、
シヤープレスを用いて遠心分離により菌体を採取
して600ｇの菌体を得た。得られた菌体を凍結状
態で保存した。 次に凍結菌体600ｇを1.2の0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.5）に懸濁し、ダイノミルを用いて細胞
を破壊後、遠心分離により細胞片を除去し、２−
ハロ酸ハリドヒドロラーゼを含む粗抽出液を得
た。この粗抽出液１当り２％の硫酸プロタミン
水溶液200mlを添加し、十分撹拌した後、生じた
沈殿を遠心分離により除去し、プロタミン上清を
得た。この上清に固形硫酸アンモニウムを徐々に
加えて40％飽和（４℃）とした。生成した沈殿を
遠心分離により除去し、上清にさらに固形硫酸ア
ンモニウムを徐々に加えて70％飽和（４℃）とし
た。生成した沈殿を遠心分離により集め、再び50
ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）にとかし、ついで30
倍量の50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）に対して透
析、脱塩して粗酵素液を得た。この粗酵素液をあ
らかじめ50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）で平衡化
したDEAEセルロースカラムに通じ、リン酸緩衝
液の濃度を徐々に増して溶出せしめると、リン酸
濃度100ｍＭの近くで目的の２−ハロ酸ハリドヒ
ドロラーゼが溶出した。この区分を集め、濃縮、
脱塩後、さらに５ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）で
平衡化したヒドロキシアパタイトカラムにその溶
出液を通し、５ｍＭリン酸緩衝液から100ｍＭリ
ン酸緩衝液の直線勾配の溶出を行なつたところ、
25ｍＭ濃度近くに目的の２−ハロ酸ハリドヒドロ
ラーゼが溶出した。この溶出区分を濃縮後、50ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH7.5）を溶出液に用いたセフ
アデツクスＧ−150カラムクロマトグラフイーを
行なうことにより、精製された２−ハロ酸ハリド
ヒドロラーゼを得ることができた。このようにし
て得た２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、PH9.4
の7.5％アクリルアミドデイスク電気泳動で陽極
側に移動し、単一なバンドを与え、セフアデツク
スＧ−150ゲルクロマトグラフイーより、分子量
は約５万であつた。 その収量は約100mgで、酵素１mg当り、約35単
位の力価を示し、その精製度は粗抽出液を１とす
ると約60であつた。 参考例 １ Ｄ−又はＬ−２−クロルプロピオン酸50マイク
ロモルを含む0.1Mトリス硫酸緩衝液（PH9.5）２
mlに、実施例１にて採取した精製酵素1.5ユニツ
トを添加し、30℃にて２時間反応を行なわしめた
後、反応液中のＤ及びＬ−乳酸を定量した。この
場合、0.4Mのヒドラジンを含む0.5Mグリシン緩
衝液（PH9.0）0.5mlに、30ｍＭのNAD（ニコチン
アミド、アデニン、ジヌクレオチド）及び被検液
をそれぞれ50μ添加し、ＤあるいはＬ−乳酸脱
水素2.5ユニツトを加え、25℃において、340nｍ
における単位時間あたりの吸光度の増加を測定
し、濃度既知の乳酸カルシウム溶液を用いて、あ
らかじめ作製した検量線から、被検液中の乳酸を
定量した。 その結果を第１表に示す。
【表】
表１から明らかなように、本発明の酵素を用い
るとＬ−乳酸の製造が可能である。
るとＬ−乳酸の製造が可能である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の理化学的性質を有する２−ハロゲノカル
ボン酸ハリドヒドロラーゼ。 (a) 作用 Ｌ−Ｒ・CHX・COOH＋H2O →Ｄ−Ｒ・CHOH・COOH＋H+＋X- Ｄ−Ｒ・CHX・COOH＋H2O →Ｌ−Ｒ・CHOH・COOH＋H+＋X- Ｒ・CX2・COOH＋H2O →Ｒ・CO・COOH＋2H+＋2X- 上記反応を触媒する。なお、上記一般式中の
Ｒは、Ｈ、CH3、C2H5、C3H7などの原子団を
表し、Ｘは、塩素、臭素などのハロゲン原子を
表す。 (b) 基質特異性 炭素数が２〜５個までの２−ハロゲノカルボ
ン酸に作用する。 (c) 至適PH PH約9.5（DL−２−クロルプロピオン酸を基
質とし、30℃にて測定した。） (d) 作用適温 約45℃ (e) 分子量 約５万（セフアデツクスＧ−150ゲルクロマ
トグラフイーによる。） ２ シユードモナス属に属する細菌を培養し、培
養物から次の理化学的性質を有する２−ハロゲノ
カルボン酸ハリドヒドロラーゼを採取することを
特徴とする次の理化学的性質を有する２−ハロゲ
ノカルボン酸ハリドヒドロラーゼの製造法。 (a) 作用 Ｌ−Ｒ・CHX・COOH＋H2O →Ｄ−Ｒ・CHOH・COOH＋H+＋X- Ｄ−Ｒ・CHX・COOH＋H2O →Ｌ−Ｒ・CHOH・COOH＋H+＋X- Ｒ・CX2・COOH＋H2O →Ｒ・CO・COOH＋2H+＋2X- 上記反応を触媒する。なお、上記一般式中の
Ｒは、Ｈ、CH3、C2H5、C3H7などの原子団を
表し、Ｘは、塩素、臭素などのハロゲン原子を
表す。 (b) 基質特異性 炭素数が２〜５個までの２−ハロゲノカルボ
ン酸に作用する。 (c) 至適PH PH約9.5（DL−２−クロルプロピオン酸を基
質とし、30℃にて測定した。） (d) 作用適温 約45℃ (e) 分子量 約５万（セフアデツクスＧ−150ゲルクロマ
トグラフイーによる。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56013425A JPS57125691A (en) | 1981-01-30 | 1981-01-30 | 2-halogenocarboxylic acid halidohydrolase and its preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56013425A JPS57125691A (en) | 1981-01-30 | 1981-01-30 | 2-halogenocarboxylic acid halidohydrolase and its preparation |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP399088A Division JPS63173598A (ja) | 1988-01-11 | 1988-01-11 | 光学活性２−ヒドロキシ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57125691A JPS57125691A (en) | 1982-08-05 |
| JPH0214033B2 true JPH0214033B2 (ja) | 1990-04-05 |
Family
ID=11832778
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56013425A Granted JPS57125691A (en) | 1981-01-30 | 1981-01-30 | 2-halogenocarboxylic acid halidohydrolase and its preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57125691A (ja) |
-
1981
- 1981-01-30 JP JP56013425A patent/JPS57125691A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57125691A (en) | 1982-08-05 |
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