JPH02150272A - 生物細胞の培養方法，培養システム及び培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生物細胞の培養方法に係り、特に生物細胞を液
体培地中で懸濁培養し、老廃成分の除去を効率よく行う
、大規模かつ高濃度な生物細胞の培養方法、培養システ
ム及び培養装置に関する。

〔従来の技術〕 微生物細胞の培養に加え、最近、動物細胞の培養による
モノクローナル抗体やインターフェロンの生産や植物細
胞による天然色素の生産が行われはじめた。こうした有
用物質を工業的に生産するためには、大規模でかつ長期
間、細胞を高濃度の状態に安定して保ちながら培養する
、いわゆる高密度培養が必要となる。

培養槽内では細胞が増殖する過程で、培地中の栄養成分
が消費されると同時に、乳酸等の老廃成分が生成し、そ
のままでは生物細胞の増殖が阻害され、高密度培養には
至らない。このため、培養液中の細胞と液とを分離し、
液を系外に除き、新鮮な培地と交換する、いわゆる潅流
培養が必須となる。

細胞は培地よりも比重の大きい一種の粒子であることか
ら、公知の固液分離技術を適用した潅流培養方法が知ら
れている。細胞を分離する方法としては沈降分離、遠心
分離、膜分離が一般的である。膜濾過機構は、培養装置
（培養槽）内に配置するか、培養装置外に配置するかの
どちらかを選択することになる。前者については、例え
ば、工、エム、バイオチクノル、ラアボ、３（１）２４
〜３０　（１９８５）、（八　Ｍ　　ＢＩＯＴＥＣＮＯ
Ｌ、ＬＡＢ　　３　　（１）　　２５　　（１９８５）
）や特開昭６１−２５７１８１号に記載されている。後
者については、サイエンティフィック　アメリカンＫｌ
（１）　２４　（１９８３）（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　
Ａｍｅｒｉｃａｎ　■（１）ｐ２４（１９８３））や特
開昭６０−１０２１８７号に記載されている。

発明者らが、これらの従来方法を検討した結果、培養装
置内に配置すると、膜面に付着した細胞が増殖して不可
逆的な閉塞が起こりやすい他、−旦、培養を開始すると
培養期間中に濾過機構の交換が不可能であり、かつ濾過
機構の構造及び位置が培養装置内の液の混合、溶存酸素
の供給に大きく影響するため、スケールアップが困難で
ある。

一方、培養装置外に配置すれば、後２者の欠点は回避で
きるが、単に外部に配置し、通常の逆洗操作を行っただ
けでは、特にＩ　Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／ｍｆ以上の高濃
度下で膜の閉塞なく長期間潅流培養は困難であることが
わかった。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、長期間安定した高密度培養を達成するには、従
来の外部設置型の長所を生かしながら膜閉塞を回避でき
る新規な濾過機構の開発が望まれ、鋭意研究の結果本発
明を完成するに到った。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の第１の特徴は、培養装置内の細胞培養液を装置
外に取り出し、取り出した培養液中に浸漬した濾過膜の
膜面に気体を接触しながら減圧濾過して、細胞を液から
分離し、これを培養装置内に返送することである。気体
を接触しながら濾過することにより、膜面での細胞増殖
を抑制し、濾過膜の目詰りを最少限にすることができる
。本発明者らは、気体を接触させない場合には、たとえ
逆洗を行っても膜面に付着した細胞が順次増殖し、膜の
細孔をうめるため、圧損が著しく増大し最終的には濾過
が不可能になることを見出し、本発明に到達した。本発
明は特に、細胞の膜面への付着をさまたげるため、細孔
内での細胞の増殖を効果的に防止できる。

本発明の第２の特徴は、吹き込んだ気体が液面上で形成
する蛋白性の難破泡性の泡沫を撥水材で構成した消泡層
により効果的に破泡し、濾過プロセスを継続できる環境
下に保つことである。培地には血清やアルブミン等の蛋
白が含まれる他、培養液中には細胞が分泌する蛋白質も
含まれるため、消泡なしに液中に通気することは不可能
に近い。

