JPH02159562A - 抗原に対してクラス特異的抗体の測定法及びこのために好適な試薬 - Google Patents

抗原に対してクラス特異的抗体の測定法及びこのために好適な試薬

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JPH02159562A JP1276197A JP27619789A JPH02159562A JP H02159562 A JPH02159562 A JP H02159562A JP 1276197 A JP1276197 A JP 1276197A JP 27619789 A JP27619789 A JP 27619789A JP H02159562 A JPH02159562 A JP H02159562A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、体液中のｒｆｃ原に対してクラス％異的抗体
を免疫検定法の原理により、試料溶液金少くトも２種類
のレセプターのＲ１及びＲ２（そのうちＲ１は固定可能
でかつ測定すべき抗体と結合能を有し、Ｒ２ｒｉ：標識
されかつ測定すべき抗体又は測定子ぺさ抗体に特異的な
抗原と結合能を有する）とインキユベートシ、固相を液
相抗体を測定する方法並びに七のために好適な試薬に関
する。
〔従来の技術分野〕
生体は異物の侵入に対する応答として免疫グロブリンと
も呼ばれる抗体上生産する。この免疫グロブリンは、こ
れらのｍｇによって区別される５種類のクラスに分類す
ることができる。
種々の免疫グロブリンのクラスは、生体中にお＾て種々
の役割ｔ″有する。そこで−人免疫に際してはｌｆＭク
ラスの免疫グロブリンが生成されるが、その濃度は感染
が進行するにつれて急速に再度減少する。Ｇクラスの免
疫グロブリンは、−人免疫に際しては、まず緩慢に生成
されるが同一の抗原との２次反応に際しては多量に生成
する。クラスＡの免疫グロブリンは生体の粘膜上皮にお
ける防禦過程を担当する。クラスＥの免疫グロブリンは
、生としてアレルギー反応に６づかる。クラスＤの免疫
グロブリンに関しては、今迄の所では比較的知られてい
ない。
個別の免疫グロブリンクラスは血液中で非常に異った濃
度で存在する。例えば、正常人の血清中の−Ｇ含有ｆは
、８〜１６１１９／ｌの範囲である。１ｇＭクラスの抗
体は血清中に０．５〜２η／ｄの量で含１れる。２番目
に多い免疫グロブリンは、工ｇＡであり、これは、正常
人の血清中に１．４〜４１１９１Ｉｌｌの量で含ｌれて
いる。血清中の工ｇ思の＃度は、最も少く、０．０ＯＬ
１０１７〜０．０００４５ダ／ｄの範囲である。血清中
のｘｇＤの含有量は０〜υ、４ｎ夕／ａの範囲にある。
ところで診断にとっては、ｑＩｆ足の抗原に対して特異
的なｔ＃足の免疫グロブリンクラスの抗体全検出するこ
とがＸ要でめる。それというのもこのようにして、ウィ
ルス、細雌、及び寄生虫感染を夫々鑑別診断することが
可能だからである。殊にＩｇＧ及び工ｇＭ測定は、新し
い及び遠Ａ過云の感染歴の識別並ひに感染の経過の検査
のために好適でろる。特にＢｆｆｌ肝炎、ト中ノプラズ
マールベラ（Ｒｕｂｅｌｌａ　）及びクラξディア（Ｃ
ｈｌａｍｙｃＬｉａ　）感染に際してクラス特異的抗体
が検出されてｈる。
クラス特異的抗体の測定法は周知である。そこで、例え
ば米国特杆（ＵＳ−ＰＳ） 第４．０２０，１５１号明細書には、血清中の工ｇＧｓ
工ｇＡ２及びＩｇＭの濃度の定童広が記載されてｈるが
、この方法ｌこおいては、まず、固体坦体を試料溶畝と
反シロさせ、にｆ：の際工ｇＧ、ＩｇＡ又は工ｇＭは固
相に吸漕される）そｎに続いて夫々の１ｇクラスに対す
る標識された抗体τ加え結合した標＊を評価する。他の
検出系は、Ｗ、Ｄｕｅｒｍｓｙθｒ等によりＴｈｅ　Ｌ
