JPH02157295A - 新しい抗腫瘍性ポリペプチド - Google Patents
新しい抗腫瘍性ポリペプチドInfo
- Publication number
- JPH02157295A JPH02157295A JP63307751A JP30775188A JPH02157295A JP H02157295 A JPH02157295 A JP H02157295A JP 63307751 A JP63307751 A JP 63307751A JP 30775188 A JP30775188 A JP 30775188A JP H02157295 A JPH02157295 A JP H02157295A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- polypeptide
- tnf
- fragment
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は新しい抗腫瘍性ポリペプチド、該ポリペプチド
をコードするＤＮＡ 、それらの製造法及び該ポリペプ
チドを含有する医薬組成物に関する。
をコードするＤＮＡ 、それらの製造法及び該ポリペプ
チドを含有する医薬組成物に関する。
（従来の技術）
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ ）はマクロファージから放出さ
れる生理活性物質であり、その特徴として（ｉ）塩ガン
動物に投与するとある種のガンを壊死させ治療せしめる
こと、（ｉｉ ） ｉｎ ｖｉｔｒｏでマウスのし細
胞を傷害すること、（ｉｉｉ ）活性に種特異性が少な
いことが知られている。このような特徴のためＴＮＦは
、新しいタイプの制ガン剤としてその臨床的応用が期待
されている。
れる生理活性物質であり、その特徴として（ｉ）塩ガン
動物に投与するとある種のガンを壊死させ治療せしめる
こと、（ｉｉ ） ｉｎ ｖｉｔｒｏでマウスのし細
胞を傷害すること、（ｉｉｉ ）活性に種特異性が少な
いことが知られている。このような特徴のためＴＮＦは
、新しいタイプの制ガン剤としてその臨床的応用が期待
されている。
現在名にヒｌ−ＴＮＦは、本発明者ら及びその他のグル
ープによりその遺伝子のクローニングが行なわれ（（Ｓ
ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ３１３
＋８０３（１９３５） ） 、 （Ｐｅｎｎｉｃａ
ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ３￥２゜７２４
（１９８４）） 、 （Ｈａｎｇ ｅｔ ａｌ、、
５ｃｉｃｎｅ ２２８ 。
ープによりその遺伝子のクローニングが行なわれ（（Ｓ
ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ３１３
＋８０３（１９３５） ） 、 （Ｐｅｎｎｉｃａ
ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ３￥２゜７２４
（１９８４）） 、 （Ｈａｎｇ ｅｔ ａｌ、、
５ｃｉｃｎｅ ２２８ 。
１４９ （１９８５）） ）、またウサギＴＮＦ遺伝子
も本発明者らによりクローニングされている（ （Ｉｔ
ｏ ｅｔａｌ、＋ＤＮＡ ５，１４９ （１９８６）
） 、 （Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ、、 ＤＮＡ ５．１
５７（１９８６） ） ）。
も本発明者らによりクローニングされている（ （Ｉｔ
ｏ ｅｔａｌ、＋ＤＮＡ ５，１４９ （１９８６）
） 、 （Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ、、 ＤＮＡ ５．１
５７（１９８６） ） ）。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明の目的は、抗１１！Ｉ！瘍活性を有し医薬用途に
有効な、新規なポリペプチドを提供することである。
有効な、新規なポリペプチドを提供することである。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ラット染色体遺
伝子ライブラリーから、遺伝子組換え手法によりガン細
胞傷害活性を有する新規なポリペプチドを得ることに成
功し、本発明を完成した。
伝子ライブラリーから、遺伝子組換え手法によりガン細
胞傷害活性を有する新規なポリペプチドを得ることに成
功し、本発明を完成した。
本発明は、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
提供する： Ｌ Ｒ５５ＳＱＮＳＳＤＫ ＰＶＡＩＩＶＶＡＮＨ
Ｑ ＡＥＥＱＬＥＷＬＳＱ ＲＡＮＡＬＬＡＮＧＭ
ＤＬＫＤＮＱＬＶＶＰ ＡＤＧＬＹＬＩＹＳＱ Ｖ
ＬＦＫＧＱＧＣＰＤ ＹＶＬＬＴＩＩＴＶＳＲＦＡＩ
ＳＹＱＥＸＶＳ ＬＬＳＡＩＫＳＰＣＰ ＫＤＴＰ
ＥＧＡＥＬＫ ＰＷＹＥＰＭＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧ
ＤＬＬ ５ＡＥＶＮＬＰＫＹＬ ＤＩＴＥＳＧＯＶ
ＹＩ？ ＧＶＩＡＬさらに上記ポリペプチドのアミノ
末端にメチオニンが付加したもの、あるいはアミノ末端
の２アミノ酸（ロイシン−アルギニン）が欠失したもの
も、本発明の提供するポリペプチドに含まれる。
提供する： Ｌ Ｒ５５ＳＱＮＳＳＤＫ ＰＶＡＩＩＶＶＡＮＨ
Ｑ ＡＥＥＱＬＥＷＬＳＱ ＲＡＮＡＬＬＡＮＧＭ