本発明の第３の特徴は、濾過膜として精密濾過膜を使う
だけの場合の他に、精密濾過膜を内側に配置しかつ両膜
間に間隙を有する２Ｎ膜糸からなり、濾過に際しては分
子濾過膜内面の圧力を精密濾過膜内面の圧力と同じか近
（保って低分子性濾液のみ、もしくは低分子性液と高分
子含有濾液とを別個に抜き出し、逆洗に際しては分子濾
過膜の内面のみから、もしくは両膜内面に低分子栄養成
分液を加圧下で供給することである。これにより、低分
子である老廃成分を単一の濾過装置で一挙に除き、両膜
の逆洗を同時にできる利点がある。さらに、血清や細胞
の分泌する自己増殖促進因子を回収再利用することもで
きる。もし、両膜を上記の如く使わず、両膜を接着した
り、分子濾過膜のみを用いようとすると、気泡による膜
面の洗滌が不充分となり、膜への細胞の増殖と膜の閉塞
を招くことになる。両膜間に間隙を設け、内側の分子濾
過膜側から精密濾過膜をも同時にかつ効果的に逆洗再生
することが可能となる。

本発明第４の特徴は、濾過装置内に培養液を流入させな
がら濾過して、濾過装置内の細胞濃度の急激な上昇を抑
えると共に、濾過後の逆洗で生じる細胞の濃厚懸濁液を
培養槽に返送することである。

すなわち、濾過装置底部と培養槽側面とを配管で連結し
ておき、濾過装置底部に設けたスパージャ−からガスを
通気することにより膜面への細胞の付着と膜面及び膜マ
トリックス内での増殖を防止できるだけでなく、ガスリ
フト効果により、濾過装置内の液を培養槽に返送すると
共に、培養槽内の培養液を濾過装置内に導入できる。こ
のため、・濾過時の細胞濃度上昇を緩和して膜寿命を延
長すると共に、膜濾過時に生じる細胞集合体をも効果的
に培養槽へ返送できる。この場合、濾過装置に導入した
ガスは培養槽底部を通り、培養槽液面で気泡を形成する
ため、培養槽液面上に前述の濾過装置に用いたものと同
様の消泡層を設けることになる。上述の対策の他に、濾
過装置と培養装置とを連結する配管を２本用意し、−本
は濾過時の培養槽から濾過装置への培養液の移送のため
に、他方は配管中にポンプ及びバルブを装着して、膜逆
洗中もしくは逆洗後に培養槽中の培養液を濾過装置の底
部に２ｃｍ／ｓｅｃ以上の空筒線速度でかつ濾過装置内
張込液量の５０％以上を移送して、逆洗時に生ずる細胞
の濃厚懸濁液を培養槽に返送するためである。

本発明に適用できる生物細胞としては、特に限定される
ものではなく、動物細胞、植物細胞、微生物細胞が含ま
れる。動物細胞としては、例えばを推動物の各種細胞、
無を推動物の各種細胞がある。細胞としては、単一細胞
のみならず細胞集合体も含まれる。

植物細胞としては、高等植物の細胞及び細胞集合体、藻
類の細胞及び細胞集合体が含まれる。

本発明に適用できる細胞の培養方法及び対応する培養装
置も特に限定されないが、主として細胞を懸濁状態で培
養する場合に好適である。付着状態での培養の場合、例
えばマイクロビーズ培養やゲル包括培養等でも、担体粒
子から脱落して液中に懸濁している細胞も多く、これら
の付着状態での培養にも十分適用できる。従って、これ
らの培養方法、条件、培養装置（培養槽）は、用いる細
胞、培養する目的、スケール、制御の方法等により適宜
選択される。特に、温度、ｐＨ１溶存酸素濃度、溶存炭
酸ガス濃度、酸化還元電位等は適宜その目的に応じ制御
される。

膜は、目的とする細胞を分離できる孔径のものが適宜選
択される。孔径としては５μ１１１〜０．５μｍのもの
が好ましい。膜の材質はアセチルセルロールやテフロン
等これまで公知のものでも十分使用できる。膜の形状も
適宜選択されるが、膜面積を大きくし、液の移送口を設
けるには中空糸膜が適している。濾過は複数の中空糸の
両端を集合して、液を抜き出すのが便利であるが、両端
ともに集合して環状とし、集合管の適当な個所から濾液
を抜き出すか、中空糸の一端を閉じ、他端どおしを集合
して集合管から濾液を抜き出してもよい。

尚、膜は単に精密濾過膜にとどまらず分子濾過膜をも精
密濾過膜を組み合せたモジュールとして用いることがで
きる。この場合、両膜間に間隙を保った状態での二重管
とし、内側に位置する濾過膜内側から低分子性濾液を、
外側に位置する精密濾過膜と分子濾過膜との間隙から高
分子性の濾液を取り出すことができる。両液は、前述し
た集合方法で各々別々の集合配管から抜き出せばよい。

