JPH0214040B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

本発明は、アスパルチルフエニルアラニンアル
キルエステルの製造方法に関するものである。 α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン
低級アルキルエステル（以下、α−APEと云
う）、特にメチルエステルは新しい甘味剤として
注目されている有用な物質である。 α−APEの製造法としては、Ｎ−保護Ｌ−ア
スパラギン酸無水物とＬ−フエニルアラニン低級
アルキルエステルを反応させてＮ−保護α−
APEとし、保護基を除去してα−APEとする方
法、Ｎ−保護Ｌ−アスパラギン酸とフエニルアラ
ニン低級アルキルエステルとを蛋白分解酵素の存
在下で反応させてＮ−保護α−APE、又はＮ−
保護α−APEとフエニルアラニン低級アルキル
エステルとの付加化合物とし、保護基を除去して
α−APEとする方法などが知られている。 前者の方法は、Ｎ−保護α−APEとともに、
Ｎ−保護β−α−APEが副生するという問題が
ある。後者の方法は、そのような問題がない点、
及び原料としてラセミ体を使用できる点などで優
れた方法である。しかし、いずれの方法でも、原
料のアスパラギン酸又はその無水物は、アミノ基
をベンジルオキシカルボニル基のような保護基で
保護したのち用いる必要があつた。 これらの公知技術では当然必要とされるアミノ
基への保護基導入及び除去の工程の不必要な方法
を開発することができれば工程の簡略化とそれに
伴なう原料、製品等の損失を避けることができ、
工業的に非常な利点が生ずる。 本発明者らは、このような観点からアスパラギ
ン酸とフエニルアラニン低級アルキルエステルか
ら直接α−APEを合成する方法について鋭意検
討した結果、シユードモナス属、アルカリゲネス
属、トルロプシス属、ロドトルラ属又はスポロボ
ロマイセス属に属する微生物の菌体又はその処理
物を用いることによつて、Ｌ−アスパラギン酸と
Ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエステルから
α−APEが生成することを見出した。 すなわち、本発明は、シユードモナス属、アル
カリゲネス属、トルロプシス属、ロドトルラ属又
はスポロボロマイセス属に属し、Ｌ−アスパラギ
ン酸とＬ−フエニルアラニン低級アルキルエステ
ルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラ
ニン低級アルキルエステルを生成させることので
きる微生物を培養し、培養物から菌体を分離し、
分離された菌体又はその処理物をＬ−アスパラギ
ン酸及びＬ−フエニルアラニン低級アルキルエス
テルと接触させることを特徴とするα−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエ
ステルの製造法を提供するものである。 本発明で用いる微生物は、上述の各属に属する
α−APE生産菌である。本発明者らによつて山
口県新南陽市の土壤又は花より分離されたこのよ
うな微生物の菌学的性質は下記の通りである。 シユードモナス プチダ（Pseudomonas
putida）TS−15001 分離源：土壤 (a) 形態 肉汁寒天培地で37℃、６〜24時間生育した場
合 細胞の形及び大きさ 桿菌（0.5〜0.7）×（1.0〜1.5）μ 細胞の多形性の有無 単菌又は双菌 運動性の有無 有 極鞭毛 胞子の有無 無 グラム染色性 陰性 抗酸性 無 (b) 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養（37℃、２日間培養） (イ) コロニー形成の遅速 普通 直径約６mm (ロ) コロニーの形 円形 (ハ) コロニー表面の形状 平滑 (ニ) コロニーの隆起状態 半レンズ状 (ホ) コロニーの周縁 全縁 (ヘ) コロニーの内容 均質 (ト) コロニーの色調 乳白色 (チ) コロニーの透明度 半透明 (リ) コロニーの光沢 鈍光 (ヌ) 可溶性色素の生成 可溶性淡緑色色素生