ａｎｃｅｔ　Ｉ工、６８４−６８５に記載されているが
、この場合には特異的免疫グロブリンクラスに対する抗
体を固体坦体に結合させている。試料の添加後、クラス
特異的免疫グロブリンは、この壁に結合し、かつ第二段
階で、測定すべき抗体に特異的な抗原全奈茄し、この抗
原はつづいてこの抗体に結合する。第三段階でこの抗原
に対してｍｍされた抗体七株加し、結合した標識分ｔ−
あらためて測定する。
これらの従来公知のクラス特異的免疫グロブリン測定の
方法は、しかし乍ら満足すべきものではな論、固相の限
定された結合能及び試料中の分析体高濃度に基づき、血
清中ｉｃｉ有される免疫グロブリンクラスの僅か一部分
のみが結合できるにすぎなＸＡ、従って抗原特異的免疫
グロブリンの定量の際に着るしく変動することＶこなる
、それというのも血清中の免疫グロブリンの全含せ孟は
着るしく変動するからである。従って、これらの既知の
方法ケ用いると、捌々の試料中の免疫グロブリンクラス
の抗原特異的免疫グロブリン含有量の等しい際に測足繕
果が異なり極端な場合には実質的にプラスの試料がマイ
ナスとして検出δれるようなことになる。
これらの障害上軽減させるために、例えばＪｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉａｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙｅ　　ｔ　９８６年８月、２８８を９３頁にｔよ、試
料液全稀釈し、続いて測定すべき免疫グロブリンクラス
の抗体金含有する血清と添加し、七の後更に稀釈するこ
とが提案′ごれて匹る。この方法では１：２０００〜１
：２００ＬＪＯの稀釈が必要である。
この強度の稀釈によって、−万では得られる結果の再現
性が問題となるし、他方では、この方法は自動分析器１
（かけることはできないということにもなる。
〔発明が解決しようとする課題〕
従って本発明の課題は、煩雑な試料の準備又は試料の高
度の稀釈が不必要で、かつ僅かな段階で実施することの
可能な、体液中の抗原に対してクラス特異的抗体を定量
的に測定することのでさる方法を提供することで６つ九
。
〔課題′ｆｃ解決する手段〕
この課題は、免疫検定法の原理に従って、試料溶液業少
くと一二捌頌のレセプターＲ１及びＨａ、七の内の妃は
固定可能でかつ測定子べき抗体と結付！＠金葺し又Ｒ２
は襟誠されかつ測定子べさ抗体又は七れの抗原Ａと結合
能を有するこれらのレセプターとインキユベートシ、固
相を液相から分離し、双方の相の一つにおける標識′ｌ
ｃ測足することによジ、体液中の抗原ＡＩＣ対する特定
の免疫グロブリンクラスの抗体上測定する方法によって
解決せられ、これは、免疫反応を均質の相で実施し、試
料溶ｇ、金レセプターＲ１及び測定子べき抗体と等しｈ
免疫グロブリンクラスに所属し抗原人との結合能を有し
ない過剰の人抗体又はそれのフラグメントと同時にイン
キュベートし、それに続りてレセプターＲ２及び場合に
よっては更に他のレセプターｔｍｍすることよりなる。
驚くべきことに本発ＦＪＡＶｃよる方法により、試料を
予備処理する必要なく、クラス特異的抗体を再現可能に
検出することに成功している。本発明による方法は簡単
かつ迅速に実施することが可能である。
本発明によれば、抗ＭＡに対するクラス特異的抗体を、
均質免疫検査法で、即ち免疫反応が均質な相で進行する
方法で測定する。このために、測定子べさ抗体と結合能
企有するレセプタＲ１として、免疫反応の間、均質な相
で存在し、これに続いて固相に固定化される固定化可能
のレセプター全使用する。レセプターＲ１は、従って固
相に結合可能にする分及び他方ではクラス特異的な抗体
との結合全可能にする分を含有する。クラス特異的な抗
体との結合のために、抗体の不変部に対する抗体又はそ
のフラグメント又は七の透導体を用いるのが有利である