ＤＬＫＤＮＱＬＶＶＰ ＡＤＧＬＹＬＩＹＳＱ Ｖ
ＬＦＫＧＱＧＣＰＤ ＹＶＬＬＴＩＩＴＶＳＲＦＡＩ
ＳＹＱＥＸＶＳ ＬＬＳＡＩＫＳＰＣＰ ＫＤＴＰ
ＥＧＡＥＬＫ ＰＷＹＥＰＭＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧ
ＤＬＬ ５ＡＥＶＮＬＰＫＹＬ ＤＩＴＥＳＧＯＶ
ＹＩ？ ＧＶＩＡＬさらに上記ポリペプチドのアミノ
末端にメチオニンが付加したもの、あるいはアミノ末端
の２アミノ酸（ロイシン−アルギニン）が欠失したもの
も、本発明の提供するポリペプチドに含まれる。
次に本発明は、上記ポリペプチドをコードする塩基配列
を有するＤＮＡを提供する。
を有するＤＮＡを提供する。
さらに本発明は、以下の塩基配列を有するＤＮＡを提供
する： ＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡＡＣＴＣＧＡ
ＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＴＡＧＣＣＣＡＣＧＴＣＧＴ
ＡＧＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧ
ＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧ八ＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣＣＡ
ＡＣＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡ
ＴＣＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＴＡ
ＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＴＡＴＣＴ
ＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＡ
４ＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＣＴＣ
ＡＣＣＣＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＣＧＧＴＴＴＧＣＣＡ
ＴＴＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴ
ＣＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＴＧＣ
ＣＣＴＡ４ＧＧＡＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＣＴＧ
ＡＧＣＴＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴ
ＧＴＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧ
ＧＡＧＡ４ＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧ
ＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＡＧＴＡＣＴＴＡＧＡ
ＣＡＴＣＡＣＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴへＣ
ＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＴＴＧＣＴＣＴＧ上述の本発明の
ポリペプチドは、マウス由来細胞であるＬ−Ｍ細胞（Ａ
ＴＣＣＣＣＬｌ、２）に対する障害活性及びマウスＭｅ
ｔｈ Ａザルコーマに対する腫瘍壊死活性等によって評
価される。尚、後述する組み換え菌体の粗抽出液をその
まま活性測定に用いることもできる。
する： ＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡＡＣＴＣＧＡ
ＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＴＡＧＣＣＣＡＣＧＴＣＧＴ
ＡＧＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧ
ＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧ八ＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣＣＡ
ＡＣＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡ
ＴＣＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＴＡ
ＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＴＡＴＣＴ
ＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＡ
４ＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＣＴＣ
ＡＣＣＣＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＣＧＧＴＴＴＧＣＣＡ
ＴＴＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴ
ＣＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＴＧＣ
ＣＣＴＡ４ＧＧＡＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＣＴＧ
ＡＧＣＴＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴ
ＧＴＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧ
ＧＡＧＡ４ＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧ
ＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＡＧＴＡＣＴＴＡＧＡ
ＣＡＴＣＡＣＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴへＣ
ＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＴＴＧＣＴＣＴＧ上述の本発明の
ポリペプチドは、マウス由来細胞であるＬ−Ｍ細胞（Ａ
ＴＣＣＣＣＬｌ、２）に対する障害活性及びマウスＭｅ
ｔｈ Ａザルコーマに対する腫瘍壊死活性等によって評
価される。尚、後述する組み換え菌体の粗抽出液をその
まま活性測定に用いることもできる。
さらに本発明は、上述のポリペプチドを含有する医薬組
成物を提供する。本発明のポリペプチドを医薬として使
用するには、抗腫瘍効果を発現するのに好適な形態で投
与することが望ましい。
成物を提供する。本発明のポリペプチドを医薬として使
用するには、抗腫瘍効果を発現するのに好適な形態で投
与することが望ましい。
本発明のポリペプチドを単独で投与しても良いが医薬的
に許容しうる希釈剤で希釈しても良い。
に許容しうる希釈剤で希釈しても良い。
このような希釈剤としてはたとえばマンニトール、ヒト
血清アルブミン、グリシン等をあげることができる。本
発明のポリペプチドの投与量は、成人の患者１日当たり
１μｇ以上が望ましいが、人種、性別、年齢、体重、投
与方法、間隔、体調、調剤の種類等により変動するため
、この投与量よりも少なくてもよい。
血清アルブミン、グリシン等をあげることができる。本
発明のポリペプチドの投与量は、成人の患者１日当たり
１μｇ以上が望ましいが、人種、性別、年齢、体重、投
与方法、間隔、体調、調剤の種類等により変動するため
、この投与量よりも少なくてもよい。
本発明の新規ポリペプチド、及びＤＮＡは次の様にして
製造することができる。
製造することができる。
（１） ラットＴＮＦ ｔ”色 ゛ −のクローニン
グラットの染色体遺伝子ライブラリーから、ウサギＴＮ
ＦｃＤＮＡ Ｐｓｔ Ｉフラグメント（ｒｔｏ ｅｔ
ａｔ、。
グラットの染色体遺伝子ライブラリーから、ウサギＴＮ
ＦｃＤＮＡ Ｐｓｔ Ｉフラグメント（ｒｔｏ ｅｔ
ａｔ、。
ＤＮＡ□５ 、１４９ （１９８６）］をブローフ゛と
して、プラークハイブリダイゼーションを行ない、目的
のクローンをスクリーニングする。クローン化したファ
ージＤＮＡを適当な制限酵素で切り出し、ＴＮＦをコー
ドするＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドを得ることが
できる。こうして得られたＤＮＡ断片について、メツシ
ングらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、
９ ＋３０９ （１９８１））によって塩基配列を解析
し、マウスＴＮＦとの比較（Ｓｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ
、、 ＤＮＡユ、 １９３ （１９８Ｂ） ）からＮ末
端部分のアミノ酸配列を決定した（第１図）。
して、プラークハイブリダイゼーションを行ない、目的
のクローンをスクリーニングする。クローン化したファ
ージＤＮＡを適当な制限酵素で切り出し、ＴＮＦをコー
ドするＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドを得ることが
できる。こうして得られたＤＮＡ断片について、メツシ
ングらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、
９ ＋３０９ （１９８１））によって塩基配列を解析
し、マウスＴＮＦとの比較（Ｓｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ
、、 ＤＮＡユ、 １９３ （１９８Ｂ） ）からＮ末
端部分のアミノ酸配列を決定した（第１図）。
勿論、ラットＴＮＦをコードする染色体遺伝子のクロー
ニングにおいて、ヒト、マウス、ウサギの各ＴＮＦのア
ミノ酸配列のホモロジーの高い部分を選び、合成りＮＡ
を用いてスクリーニングしても良い。又、染色体遺伝子
でなく、ウサギと同様（Ｉｔ。
ニングにおいて、ヒト、マウス、ウサギの各ＴＮＦのア
ミノ酸配列のホモロジーの高い部分を選び、合成りＮＡ
を用いてスクリーニングしても良い。又、染色体遺伝子
でなく、ウサギと同様（Ｉｔ。
ｅｔ ａｌ、、 ＤＮＡ ５．１４９ （１９８６）
） 、マクロファージからｍＲＮＡを取得しｃ ＤＮＡ
としても良い。ｃＤＮＡの選択においては、プローブと
して合成りＮＡ 、あるいはヒト、マウス、ウサギの各
ＴＮＦのｃＤＮＡあるいは染色体遺伝子を用いることが
できるが、アフリカッメガエルの卵母細胞を用いた、活