成 肉汁寒天斜面培養（37℃、２日間培養） (イ) 生育の良否 生育良好 (ロ) コロニーの形 平滑 (ハ) コロニー断面の隆起状態 扁平状 (ニ) コロニーの光沢 鈍光 (ホ) コロニー表面の形状 平滑 (ヘ) コロニーの透明度 半透明 (ト) コロニーの色 乳白色 (チ) コロニーの質 バター質 肉汁液体培養（37℃、２日間培養） (イ) 表面の生育 なし (ロ) 濁度 やや濁る (ハ) 沈殿 粉末状 (ニ) ガス発生 なし (ホ) 培地の着色 なし 肉汁寒天穿刺培養（37℃、２日間培養） (イ) 生育の場所 上下一様 (ロ) コロニーの形状 乳頭状 肉汁ゼラチン穿刺培養（20℃、14日間培
養） (イ) ゼラチン液化 なし リトマスミルク（37℃、７日間培養） (イ) 反応 BCPを青色に、リトマスを青紫
色にする (ロ) 凝固、液化 なし (c) 生理学的性質 硝酸塩の還元 − 脱窒反応 − MRテスト − VPテスト − インドールの生成 − 硫化水素の生成 ＋（Ｗ） デンプンの加水分解 − クエン酸の利用 ＋ 無機窒素源の利用 アンモニア態のみ利用 色素の生成 緑黄色水溶性螢光色素生成 ウレアーゼ − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ 生育の範囲 PH５〜9.5、温度10〜43℃ 酸素に対する態度 好気性 Ｏ−Ｆテスト ０ 糖類からの酸及びガスの生成の有無

【表】 アルギニン ジヒドロラーゼ（（Arginine
Dihydrolase） ＋ 炭素源の利用（37℃、１〜７日間培養） 利用するもの；Ｄ−グルコース、Ｌ−バリン、 β−Ｌ−アラニン、 Ｌ−アルギニン 利用しないもの；トレハロース、 メソイノシトール ゲラニオール アルカリゲネス フエーカリス（Alcaligenes
faecalis）TS−15002 分離源；土壤 (a) 形態 肉汁寒天培地で37℃、６〜24時間生育した場
合 細胞の形及び大きさ 桿菌（0.5〜0.8）×（1.0〜1.5）μ 細胞の多形性の有無 単菌又は双菌 運動性の有無 有 周鞭毛 胞子の有無 無 グラム染色性 陰性 抗酸性 無 (b) 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養（37℃、４日間培養） (イ) コロニー形成の遅速 遅い 直径約２mm (ロ) コロニーの形 円形 (ハ) コロニー表面の形状 平滑 (ニ) コロニーの隆起状態 半レンズ状 (ホ) コロニーの周縁 全縁 (ヘ) コロニーの内容 均質 (ト) コロニーの色調 乳白色 (チ) コロニーの透明度 半透明 (リ) コロニーの光沢 鈍光 (ヌ) 可溶性色素の生成 なし 肉汁寒天斜面培養（37℃、２日間培養） (イ) 生育の良否 生育良好 (ロ) コロニーの形 平滑 (ハ) コロニー断面の隆起状態 扁平状 (ニ) コロニーの光沢 鈍光 (ホ) コロニー表面の形状 平滑 (ヘ) コロニーの透明度 半透明 (ト) コロニーの色 乳白色 (チ) コロニーの質 バター質 肉汁液体培養（37℃、２日間培養） (イ) 表面の生育 なし (ロ) 濁度 やや濁る (ハ) 沈殿 粉末状 (ニ) ガス発生 なし (ホ) 培地の着色 なし 肉汁寒天穿刺培養（37℃、２日間培養） (イ) 生育の場所 上下一様 (ロ) コロニーの形状 乳頭状 肉汁ゼラチン穿刺培養（37℃及び20℃、14
日間培養） (イ) ゼラチン液化 なし リトマスミルク（37℃、７日間培養） (イ) 反応 BCPを青色に、リトマスを桃色
から青紫色にする (ロ) 凝固、液化 なし (c) 生理学的性質 硝酸塩の還元 − 脱窒反応 − MRテスト − VPテスト − インドールの生成 − 硫化水素の生成 − デンプンの加水分解 − クエン酸の利用 ＋ 無機窒素源の利用 アンモニア態のみ利用 色素の生成 − ウレアーゼ − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋（Ｗ） 生育の範囲 PH５〜8.8、温度11〜41℃ 酸素に対する態度 好気性 Ｏ−Ｆテスト 酸化 糖類からの酸及びガスの生成の有無

【表】 トルロプシス カンジダ（Torulopsis candida）
TS−15101 分離源；花 (a) 形態 １ MY寒天培地、25℃、平板培養 栄養細胞の形状 楕円形 栄養細胞の大きさ （３〜５）×（４〜
