JPH02167075A - バンパイアバット唾液プラスミノーゲン賦活体 - Google Patents
バンパイアバット唾液プラスミノーゲン賦活体Info
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- JPH02167075A JPH02167075A JP1188673A JP18867389A JPH02167075A JP H02167075 A JPH02167075 A JP H02167075A JP 1188673 A JP1188673 A JP 1188673A JP 18867389 A JP18867389 A JP 18867389A JP H02167075 A JPH02167075 A JP H02167075A
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
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- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
パンパイアバツトもしくは吸血コラモリ（Ｖａｍｐｉｒ
ｅｂａｔ ）は犠牲動物を負傷させることによって得る
新鮮器の食餌に絶対的に依存している。これらの傷は表
面的なものであるが数時間血液の滲出が続く。
ｅｂａｔ ）は犠牲動物を負傷させることによって得る
新鮮器の食餌に絶対的に依存している。これらの傷は表
面的なものであるが数時間血液の滲出が続く。
デスモダス ロタンダス（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ ｒｏｔｕ
ｎｄｕｓ）の吸血コラモリ唾液成分は研究されており、
哺乳類血液の止血機序を３種の異なったレベルで妨害す
ることが明らかにされている。これらは血小板凝集を阻
害し、プラスミノーゲンを賦活化することが示されてい
る（ホーキー、Ｃ，Ｍ、ネイチュア第２１１巻、４３４
頁（１９６６年）及びホーキー、Ｃ，Ｍ、 Ｂｒ、 Ｊ
、ｌｌａｅｍａｔｏＬ第１３巻、１０１４頁（１９６７
年））。これらの活性の各々は異種のタンパク質フラク
ションと関連がある。プラスミノーンを賦活化させるフ
ラクションは、“デスモキナーゼパと名付けられている
（ホーキー、Ｃ６門、ネイチュア）。カートライト、Ｔ
、血液にはデスモダス唾液から得られたデスモキナーゼ
の精製が記載されており、予め形成されている血餅（ｃ
ｌｏｔ）の溶解にウロキナーゼ（ＵＫ）やストレプトキ
ナーゼより有効であることが示唆されているシ組織型（
ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ）プラスミノーゲン賦活体（
ｔＰＡ）の血、栓溶解剤としての用途は、深刻な出血合
併症、比較的頻繁に起こる再閉塞、均一に有効でないこ
と、プラスミノーゲン賦活体阻害剤、例えばタイプ１プ
ラスミノーゲン賦活体阻害剤（ＦＡＩ−１）による不活
化に対する感受性を含む多くの欠点によって取り巻かれ
ている（ロスクトフ、セミナース イン トロンボシス
アンド へモスタシス、第１４巻１ｋｌ （１９８
８年））。
ｎｄｕｓ）の吸血コラモリ唾液成分は研究されており、
哺乳類血液の止血機序を３種の異なったレベルで妨害す
ることが明らかにされている。これらは血小板凝集を阻
害し、プラスミノーゲンを賦活化することが示されてい
る（ホーキー、Ｃ，Ｍ、ネイチュア第２１１巻、４３４
頁（１９６６年）及びホーキー、Ｃ，Ｍ、 Ｂｒ、 Ｊ
、ｌｌａｅｍａｔｏＬ第１３巻、１０１４頁（１９６７
年））。これらの活性の各々は異種のタンパク質フラク
ションと関連がある。プラスミノーンを賦活化させるフ
ラクションは、“デスモキナーゼパと名付けられている
（ホーキー、Ｃ６門、ネイチュア）。カートライト、Ｔ
、血液にはデスモダス唾液から得られたデスモキナーゼ
の精製が記載されており、予め形成されている血餅（ｃ
ｌｏｔ）の溶解にウロキナーゼ（ＵＫ）やストレプトキ
ナーゼより有効であることが示唆されているシ組織型（
ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ）プラスミノーゲン賦活体（
ｔＰＡ）の血、栓溶解剤としての用途は、深刻な出血合
併症、比較的頻繁に起こる再閉塞、均一に有効でないこ
と、プラスミノーゲン賦活体阻害剤、例えばタイプ１プ
ラスミノーゲン賦活体阻害剤（ＦＡＩ−１）による不活
化に対する感受性を含む多くの欠点によって取り巻かれ
ている（ロスクトフ、セミナース イン トロンボシス
アンド へモスタシス、第１４巻１ｋｌ （１９８
８年））。
血栓溶解療法に起因する出血合併症は、循環プラスミノ
ーゲンの賦活化によって少なくとも悪化させていると思