性に基くスクリーニングによっても得ることができる。
） 、マクロファージからｍＲＮＡを取得しｃ ＤＮＡ
としても良い。ｃＤＮＡの選択においては、プローブと
して合成りＮＡ 、あるいはヒト、マウス、ウサギの各
ＴＮＦのｃＤＮＡあるいは染色体遺伝子を用いることが
できるが、アフリカッメガエルの卵母細胞を用いた、活
性に基くスクリーニングによっても得ることができる。
染色体遺伝子の場合は、合成りＮＡを用いるイントロン
の欠失でｃＤＮＡ型にしても良いし、染色体ＤＮＡ断片
と合成りＮＡを用いてｃＤＮＡ型としても良い。
の欠失でｃＤＮＡ型にしても良いし、染色体ＤＮＡ断片
と合成りＮＡを用いてｃＤＮＡ型としても良い。
（２） ポリペプチドをコードするＤＮＡの第１
図に示す塩基配列において、大腸菌での発現に不用なイ
ントロン３ （１７４３番目〜２０２６番目）を合成り
ＮＡ （ＭＥ３４ （５’ −ＣＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧ
ＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＧＧＣ−３′ ） ）を用いて
除去しく５ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ、、ＤＮＡ ７ 、
１９３（１９８８）） 、発現に必要なエクソン３及び
エクソン４を結合する。制限酵素Ｔａｑｌ、 Ｂａｍ１
ｌｌで切り出した後、合成りＮＡでアミノ末端部分をお
ぎない、ｔａｃプロモーターの下流に接続し、発現ベク
ターとする。こうして得られたプラスミドｐＲｔａｃｌ
を用いて、大腸菌ＪＭ１０５株を形質転換し、アンピシ
リン耐性のコロニーから目的とする大腸菌を選択する。
図に示す塩基配列において、大腸菌での発現に不用なイ
ントロン３ （１７４３番目〜２０２６番目）を合成り
ＮＡ （ＭＥ３４ （５’ −ＣＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧ
ＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＧＧＣ−３′ ） ）を用いて
除去しく５ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ、、ＤＮＡ ７ 、
１９３（１９８８）） 、発現に必要なエクソン３及び
エクソン４を結合する。制限酵素Ｔａｑｌ、 Ｂａｍ１
ｌｌで切り出した後、合成りＮＡでアミノ末端部分をお
ぎない、ｔａｃプロモーターの下流に接続し、発現ベク
ターとする。こうして得られたプラスミドｐＲｔａｃｌ
を用いて、大腸菌ＪＭ１０５株を形質転換し、アンピシ
リン耐性のコロニーから目的とする大腸菌を選択する。
本発明の新規ポリペプチドを大腸菌中で発現させるため
のプロモーターとしてはたとえば、ラクトースプロモー
ター系、トリプトファンプロモーター系、大腸菌アルカ
リ性ホスファターゼプロモーター系等があげられるが、
大腸菌で発現するプロモーターであればすべて用いるこ
とができる。
のプロモーターとしてはたとえば、ラクトースプロモー
ター系、トリプトファンプロモーター系、大腸菌アルカ
リ性ホスファターゼプロモーター系等があげられるが、
大腸菌で発現するプロモーターであればすべて用いるこ
とができる。
又、本発明の新規ポリペプチドを酵母で発現させる場合
の酵母ベクターは２ミクロン酵母プラスミドからの複製
起源または、自律的複製配列、プロモーター、本発明の
ポリペプチドをコードするＤＮＡ 、必要であれば翻訳
開始及び停止の為の配列を付し、並びにポリアデニル化
及び転写終止の為の配列及び選択性遺伝子配列を含有す
るものを用いる。
の酵母ベクターは２ミクロン酵母プラスミドからの複製
起源または、自律的複製配列、プロモーター、本発明の
ポリペプチドをコードするＤＮＡ 、必要であれば翻訳
開始及び停止の為の配列を付し、並びにポリアデニル化
及び転写終止の為の配列及び選択性遺伝子配列を含有す
るものを用いる。
又、宿主として動物細胞を用いることもできる。
宿主細胞の例としてはＣＨＯ，ＣＶ−１，ＣＯ３−１，
ＣＯ５−７，Ｃ１２７等が挙げられる。プロモーターと
してはＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモ
ーター等があげられる。選択マーカーとしてはネオマイ
シン耐性遺伝子（Ｎｅｏ） 、デヒドロ葉酸還元酵素（
ＤＩＩＰＲ）などが挙げられる。動物細胞を用いる場合
、本発明のポリペプチドをコードする１）ＮＡのアミノ
末端にいわゆるシグナル配列を接続し、細胞外へ分泌さ
せることも可能である。
ＣＯ５−７，Ｃ１２７等が挙げられる。プロモーターと
してはＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモ
ーター等があげられる。選択マーカーとしてはネオマイ
シン耐性遺伝子（Ｎｅｏ） 、デヒドロ葉酸還元酵素（
ＤＩＩＰＲ）などが挙げられる。動物細胞を用いる場合
、本発明のポリペプチドをコードする１）ＮＡのアミノ
末端にいわゆるシグナル配列を接続し、細胞外へ分泌さ
せることも可能である。
（３） 大ポリペプチドの一１１壱′ｐＲｔａｃｌ
を有するＥ、ｃｏｆｆｉｉを培養し、培養終了後、その
菌体を集めて破砕した後、遠心分離等を行なうことによ
り本発明のポリペプチド含有の粗抽出液を得る。
を有するＥ、ｃｏｆｆｉｉを培養し、培養終了後、その
菌体を集めて破砕した後、遠心分離等を行なうことによ
り本発明のポリペプチド含有の粗抽出液を得る。
