JPH0137112B2 - - Google Patents
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- JPH0137112B2 JPH0137112B2 JP56013426A JP1342681A JPH0137112B2 JP H0137112 B2 JPH0137112 B2 JP H0137112B2 JP 56013426 A JP56013426 A JP 56013426A JP 1342681 A JP1342681 A JP 1342681A JP H0137112 B2 JPH0137112 B2 JP H0137112B2
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Description
本発明は、シュードモナスUK113株に関する
ものである。 ２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、２−ハロ酸
を原料として、光学活性な２−ヒドロキシカルボ
ン酸をを製造する際に用いられる酵素である。こ
の光学活性２−ヒドロキシカルボン酸を製造する
従来の方法としては、光学活性アミン類などの光
学分割剤を用いて、Ｄ体及びＬ体の２−ヒドロキ
シカルボン酸を得る方法が知られている。しかし
ながら、この公知の方法は、用いられる光学分割
剤が高価であり、さらにその操作がきめて煩雑で
あるため、工業的に有利な方法ではなかつた。そ
のため、２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼが用いら
れており、この酵素を用いると、２−ハロ酸から
光学的に純粋な２−ヒドロキシカルボン酸を容易
にかつ高収率で得られ、光学活性な２−ヒドロキ
シカルボン酸を、工業的に生産する方法として非
常に有利である。しかしながら、従来知られてい
る２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌（J.
Biol.Chem.）第234巻、428頁（1968年）及びヨ
ーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオケミスト
リー誌（Eur.J.Biochem.）第21巻、99頁（1971
年）などに記載されているように、いずれも２−
ハロ酸のＬ体のみに作用し、Ｄ体の２−ヒドロキ
シカルボン酸を生成し、Ｄ体の２−ハロ酸には作
用しないものであつた。それゆえ、生化学的観点
からＤ体と比較し、より重要なＬ体の２−ヒドロ
キシカルボン酸の製造は、従来の２−ハロ酸ハリ
ドヒドロラーゼを用いては不可能であつた。それ
に加え、原料である２−ハロ酸は、Ｄ体とＬ体と
の混合物であるラセミ体として存在するため、従
来の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いると、
Ｄ体の２−ハロ酸は原料のままで残存し、経済的
にも不利であつた。すなわち、従来の微生物から
得られている２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼが、
２−ハロ酸のＬ体のみに作用し、Ｄ体には作用し
ないという大きな欠点があつた。 そこで本発明者らは、このような観点から２−
ハロ酸のＤ体に作用する性質を有する２−ハロ酸
ハリドヒドロラーゼ生産能のもつ微生物を求めて
集積培養法により広く自然界を対象にスクリ−ニ
ングを行なつた結果、京都府宇治市五ヶ庄の土壌
よりシュードモナス属に属すると考えられる、Ｄ
体の２−ハロ酸を資化する性質を有する新菌株を
発見し、この新菌株が２−ハロ酸のＤ体に作用す
る性質を有する２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼ生
産能を持つ細菌であることを見い出し、本発明に
到達した。 すなわち、本発明はシュードモナス属に属し、
２−ハロゲノカルボン酸のＤ体に作用する２−ハ
ロゲノカルボン酸ハリドヒドロラーゼ生産能を有
するシュードモナス属UK113株を要旨とするも
のである。 本発明おいて、２−ハロ酸とは一般式Ｒ・
CHX・COOH（Ｘはハロゲン原子を表わす。）又
はＲ・CX2COOHで示す化合物で、そのような具
体例としてはモノクロル酢酸、モノブロモ酢酸、
モノヨード酢酸、ジクロル酢酸、ジブロモ酢酸あ
るいはトリクロル酢酸などの酢酸の誘導体、２−
クロルプロピオン酸、２−ブロモプロピオン酸、
２，２−ジクロルプロピオン酸などのプロピオン
酸の誘導体２−クロル酪酸、２−ブロモ酪酸、
２，２−ジクロル酪酸などの酪酸の誘導体、２−
クロル吉草酸、２−プロモ吉草酸、２，２−ジク
ロル吉草酸などの吉草酸の誘導体があげられる。
また、炭素数が５個以下のカルボン酸の２番目の
炭素原子に、塩素あるいは臭素などのハロゲン原
子が１個又は２個結合している化合物でもよい