濾過の方式は通常減圧濾過が用いられる。加圧濾過を行
う場合には、炭酸ガスの液中溶解によるｐＨ低下や、脆
弱細胞の損傷を考慮して採用する必要がある。濾過装置
内の膜面の方向は特に限定されないが、膜下力からの気
泡が効率よく膜面に接触するように配置、構造が選択さ
れる。例えば中空糸の方向を垂直にもしくは水平に配置
する等である。通気方法も特に限定されないが、少なく
とも膜面積１ｃＩｉ１当り０．１　ｃａｌ　／ｒａｉｎ
以上の通気が必要である。気泡径も適宜選択される。通
気するガスは、細胞に毒性でないガスのうち、適宜選択
して用いられる。例えば、窒素、アルゴン、空気等でも
よい。濾過圧も、材質、液性、細胞濃度、運転条件等に
より適宜選択されるが、０．０１〜５ｋｇ／ｃ１１が適
している。

液面上に発生した泡沫の消泡は、液面上に配置した消泡
層で行われる。消泡層は気体を通過しうる多数の開口を
有し、その開口比が５０％以上、開口径２〜５０ｍｍが
好ましい。消泡層の表層は培養液もしくは培地の液適と
の接触角が８０度以上を形成するｔ８水性材料で構成す
る。例えば、炭素数１０以上のシラン又はシロキサンの
有機ポリマー等が好適である。消泡層は単層でもよいが
、長期の運転には、細胞付着による撥水面の撥水性紙下
等を考慮し、複数層が好ましい。消泡層の撥水性低下を
回復するために培養濾液や培地、培養液を用いて表面を
洗い、再生することも可能である。

〔作　用〕

本発明は、前述したように、培養装置内の培養液を装置
外に取り出し、取り出した培養液中に浸漬した濾過膜に
気体を接触させながら減圧濾過して細胞を分離し、これ
を培養装置内に返送することである。気体を接触させず
に濾過すると、膜のマトリックス内に侵入、付着した細
胞が徐々に増殖し、膜の細孔をうめるようになり、もは
や膜裏面から、液体培養地等を洗滌液として用いて逆洗
しても、目詰まりが不可逆的に進行する。そしてついに
は濾過時の圧損が著しく増大し、最終的には濾過が不可
能になる。中でも動物細胞は、膜と細胞、細胞と細胞と
が付着しやすく膜の目詰まりをおこしやすい。これに対
し、膜に気体を接触させながら濾過することにより、膜
面への細胞の付着と膜面及び膜マトリックス内での細胞
の増殖を完全に抑制して、濾過時の目詰まりを効果的に
抑制できる。したがって、濾過、逆洗のサイクル化によ
り、少なくとも１か月収上の長期にわたり、可逆的に膜
の再生使用が可能となる。

本発明は更に、濾過装置内の膜面に接触させた気体が濾
過装置もしくは培養装置の液面上に達した際に生成する
蛋白性の難破泡沫の泡沫を撥水材で構成した消泡層で破
泡することにより、濾過プロセスを継続できる条件下に
保つことにある。生物細胞の培養、特に動物細胞の培養
では培地中にアルブミンや血清等の蛋白が含まれる他、
培養液中には培養中に細胞が分泌する蛋白質が含まれる
ため、膜面への気体通気による液面上での泡沫形成はさ
けられない。一般に培養系から排出されるガスは系外か
らの微生物進入を防止するため、排ガス排出配管の途中
に微生物濾過膜を挿入している。もし、液面上の泡を破
泡しない状態で運転を継続すると、泡沫が排ガスととも
に微生物濾過膜に達する。泡沫を形成している培養液中
には細胞等の粒子が含まれるため微生物濾過膜が閉鎖し
、系内圧が上昇し続け、やがて運転が不可能となる。

本発明では、これを防ぐため、液面上に設置した撥水材
の消泡層で泡沫を破壊することにより、微生物フィルタ
ーと培養液との接触を効果的に防止している。すなわち
泡が消泡層の撥水材と接触した段階で泡が破壊するため
、細胞濾過に用いる濾過膜へのガス通気及び培養装置内
の培養液中への酸素供給のための空気及び酸素ガスの通
気をはじめて可能にする。

上述した作用効果により、目的とする長期にわたる潅流
培養が可能になる。

〔実施例〕

次に本発明の実施例を示す、さらに詳しく説明する。

実施例１ 第１図に示す培養システムにより動物細胞の潅流培養を
行った。

培養に先だち、上記システムの各槽及び各配管系統に順
次スチームを供給し、１２５°Ｃ，３０分以上加熱して
殺菌した。培地貯槽１１には無菌的に次の組成の培地を
充填した。