このような方法により製造された本発明のポリペプチド
の精製は、ポリペプチドや、蛋白の精製方法として知ら
れる方法を組合わせることによって達成される。
の精製は、ポリペプチドや、蛋白の精製方法として知ら
れる方法を組合わせることによって達成される。
このような方法としては、例えば、高速液体クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーイオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、塩
析、硫安沈澱などを適宜組合せることができる。
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーイオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、塩
析、硫安沈澱などを適宜組合せることができる。
尚、本発明においては以下の略号を使用する。
塩基配列においては、Ａ：アデニン、Ｃ：シトシン、Ｇ
；グアニン、Ｔ：、チミンを表す。
；グアニン、Ｔ：、チミンを表す。
アミノ酸配列においては、Ａ：アラニン、Ｒ：アルギニ
ン、Ｎ：アスパラギン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｃニジス
ティン、Ｑ：グルタミン、Ｅ：グルタミン酸、Ｇニゲリ
シン、Ｈ：ヒスチジン、■：イソロイシン、Ｌ：ロイシ
ン、Ｋ：リジン、Ｍ：メチオニン、Ｆ：フェニルアラニ
ン、Ｐニブロリン、Ｓ：セリン、Ｔニスレオニン、Ｗ：
トリフ゛トファン、Ｙ：チロシン、■：バリンを表す
。
ン、Ｎ：アスパラギン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｃニジス
ティン、Ｑ：グルタミン、Ｅ：グルタミン酸、Ｇニゲリ
シン、Ｈ：ヒスチジン、■：イソロイシン、Ｌ：ロイシ
ン、Ｋ：リジン、Ｍ：メチオニン、Ｆ：フェニルアラニ
ン、Ｐニブロリン、Ｓ：セリン、Ｔニスレオニン、Ｗ：
トリフ゛トファン、Ｙ：チロシン、■：バリンを表す
。
以下、本発明を実施例により説明する。
（実施例）
ラント染色体遺伝子（クローンチック社）２×１０６個
のプラークをウサギＴＮＦ ｃＤＮＡ ｐＢ２−７のＰ
ｓｔＩフラグメント［Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ、、 ＤＮＡ
５．１４９−１５６（１９８６） Ｅをプローブとし
て用い、ハイブリダイゼーションを行ない、３個のポジ
イティブクローンを取得した。このうちの１クローンか
らＤＮＡを取得し、サザン解析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、
Ｊ、Ｍｏ ｌ 、Ｂｉｏ ｌ 、 ９８＋５０３−５１
７（１９７５） ）の結果、ＩＥｃｏＲＩ−Ｂａｍｌｌ
ｌ ３．５ｋｂのフラグメントがラットＴＮＦをコード
する事が判明した。この３．５ｋｂのフラグメントを通
常の方法で平滑末端とし、Ｍ１３ｍｐ１８のＳｍａ Ｉ
サイトにサブクロニングし、ｍｐｌＢ−ＲＥＢと命名し
た。
のプラークをウサギＴＮＦ ｃＤＮＡ ｐＢ２−７のＰ
ｓｔＩフラグメント［Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ、、 ＤＮＡ
５．１４９−１５６（１９８６） Ｅをプローブとし
て用い、ハイブリダイゼーションを行ない、３個のポジ
イティブクローンを取得した。このうちの１クローンか
らＤＮＡを取得し、サザン解析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、
Ｊ、Ｍｏ ｌ 、Ｂｉｏ ｌ 、 ９８＋５０３−５１
７（１９７５） ）の結果、ＩＥｃｏＲＩ−Ｂａｍｌｌ
ｌ ３．５ｋｂのフラグメントがラットＴＮＦをコード
する事が判明した。この３．５ｋｂのフラグメントを通
常の方法で平滑末端とし、Ｍ１３ｍｐ１８のＳｍａ Ｉ
サイトにサブクロニングし、ｍｐｌＢ−ＲＥＢと命名し
た。
実庭貫Ｉ
ポリペプチドの−
〔組換えプラスミドｐＲｔａｃｌの構築〕第２図に示す
ように、ｍｐｌＢ−ＲＵＢの一本鎖ＤＮＡを調整し、イ
ントロン３の欠失に用いた。合成りＮＡ（ＭＥ３４ （
５′−ＣＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧ
ＧＧＣ−３′） ）を用い（Ｇｅｎｅ ５７．１１−
１９． （１９８７） ）の記載に従ってイントロン３
を欠失したｍｐｌＢ−ＲＨＤを作成した。
ように、ｍｐｌＢ−ＲＵＢの一本鎖ＤＮＡを調整し、イ
ントロン３の欠失に用いた。合成りＮＡ（ＭＥ３４ （
５′−ＣＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧ
ＧＧＣ−３′） ）を用い（Ｇｅｎｅ ５７．１１−
１９． （１９８７） ）の記載に従ってイントロン３
を欠失したｍｐｌＢ−ＲＨＤを作成した。
ｍｐｌＢ−ＲＩ＋Ｄの二本鎖ＤＮＡを旧ｎｄｌｌ［で切
り出し、約８４０ｂｐの断片をｐＵｃ１１３にサブクロ
ーニングし、プラスミドｐＲ）（を作製する。ｐＲＨを
Ｔａｑｌ、 Ｂａｍ１ｌｌで切断し約７２０ｂｐの断片
を切り出す。２つの合成りＮＡ（ＭＯ−１：ＧＡＴＣＣ
ＡＴＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡＡＴＴ
、 ＭＵ−１：ＧＴＡＣＧＡＧＴＣＴＡＧＴＡＧＡＡ
ＧＡＧＴＴＴＴＡＡＧＣ）を用い、ＭＯ−１をＡＴＰの