し、カルボン酸が酢酸の場合には１〜３個結合し
ている化合物でもよい。 本発明の菌株の菌学的性質を示す。この菌学的
性質の検討には、マニユアル・オブ・マイクロバ
イオロジカル・メソツズ（Manual of
Microbiological Methods，Mc Grow−Hill
Book Company）、微生物の分類と同定（長谷川
武治編著、東京大学出版会）及び培地学各論（坂
崎利一著、納谷書店）に記載されている方法、培
地組成を用いた。 （形態的所見） １ 細胞の形及び大きさ；短桿状。 0.5〜1.0ミクロン×1.5〜3.0ミクロン。 ２ 多形性；なし。 ３ 運動性；あり。 ４ 鞭毛；あり、極鞭毛。 ５ 胞子；なし。 ６ グラム染色性；陰性。 ７ 抗酸性；なし。 （生育状態） １ 肉汁寒天平板培養 形状；円形。 周縁；全縁。 隆起；扁平。 光沢；なし。 表面；滑らか。 色調；クリーム色。 ２ 肉汁寒天斜面培養 生育度；良好。 形状；糸状。 ３ 肉汁液体培養 表面生育；なし。 濁度；混濁。 沈渣；あり。 着色、脱色；なし。 ４ 肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチン30％添加、ゼラチンは液化しない。 ５ 肉汁寒天穿刺培養；表面生育良好。 ６ リトマスミルク 微アルカリ性、ミルクは固化しない。 （生理学的性質） １ 硝酸塩の還元；なし。 ２ 脱窒反応；なし。 ３ MRテスト；陰性。 ４ VPテスト；陰性。 ５ インドールの生成；なし。 ６ 硫化水素の生成；なし。 ７ デンプンの加水分解；なし。 ８ クエン酸の利用；あり。 ９ 硝酸塩の利用；あり。 10 アンモニウム塩の利用；あり。 11 色素の生成；なし。 12 ウレアーゼ活性；なし。 13 オキシダーゼ反応；陽性。 14 カタラーゼ活性；あり。 15 OFテスト；オキシデイテイプ。 16 アルギニンの加水分解性；あり。 17 ビタミン要求性；なし。 18 酸素に対する態度；好気性。 19 ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積；なし。 20 芳香族環の開裂；オルト位にて開裂する。 21 生育PH；PH５〜８ 22 生育温度；20〜35℃ 〔糖から酸及びガスの生成〕 糖 類 酸 ガス (1) Ｌ−アラビノース ＋ − (2) Ｄ−キシロース ＋ − (3) Ｄ−グルコース ＋ − (4) Ｄ−マンノース ＋ − (5) フランクトース ＋ − (6) Ｄ−ガラクトース ＋ − (7) 麦芽糖 − − (8) シヨ糖 − − (9) 乳糖 ＋ − (10) トレンハロース ＋ − (11) Ｄ−ソルビツト ＋ − (12) Ｄ−マンニツト ＋ − (13) イノシツト ＋ − (14) グリセリン ＋ − (15) デンプン − − 〔炭素化合物の資化性〕 (1) 資化するもの；Ｄ−２−クロルプロピオン
酸。グルコース、２−ケトグルコン酸、イノシ
ツト、トレハロース、乳糖、ベンジルアミン、
β−アラニン、Ｌ−バリン、DL−アルギニン、
ベタイン、クロル酢酸、２−クロルプロピオン
酸、パラヒドロキシ安息香酸。 (2) 資化しないもの；シヨ糖、ゲラニオール、メ
タノール、メチルアミン、シユウ酸。 以上の菌学的諸性質からバージエイのマニユア
ル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジ
−（Bevgey′s Manual of Determinative
Bacteviology）第７版及び第８版に基づき検索
した結果、この菌株はグラム陰性桿菌、極鞭
毛を有し、運動性がある、好気性、オキシダ
ーゼ陽性、グルコースを酸化的に分解すること
から、シュードモナス属に含まれる細菌であると
考えられる。そこで、シュードモナス属に含まれ
る種について検索を行なつたところ、栄養要求性
がなく、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸を蓄積せず、
蛍光性色素を生産せず、さらに脱窒反応が陰性で
あることから、シュードモナス・アルカリゲネス
に属すると考えられるが、41℃で生育しない、ゼ
ラチンを加水分解しない、グルコース、トレハロ
ース、２−ケトグルコン酸、イノシツト、Ｌ−バ
リンを資化するなどの諸性質が異なつている。さ
らに、シュードモナス．プチダ（Pseudomonas
putida）に属するとも考えられるが、蛍光性色素
を生産しない、トレハロース、イノシツトを資化
するなどの諸性質が異なつており、本菌株と菌学
的諸性質が一致する公知の菌株は見出せなかつ
た。特にＤ体の２−ハロ酸を資化する性質を有す
る菌株の報告はなかつた。以上のことから、本菌
株はシュードモナス属に属する新菌株であると考
えられるので、シュードモナスUK113株と命名
し、昭和55年７月30日に通産省工業技術院技術研
究所に寄託した。その微生物受託番号は微工研菌