イーグルＭＥＭ培地（日水製薬製イーグルＭＥＭニッス
イ■）９．４ｇ＃！、グルタミン（１９２ｇ＃！、７．
５％炭酸水素ナトリウム水溶液２９ｍ１＃！、グルコー
ス２０ｇ／　１、及び牛血清１００ｍｆ／ｌ。

種細胞としては、ラット肝臓癌細胞ＪＴＣ−１（Ｊａｐ
ａｎＴｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｎｏ　１）を用い
た。培養に用いる種細胞液は以下の様にして調製した。

２０−偏平フラスコ１５ケに、上記の培地を各５ｄずつ
分注し、上記ＪＴＣ−１株をＩ　Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ
／　ｍｌの濃度に接種して静置培養した。３日間培養し
たフラスコの内面に付着した細胞をはく離して液中に懸
濁している細胞と合せて、細胞濃度４．０Ｘ１０５ｃｅ
ｌｌｓ／−の培養液７５−を得た。本培養液を無菌処理
した遠沈管に無菌的に分注して、懸架式のオープン型遠
心分離機で細胞を回収した。同細胞を培地７５／の入っ
た１１のローラボトル２本に接種し、３７°Ｃで３日間
培養した。同操作を数回繰り返し、培養液量を増やし、
１．　ＯＸ　１０’ｃｅｌｌｓ／　ｒｄの培養液２Ｉ！
、を得た０本培養液を上記の要領で細胞を回収し、培地
５００ｒＢ！に懸濁し、これを本実施例の種液とした。

培養システムは、膜濾過分離装置６と、培養装置ｌ、培
地貯槽１１、培養濾液貯槽１３との間を液移送配管２４
．２５．２６．２９で連結している。液移送配管上のバ
ルブ及び液移送用ポンプは各々プロセスシーケンサ１０
と連結している。

培養槽は有効容積５１のステンレス製で、撹拌機３の他
、温度、ｐＨ，Ｄｏを自動コントロール可能である。酸
素はコンプレッサ４からエアフィルタ５を経由したエア
移送配管２８により、培養槽液面にオーバレイ式で供給
され、液面から拡散により溶解して細胞の増殖に必要な
溶存酸素が供給される。

スチーム処理した培養装置１に培地４．５１を無菌的に
導入後、上記種液０．５１を接種して、細胞濃度を４．
　Ｉ　Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ　／　ｄとした。槽側壁か
ら液面上に無菌空気を１０〜３０１／分の速度で通じな
がら、撹拌速度２０ｒｐｍ　、　３７°Ｃ，、ｐＨ７，
０〜７．６で培養した。培養液中の溶存酸素濃度（Ｄｏ
）が１　ｐｐｍとなる様に、通気量を自動的に調節した
。

培養液２の１１をバルブ２０を開はポンプ１６を作動し
て濾過装置６に移送した。濾過装置６は有効容積１．３
１！のステンレス製で、液中に精密濾過膜７の中空糸モ
ジュールを配置している。膜としては、テトラフルオロ
エチレン製で外径２鵬、内径ＩＩｍ、細孔径０．８μ俄
の中空糸膜１１１１を５本を並列に並べて、両ターミナ
ルを共通の配管にまとめている。さらに両配管を接続し
て、培地移送配管２５により培地貯槽１１と、培養濾液
移送配管２６による培養濾液貯槽１３とに連絡しである
。濾過装置６の底部にスパージャ９　（直径３０ｍｍリ
ングスパージャ−１孔径１０１ｍ、１０ケ）を配置し、
ボンベ１５からガス移送配管２７を経て、精密濾過膜７
に気泡を接触できるようにしである。液面上には消泡層
８が配置されている。消泡層８は表面にシラン系有機ポ
リマ（粘度ｌＸｌ０’センチポイズ）を薄く塗布した正
方形網目のステンレス′！Ｊ４（目の１辺の長さ：３ｍ
＋ａ）である。槽底部には、濾過、逆洗のあとで得られ
る細胞懸濁液を培養槽ｌに返送するための配管２９を配
置している。