８）μ 増殖の形式 多極出芽 菌糸及び仮性菌糸なし ２ MY液体培地、25℃、７日間 ガスの発生 あり 表面の生育 リング状 培地の混濁 やや濁る 沈殿の生成 粉末状 培地の着色 なし ３ MY寒天培地、25℃、30日間；斜面培養 生育の程度 生育良好 コロニーの周縁 波状 コロニーの隆起状態 半レンズ状 コロニーの表面の形状 平滑 コロニーの光沢 鈍光 コロニーの性状 バター状 コロニーの色調 白色 ４ バレイシヨ培地、スライド培養 菌糸及び仮性菌糸は認められない。 (b) 子嚢蓼胞子の形成 なし (c) 射出胞子の形成 なし (d) 生理的性質 最適生育条件 PH３〜7.5、温度15〜30℃ 生育の範囲 PH３〜8.2、温度５〜37℃ 硝酸塩の同化性 なし 脂肪の分解 あり（弱い） 尿素の分解 なし ゼラチンの液化 あり カロチノイド色素の生成 なし 顕著な有機酸の生成 なし デンプン類似物質の生成 なし ビタミン要求性 あり（ビチオン要求性） (e) 炭水化物の同化性 Wickerham培地、25℃、７日間培養

【表】

【表】 ロドトロラ グルチニス（Rhodotorula
glutinis）TS−15103 分離源；花 (a) 形態 １ MY寒天培地、25℃、平板培養 栄養細胞の形状 楕円形 栄養細胞の大きさ （３〜５）×（８〜
10）μ 増殖の形式 多極出芽 菌糸及び仮性菌糸なし ２ MY液体培地、25℃、７日間 ガスの発生 なし 表面の生育 平滑 培地の混濁 やや濁る 沈殿の生成 粉末状 培地の着色 なし ３ MY寒天培地、25℃、30日間、斜面培養 生育の程度 生育良好 コロニーの周縁 全縁 コロニーの隆起状態 半レンズ状 コロニーの表面の形状 平滑 コロニーの光沢 鈍光 コロニーの性状 バター質 コロニーの色調 紅色 ４ バレイシヨ培地、スライド培養 菌糸及び仮性菌糸は認められない。 (b) 子嚢胞子の形成 なし (c) 射出胞子の形成 なし (d) 生理的性質 最適生育条件 PH３〜7.5、温度15〜30℃ 生育の範囲 PH３〜8.2、温度１〜35℃ 硝酸塩の同化性 あり 脂肪の分解 あり 尿素の分解 あり ゼラチンの液化 あり カロチノイド色素の生成 あり（紅色） 顕著な有機酸の生成 なし デンプン類似物質の生成 なし ビタミン要求性 なし性 (e) 炭水化物の同化性 Wickerham培地、25℃、７日間培養

【表】 スポロボロマイセス オドルス
（Sporobolomyces odorus）TS−15105 分離源；花 (a) 形態 １ MY寒天培地、25℃、平板培養 栄養細胞の形状 円筒形 栄養細胞の大きさ （３〜５）×（６〜
10）μ 増殖の形式 多極出芽 菌糸及び仮性菌糸なし ２ MY液体培地、25℃、７日間 ガスの発生 なし 表面の生育 平滑 培地の混濁 やや濁る 沈殿の生成 粉末状 培地の着色 なし ３ MY寒天培地、25℃、30日間、斜面培養 生育の程度 生育良好 コロニーの周縁 全縁 コロニーの隆起状態 半レンズ状 コロニーの表面の形状 平滑 コロニーの光沢 鈍光 コロニーの性状 バター質 コロニーの色調 オレンジ色 ４ バレイシヨ培地、スライド培養 菌糸、仮性菌糸は認められない。 (b) 子嚢胞子の形成 なし (c) 射出胞子の形成 なし (d) 生理的性質 最適生育条件 PH３〜7.5、温度20〜33℃ 生育の範囲 PH３〜8.2、温度14〜36℃ 硝酸塩の同化性 あり 脂肪の分解 なし 尿素の分解 あり ゼラチンの液化 なし カロチノイド色素の生成 あり（オレンジ
色） 顕著な有機酸の生成 なし デンプン類似物質の生成 なし ビタミン要求性 なし (e) 炭水化物の同化性 Wickerham培地、25℃、７日間培養

【表】

【表】 これらの菌株はいずれも工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されている。寄託番号は下記の
通りである。 シユードモナス プチダ（Pseudomonas
putida）TS−15001 微工研菌寄第6035号 アルカリゲネス フエーカリス（Alcaligenes