存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化する
。リン酸化したＭＯ−１、ＭＵ−１、約７２０ｂｐの断
片、ＢａｍＨｒ消化したｐｌＪｃ１８をリガーゼ存在下
反応させ、プラスミドｐＲＩ３を得る。
り出し、約８４０ｂｐの断片をｐＵｃ１１３にサブクロ
ーニングし、プラスミドｐＲ）（を作製する。ｐＲＨを
Ｔａｑｌ、 Ｂａｍ１ｌｌで切断し約７２０ｂｐの断片
を切り出す。２つの合成りＮＡ（ＭＯ−１：ＧＡＴＣＣ
ＡＴＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡＡＴＴ
、 ＭＵ−１：ＧＴＡＣＧＡＧＴＣＴＡＧＴＡＧＡＡ
ＧＡＧＴＴＴＴＡＡＧＣ）を用い、ＭＯ−１をＡＴＰの
存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化する
。リン酸化したＭＯ−１、ＭＵ−１、約７２０ｂｐの断
片、ＢａｍＨｒ消化したｐｌＪｃ１８をリガーゼ存在下
反応させ、プラスミドｐＲＩ３を得る。
プラスミドｐＲＢをＢａｍＨＩで切断し、約７６０ｂｐ
の断片をうる。一方プラスミドｐＧｔａｃｌｌｌＯ（Ｓ
ｈｉｒａｉｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ ’３１３．
８０３−８０６．（１９８５） ）をＢｇｆ［、Ｂａｍ
Ｈで切断し、ベクタ一部分をとる。このベクタ一部分と
、約７６０ｂｐの 断片をリガーゼ存在下に反応させ、
目的のプラスミドｐＲｔａｃｌを得る。
の断片をうる。一方プラスミドｐＧｔａｃｌｌｌＯ（Ｓ
ｈｉｒａｉｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ ’３１３．
８０３−８０６．（１９８５） ）をＢｇｆ［、Ｂａｍ
Ｈで切断し、ベクタ一部分をとる。このベクタ一部分と
、約７６０ｂｐの 断片をリガーゼ存在下に反応させ、
目的のプラスミドｐＲｔａｃｌを得る。
工ＩＬＬ
〔新規ポリペプチドの大腸菌による発現〕実施例２工程
１で得られたｐＲｔａｃｌを大腸菌Ｄ１２１０株に導入
し、アンピシリン５０μｇ７ｍｌを含むＩ７培地で一晩
前培養する。これを培地の１／１００になるように新し
い培地に入れ、波長６００ｎｍでの吸光度が０．２から
０．３になる迄、３７°Ｃで培養する。Ｉ ＰＴＧ（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド）を最終濃度
１ｍＭになる様加え、吸光度（６００ｎｍ）が５になる
迄、さらに培養する。培養液を遠心して集菌し、０°Ｃ
で超音波破砕した。得られた破砕液を遠心して、その上
清を得る。
１で得られたｐＲｔａｃｌを大腸菌Ｄ１２１０株に導入
し、アンピシリン５０μｇ７ｍｌを含むＩ７培地で一晩
前培養する。これを培地の１／１００になるように新し
い培地に入れ、波長６００ｎｍでの吸光度が０．２から
０．３になる迄、３７°Ｃで培養する。Ｉ ＰＴＧ（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド）を最終濃度
１ｍＭになる様加え、吸光度（６００ｎｍ）が５になる
迄、さらに培養する。培養液を遠心して集菌し、０°Ｃ
で超音波破砕した。得られた破砕液を遠心して、その上
清を得る。
工１−
〔新規ポリペプチドの精製］
工程２で得られた上清にアンホライ） （ｐ１３−１０
）を最終濃度２％になる様に加え、蒸留水で５０ｍ１に
する。ロトフオア（バイオラッド社、調製用液体等電点
電気泳動装置）にサンプルを充てんし、１２Ｗ定電力に
合せ、約４時間泳動する。サンプルを分取した後、ＳＯ
３−ポリアクリルアミド電気泳動でラットＴＮＦのバン
ドが見えるフラクションを集め、再びロトフオアに充て
んする。同様に約３時間泳動じた後、サンプルを分取す
る。
）を最終濃度２％になる様に加え、蒸留水で５０ｍ１に
する。ロトフオア（バイオラッド社、調製用液体等電点
電気泳動装置）にサンプルを充てんし、１２Ｗ定電力に
合せ、約４時間泳動する。サンプルを分取した後、ＳＯ
３−ポリアクリルアミド電気泳動でラットＴＮＦのバン
ドが見えるフラクションを集め、再びロトフオアに充て
んする。同様に約３時間泳動じた後、サンプルを分取す
る。
これを、ＩＩＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で
精製する。ＤＥＡＥ−５ＰＷ （東ソー社製）で２０
ｍＭＴｒｉｓ−１１Ｃｆｆｉ （ｐＨ８）の溶液下、Ｎ
ａＣｅを０１１から０．３Ｍへ１時間でグラジェントを
かけ、得られたピークをＬ細胞障害活性で同定し、障害
活性を示すピークをセントリコン１０（アミコン社）で
濃縮する。
精製する。ＤＥＡＥ−５ＰＷ （東ソー社製）で２０
ｍＭＴｒｉｓ−１１Ｃｆｆｉ （ｐＨ８）の溶液下、Ｎ
ａＣｅを０１１から０．３Ｍへ１時間でグラジェントを
かけ、得られたピークをＬ細胞障害活性で同定し、障害
活性を示すピークをセントリコン１０（アミコン社）で
濃縮する。
次ニ５ＩＩＯＤＥＸ Ｉｔｓ−８０３Ｆカラム（昭和電
工社製）を用い２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃｊｌ！ （
＋）１１８％ｏ）、１５０ｍＭ ＮａＣＩ！、でゲル
濾過を行ない、Ｌ細胞に障害活性を示す部分を′ａ縮し
、精製品とする。
工社製）を用い２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃｊｌ！ （
＋）１１８％ｏ）、１５０ｍＭ ＮａＣＩ！、でゲル