濾過装置１中に導入した培養液２に窒素ガスをスパージ
ャ−から精密濾過膜に向け１００ｍｆ／ｗｉｎに通気し
、生成する泡沫を消泡層で破泡しつつ、ポンプ１９で濾
液１４を抜きとり、濾液貯槽１３へ移送した。濾過速度
を０．５ｊｌ！／ｈにし濾液量０．５１に達した時点で
濾過を停止した。次いで、培地貯槽１１中の培地１２を
配管２５を経て、ポンプ１８により逆洗液として精密濾
過膜７に３２／ｈで０．５ｉ圧入した。

得られた細胞懸濁液はポンプ１７により配管２９を経て
培養装置１に返送した。本プロセスを均等分割で１日あ
たり１０サイクル行い３０日間培養を継続した。その際
の培養装置１中の生細胞濃度、生存率及び濾過時の圧力
損失を表１に示した。

培養期間中細胞の生存率（生細胞／総細胞Ｘ　１００）
が９０％以上と高く、圧力損失が増加しないことから、
膜の閉塞なしに、本システムにより、効率よく培養でき
ることを示している。

（来夏以下余白） 実施例２ 第２図に示す培養システムにより動物細胞の潅流培養を
行った。

実施例１と同じ培地及び同じ株の動物細胞を用いた。種
液としては、実施例１と同様に１．０Ｘ１０６ｃｅｌｌ
ｓ／ｒｎｌの培養液２２分を遠心分離して細胞を培地に
懸濁した細胞懸濁液を用いた。

本培養システムは、実施例１で用いたシステムの濾過分
離装置６の消泡層の上部に消泡層８を洗滌用の培地散布
ノズルを付加している。散布ノズルはスパージャ−９と
同型のものを用いた。

実施例１では濾液量と同量の培地を逆洗用として用いた
ものに対し、本実施例では逆洗用を４８０−とし、濾過
量と逆洗用培地量との１日基準の差額２００ａ／を消泡
層洗滌用として１日１回使用した（４００＋ｄ／ｍｉｎ
、　０．５ｍ１ｎ）。

その他は実施例１と同じ操作条件で培養した。

その結果を第２表に示す。実施例１と同様、高い生存率
でほぼ同じ増殖を示した。

実施例３ 第３図に示す培養システムにより動物細胞の潅流培養を
行った。

実施例１と同じ培地及び同じ株の動物細胞を用いた。種
液も実施例１と同じ操作条件で調製した１、　ＯＸ　１
０’ｃｅｌｌｓ　／　ｍｌの培養液２１分を遠心分離し
て細胞を培地に懸濁した細胞懸濁液を用いた。

本培養システムは濾過分離装置６の精密濾過膜７を実施
例１の精密濾過膜のように中空糸の両端を集合固定せず
、一端のみを集合して抜き出し配管に結合した精密濾過
膜を用いた以外は実施例１のシステムと同じである。培
養は実施例１と同じ手法及び条件で行、った。その結果
を第３表に示す。

実施例１と同様、高い生存率でほぼ同じ増殖を示した。

（来夏以下余白） 実施例４ 第４図に示す培養システムにより動物細胞の潅流培養を
行った。

実施例１と同じ培地及び同じ株の動物細胞を用いた。但
し、培地の血清濃度は培養スタート時の４．５１分だけ
１０％とし、以後供給する培地には添加していない。種
液も実施例１と同じ操作条件で調製した１、　ＯＸ　１
０６ｃｅｌｌｓ　／　ｔａｒの培養液２２分を遠心分離
して細胞を培地に懸濁した細胞懸濁液を用いた。

本培養システムは濾過分離装置６の濾過膜を実施例１〜
３のように精密濾過膜７のみから構成せず、分子濾過膜
３５を内側に配置しかつ両膜間に間隙を有する２層膜糸
とし、濾過に際しては分子濾過膜内面の圧力を精密′濾
過膜内面の圧力を低く保って分子濾過膜の内側から低分
子性濾液を、精密濾過膜７と分子濾過膜３１との間隙か
ら高分子含有濾液を別個に抜き出した。低分子性濾液は
低分子性濾液貯槽１３へ、高分子含有濾液は配管３６を
経て、ポンプ３７により培養装置１に返送した。精密濾
過膜としては実施例１と同材質で外径３　ｍｍ、内径２
ｍｍ、同じ長さの中空糸を用い、該精密濾過中空系の内
に、外径１＋＋ｏ＋＋、内径０．５Ｍのアセチルカルロ
ース性の分子濾過用中空糸膜（孔径６０００ダルトン）
を挿入した中重管を用い、両端を同じ膜を同−抜き出し
口に集合して、両濾液を個別に分離できるようにした。