寄第5666号である。 本発明のシュードモナスUK113株を培養する
に際して用いられる培地の栄養源としては、本菌
株が資化可能な栄養源であればいかなるものでも
使用できる。炭素源としては、たとえばグリコー
ス、、グリセリン、アルコール類、油脂、脂肪酸、
さらに２−ハロ酸などが使用でき、窒素源として
は、たとえば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、アンモニア、各種アミ
ノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどの無
機又は有機物が使用できる。さらに無機塩類とし
て、たとえばカリウム、ナトリウム、リン酸、亜
鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カルシウ
ム、コバルト、モリブデンなどの各塩類、必要に
応じて微量金属塩、コーンステイ−プリカ−、ビ
タミン類、核酸などを使用してもよく、細菌の一
般的栄養培地が使用できる。 これらの培地を用いて、本菌株を、好ましくは
10〜36℃、さらに好ましくは20〜33℃、最適には
26〜30℃で約５〜48時間、好気的に培養すればよ
い。 このようにして得られた培養物は、そのまま酵
素源として使用できるが、粗製酵素、精製酵素は
もちろん分離生菌体、分離菌体の処理物も酵素源
として使用可能である。次に得られた培養物から
本発明における２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼが
採取されるが、培養物、分離生菌体、分離菌体の
処理物、粗製酵素、精製酵素などのあらゆる段階
で採取できる。その際の精製法としては、通常の
酵素精製法を用いることができる。すなわち、遠
心分離などにより菌体を得た後、菌体をマントン
ゴーリン、ダイノミル、フレンチプレス、超音波
処理などにより細胞破砕後、遠心分離により細胞
片を除去し、細胞抽出液を得、これに硫酸ストレ
プトマイシン又は硫酸プロタミン処理を行ない、
さらには硫酸アンモニウムなどによる塩析処理又
はアセトンなどによる有機溶媒処理などを行な
い、精製するためには、DEAEセルロースカラム
などのイオン交換クロマトグラフイー、ヒドロキ
シアパタイトカラムなどの吸着クロマトグラフイ
ー、セフアデツクスクロマトグラフイーなどによ
るゲルクロマトグラフイーを組合わせて行なうこ
とができる。このようにして、本発明における２
−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを単離、精製するこ
とができる。 次にこのようにして得られた２−ハロ酸ハリド
ヒドロラーゼの理化学的性質を示す。 １ 作用 Ｌ−Ｒ・CHX・COOH＋H2O →Ｄ−Ｒ・CHOH・COOH＋H+＋X- Ｄ−Ｒ・CHX・COOH＋H2O →Ｌ−Ｒ・CHOH・COOH＋H+＋X- Ｒ・CX2・COOH＋H2O →Ｒ・CO・COOH＋2H+＋2X- 上記反応を触媒する。なお、上記一般式中の
ＲはＨ、H2、HX、X2、CH3、C2H5、C3H7な
どの原子団を表わし、Ｘは塩素、臭素などのハ
ロゲン原子を表わす。水の存在下にＬ−２−ハ
ロ酸に作用してハロゲン原子を加水分解し、Ｄ
−２−ヒドロキシ酸を生成する。２−ハロ酸が
Ｄ体の場合にはＬ体の２−ヒドロキシ酸を生成
する。また、基質が２−ジハロ酸の場合には２
−ケト酸を生成する。 ２ 基質特異性 Ｄ、Ｌ及びDL−２−クロルプロピオン酸に
対するミカエリス定数（Km値）は、それぞれ
4.8、1.1、3.2ｍＭである。この他に炭素数が２
〜５個までの２−ハロ酸が基質となり、DL−
２−クロルプロピオン酸を100とした場合の他
の基質の反応速度は次表のとおりである。
ものである。 ２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、２−ハロ酸
を原料として、光学活性な２−ヒドロキシカルボ
ン酸をを製造する際に用いられる酵素である。こ
の光学活性２−ヒドロキシカルボン酸を製造する
従来の方法としては、光学活性アミン類などの光
学分割剤を用いて、Ｄ体及びＬ体の２−ヒドロキ
シカルボン酸を得る方法が知られている。しかし
ながら、この公知の方法は、用いられる光学分割
剤が高価であり、さらにその操作がきめて煩雑で
あるため、工業的に有利な方法ではなかつた。そ
のため、２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼが用いら
れており、この酵素を用いると、２−ハロ酸から
光学的に純粋な２−ヒドロキシカルボン酸を容易
にかつ高収率で得られ、光学活性な２−ヒドロキ
シカルボン酸を、工業的に生産する方法として非
常に有利である。しかしながら、従来知られてい
る２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌（J.