われる。ｔＰＡのフィブリン結合能は、フィブリン結合
プラスミノーゲンよりもその著しい基質に原因があると
考えられる。しかし、理論的考察及び臨床の結果は、血
餅の急速な溶解に必要とされる高レベルのｔＰＡもまた
かなりの量の循環プラスミノーゲンの賦活化を生じるこ
とが示された。
ーゲンの賦活化によって少なくとも悪化させていると思
われる。ｔＰＡのフィブリン結合能は、フィブリン結合
プラスミノーゲンよりもその著しい基質に原因があると
考えられる。しかし、理論的考察及び臨床の結果は、血
餅の急速な溶解に必要とされる高レベルのｔＰＡもまた
かなりの量の循環プラスミノーゲンの賦活化を生じるこ
とが示された。
更にその上、ｔＰＡと血漿阻害剤の相互作用が注入中及
び注入後にＬＰＡの機能活性を減少させ、これが、再閉
塞の原因となるかもしれないと思われる。
び注入後にＬＰＡの機能活性を減少させ、これが、再閉
塞の原因となるかもしれないと思われる。
ｔ、ＰＡの血栓溶解剤としての用途に付随するほかの欠
点は、ｔＰＡの必要とされる服用型が１００〜１５０■
と多量でありこの治療法を非常に高価にさせることであ
る。
点は、ｔＰＡの必要とされる服用型が１００〜１５０■
と多量でありこの治療法を非常に高価にさせることであ
る。
我々はフィブリン結合プラスミノーゲンに対して更に著
しい選択性を示し、従って血栓溶解療法に用いたときに
出血素質の重篤度と頻度の減少に関係させることができ
るデスモダスロツンダス唾液及び唾液腺に存在するプラ
スミノーゲン賦活体を見い出した。更にその上、この賦
活化因子は血漿阻害剤例えばＰＡＩ−１によって容易に
不活化されず、従って再閉塞の頻度の減少に関係させる
ことができる。
しい選択性を示し、従って血栓溶解療法に用いたときに
出血素質の重篤度と頻度の減少に関係させることができ
るデスモダスロツンダス唾液及び唾液腺に存在するプラ
スミノーゲン賦活体を見い出した。更にその上、この賦
活化因子は血漿阻害剤例えばＰＡＩ−１によって容易に
不活化されず、従って再閉塞の頻度の減少に関係させる
ことができる。
本発明の目的は、安全性及び効能の両方に関してｔＰＡ
よりも優れた繊維素溶解剤を提供することである。
よりも優れた繊維素溶解剤を提供することである。
また本発明の目的は、本発明のタンパク質をエンコード
するＤＮＡ配列を同定し、この配列を組織由来ｃＤＮＡ
から作り、この配列を発現ベクターに実施上挿入させる
ことである。
するＤＮＡ配列を同定し、この配列を組織由来ｃＤＮＡ
から作り、この配列を発現ベクターに実施上挿入させる
ことである。
また本発明の目的は、タンパク質を産生ずるために発現
ベクターによって形質転換された宿主微生物又は真核細
胞から本発明のタンパク質を産生ずることである。
ベクターによって形質転換された宿主微生物又は真核細
胞から本発明のタンパク質を産生ずることである。
また本発明の目的は、本発明のタンパク質に反応性の抗
体を生産することである。
体を生産することである。
本発明は、デスモダスロッンダス唾液及び唾液腺から得
られた又は誘導された精製又は一部端製プラスミノーゲ
ン賦活化タンパク質、吸血コウモリデスモダスロツンダ
ス唾液及び唾液腺からタンパク質を精製する方法、これ
らのタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列、組換え体
ＤＮＡ方法を用いる生産子゛段、これらのタンパク質と
特異的に反応する抗体及び本発明のタンパク質を包含し
ているフィブリン結合プラスミノーゲンを賦活化するた
めの薬薬組成物を含む。
られた又は誘導された精製又は一部端製プラスミノーゲ
ン賦活化タンパク質、吸血コウモリデスモダスロツンダ
ス唾液及び唾液腺からタンパク質を精製する方法、これ
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ＤＮＡ方法を用いる生産子゛段、これらのタンパク質と
特異的に反応する抗体及び本発明のタンパク質を包含し
ているフィブリン結合プラスミノーゲンを賦活化するた
めの薬薬組成物を含む。
吸血コラモリ唾液及び唾液腺から単離されるタンパク質
プラスミノーゲンｌｉｔ：油体は、いくつかの構造及び
機能基準によりｔＰＡ及びウロキナーゼの両方と異なっ
ている。ｔＰＡと異なり、本発明のプラスミノーゲン賦
活体は、クリングル２ドメイン及びプラスミン惑受性処
理部位を含んでいない。予め形成されている血漿凝塊を
溶解する触媒能を監視する場合、これらの賦活体とｔＰ
Ａは等モル量が同様に有効である。プラスミノーゲンに
対する活性は、フィブリン補因子の存在下で少なくとも
２７，０００倍に刺激される。ｔＰＡに対するこの対応
値はわずか２０５倍である。ｔ−ＰＡの全長、フィンガ
ーマイナス及びフィンガーＥＧＦマイナス形に対応する