低分子性濾液の抜き出し速度を０．４５１／ｈ、高分子
含有濾液の返送速度を０．０５ｆ／ｈにし、両者合計の
濾液１０．５ｆに達した時点で濾過を停止した。その他
は実施例１と全く同要領の運転を行い３０日間培養を継
続した。その際の培養装置１中の生細胞濃度、生存率及
び濾過時の圧力損失を表４に示す。

実施例１〜３と同様、高い生存率を維持しかつ高い細胞
濃度に達した。生細胞濃度が前実施例より高いのは、細
胞が分泌する高分子性の自己増殖促進因子が回収された
効果と考えられる。

（来夏以下余白） 比較例１ 第５図に示す培養システムによりＪＴＣ−１株の培養を
行った。種液は実施例１と同じ要領で調製した。培地も
実施例１と同組成とした。

本培養システムは、実施例１のシステムの濾過分離装置
６のスパージャ−９と消泡層８を除去し、液撹拌のため
、撹拌翼３を付設したものを用いた。

運転方法は実施例と同じ要領で行った。

その結果を第５表に示す。実施例１〜４に比べ、濾過膜
の閉塞がおこり、圧損が増加したため２０日目で培養を
中断した。また、膜への細胞集積により生細胞濃度、生
存率ともに、実施例に及ばなかった。

（来夏以下余白） 実施例５ 第６図に示す培養システムにより動物細胞の潅流培養を
行った。本システムは実施例１に於いて用いた第１図の
培養システムと下記の点を異にする。

ｌ）濾過装置を培養槽の底部に配置し、濾過装置底部で
のガス通気によるガスリフト効果により濾過装置内の液
が培養槽に返送できる様、培養槽底部と濾過装置上部と
を移送配管２４で連結しである。濾過装置の容量は同じ
に、液の上昇流を円滑にするため、濾過装置の上下端を
搾っである。

２）濾過装置に消泡層を設けず、培養槽液面上に同質の
消泡層を装着する。

３）培養槽への酸素の供給を、第１図のオーバレイ方式
から槽底部に設けたスパージャから液中に通気する方式
に変える。

実施例１と同様の手法により、第６図の培養システムを
スチーム殺菌し、培養槽及び濾過装置に同種の培地４．
５１を無菌的に導入した。次いで、実施例１と同手順で
調製した種細胞液０．５１を接種して、細胞濃度を３．
９　Ｘ　１０’ｃｅｌｌ／ｍＦ１．とした。培養槽底部
のスパージャから、無菌空気を１０〜３０４２７分の速
度で通気し、液面上に形成される泡沫を消泡層で破泡し
ながら、攪拌速度２０ｒｐｍ、、３７°Ｃ１ｐＨ７，０
〜７．６で培養した。培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ）
がｉｐｐｍとなる様に、通気量を調節した。

濾過操作中、バルブ２０を開き、濾過装置下部にあるス
パージャ９からのガス上昇による循環流を形成させた。

膜の逆洗は実施例１と同じく均等分割で１日あたり１０
サイクル行い、３１日間培養を継続した。その際の培養
装置１中の生細胞濃度、生存率及び濾過時の圧力損失も
低下したいる。これは、濾過が行われている間、膜への
気泡接触とガスリフトにより培養槽から濾過槽に常時培
養液が供給、循環することにより濾過装置内での細胞濃
度の上昇を細胞に温和な条件下で抑制し、かつ膜への付
着防いでいるためと考えられる。

（来夏以下余白） 実施例６ 第７図に示す培養システムにより動物細胞の潅流培養を
行った。本システムは、実施例５の培養システム（第６
図）において、培養槽１と濾過装置６の底部とを連結す
る液移送配管２９の他に、バイパスに相当する液移送配
管１７を付加したものである。配管１７にはバルブ２０
とポンプ１６が装置されており、逆洗後に、濾過装置中
の濃厚細胞懸濁液を強制的に培養槽内へ返送するために
用いられる。

その際の条件は２５０ｍ１／ｍｉｎの速度で作動時間２
分間である。濾過、逆洗のプロセスは、実施例１と同じ
く、均等分割で１日あたり１０サイクル行い、３０日間
培養を継続した。その際の培養装置ｌ中の生裁縫濃度、
生存率及び濾過時の圧力損失を第７表に示した。