Biol.Chem.）第234巻、428頁（1968年）及びヨ
ーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオケミスト
リー誌（Eur.J.Biochem.）第21巻、99頁（1971
年）などに記載されているように、いずれも２−
ハロ酸のＬ体のみに作用し、Ｄ体の２−ヒドロキ
シカルボン酸を生成し、Ｄ体の２−ハロ酸には作
用しないものであつた。それゆえ、生化学的観点
からＤ体と比較し、より重要なＬ体の２−ヒドロ
キシカルボン酸の製造は、従来の２−ハロ酸ハリ
ドヒドロラーゼを用いては不可能であつた。それ
に加え、原料である２−ハロ酸は、Ｄ体とＬ体と
の混合物であるラセミ体として存在するため、従
来の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いると、
Ｄ体の２−ハロ酸は原料のままで残存し、経済的
にも不利であつた。すなわち、従来の微生物から
得られている２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼが、
２−ハロ酸のＬ体のみに作用し、Ｄ体には作用し
ないという大きな欠点があつた。 そこで本発明者らは、このような観点から２−
ハロ酸のＤ体に作用する性質を有する２−ハロ酸
ハリドヒドロラーゼ生産能のもつ微生物を求めて
集積培養法により広く自然界を対象にスクリ−ニ
ングを行なつた結果、京都府宇治市五ヶ庄の土壌
よりシュードモナス属に属すると考えられる、Ｄ
体の２−ハロ酸を資化する性質を有する新菌株を
発見し、この新菌株が２−ハロ酸のＤ体に作用す
る性質を有する２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼ生
産能を持つ細菌であることを見い出し、本発明に
到達した。 すなわち、本発明はシュードモナス属に属し、
２−ハロゲノカルボン酸のＤ体に作用する２−ハ
ロゲノカルボン酸ハリドヒドロラーゼ生産能を有
するシュードモナス属UK113株を要旨とするも
のである。 本発明おいて、２−ハロ酸とは一般式Ｒ・
CHX・COOH（Ｘはハロゲン原子を表わす。）又
はＲ・CX2COOHで示す化合物で、そのような具
体例としてはモノクロル酢酸、モノブロモ酢酸、
モノヨード酢酸、ジクロル酢酸、ジブロモ酢酸あ
るいはトリクロル酢酸などの酢酸の誘導体、２−
クロルプロピオン酸、２−ブロモプロピオン酸、
２，２−ジクロルプロピオン酸などのプロピオン
酸の誘導体２−クロル酪酸、２−ブロモ酪酸、
２，２−ジクロル酪酸などの酪酸の誘導体、２−
クロル吉草酸、２−プロモ吉草酸、２，２−ジク
ロル吉草酸などの吉草酸の誘導体があげられる。
また、炭素数が５個以下のカルボン酸の２番目の
炭素原子に、塩素あるいは臭素などのハロゲン原
子が１個又は２個結合している化合物でもよい
し、カルボン酸が酢酸の場合には１〜３個結合し
ている化合物でもよい。 本発明の菌株の菌学的性質を示す。この菌学的
性質の検討には、マニユアル・オブ・マイクロバ
イオロジカル・メソツズ（Manual of
Microbiological Methods，Mc Grow−Hill
Book Company）、微生物の分類と同定（長谷川
武治編著、東京大学出版会）及び培地学各論（坂
崎利一著、納谷書店）に記載されている方法、培
地組成を用いた。 （形態的所見） １ 細胞の形及び大きさ；短桿状。 0.5〜1.0ミクロン×1.5〜3.0ミクロン。 ２ 多形性；なし。 ３ 運動性；あり。 ４ 鞭毛；あり、極鞭毛。 ５ 胞子；なし。 ６ グラム染色性；陰性。 ７ 抗酸性；なし。 （生育状態） １ 肉汁寒天平板培養 形状；円形。 周縁；全縁。 隆起；扁平。 光沢；なし。 表面；滑らか。 色調；クリーム色。 ２ 肉汁寒天斜面培養 生育度；良好。 形状；糸状。 ３ 肉汁液体培養 表面生育；なし。 濁度；混濁。 沈渣；あり。 着色、脱色；なし。 ４ 肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチン30％添加、ゼラチンは液化しない。 ５ 肉汁寒天穿刺培養；表面生育良好。 ６ リトマスミルク 微アルカリ性、ミルクは固化しない。 （生理学的性質） １ 硝酸塩の還元；なし。 ２ 脱窒反応；なし。 ３ MRテスト；陰性。 ４ VPテスト；陰性。 ５ インドールの生成；なし。 ６ 硫化水素の生成；なし。 ７ デンプンの加水分解；なし。 ８ クエン酸の利用；あり。 ９ 硝酸塩の利用；あり。 10 アンモニウム塩の利用；あり。 11 色素の生成；なし。 12 ウレアーゼ活性；なし。 13 オキシダーゼ反応；陽性。 14 カタラーゼ活性；あり。 15 OFテスト；オキシデイテイプ。 16 アルギニンの加水分解性；あり。 17 ビタミン要求性；なし。 18 酸素に対する態度；好気性。 