３種の異なった物質が吸血コラモリ唾液から分離されて
いる。これらは、各々Ｂａｔ−ＰＡ（Ｉｆ）、Ｂａｔ−
ＰＡ（［）及びＢａｔ−ＰＡ（Ｌ）と呼ばれる。以下“
Ｂａｔ−ＰＡ”に対する言及は３種の分子形７）Ｈｔ、
■及びＬを含む分別されていない生成物に相当する。全
長物質は、他の２種と異なりフィブリンにしっかりと結
合する。Ｂａｔ−ＰＡ（Ｈ）、ＢａｔＰへ（１）及びＢ
ａｔ−ＰＡ（Ｌ）は、ジチオトレイトールの存在下ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで測定した場合各々Ｍｒ値４９．４２及び
４０ＫＯを示す（第１図、レーンｌ）。Ｂａ ｔ−ＰＡ
（ＩＩ）、Ｂａｔ−ＰＡ（１）及びＢａｔ−ＰＡ（Ｌ
）の脱グリコシル化形態（Ｎ一連鎖炭水化物鎖をエンド
グリコシダーゼＦで除去することにより得られる）の見
掛けのＭｒ値はＳＤＳ−ＰＡＧ、Ｅで測定した場合各々
４４．４０及び３８にＤである（第１図、レーン２）。
プラスミノーゲンｌｉｔ：油体は、いくつかの構造及び
機能基準によりｔＰＡ及びウロキナーゼの両方と異なっ
ている。ｔＰＡと異なり、本発明のプラスミノーゲン賦
活体は、クリングル２ドメイン及びプラスミン惑受性処
理部位を含んでいない。予め形成されている血漿凝塊を
溶解する触媒能を監視する場合、これらの賦活体とｔＰ
Ａは等モル量が同様に有効である。プラスミノーゲンに
対する活性は、フィブリン補因子の存在下で少なくとも
２７，０００倍に刺激される。ｔＰＡに対するこの対応
値はわずか２０５倍である。ｔ−ＰＡの全長、フィンガ
ーマイナス及びフィンガーＥＧＦマイナス形に対応する
３種の異なった物質が吸血コラモリ唾液から分離されて
いる。これらは、各々Ｂａｔ−ＰＡ（Ｉｆ）、Ｂａｔ−
ＰＡ（［）及びＢａｔ−ＰＡ（Ｌ）と呼ばれる。以下“
Ｂａｔ−ＰＡ”に対する言及は３種の分子形７）Ｈｔ、
■及びＬを含む分別されていない生成物に相当する。全
長物質は、他の２種と異なりフィブリンにしっかりと結
合する。Ｂａｔ−ＰＡ（Ｈ）、ＢａｔＰへ（１）及びＢ
ａｔ−ＰＡ（Ｌ）は、ジチオトレイトールの存在下ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで測定した場合各々Ｍｒ値４９．４２及び
４０ＫＯを示す（第１図、レーンｌ）。Ｂａ ｔ−ＰＡ
（ＩＩ）、Ｂａｔ−ＰＡ（１）及びＢａｔ−ＰＡ（Ｌ
）の脱グリコシル化形態（Ｎ一連鎖炭水化物鎖をエンド
グリコシダーゼＦで除去することにより得られる）の見
掛けのＭｒ値はＳＤＳ−ＰＡＧ、Ｅで測定した場合各々
４４．４０及び３８にＤである（第１図、レーン２）。
これらのタンパク質はフィブリン補因子の存在及び血漿
凝塊を溶解する著しい触媒能に厳しい要件を示す。フィ
ブリン結合プラスミノーゲンに対するこれらのタンパク
質の選択性機序は、フィブリンの直接結合及びフィブリ
ン凝塊の存在下で除去されるＮａＣｌによる強力な阻害
を含むいくつかの要因の結果である。更にその上吸血コ
ウモリプラスミノーゲン賦活体は、血漿中に存在する阻
害剤による不活化に対してｔＰＡより怒受性が低い。
凝塊を溶解する著しい触媒能に厳しい要件を示す。フィ
ブリン結合プラスミノーゲンに対するこれらのタンパク
質の選択性機序は、フィブリンの直接結合及びフィブリ
ン凝塊の存在下で除去されるＮａＣｌによる強力な阻害
を含むいくつかの要因の結果である。更にその上吸血コ
ウモリプラスミノーゲン賦活体は、血漿中に存在する阻
害剤による不活化に対してｔＰＡより怒受性が低い。
デスモダスロツンダス唾液から誘導される“全長”グリ
コプロティンプラスミノーゲン賦活体（Ｂａｔ−ＰＡ（
ＩＩ））のｃＤＮＡから予期されるアミノ酸配列は次の
通りである。
コプロティンプラスミノーゲン賦活体（Ｂａｔ−ＰＡ（
ＩＩ））のｃＤＮＡから予期されるアミノ酸配列は次の
通りである。
Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａ
ｒｇ−＾ｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅ
ｔ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ
−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−Ｐｒ。
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ｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
−Ｃｙｓ−旧５−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＶａｌＬｙ
ｓ −５ｅｒ−Ｃｙｓ −５ｅｒ−Ｇ １ｕ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇ １ｙ−Ｇ １ｙ
Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−＾１ａ−Ａｌａ−５
ｅｒ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−＾５ｐ−Ｐｈｅ−ＶａｌＣｙｓ
−Ｇ Ｉｎ−Ｃｙｓ −Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇ ｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇ ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇ Ｉｎ−Ｃｙｓ
Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−１１ｉｓ−＾１ａ−
Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎｃｒ
ｙ−Ｖａ ｌ −Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇ Ｉｙ−
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇ １ｕ−
５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−１１ｅ−Ａ
ｓｎ−Ｔｒｐ−八ｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＬｅｕＬｅｕ
−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−
Ｇｌｙ−＾ｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−ＡｓｐＡｌａ−１１
ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−八ｓｎ
−１１ｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＣｙｓＡｒｇ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−ＴｙｒＶａｌ−１ｉｅ−Ｌｙｓ
−＾１ａ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＣｙｓＳｅｒ−シａｔ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ
−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ −Ｌｙｓ
−Ｇ ｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｆ ｉｓ
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Ｔｈｒ−＾ｓｐ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−１１ｉｓ−
Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐ
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ｒ−３ｅｒ−ＧｌｙＧｌｕ−＾ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−
Ｃｙｓ−Ｇｌ ｙ−Ｇ ｌｙ−Ｉ ｌｅ−Ｌｅｕ−１１
ｅ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓ −Ｔｒｐ−Ｖａ ｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ａ ｌａ−Ａｌａ−）１ ｉｓ−Ｃｙｓ
−Ｐｈｅ−Ｇ ｌｎ−Ｇ ｌｕＡｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−シａｌ−
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ｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
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ｌ−Ｇ １ｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｖａ ｌ−
ＩＩ １ｓ−Ｇ １ｕ−Ｇ １ｕ−Ｐｈｅ−八ｓｐ−＾
５ｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓ
ｐ−１１ｅ−Ａｌａ−ＬｅｕＬｅｕ−Ｇ Ｉｎ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｇ １ｙ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇ １
ｎ−Ｃｙｓ−Ａ １ａ−Ｇ ＩｎＧ ｌ ｕ−５ｅｒ−
Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｖａ ｌ−Ａｒｇ−Ａ ｌａ−１１ｅ
−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｕＡ ｌａ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ｇ ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ
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−Ｇ １ｙ−Ｔｙｒ−Ｇ ｌｙ−Ｌｙｓ−ｉｆ １ｓ−
Ｌｙｓ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ −Ｐｈｅ−
Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−シａｌ−ＡｒｇＬｅｕ −Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
−５ｅｒ−Ｌｙｓ −ｒ’ｈｅ−Ｌｅｕ −Ｐｈｅ−Ａ
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１１ｉｓ−Ｐｒｏ−＾５ｎ−Ｖａ１１１ｉｓ−八ｓｐ−
＾１ａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−＾ｓｐ−５ｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＬｅｕＶａｌ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ
−Ａｓｎ−へ５ｐ−Ａｓｎ−旧ｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｅｕ−、Ｌｅｕ−ＧｌｙＩ １ｅ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｔ
ｒｐ−Ｇ ｌ ｙ−Ｖａｌ−Ｇ １ｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｇ １ ｕ−Ｌｙｓ −Ａｓｐｌｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−シａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＬｅｕＧｌｙ−Ｔｒｐ−１１ｅ−
Ａｒｇ−八ｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ−Ｐｒ。
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ｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
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Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇ １ｙ−Ｇ １ｙ
Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−＾１ａ−Ａｌａ−５
ｅｒ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−＾５ｐ−Ｐｈｅ−ＶａｌＣｙｓ
−Ｇ Ｉｎ−Ｃｙｓ −Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇ ｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇ ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇ Ｉｎ−Ｃｙｓ
Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−１１ｉｓ−＾１ａ−
Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎｃｒ
ｙ−Ｖａ ｌ −Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇ Ｉｙ−
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇ １ｕ−
５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−１１ｅ−Ａ
ｓｎ−Ｔｒｐ−八ｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−ＬｅｕＬｅｕ
−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−
Ｇｌｙ−＾ｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−ＡｓｐＡｌａ−１１
ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−八ｓｎ
−１１ｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＣｙｓＡｒｇ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−ＴｙｒＶａｌ−１ｉｅ−Ｌｙｓ
−＾１ａ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＣｙｓＳｅｒ−シａｔ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ
−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ −Ｌｙｓ
−Ｇ ｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｆ ｉｓ
−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇ １ｙＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
Ｔｈｒ−＾ｓｐ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−１１ｉｓ−
Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−八ｒｇ−Ｓｅ
ｒ−３ｅｒ−ＧｌｙＧｌｕ−＾ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−
Ｃｙｓ−Ｇｌ ｙ−Ｇ ｌｙ−Ｉ ｌｅ−Ｌｅｕ−１１
ｅ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓ −Ｔｒｐ−Ｖａ ｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ａ ｌａ−Ａｌａ−）１ ｉｓ−Ｃｙｓ
−Ｐｈｅ−Ｇ ｌｎ−Ｇ ｌｕＡｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−シａｌ−
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−へｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａ
ｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇ １ｕ−Ｖａ
ｌ−Ｇ １ｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｖａ ｌ−
ＩＩ １ｓ−Ｇ １ｕ−Ｇ １ｕ−Ｐｈｅ−八ｓｐ−＾
５ｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓ
ｐ−１１ｅ−Ａｌａ−ＬｅｕＬｅｕ−Ｇ Ｉｎ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｇ １ｙ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇ １
ｎ−Ｃｙｓ−Ａ １ａ−Ｇ ＩｎＧ ｌ ｕ−５ｅｒ−
Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｖａ ｌ−Ａｒｇ−Ａ ｌａ−１１ｅ
−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｕＡ ｌａ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ｇ ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ
−Ｔｈｒ−Ｇ １ｕ−Ｃｙｓ−Ｇ １ｕＬｅｕ−５ｅｒ
−Ｇ １ｙ−Ｔｙｒ−Ｇ ｌｙ−Ｌｙｓ−ｉｆ １ｓ−