（来夏以下余白） 実施例７ 第８図に示す培養システムにより動物細胞の潅流培養を
行った。本システムは実施例５のシステム（第６図）の
配管１７上にバルブ２０の、他、ポンプ１６を配置した
ものである。運転方法は、実施例６では濾過装置６の底
部からのガススパージングによるガスリフト効果により
、濾過装置中に培養液を濾過槽に循環させるのに対し、
本実施例では、ガスリフトによる液循環をさせずに、ポ
ンプ１６により濾過操作中に培養槽内の培養液を強制的
に循環返送するものである。濾過／返送、逆洗のプロセ
スは実施例１と同じ（均等分割で１日あたり１０サイク
ル行い、３０日間培養を継続した。なお、返送条件は１
サイクル２５０ｍ１／ｌｌｌ１ｎの速度で２分間とした
。その際の培養装置１中の生細胞濃度、生存率及び濾過
時の圧力損失を第８表に示した。

生細胞濃度、生存率が実施例６より向上し、かつ膜の圧
力損失も低下している。本効果は、逆洗時に生じる濃厚
な細胞懸濁液をポンプによる矯正循環により実施例６よ
りも効果的に培養槽に返送できたためと考えられる。

（来夏以下余白） 〔発明の効果〕 本発明によれば、培養液を濾過する際に生ずる細胞の膜
面への付着及び付着後の膜面及び膜マトリックス内での
細胞増殖を効果的に抑制できるため、膜の濾過寿命を少
なくとも１ケ月以上に向上でき、目的とする長期にわた
る潅流培養が可能になる。

【図面の簡単な説明】 第１図〜第４図及び第６図〜第８図は本発明の一実施例
である培養システム図である。第５図は培養装置（培養
槽）外で単純な機械撹拌下で培養液中の細胞を濾過分離
する従来技術の範囲に相当する培養システムを示す図で
ある。 １・・・培養装置　２・・・細胞培養液　３・・・撹拌
翼４・・・コンプレッサ　５・・・エアフィルタ　６・
・・膜濾過分離装置　７・・・精密濾過膜　８・・・消
泡層９・・・スパージャ　１０・・・プロセスシーケン
サ１１・・・液体培地貯槽　１２・・・液体培地　１３
・・・培養濾液貯槽　１４・・・培養濾液　１５・・・
窒素ガスボンベ１６・・・培養液移送ポンプ　１７・・
・細胞返送ポンプ１８・・・培地移送装置　１９・・・
培養濾液移送ポンプ２０・・・培養液移送配管バルブ　
２１・・・培地移送配管バルブ２２・・・培養濾液移送
配管バルブ　２３・・・濾過装置用ガス移送配管バルブ
　２４・・・培養液移送配管　２５・・・培地移送配管
　２Ｇ・・・培養濾液移送配管２７・・・濾過装置用ガ
ス移送配管　２８・・・エア移送配管　２９・・・細胞
懸濁液移送配管　３０・・・細胞懸濁液移送配管バルブ
　３１・・・消泡層洗滌ノズル３２・・・消泡層洗滌用
培地移送配管　３３・・・消泡層洗滌用培地移送ポンプ
　３４・・・消泡層洗滌用培地移送配管バルブ　３５・
・・分子濾過膜　３６・・・高分子濾液返送用配管　３
７・・・高分子濾液返送用配管ポンプ　３８・・・高分
子濾液返送用配管バルブ　３９・・・攪拌用モーター　
４０・・・液移送配管