19 ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積；なし。 20 芳香族環の開裂；オルト位にて開裂する。 21 生育PH；PH５〜８ 22 生育温度；20〜35℃ 〔糖から酸及びガスの生成〕 糖 類 酸 ガス (1) Ｌ−アラビノース ＋ − (2) Ｄ−キシロース ＋ − (3) Ｄ−グルコース ＋ − (4) Ｄ−マンノース ＋ − (5) フランクトース ＋ − (6) Ｄ−ガラクトース ＋ − (7) 麦芽糖 − − (8) シヨ糖 − − (9) 乳糖 ＋ − (10) トレンハロース ＋ − (11) Ｄ−ソルビツト ＋ − (12) Ｄ−マンニツト ＋ − (13) イノシツト ＋ − (14) グリセリン ＋ − (15) デンプン − − 〔炭素化合物の資化性〕 (1) 資化するもの；Ｄ−２−クロルプロピオン
酸。グルコース、２−ケトグルコン酸、イノシ
ツト、トレハロース、乳糖、ベンジルアミン、
β−アラニン、Ｌ−バリン、DL−アルギニン、
ベタイン、クロル酢酸、２−クロルプロピオン
酸、パラヒドロキシ安息香酸。 (2) 資化しないもの；シヨ糖、ゲラニオール、メ
タノール、メチルアミン、シユウ酸。 以上の菌学的諸性質からバージエイのマニユア
ル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジ
−（Bevgey′s Manual of Determinative
Bacteviology）第７版及び第８版に基づき検索
した結果、この菌株はグラム陰性桿菌、極鞭
毛を有し、運動性がある、好気性、オキシダ
ーゼ陽性、グルコースを酸化的に分解すること
から、シュードモナス属に含まれる細菌であると
考えられる。そこで、シュードモナス属に含まれ
る種について検索を行なつたところ、栄養要求性
がなく、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸を蓄積せず、
蛍光性色素を生産せず、さらに脱窒反応が陰性で
あることから、シュードモナス・アルカリゲネス
に属すると考えられるが、41℃で生育しない、ゼ
ラチンを加水分解しない、グルコース、トレハロ
ース、２−ケトグルコン酸、イノシツト、Ｌ−バ
リンを資化するなどの諸性質が異なつている。さ
らに、シュードモナス．プチダ（Pseudomonas
putida）に属するとも考えられるが、蛍光性色素
を生産しない、トレハロース、イノシツトを資化
するなどの諸性質が異なつており、本菌株と菌学
的諸性質が一致する公知の菌株は見出せなかつ
た。特にＤ体の２−ハロ酸を資化する性質を有す
る菌株の報告はなかつた。以上のことから、本菌
株はシュードモナス属に属する新菌株であると考
えられるので、シュードモナスUK113株と命名
し、昭和55年７月30日に通産省工業技術院技術研
究所に寄託した。その微生物受託番号は微工研菌
寄第5666号である。 本発明のシュードモナスUK113株を培養する
に際して用いられる培地の栄養源としては、本菌
株が資化可能な栄養源であればいかなるものでも
使用できる。炭素源としては、たとえばグリコー
ス、、グリセリン、アルコール類、油脂、脂肪酸、
さらに２−ハロ酸などが使用でき、窒素源として
は、たとえば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、アンモニア、各種アミ
ノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどの無
機又は有機物が使用できる。さらに無機塩類とし
て、たとえばカリウム、ナトリウム、リン酸、亜
鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カルシウ
ム、コバルト、モリブデンなどの各塩類、必要に
応じて微量金属塩、コーンステイ−プリカ−、ビ
タミン類、核酸などを使用してもよく、細菌の一
般的栄養培地が使用できる。 これらの培地を用いて、本菌株を、好ましくは
10〜36℃、さらに好ましくは20〜33℃、最適には
26〜30℃で約５〜48時間、好気的に培養すればよ
い。 このようにして得られた培養物は、そのまま酵
素源として使用できるが、粗製酵素、精製酵素は
もちろん分離生菌体、分離菌体の処理物も酵素源
として使用可能である。次に得られた培養物から
本発明における２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼが
採取されるが、培養物、分離生菌体、分離菌体の
処理物、粗製酵素、精製酵素などのあらゆる段階
で採取できる。その際の精製法としては、通常の
酵素精製法を用いることができる。すなわち、遠
心分離などにより菌体を得た後、菌体をマントン