。クラスＧの免疫グロブリンを測定すべａ鴫会には、レ
セプターＲ１は、抗工ｇＧ抗体又は七のｔａｂ　フラグ
メントを含有する。固定化のために、レセプターＲ１の
不変部と結合可能なレセプターが固相に固定されてして
よ匹。しかしながら、レセプタ−Ｒ１としては、クラス
特異的抗体と結合可能な部分及び特異的に結合可能な一
対の一方の成分、有利には、ビオチンからなる（１合体
を使用するのが有利でらる。七れから、固相としては特
異的に結合する対の他の成分、株に有利にストレプトア
ビジン（Ｅを；ｒａｐｔａｖｉｃＬｉｎ　）　ＩＩＣＭ
合してｂるマトリックスを使用でさる。固定化は従って
両方の成分同志の結合によって行われる。この結合は異
質同志で行われ、従ってこの免疫反応よりも極めて緩慢
に進行するので、これは、均質相における免疫反応の進
行を妨害しない。他の変法にお＾ては、特異的に結合す
る対の同じ成分、有利にはビオチンが同様にこの固相に
結合することができるが、この際には、固定化のために
、特異的に結合する対の他の成分を加え、これがこの際
固相とレセプターＲ１との間の結合を媒介する。
該方法の実施のために、ｌず、レセプターＲ１及び試料
溶液に、抗原人と結合能を有さなり測定子べき免疫グロ
ブリンクラスの過剰の人クラス特異的抗体又はそのフラ
グメントを添加する。
フラグメントとしては、この際、測定すべき免疫グロブ
リンクラスの？Ｃフラグメント又はＨ鎖抗原決定基を使
用することができる・かくして工ｇＭの検出のためＶＣ
Ｌμ鎖を、工ｇＧの検出のためにはｒ−鎖等を使用する
ことができる。
人のクラス特異的抗体は、試料溶液中で期待される免疫
グロブリンの量に関して２〜１００：１の過剰で使用す
るのが有利である。
有利にｌず、レセプターＲ１及び過剰のクラス特異的抗
体からなる溶液を作る。この際、レセプターＲ１の測定
すべき抗体と結合可能の区分は加えられたクラス特異的
抗体と反応する。
つづいて試料溶液ｔ−添加する。ところで試料溶液中で
不足しているクラス特異的抗体は、過剰に存在する非特
異的抗体を複合体から部分的に排除する。この際この排
除反応は、Ｒ１に対するクラス特異的抗体の活性が小さ
＾程迅速に進行する。従って、Ｒ１に対して５　Ｘ　１
０−１ｌｌノロＯｌ以下の活性ｔ−有するクラス特異的
抗体が有利に使用される。引続くレセプターＲ２の添加
後にｓ　Ｒ１１は測定すべき抗体とレセプターＲ１とか
らの複合体に結合する。固定化後に、結合した標繊分は
周知の方法で測定でき、かつ試料溶液中のクラス特異的
抗体量に関する直接の尺度でおる。
加えられたクラス特異的抗体の童は１要ではない。七の
量は、通常、血清中のこのクラスの免疫グロブリンに対
して期待され得る上限の値の少くとも２倍の大きさであ
るべきである。従って、期待される免疫グミプリン量に
対して２：１〜１００　：　１の過剰が有利でろる。１
００倍以上の過剰の場合には、それ以上の改善は与られ
ないので、これ以上の過剰は不経済である。
二番口のレセプターとして、標識されたレセプターが使
用される。標識は公知の方法で行われ、放射性のアイソ
トープ、化学発光又は螢光物質、色素生成物質又は酵巣
であってよい。これらの標ｗｔを検出するための方法は
、同様に周知でらり詳細に説明する１でもない。レセプ
タＨ２は測定子べき抗体と又はこの抗体に対して特異的
な抗原と結合可能である。これの最初の変法では、レセ
プターＲ２として、周知の方法で標識されてｈる測定す
べき抗体に対して特異的な抗原を使用するのが有利であ
る。もう１つの他の変法にお論ては、レセプターＲ２と
して、測定すべき抗体に対して特異的抗原にむけられた
抗体又はそのフラグメントラ使用するのが有利である。
抗体は、その際、モノクロナール又はポリクロナールで
あってよい。この第２の実施形にお＾ては、この測定に