Ｌｙｓ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ −Ｐｈｅ−
Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−シａｌ−ＡｒｇＬｅｕ −Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
−５ｅｒ−Ｌｙｓ −ｒ’ｈｅ−Ｌｅｕ −Ｐｈｅ−Ａ
ｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−＾ｓ
ｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−１１ｅ−
１１ｉｓ−Ｐｒｏ−＾５ｎ−Ｖａ１１１ｉｓ−八ｓｐ−
＾１ａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−＾ｓｐ−５ｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＬｅｕＶａｌ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ
−Ａｓｎ−へ５ｐ−Ａｓｎ−旧ｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｅｕ−、Ｌｅｕ−ＧｌｙＩ １ｅ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｔ
ｒｐ−Ｇ ｌ ｙ−Ｖａｌ−Ｇ １ｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｇ １ ｕ−Ｌｙｓ −Ａｓｐｌｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−シａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＬｅｕＧｌｙ−Ｔｒｐ−１１ｅ−
Ａｒｇ−八ｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ−Ｐｒ。
Ｂａｔ−ＰＡ（Ｉ（）はアミノ酸配列１〜４４１を含み
第８ａ図に示される。Ｂａｔ−ＰＡ（１）は、アミノ酸
配列１〜３及び５０〜４４１を含み、第８ａ図に示され
、Ｂａｔ−ＰＡ（Ｌ）はアミノ酸配列１〜３及び８７〜
４４１を含み、第８ａ図に示される。更にその上８８位
のアミノ酸はトレオニンからタンパク質“Ｌ″のプロリ
ンに変えられる。
第８ａ図に示される。Ｂａｔ−ＰＡ（１）は、アミノ酸
配列１〜３及び５０〜４４１を含み、第８ａ図に示され
、Ｂａｔ−ＰＡ（Ｌ）はアミノ酸配列１〜３及び８７〜
４４１を含み、第８ａ図に示される。更にその上８８位
のアミノ酸はトレオニンからタンパク質“Ｌ″のプロリ
ンに変えられる。
また次の工程を包含している吸血コラモリ唾液プラスミ
ノーゲン賦活体の精製方法も本発明の範囲内である。
ノーゲン賦活体の精製方法も本発明の範囲内である。
ａ） 吸血コウモリから得た下顎腺を均質化して混合液
を得、この混合液を遠心分離して上澄フラクションを生
成する、 ｂ） この上澄をホスフォセルロースカチオン交換カラ
ムに加え、カラムにＢａｔ−ＰＡの吸収が生じる、Ｃ）
カラムを？容離してＢａｔ−ＰＡを含むフラクション
を得る、 ｄ） 有効フラクションをプールし、このプールしたも
のを固定化エリスリナトリプシンインヒビター（ＥＴり
を有し、低ｐａｔ緩衝液でＢａｔ−ＰＡを溶離するアフ
ィニティークロマトグラフィーカラムに加える。
を得、この混合液を遠心分離して上澄フラクションを生
成する、 ｂ） この上澄をホスフォセルロースカチオン交換カラ
ムに加え、カラムにＢａｔ−ＰＡの吸収が生じる、Ｃ）
カラムを？容離してＢａｔ−ＰＡを含むフラクション
を得る、 ｄ） 有効フラクションをプールし、このプールしたも
のを固定化エリスリナトリプシンインヒビター（ＥＴり
を有し、低ｐａｔ緩衝液でＢａｔ−ＰＡを溶離するアフ
ィニティークロマトグラフィーカラムに加える。
本発明のタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列、本発
明の挿入ＤＮＡ配列を有するクローニングベしクル、本
発明のタンパク質と反応性の抗体、及び本発明のタンパ
ク質の有効量を有するフィブリン・結合プラスミノーゲ
ンを活性化する薬薬組成物も本発明の範囲内である。
明の挿入ＤＮＡ配列を有するクローニングベしクル、本
発明のタンパク質と反応性の抗体、及び本発明のタンパ
ク質の有効量を有するフィブリン・結合プラスミノーゲ
ンを活性化する薬薬組成物も本発明の範囲内である。
プラスミノーゲン賦活化物質の各々はフィブリンによっ
て活性化される。この物質を区別する唯一の識別できる