ゴーリン、ダイノミル、フレンチプレス、超音波
処理などにより細胞破砕後、遠心分離により細胞
片を除去し、細胞抽出液を得、これに硫酸ストレ
プトマイシン又は硫酸プロタミン処理を行ない、
さらには硫酸アンモニウムなどによる塩析処理又
はアセトンなどによる有機溶媒処理などを行な
い、精製するためには、DEAEセルロースカラム
などのイオン交換クロマトグラフイー、ヒドロキ
シアパタイトカラムなどの吸着クロマトグラフイ
ー、セフアデツクスクロマトグラフイーなどによ
るゲルクロマトグラフイーを組合わせて行なうこ
とができる。このようにして、本発明における２
−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを単離、精製するこ
とができる。 次にこのようにして得られた２−ハロ酸ハリド
ヒドロラーゼの理化学的性質を示す。 １ 作用 Ｌ−Ｒ・CHX・COOH＋H2O →Ｄ−Ｒ・CHOH・COOH＋H+＋X- Ｄ−Ｒ・CHX・COOH＋H2O →Ｌ−Ｒ・CHOH・COOH＋H+＋X- Ｒ・CX2・COOH＋H2O →Ｒ・CO・COOH＋2H+＋2X- 上記反応を触媒する。なお、上記一般式中の
ＲはＨ、H2、HX、X2、CH3、C2H5、C3H7な
どの原子団を表わし、Ｘは塩素、臭素などのハ
ロゲン原子を表わす。水の存在下にＬ−２−ハ
ロ酸に作用してハロゲン原子を加水分解し、Ｄ
−２−ヒドロキシ酸を生成する。２−ハロ酸が
Ｄ体の場合にはＬ体の２−ヒドロキシ酸を生成
する。また、基質が２−ジハロ酸の場合には２
−ケト酸を生成する。 ２ 基質特異性 Ｄ、Ｌ及びDL−２−クロルプロピオン酸に
対するミカエリス定数（Km値）は、それぞれ
4.8、1.1、3.2ｍＭである。この他に炭素数が２
〜５個までの２−ハロ酸が基質となり、DL−
２−クロルプロピオン酸を100とした場合の他
の基質の反応速度は次表のとおりである。
【表】
【表】
３ 至適PH
PH約9.5（DL−２−クロルプロピオン酸を基
質とし、30℃にて測定した。） ４ 安定PH範囲 PH約６〜12（４℃、24時間経過後、もとの活
性の90％以上が存在。） ５ 作用適温及び耐熱性 PH9.5で20℃より45℃まで温度の上昇ととも
に活性は増大するが、45℃で15分間処理すると
活性は50％以下に低下する。 ６ カ価の測定法 50マイクロモルのDL−２−クロルプロピオ
ン酸を含む0.1Mトリス硫酸緩衝液（PH9.5）２
mlに酵素液１〜100μを加え、30℃にて10分
間反応後、3.6規定硫酸0.1mlを添加し反応を停
止した。この反応混合液中の塩素イオンをチオ
シアン酸法により定量した。すなわち、反応混
合液あるいはその希釈溶液１mlに対し、チオシ
アン酸水銀0.1％を含む10％エタタノール含有
ジオキサン溶液１ml、さらに８％の鉄明バンを
含む６規定硝酸溶液0.4mlを加え、460mmの吸光
度を測定し、検量線から塩素イオン濃度を求め
た。30℃で１分間に１マイクロモルの塩素イオ
ンを生成する酵素量を１単位とした。 ７ 分子量 セフアデイツクスＧ−150ゲルクロマトグラ
フイーにより、約５万の分子量であつた。 ８ 阻害、活性化及び安定化剤。 種々の金属イオン又は添加物を加え、酵素活
性を測定したところ、下表に示すごとく塩化第
二水銀、亜鉛、マンガン及びニツケルなどによ
り阻害された。また、今のところ本酵素に特異
的な活性化剤あるいは安定化剤は見出されてい
ない。
質とし、30℃にて測定した。） ４ 安定PH範囲 PH約６〜12（４℃、24時間経過後、もとの活
性の90％以上が存在。） ５ 作用適温及び耐熱性 PH9.5で20℃より45℃まで温度の上昇ととも
に活性は増大するが、45℃で15分間処理すると
活性は50％以下に低下する。 ６ カ価の測定法 50マイクロモルのDL−２−クロルプロピオ
ン酸を含む0.1Mトリス硫酸緩衝液（PH9.5）２
mlに酵素液１〜100μを加え、30℃にて10分
間反応後、3.6規定硫酸0.1mlを添加し反応を停
止した。この反応混合液中の塩素イオンをチオ
シアン酸法により定量した。すなわち、反応混
合液あるいはその希釈溶液１mlに対し、チオシ
アン酸水銀0.1％を含む10％エタタノール含有
ジオキサン溶液１ml、さらに８％の鉄明バンを
含む６規定硝酸溶液0.4mlを加え、460mmの吸光
度を測定し、検量線から塩素イオン濃度を求め
た。30℃で１分間に１マイクロモルの塩素イオ
ンを生成する酵素量を１単位とした。 ７ 分子量 セフアデイツクスＧ−150ゲルクロマトグラ
フイーにより、約５万の分子量であつた。 ８ 阻害、活性化及び安定化剤。 種々の金属イオン又は添加物を加え、酵素活
性を測定したところ、下表に示すごとく塩化第
二水銀、亜鉛、マンガン及びニツケルなどによ
り阻害された。また、今のところ本酵素に特異
的な活性化剤あるいは安定化剤は見出されてい