faecalis）TS−15002 微工研菌寄第6036号 トルロプシス カンジダ（Torulopsis candida）
TS−15101 微工研菌寄第6037号 ロドトルラ グルチニス（Rhodotorula
glutinis）TS−15103 微工研菌寄第6038号 スポロボロマイセス オドルス
（Sporobolomyces odorus）TS−15105 微工研菌寄第6039号 上記微生物を培養するための培地としては、炭
素源、窒素源、有機栄養源、無機栄養源などを含
む通常に栄養培地が使用できる。 炭素源としてはグルコース、シユクロース、糖
蜜等の炭水化物ならびに酒石酸、フマール酸、マ
レイン酸、リンゴ酸等の有機酸及びその塩類を、
窒素源としては通常の発酵に用いられる硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、アンモニア、リン
酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素
化合物及び尿素、コーン・ステイープ・リカー、
カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなど
の有機窒素化合物を用いることができる。 その他無機栄養源としては、例えばカルシウム
塩、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄
塩、マンガン塩、亜鉛塩、銅塩などが用いられ
る。 トルロプシス カンジダTS−15101株はビオチ
ン要求性であるので、培地にビオチン又はビオチ
ン含有物を添加する。 上記微生物の培養は、それぞれの菌種について
の慣用の方法を用いて行なうことができる。 例えば、シユードモナス プチダTS−15001、
アルカリゲネス フエーカリスTS−15002の各細
菌については、通常、温度約20ないし約40℃、好
ましくは約25ないし約38℃で、PH約５ないし約
９、好ましくはPH約5.5ないし約7.5で振盪、通気
撹拌などの手段により好気的に行なわれる。一
方、トロプシス カンジダTS−15101、ロドトル
ラ グルチニスTS−15103及びスポロボロマイセ
ス オドルスTS−15105の各酵母については、通
常、温度約15ないし約35℃、好ましくは約20ない
し約30℃で、PH約３ないし約8.2、好ましくは約
４ないし約7.5で、細菌の場合と同様に振盪、通
気撹拌などの手段により好気的に行なわれる。 尚、培養に当つて、培地中にα−APE、フエ
ニルアラニン低級アルキルエステル等を少量添加
しておくことによつて得られる微生物の菌体又は
その処理物のα−APE生産能を高めることがで
きる。 本発明で用いる微生物の菌体の処理物とは、上
述した属に属する微生物を培養して得た培養液等
から分離した菌体を処理して得た洗浄菌体、乾燥
菌体、菌体粉砕物、自己清化等による菌体清化
物、菌体の超音波処理物、その他の溶菌生成物又
はこれらを固定化したものなどを言う。また、こ
れらのものから得られた酵素蛋白質区分も含むも
のである。 培養液からの菌体の分離、得られた菌体の処理
等は慣用の方法で容易に行なうことができる。 本発明は、この微生物の菌体又はその処理物を
水溶液中でＬ−アスパラギン酸及びＬ−フエニル
アラニン低級アルキルエステルと接触させること
により行なうものである。 本発明で微生物の菌体又はその処理物をＬ−ア
スパラギン酸及びＬ−フエニルアラニン低級アル
キルエステルと接触させる際の濃度には格別の制
限はないが、両者とも通常は約１重量％ないし溶
解度の許す範囲、好ましくは約５重量％ないし約
40重量％程度である。 本発明の微生物の菌体又はその処理物の使用量
にも格別の制限はないが、これらは通常モル濃度
でより低い濃度の基質１モル当り、湿菌重量で約
10ｇないし約1000ｇ、好ましくは約50ｇないし約
500ｇの菌体又はその処理物を用いる。 本発明の方法の反応温度は、通常約10℃ないし
約50℃、好ましくは約25℃ないし約40℃である。
また、反応液の液性は、PH約４ないし約７、好ま
しくは約５ないし約６である。 反応時間は何ら限定的でないが、通常約１時間
ないし約40時間、好ましくは約10時間ないし約20
時間程度が便利である。 本発明で用いるＬ−フエニルアラニン低級アル