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物細胞の培養方法に於て、培養装置内の細胞培養
   液を培養装置外に取り出し、取り出した培養液中に浸漬
   した濾過膜の膜面に気体を接触させるとともに、発生す
   る液面上の泡沫を液面上に設置した撥水材製の消泡層で
   破泡しながら該濾過膜で細胞を減圧濾過して得られる細
   胞を培養装置内に返送し、かつ濾液を培養装置外に抜き
   出すことを特徴とする生物細胞の培養方法。 ２、分離細胞の培養槽への返送に際し、膜を液体培地で
   逆洗することにより、分離した細胞を液体培地に懸濁し
   た細胞懸濁液として培養装置に返送することを特徴とす
   る請求項１記載の生物細胞の培養方法。 ３、濾過膜が、精密濾過膜を外側に、分子濾過膜を内側
   に配置したものであって、かつ両膜間に間隙を有する２
   層膜系からなり、濾過に際しては、分子濾過膜内面の圧
   力を精密濾過膜内面の圧力と同じか低く保って低分子性
   濾液のみ、もしくは低分子性液と高分子含有濾液とを別
   個に抜き出し、逆洗に際しては、分子濾過膜内面のみか
   ら、もしくは分子濾過膜内面及び精密濾過膜内面に低分
   子栄養成分液を加圧下で供給することを特徴とする請求
   項１又は２記載の生物細胞の培養方法。 ４、膜として複数本の中空糸膜を用い、一端のみを固定
   すると同時に各末端を共通の液引き出し口に合流させた
   膜モジュールを用いることを特徴とする請求項１乃至３
   のいずれかの項記載の生物細胞の培養方法。 ５、消泡層を新鮮な培地で洗浄することを特徴とする請
   求項１乃至４のいずれかの項記載の生物細胞の培養方法
   。 ６、消泡層を培養液、培養濾液、高分子含有濾液、低分
   子性濾液のいずれか１種又は２種以上で洗浄することを
   特徴とする請求項１乃至５のいずれかの項記載の生物細
   胞の培養方法。 ７、濾過操作中に間歇的もしくは連続的に培養槽中の培
   養液を該濾過装置に送り、濾過装置から培養槽へと返送
   することを特徴とする請求項１乃至６のいずれかの項記
   載の生物細胞の培養方法。 ８、培養液の循環方法として、培養槽の下方に濾過装置
   を配置し、濾過装置下方部分に気泡を通気して生ずるガ
   スリフトを利用すると同時に、培養槽液面上に発生する
   泡沫を液面上で消泡することを特徴とする請求項７記載
   の生物細胞の培養方法。 ９、細胞濾過に用いる膜の逆洗と同時か又は逆洗後に、
   培養槽内の培養液を濾過装置に逆洗用培地容量の５０％
   以上移送することを特徴とする請求項８記載の生物細胞
   の培養方法。 １０、細胞と液とを濾過分離可能な膜を袋状にした膜構
   造物と、該膜構造物の膜周辺に気体を通気できるスパー
   ジャーとを液面下に内蔵する膜濾過分離装置と、培養装
   置、培地貯槽、濾液貯槽との間を、プロセスシーケンサ
   と接続する液移送ポンプならびにバルブを挿入した液移
   送配管で連結することを特徴とする生物細胞の培養シス
   テム。 １１、細胞と液とを濾過分離可能な膜として、外側に精
   密濾過性の膜、内側に分子濾過性の膜とを間隙を保つ状
   態で両膜を別個に袋状にし、プロセスシーケンサと接続
   したバルブ及びポンプを挿入した両膜別々の濾液取り出
   し配管を設けた膜構造物を液面下に内蔵させた膜濾過分
   離装置を用いることを特徴とする請求項１０記載の生物
   細胞の培養システム。 １２、膜構造物が膜の一端を固定していないものである
   膜濾過分離装置を用いることを特徴とする請求項１０又
   は１１記載の生物細胞の培養システム。 １３、培養システム内の液を消泡層に供給し、かつプロ
   セスシーケンサと接続したバルブ及び液移送ポンプを挿
   入した液移送配管を有することを特徴とする請求項１０
   乃至１２のいずれかの項記載の生物細胞の培養システム
   。 １４、消泡層に供給する液の配管が該液用の配管から分
   岐してなることを特徴とする請求項１３記載の生物細胞
   の培養システム。 １５、消泡層の外表面に液を供給する洗滌機構を有する
   ことを特徴とする請求項１３又は１４記載の生物細胞の
   培養システム。 １６、消泡層の構成材の内部から外表面に液を供給する
   洗滌機構を有することを特徴とする請求項１３又は１４
   記載の生物細胞の培養装置。 １７、濾過装置が少なくとも培養槽の液面より下方に位
   置し、さらに培養槽と濾過装置の底部とを連結する配管
   を有し、濾過装置底部にシーケンサを連結した通気ノズ
   ルを有し、培養槽液面上に消泡層を有することを特徴と
   する生物細胞の培養装置。 １８、培養槽の底部に濾過装置上部が連結し、培養槽側
   面と濾過装置底部とを連結する配管を有することを特徴
   とする請求項１７記載の生物細胞の培養装置。 １９、培養槽側面と濾過装置底部とを連結する配管に、
   少なくともバルブとポンプを有し、バルブとポンプもし
   くはポンプとシーケンサと連結していることを特徴とす
   る生物細胞の培養装置。 ２０、培養槽側面と培養槽底部とを連結する配管として
   ２本の配管を有し、一方はシーケンサと連結したバルブ
   を有し、他方はシーケンサと連結したバルブ及びポンプ
   を有する配管であることを特徴とする請求項１７乃至１
   ９のいずれかの項記載の生物細胞の培養装置。