ない。
【表】
本発明のシュードモナスUK113株が生産する
２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いると、たと
えば２−クロルプロピオン酸から、高収率で乳酸
を生産する事ができ、さらに従来知られている同
様な酸素では、生産不可能であつたＬ−乳酸の生
産が可能となる。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 実施例 １ 硫酸アンモニウム５ｇ／、リン酸−カリウム
１ｇ／、リン酸ニナトリウム１ｇ／、硫酸マ
グネシウム0.05ｇ／、硫酸第一鉄0.005ｇ／、
水酸化カルシウム0.005ｇ／、硫酸マンガン
0.0015ｇ／モリブデン酸ナトリウム0.0015ｇ／
、PH7.0に調整した培地248を120℃、30分間
加熱殺菌した後、DL−２−クロルプロピオン酸
750ｇを水酸化ナトリウムにてPH７に調整後、除
菌慮過したもの２を加え、シュードモナス
UK113株（微工研菌寄第5666号）を接種し、30
℃で18時間通気撹拌培養した。次いで培養後、シ
ヤープレスを用いて遠心分離により菌体を採取し
て600ｇの菌体を得た。得られた菌体を凍結状態
で保存した。 次に凍結菌体600を1.2の0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）に懸濁し、ダイノミルを用いて細胞を破
壊後、遠心分離により細胞片を除去し、２−ハロ
酸ハリドヒドロラーゼを含む粗抽出液を得た。こ
の粗抽出液１当り２％の硫酸プロタミン水溶液
200mlを添加し、十分撹拌した後、生じた沈殿を
遠心分離により除去し、プロミタン上清を得た。
この上清に固形硫酸アンモニウムを徐々に加えて
40％飽和（４℃）とした。生成した沈殿を遠心分
離により除去し、上清にさらに固形硫酸アンモニ
ウムを徐々に加えて70％飽和（４℃）とした。生
成した沈殿を遠心分離により集め、再び50ｍＭリ
ン酸緩衝液（PH7.5）にとかし、ついで30倍量の
50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）に対して透析脱塩
して粗酵素液を得た。この粗酵素液をあらかじめ
50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）で平衡化した
DEAEセルロースカラムに上記粗酵素を通じ、リ
ン酸緩衝液の濃度を徐々に増して溶出せしめる
と、リン酸濃度100ｍＭの近くで目的の２−ハロ
酸ハリドヒドロラーゼが溶出した。この区分を集
め、濃縮、脱塩後、さらに５ｍＭリン酸緩衝液
（PH7.5）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラ
ムにその溶出液を通し、５ｍＭリン酸緩衝液から
100ｍＭリン酸緩衝液の直線勾配の溶出を行なつ
たところ、25ｍＭ濃度近くに目的の２−ハロ酸ハ
リドヒドロラーゼが溶出した。この溶出区分を濃
縮後、50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）を溶出液に
用いたセフアデツクスＧ−150カラムクロマトグ
ラフイーを行なうことにより、精製された２−ハ
ロ酸ハリドヒドロラーゼを得ることがきた。この
ようにして得た２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼ
は、PH9.4の7.5％アクリルアミドデイスク電気泳
動で陽極側に移動し、単一なバンドを与え、セフ
アデツクスＧ−150ゲルクロマトグラフイーより、
分子量は約５万であつた。 その収量は約100mgで、酵素１mg当り約35単位
のカ価を示し、その精製度は粗抽出液を１とする
と約60であつた。
２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いると、たと
えば２−クロルプロピオン酸から、高収率で乳酸
を生産する事ができ、さらに従来知られている同
様な酸素では、生産不可能であつたＬ−乳酸の生
産が可能となる。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 実施例 １ 硫酸アンモニウム５ｇ／、リン酸−カリウム
１ｇ／、リン酸ニナトリウム１ｇ／、硫酸マ
グネシウム0.05ｇ／、硫酸第一鉄0.005ｇ／、
水酸化カルシウム0.005ｇ／、硫酸マンガン
0.0015ｇ／モリブデン酸ナトリウム0.0015ｇ／
、PH7.0に調整した培地248を120℃、30分間
加熱殺菌した後、DL−２−クロルプロピオン酸
750ｇを水酸化ナトリウムにてPH７に調整後、除
菌慮過したもの２を加え、シュードモナス
UK113株（微工研菌寄第5666号）を接種し、30
℃で18時間通気撹拌培養した。次いで培養後、シ