対して測定すべき抗体及びＲ２と特異的に結合可能の１
ｌｌｌｌｌ［であるも５１つのレセプターＲ３が必要で
６．６゜１３ｑ測定すべき抗体に対して特異的な抗Ｗを
含有することが特に重要である。この抗原が測定子べき
抗体及びレセプターＲ２に対する結合部位（エピトープ
〕を有するならは、この抗原を直接Ｒ３として使用可能
でｂる。
発明による方法の実施に対して、試料溶液をまず、レセ
プターＲ１及び過剰のクラス特異的抗体とインキュベー
トし、りづＡてレセプターＲ２ｔ−添加する。レセプタ
ーＲ３の使用されるこの変法においては、Ｒ”ｔレセプ
ターＲ２の添加の前に試料溶液に添加する。
二個のレセプターのみ必要とし、その結果として反応が
２つの段階で実施できそれによって自動分析器にかける
ことの可能な本発明法の実施形式は殊に有利である。
この免疫反応は、均質な相で行われるが、これは、均質
な反応がより迅速にかつ再現性をもって進行するので、
極めて有益である。
本発明の対象は、体液中の成る抗原に対して合可能なレ
セプター１１及び抗原Ａと結合することの７′きない過
剰の人クラス特異的抗体及び溶液２として、標識さｉｔ
かつ抗原Ａ、を有するレセプターＲ３七會有゛する。
もう１つの他の変法では、木兄Ｅ３Ａによる試薬は、溶
液１としてレセプター・Ｒ１，ｌ！：過剰の人クラス特
異的抗体との混合物、Ｂ液２として標識さル抗原ＡＫ：
対する抗体金含有するレセプターＲ２及び浴１ｇｉ、Ｒ
３として抗原Ａ全方するレセプタＲ３を含有する。
このに法において、レセプターＲ３ｒｌ　少＜　１！：
も特異的Ｍ合能金せする抗体に対して又レセプターＲ”
　Ｋ対し−Ｃ夫々１１固の結合部位を有すべきで必る。
従って１７セプターＲ３ＶＣ対して、自身多価の抗原が
使用されるか又は−愉の一つの抗原に対して一つの抗体
が検出されるべき場合には、ｌ／セグターＲ３ｆｃ対し
てポリマー・の形の抗原が使用される。このために、こ
の抗原は、例え、ば’ＲＩ’ｔＡ、（ウシ血清アルブミ
ン〕、ラデックス又はマイクロキャリアの如き坦体に結
合し又は交差網状に結合して匹てよい。このための方法
は専門家に周知である。
有利な実施形では、試薬の溶液２及び３企前もって混合
することができる。本ｔｌｃ薬鉱、従って溶液１として
レセプターＨ１と過剰の人クラス特異的抗体との混合物
、及び溶液２として、標Ｒされ、抗ｉＡに対する抗体を
含［７るレセプターＲ１及び抗原ｈ＜有するレセプター
Ｒ３ｔ−含存する。
本試薬は、試料溶液中における免疫グロプリ＼ ンの期待ｔｌｆｃ対して人り２ス％Ａ的抗体の２−１０
０倍量が反応溶液中ｉｃ存在する程度の過剰に人クラス
特異的抗体を含有する。更に、試別・１０μｌを試薬１
．Ｉｌｌに加える場合の試薬は、１１につき抗体２０〜
２０００ｒｖ金含有するのが有利である。
本発明による試薬は、２もしくは３′ａの別々の溶液の
中にククスｑ＃異的抗体の？１１Ｊ定の几めに必要な成
分を含有する。溶液は、物理的に互に分離して保存しか
つ測定に際しては順時に試料溶液ｔインキュベ〜トする
。本済液は貯Ｒに安定である。
〔実施例〕
本発明金欠の例によって詳述する。
例　　１ 血清中の免疫グロブリンクラスＭのＫ　−ＥＢａＡｇ抗
体（Ａｎｔ：Ｌ−ＨＪ３ｃＡｇ−Ａｎｔ：１ｋｏｅｒ　
ｐ＠ｒ　）　Ｙｚ測測定た。
このために−固相としてストレプトアピーン（８ｔｒｅ
ｐｔａｖｉ、ｃｌｊ、、ｎ）で被覆された小管ｌｅ用ｔ
。
た。Ｃの小管中に試料１０μｉ−次の組成の試薬１００
０μ影と共に入れた二 試薬１：燐酸緩衝液ＣｐＨ７，［］　）　４　Ｏｍｍｏ
ｊ／ｌ、グ／ｌ／　＊　二ｙりＣＰｌｕｒｏｎｉａ　）
　？　６８　０．５チ、牛血τにアルプｉン０．２チ、
石炭酸０００１チ、ＨＢｃＡｇと酵合紺のなり人工ｇＭ
４０　”？　／　Ｊ　ｓ　　ビオチンと結合した工ｇＭ
に対するモノクロナール抗体２　Ｑ　／　ｌ。