キルエステルの低級アルキル基は、メチル基、エ
チル基、イソプロピル基などの基である。アスパ
ラギン酸及びフエニルアラニン低級アルキルエス
テルのＤ−体は利用されず、また反応に関与しな
いので、これらのＬ−体に代えてラセミ体を用い
てもよい。 生成したα−APEは公知の分離精製手段によ
り分離精製することができる。例えば、反応液に
菌体等の固形分を含むときは、遠心分離、過等
によりこれを分離したのち、必要に応じて除蛋白
等の処理を行ない、慣用のカラムクロマトグラフ
イー、薄層クロマトグラフイー、晶析、減圧下で
の乾燥等の分離精製手段によりα−APEを精製
単離することができる。 本発明によれば、原料であるＬ−アスパラギン
酸のアミノ基を保護する必要がなく、直ちにα−
APEの製造に用いることができる。また生化学
反応を利用するので、原料としてラセミ体を用い
てもα−APEのLL−体のみを選択的に製造する
ことができる。更にまた、本発明ではβ−APE
の副生がない。 以下、実施例で本発明を更に詳細に説明する。
実施例中、百分率はいずれも重量百分率を示す。 実施例 １ フマール酸アンモニウム２％、リン酸２水素１
カリウム0.1％、リン酸１水素２カリウム0.1％、
硫酸マグネシウム・７水塩0.05％、硫酸第２鉄・
７水塩0.01％、塩化マンガン0.01％、塩化ナトリ
ウム0.01％及び残部水からなる培地（PH5.5）1.0
を２容ミニジヤー型醗酵槽に入れ、120℃、
15分間滅菌を行なつた。 これにこれと同一組成の培地（PH5.5）にシユ
ードモナス プチダTS−15001を37℃で16時間培
養して得た前培養液50mlを接種し、培養期間中PH
5.5〜6.0を維持するように2N−HCl水溶液、2N
−NaOH水溶液を添加しながら培養温度37℃、
撹拌器回転数500rpm、通気量１空気／分の条
件下で通気撹拌培養を行なつた。 16時間培養後、得られた培養液のうち、その
500mlを遠心分離して菌体を集め（湿潤菌体量５
ｇ）、これを1/50Ｍリン酸塩緩衝液（PH5.5）25ml
に懸濁した。この懸濁液をＬ−アスパラギン酸
3.3ｇ、Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル4.5
ｇを含む水溶液25mlに加え、振盪しながら37℃で
16時間反応を行なつた。 反応終了後、反応液を15℃、10000rpmで30分
間遠心分離して菌体を除いた。得られた上清液を
水：エタノール（容量比80：20）を溶離液とする
カラムクロマトグラフイー（充填剤トヨパール
55F 商標、東洋曹達工業(株)製）により分画を行
なつた。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルア
ラニンメチルエステルに相当する分画区分を減圧
下で濃縮を行ない白色粉末100mgを得た。このも
のの元素分析値及び物理化学的性質は以下の通り
であつた。

【表】 融点：235〜236℃で分解した。 比旋光度：〔α〕²⁵ _D＋32.0（Ｃ＝1.0、酢酸） アミノ基をトリフロロアセチル化、カルボキシ
ル基をメチル化したものの分子量は404であつた。 また、これをＬ−フエニルアラニル−Ｌ−フエ
ニルアラニン、Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエ
ニルアラニンメチルエステル、ジケトピヘラジ
ン、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステル、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−アスパラギン酸、α−Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル、β
−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンを標
準物質として薄層クロマトグラフイー、高速液体
クロマトグラフイー及びアミノ酸分析計で分析を
行なつた。更に塩酸メタノールによるメチル化及
びトリフロロアセテートメチルエステルによるト
リフロロアセチル化処理を行なつた試料のガスク