ヤープレスを用いて遠心分離により菌体を採取し
て600ｇの菌体を得た。得られた菌体を凍結状態
で保存した。 次に凍結菌体600を1.2の0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）に懸濁し、ダイノミルを用いて細胞を破
壊後、遠心分離により細胞片を除去し、２−ハロ
酸ハリドヒドロラーゼを含む粗抽出液を得た。こ
の粗抽出液１当り２％の硫酸プロタミン水溶液
200mlを添加し、十分撹拌した後、生じた沈殿を
遠心分離により除去し、プロミタン上清を得た。
この上清に固形硫酸アンモニウムを徐々に加えて
40％飽和（４℃）とした。生成した沈殿を遠心分
離により除去し、上清にさらに固形硫酸アンモニ
ウムを徐々に加えて70％飽和（４℃）とした。生
成した沈殿を遠心分離により集め、再び50ｍＭリ
ン酸緩衝液（PH7.5）にとかし、ついで30倍量の
50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）に対して透析脱塩
して粗酵素液を得た。この粗酵素液をあらかじめ
50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）で平衡化した
DEAEセルロースカラムに上記粗酵素を通じ、リ
ン酸緩衝液の濃度を徐々に増して溶出せしめる
と、リン酸濃度100ｍＭの近くで目的の２−ハロ
酸ハリドヒドロラーゼが溶出した。この区分を集
め、濃縮、脱塩後、さらに５ｍＭリン酸緩衝液
（PH7.5）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラ
ムにその溶出液を通し、５ｍＭリン酸緩衝液から
100ｍＭリン酸緩衝液の直線勾配の溶出を行なつ
たところ、25ｍＭ濃度近くに目的の２−ハロ酸ハ
リドヒドロラーゼが溶出した。この溶出区分を濃
縮後、50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）を溶出液に
用いたセフアデツクスＧ−150カラムクロマトグ
ラフイーを行なうことにより、精製された２−ハ
ロ酸ハリドヒドロラーゼを得ることがきた。この
ようにして得た２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼ
は、PH9.4の7.5％アクリルアミドデイスク電気泳
動で陽極側に移動し、単一なバンドを与え、セフ
アデツクスＧ−150ゲルクロマトグラフイーより、
分子量は約５万であつた。 その収量は約100mgで、酵素１mg当り約35単位
のカ価を示し、その精製度は粗抽出液を１とする
と約60であつた。
Claims (1)
- １ シュードモナス属に属し、２−ハロゲノカル
ボン酸のＤ体に作用する２−ハロゲノカルボン酸
ハリドヒドロラーゼ生産能を有するシュードモナ
スUK113（微工研菌寄第5666号）株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56013426A JPS57125690A (en) | 1981-01-30 | 1981-01-30 | Pseudomonas uk113 strain |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56013426A JPS57125690A (en) | 1981-01-30 | 1981-01-30 | Pseudomonas uk113 strain |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57125690A JPS57125690A (en) | 1982-08-05 |
| JPH0137112B2 true JPH0137112B2 (ja) | 1989-08-04 |
Family
ID=11832805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56013426A Granted JPS57125690A (en) | 1981-01-30 | 1981-01-30 | Pseudomonas uk113 strain |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57125690A (ja) |
-
1981
- 1981-01-30 JP JP56013426A patent/JPS57125690A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57125690A (en) | 1982-08-05 |
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