濾過を行ない、Ｌ細胞に障害活性を示す部分を′ａ縮し
、精製品とする。
この精製品を気相アミノ酸シーケンサ−（アプライドバ
イオシステムズ社製）を用いて、そのアミノ酸配列を調
べたところ、Ｎ末端からのアミノ酸配列は、Ｌｅｕ−Ａ
ｒｇ−３ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｇ Ｉｎ−Ａｓｎ−で
あった。又、本発明で得られる新規ポリペプチドの分子
量を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で測定すると
、約１７，０００を示す。
イオシステムズ社製）を用いて、そのアミノ酸配列を調
べたところ、Ｎ末端からのアミノ酸配列は、Ｌｅｕ−Ａ
ｒｇ−３ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｇ Ｉｎ−Ａｓｎ−で
あった。又、本発明で得られる新規ポリペプチドの分子
量を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で測定すると
、約１７，０００を示す。
要な活性を１単位／戚と定義し、対照の吸光度の５０％
の値に相当する試料の希釈率を力価とした。
の値に相当する試料の希釈率を力価とした。
実施例２で得られた新規ポリペプチドの比活性は、約４
Ｘ １０”ｕ／ ｍｇであった。
Ｘ １０”ｕ／ ｍｇであった。
山峡ら（Ｊａｐａｎ、 Ｊ、 Ｍｅｄ、 Ｓｃｉ、 Ｂ
ｉｏｌ ２９＋ １０５１１８ （１９８６））に記
載の方法に従ってマウス由来細胞り−Ｈ細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬｌ、２）に対する抗腫瘍活性を測定した。検体を
１％のウシ胎児血清を含むイーグルのミニマムエツセン
シャル培地（ＭＥＭ）で希釈した試料１００μｉとＬ−
Ｍ細胞１０５１１８の懸濁液１００ μｒを９６穴のマ
イクロプレート（フロー・ラボラトリ−社）に加えた。
ｉｏｌ ２９＋ １０５１１８ （１９８６））に記
載の方法に従ってマウス由来細胞り−Ｈ細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬｌ、２）に対する抗腫瘍活性を測定した。検体を
１％のウシ胎児血清を含むイーグルのミニマムエツセン
シャル培地（ＭＥＭ）で希釈した試料１００μｉとＬ−
Ｍ細胞１０５１１８の懸濁液１００ μｒを９６穴のマ
イクロプレート（フロー・ラボラトリ−社）に加えた。
これを３７°Ｃ１５％ＣＯ２下、１００％の湿度で４８
時間培養する。その後２０μｌの２５％グルタルアルデ
ヒド液を加え生細胞を固定した。洗浄後、固定化細胞を
１００μｉの０．０５％メチレンブルー液で染色し、洗
浄後２００μｉの０．３３Ｎ塩酸で抽出し、その６６５
ｎｍにおける吸光度を測定した。Ｌ−Ｍ細胞の５０％を
殺す為に必ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹部皮肉に、２ＸＩＯ
’個のメスＡザルコーマ細胞を移植する。７日後、移植
した腫瘍の大きさが直径７〜８［ｌｌｌ１１となり、出
血性壊死がなく良好な血行状態にあるマウスを選び、尾
静脈より生理食塩水で希釈した０、２ ｄの実施例２で
得られた本発明の新規ポリペプチド試料を一匹あたりｌ
Ｘ１０’ｕとなるよう注射し、２４時間後に以下の判定
基準により、判定を行なった。結果を表１に示す。
時間培養する。その後２０μｌの２５％グルタルアルデ
ヒド液を加え生細胞を固定した。洗浄後、固定化細胞を
１００μｉの０．０５％メチレンブルー液で染色し、洗
浄後２００μｉの０．３３Ｎ塩酸で抽出し、その６６５
ｎｍにおける吸光度を測定した。Ｌ−Ｍ細胞の５０％を
殺す為に必ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹部皮肉に、２ＸＩＯ
’個のメスＡザルコーマ細胞を移植する。７日後、移植
した腫瘍の大きさが直径７〜８［ｌｌｌ１１となり、出
血性壊死がなく良好な血行状態にあるマウスを選び、尾
静脈より生理食塩水で希釈した０、２ ｄの実施例２で
得られた本発明の新規ポリペプチド試料を一匹あたりｌ
Ｘ１０’ｕとなるよう注射し、２４時間後に以下の判定
基準により、判定を行なった。結果を表１に示す。
以下 余白
表 １
及びラットＴＮＦ前駆体のアミノ酸配列を示す。
第２図は、プラスミドｐＲｔａｃｌの構築の概念図を示
す。
す。
判定基準：
（−）：変化なし
く＋）：かすかな出血性壊死
（＋）：中程度の出血性壊死
（移植表面の真中から５０％以上にわたって壊死）
（４Ｈ−） 、顕著な出血性壊死
（移植癌の中央部が重度の壊死し、周囲の癌組織がわず
かに残った状態）
かに残った状態）
Claims (6)
- （１）下記のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を有するポリペプチド
- （２）請求項１記載のポリペプチドを有効成分として含
有する抗腫瘍用医薬組成物 - （３）請求項１記載のポリペプチドをコードする塩基配
列を有するＤＮＡ - （４）下記の塩基配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ
- （５）請求項３記載のＤＮＡを有する微生物を培養する
ことにより、請求項１記載のポリペプチドを製造する方
法 - （６）請求項４記載のＤＮＡを、染色体遺伝子ライブラ