ロマトグラフイーならびにガスクロマトグラフイ
ー・マススペクトログラフイー分析によりこれが
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメ
チルエステルであることを同定確認した。 実施例 ２〜５ 実施例１と同様にして培養及び菌体分離を行な
つて菌体懸濁液を得た。この懸濁液を第１表に示
す量のＬ−アスパラギン酸及びＬ−フエニルアラ
ニンメチルエステルを含む水溶液25mlに加え、同
表に示す反応条件で両者を反応させた。 第１表に示す量のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−
フエニルアラニンメチルエステルの白色粉末を得
た。

【表】 実施例 ６ 実施例１と同様にして培養及び菌体分離を行な
つて菌体懸濁液を得た。Ｌ−アスパラギン酸3.3
ｇ、及びＬ−フエニルアラニンメチルエステル
4.5ｇを含む水溶液25mlに代えて、DL−アスパラ
ギン酸モノナトリウム3.3ｇ及びDL−フエニルア
ラニンメチルエステル塩酸塩4.5ｇを含む水溶液
25mlを用いて実施例１と同様にして反応を行なつ
た。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステル50mgを得た。 実施例 ７ シユードモナス プチダTS−15001に代えてア
ルカリゲネス フエーカリスTS−15002を用いて
実施例１を繰返えした。α−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルの白色粉末
80mgを得た。 実施例 ８ グルコース1.0％、フマール酸アンモニウム1.0
％、リン酸２水素１カリウム0.1％、リン酸１水
素２カリウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水塩
0.05％、硫酸第２鉄・７水塩0.01％、塩化マンガ
ン0.01％、塩化ナトリウム0.01％及び残部水から
なる培地（PH5.0）1.0を２容ミニジヤー型醗
酵槽に入れ、120℃、15分間滅菌を行なつた。 これにこれと同一組成の培地（PH5.0）にロド
トルラ グルチニスTS−15103を30℃で24時間培
養して得た前培養液50mlを接種し、培養期間中PH
5.0〜5.5を維持するように2N−HCl水溶液、2N
−NaOH水溶液を添加しながら培養温度30℃、
撹拌器回転数500rpm、通気量１空気／分の条
件下で通気撹拌培養を行なつた。40時間培養後、
得られた培養液のうち、その500mlを遠心分離し
て菌を集め（湿潤菌体量５ｇ）、この菌体を用い
て実施例１と同様にしてＬ−アスパラギン酸とＬ
−フエニルアラニンメチルエステルを反応させ、
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメ
チルエステルの白色粉末80mgを得た。 実施例 ９ ロドトルラ グルチニスTS−15103に代えてス
ポロボロマイセス オドルスTS−15105を用いて
実施例８を繰返えした。α−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルの白色粉末
70mgを得た。 実施例 10 グルコース1.0％、フマール酸アンモニウム1.0
％、リン酸２水素１カリウム0.1％、リン酸１水
素２カリウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水塩
0.05％、硫酸第２鉄・７水塩0.01％、塩化マンガ
ン0.01％、塩化ナトリウム0.01％、ビチオン0.5×
10^-6％及び残部水からなる培地（PH5.0）1.0を
２容ミニジヤー型醗酵槽に入れ、120℃、15分
間滅菌を行なつた。 これにこれと同一組成の培地（PH5.0）にトル
ロプシス カンジダTS−15101を30℃で24時間培
養して得た前培養液50mlを接種し、培養期間中PH
5.0〜5.5を維持するように2N−HCl水溶液、2N
−NaOH水溶液を添加しながら培養温度30℃、
撹拌器回転数500rpm、通気量１空気／分の条
件下で通気撹拌培養を行なつた。 40時間後、得られた培養液のうち、その500ml