インキュベー７ヨ／は、室温で６０分間行つた。水で３
回洗った後、次の組成のに薬１４盆加えた／　： 試薬２：燐虐緩Ｗｉｇ（１”７．０）４０ｍｍｏＪ／ｌ
、牛血清アルブミン０．２チ、石炭酸Ｕ、ｌＩＩ　１チ
、ヘパチテスコア抗ｍ　（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｏｒ
ｅ　）　７５Ａｉ／！１．、−ｖニックＣ１ｔ　−ｋ　
Ａｎｔｉ−）ＩＢａＡｇ−抗体及びペルオキシダーゼか
らなる複合体２５Ｕ／Ｊ。
２０〜２２℃で６０分間インキ−。ベートし、水で６回
洗ってからＡＢＴＳ　溶液１１１ｔｔ−基質として加え
た。吸光度金−時間彼４　Ｑ　５　ｎｍで測定（ハ検童
曲顧により評価した。結果は久異から構成される装置 オチン結合モノクａナール抗体の代りにビオチン結合の
ポリクロナール抗人工座抗体を試薬１中で使用した。評
価は例１の記載と同様に行った。
例　　３ Ｊｌｌｌｌｆｆ中の１８Ｍクラスの抗−ＨＢＯＡｇ抗体
を例１記載と同様にして検出したがこの際には、Ｋ薬２
に抗体ＰＯＤ−複合体及び血清肝炎コア抗原の代りに、
　ＨＢｃＡｇ及びベルオキダーゼからなる腹合体を使用
した。評価は例ＩＫ記載の如くに行なった。
ｌ）平均［： ２）平均１１ｔ　： 例　　２

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、免疫検定法の原理に従つて、試料溶液を少くとも２
    種類のレセプターのＲ＾１及びＲ＾２（その内のＲ＾１
    は固定化可能でかつ測定すべき抗体と結合能を有しＲ＾
    ２は標識されておりかつ測定すべき抗体又は抗原Ａと結
    合能を有する）これらのレセプターと共にインキュベー
    トし、固相を液相から分離し、かつ双方の相の一種にお
    ける標識を測定することにより特定の免疫グロブリンク
    ラスの抗体を測定する場合に、該免疫反応を均質相で実
    施しかつ、試料溶液をレセプターＲ＾１及び測定すべき
    抗体と同じ免疫グロブリンクラスに所属しかつ抗原Ａと
    結合能を有しない過剰の人抗体又はそれのフラグメント
    と同時にインキュベートし、続いてレセプターＲ＾２及
    び場合によつては更に他のレセプターを添加することを
    特徴とする、特定の免疫グロブリンクラスの抗体を測定
    する方法。 ２、レセプターＲ＾２として標識及び抗原Ａからなる複
    合体を使用する請求項１記載の方法。 ３、レセプターＲ＾２として、抗原Ａに対する抗体及び
    標識からの複合体及びレセプターＲ＾３として抗原Ａを
    使用する、請求項１又は２記載の方法。 ４、溶液１として、固定可能でありかつ測定すべき抗体
    と結合能を有するレセプターＲ＿１と抗原Ａと結合能を
    有しない過剰の人クラス特異的抗体との混合物及び溶液
    ２として標識され、かつ抗原ＡをもつレセプターＲ＾２
    を含有する、請求項１から３までのいずれか１項に記載
    の特定の免疫グロブリンクラスの抗体を測定するための
    試薬。 ５、溶液１としてレセプターＲ＾１と過剰の人クラス特
    異的抗体との混合物を含有し、溶液２として標識されか
    つ抗原Ａに対する抗体を包含するレセプターＲ＾２を含
    有し、溶液３として抗原Ａを有するレセプターＲ＾３を
    含有する請求項４記載の試薬。 ６、溶液１として、レセプターＲ＾１と過剰の人クラス
    特異的抗体との混合物及び溶液２として標識されかつ抗
    原Ａに対する抗体を含有しかつ、抗原Ａを有するレセプ
    ターＲ＾３を含有することを特徴とする請求項４記載の
    試薬。
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