リーより取得することにより製造する方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63307751A JPH02157295A (ja) | 1988-12-07 | 1988-12-07 | 新しい抗腫瘍性ポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63307751A JPH02157295A (ja) | 1988-12-07 | 1988-12-07 | 新しい抗腫瘍性ポリペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02157295A true JPH02157295A (ja) | 1990-06-18 |
Family
ID=17972833
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63307751A Pending JPH02157295A (ja) | 1988-12-07 | 1988-12-07 | 新しい抗腫瘍性ポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02157295A (ja) |
-
1988
- 1988-12-07 JP JP63307751A patent/JPH02157295A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3367581B2 (ja) | 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞 | |
| JP4219404B2 (ja) | 新規なアグーティ関連遺伝子 | |
| JPH05500211A (ja) | 造巨核球因子 | |
| JP2002500886A (ja) | Ｉｌ−１８受容体 | |
| TW201107471A (en) | Polypeptides selective for αvβ3 integrin conjugated with a variant of human serum albumin (HSA) and pharmaceutical uses thereof | |
| WO1988005053A1 (fr) | Peptide servant a accelerer l'activation de la proteine c avec de la thrombine | |
| JPH0341096A (ja) | インシュリン様成長因子類の結合蛋白 | |
| JPH11236400A (ja) | モノクローナル抗体，ポリクローナル抗体及び遊離ソマトメジン濃度測定方法 | |
| JPH10262686A (ja) | ポリペプチド | |
| JPH05503512A (ja) | 白血球接着阻害因子としての［ａｌａ ｉｌ―８］↓７↓７ | |
| JP3439490B2 (ja) | 蛋白質とその蛋白質をコードするｄｎａ並びにその蛋白質の製造方法 | |
| US20040009950A1 (en) | Secreted human proteins | |
| JPH11217399A (ja) | クリングル関連クローン、ｈｔｈｂｚ４７ | |
| JPH02157295A (ja) | 新しい抗腫瘍性ポリペプチド | |
| WO2001038522A1 (fr) | Nouveau polypeptide, histone humaine h2a.21, et polynucleotide codant pour ce polypeptide | |
| CN100480264C (zh) | 一种广谱抑制癌细胞生长的蚯蚓蛋白及其编码序列 | |
| WO2009030093A1 (fr) | Fonctions et utilisations de l'inhibiteur 2 de la protéine phosphatase 1 humaine | |
| JP2001500019A (ja) | 顆粒球走化性タンパク質２変異体 | |
| JP3016756B2 (ja) | ヒトｂ細胞分化因子の製造方法 | |
| JPH0219398A (ja) | 新規な抗腫瘍性ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするｄｎａ及び該ポリペプチドを含有する医薬組成物 | |
| JP2899561B2 (ja) | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進するペプチドのシグナル配列 | |
| JP2763026B2 (ja) | ヒトｂ細胞分化因子をコードする遺伝子系 | |
| WO2001032699A1 (en) | Novel human udp-glucose: glycoprotein glucosyltransferase and a polynucleotide encoding the same | |
| WO2001019864A1 (fr) | Polynucleotides codant pour des nouvelles proteines humaines du recepteur de l'angiotensine ii-1, leur procede de preparation et leur utilisation | |
| JPH08271A (ja) | 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物 |