から遠心分離により菌体を集め、これを純水に懸
濁して10mlとした。これにアクリル酸アミド1.9
ｇ、Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド0.1ｇ、
20％β−ジメチルアミノプロピオニトリル水溶液
0.5ml及び過硫酸アンモニウム２ｇを加え、室温
で10分間静置した。 次に反応生成物を粉砕し、純水で洗浄して固定
化菌体14ｇを得た。 こうして得た固定化菌体10ｇをＬ−アスパラギ
ン酸3.3ｇ、Ｌ−フエニルアラニンメチルエステ
ル4.5ｇを含むPH5.5の水溶液25mlに加え、振盪し
ながら37℃、18時間反応させた。 遠心分離で固形分を除いた後、この水溶液を実
施例１と同様にして処理を行ないα−Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルの
白色粉末45mgを得た。 実施例 11 シユードモナス プチダTS−15001を実施例１
と同一組成の培地に同一条件で培養した。得られ
た培養液のうち、その500mlから遠心分離により
菌体を集め（湿潤菌体量５ｇ）、1/50Ｍリン酸塩
緩衝液25mlに懸濁した。こうして得た菌体懸濁液
を５℃で15分間超音波処理して菌体を破砕した。
破砕液を５℃、10000rpmで15分間遠心分離して
得た上清液をＬ−アスパラギン酸3.3ｇ及びＬ−
フエニルアラニンメチルエステル4.5ｇを含む水
溶液25mlに加え、振盪しながら37℃で16時間反応
を行なつた。 以下実施例１と同様に処理を行ない、Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル
の白色粉末70mgを得た。 実施例 12 Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルに代えて
Ｌ−フエニルエチレンアラニンエチルエステルを
用いて実施例１をくり返えした。α−Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−フエニルアラニンエチルエステルの
白色粉末65mgを得た。 元素分析：

【表】 融点：244〜246℃（分解） 比旋光度：〔α〕²⁵ _D：−6.0（Ｃ＝１、メタノール） アミノ基トリフロロメチル化及びカルボキシル
基メチルエステル化体の分子量：418

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ シユードモナス属、アルカリゲネス属、トル
   ロプシス属、ロドトルラ属又はスポロボロマイセ
   ス属に属し、Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フエニル
   アラニン低級アルキルエステルからα−Ｌ−アス
   パルチル−Ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエ
   ステルを生成させることのできる微生物を培養
   し、培養物から菌体を分離し、分離された菌体又
   はその処理物を、Ｌ−アスパラギン酸及びＬ−フ
   エニルアラニン低級アルキルエステルと接触させ
   ることを特徴とするアスパルチルフエニルアラニ
   ンアルキルエステルの製造法。 ２ 反応をPH約４ないし約７で行なう特許請求の
   範囲第１項記載の製造法。 ３ 微生物の菌体の処理物がその固定化された菌
   体である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
   製造法。 ４ 微生物の菌体の処理物がその溶菌生成物であ
   る特許請求の範囲第１項又は第２項記載の製造
   法。 ５ Ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエステル
   及びα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニ
   ン低級アルキルエステルの低級アルキル基がメチ
   ル基又はエチル基である特許請求の範囲第１項な
   いし第４項のいずれかの項記載の製造法。