特徴はＢａ ｔ−ＰＡ （ＩＩ）がフィブリンにしっか
りと結合する排他能であり、この特性は、フィンガード
メインの存在で関係づけられる。フィブリン結合プラス
ミノーゲンに対するＢａｔ−ＰＡ（１）とＢａｔ−ＰＡ
（Ｌ）の特異性は、フィブリン結合能の強固さに依存し
ていると思われる。
て活性化される。この物質を区別する唯一の識別できる
特徴はＢａ ｔ−ＰＡ （ＩＩ）がフィブリンにしっか
りと結合する排他能であり、この特性は、フィンガード
メインの存在で関係づけられる。フィブリン結合プラス
ミノーゲンに対するＢａｔ−ＰＡ（１）とＢａｔ−ＰＡ
（Ｌ）の特異性は、フィブリン結合能の強固さに依存し
ていると思われる。
Ｂａｔ−Ｐ＾活性の厳密なフィブリン依存性は繊維素溶
解療法の情況に望ましい特徴である。血栓溶解剤の使用
に伴う出血合併症は、循環プラスミノーゲンの活性化に
よって悪化してプラスミンが生成してしまう。出血合併
症の重篤度と頻度は本発明のプラスミノーゲン賦活体を
用いて減少させることができその作用はフィブリン凝塊
の部位に局在される。
解療法の情況に望ましい特徴である。血栓溶解剤の使用
に伴う出血合併症は、循環プラスミノーゲンの活性化に
よって悪化してプラスミンが生成してしまう。出血合併
症の重篤度と頻度は本発明のプラスミノーゲン賦活体を
用いて減少させることができその作用はフィブリン凝塊
の部位に局在される。
２９３−Ｂａｔ−ＰＡ ｌ＠乳類細胞（ＡＴＣＣ寛Ｃ
ＲＬ１０１８０に指定） 、ＢＰＡ−ＣＮ−ｐＳＺ８８
−１０４−２０細菌細胞（ＡＴＣＣ寛６８０５０に指定
） 、ＢＰＡ−ＣＫ−ｐＳＺ８９−１１１−１７細菌細
胞（ＡＴＣＣ阻６８０５２に指定）、ＢＰＡ−ＦＫ−ｐ
８９Ｗｏ−１細菌細胞（ＡＴＣＣ隘６８０５１に指定）
、ＢＰＡ−ＦＮ−ｐ ８９ＷＯ−２Ｃ細菌細胞（ＡＴ
ＣＣ患６８０５３に指定）及びＢ ＰＡ−ＤＫ−ｐ ８
９ＷＰ−２０Ａ細菌細胞（ＡＴＣＣ１ｌｋＬ６８０４９
に指定）はブタベスト条約の要件に従ってアメリカンタ
イプ力ルチュアコレクション、ベセスダ、ＭＤ。
ＲＬ１０１８０に指定） 、ＢＰＡ−ＣＮ−ｐＳＺ８８
−１０４−２０細菌細胞（ＡＴＣＣ寛６８０５０に指定
） 、ＢＰＡ−ＣＫ−ｐＳＺ８９−１１１−１７細菌細
胞（ＡＴＣＣ阻６８０５２に指定）、ＢＰＡ−ＦＫ−ｐ
８９Ｗｏ−１細菌細胞（ＡＴＣＣ隘６８０５１に指定）
、ＢＰＡ−ＦＮ−ｐ ８９ＷＯ−２Ｃ細菌細胞（ＡＴ
ＣＣ患６８０５３に指定）及びＢ ＰＡ−ＤＫ−ｐ ８
９ＷＰ−２０Ａ細菌細胞（ＡＴＣＣ１ｌｋＬ６８０４９
に指定）はブタベスト条約の要件に従ってアメリカンタ
イプ力ルチュアコレクション、ベセスダ、ＭＤ。
ＵＳＡに寄託されている。寄託物はまた主題出願又はそ
の継続の対応物を出願することができる国の外国特許の
法律によって必要に応じて入手することができる。しか
しながら、寄託物の利用可能性が政府の処置によって付
与される特許権をＭｔｌして発明の主題を実施すること
を許可しないことは理解すべきである。
の継続の対応物を出願することができる国の外国特許の
法律によって必要に応じて入手することができる。しか
しながら、寄託物の利用可能性が政府の処置によって付
与される特許権をＭｔｌして発明の主題を実施すること
を許可しないことは理解すべきである。
本発明は、天然及び組換え体由来精製プラスミノゲンア
クチベータ−（賦活体）タンパク質並びに吸血コウモリ
（ｖａｍｐｉｒｅ ｂａｔ）デスモダス・ロタンダス（
Ｄｅｓｍｏｄｕｓ ｒｏｔｕｎｄｕｓ）の唾液及び唾液
腺に伴うタンパク質のいずれかの微異質 （ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）又は断片形
に関する。
クチベータ−（賦活体）タンパク質並びに吸血コウモリ
（ｖａｍｐｉｒｅ ｂａｔ）デスモダス・ロタンダス（
Ｄｅｓｍｏｄｕｓ ｒｏｔｕｎｄｕｓ）の唾液及び唾液
腺に伴うタンパク質のいずれかの微異質 （ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）又は断片形
に関する。
タンパク質及びポリペプチドは本明細書において相互に
置き換えて用いられ、アミド結合によって互いに結合さ
れたアミノ酸の直鎖ポリマーに関するものである。鎖中
のアミノ酸配列は、タンパク質又はポリペプチドの生物
学的機能に関し極めて重要である。本明細書で用いられ
るプラスミノゲンアクチベーターとは、プラスミンの形
成を触媒するタンパク質、即ちアルギニン及びリジンの
エステル及びペプチドを加水分解してフィブリンを可溶
性生成物に変換する酵素に関する。
置き換えて用いられ、アミド結合によって互いに結合さ
れたアミノ酸の直鎖ポリマーに関するものである。鎖中
のアミノ酸配列は、タンパク質又はポリペプチドの生物
学的機能に関し極めて重要である。本明細書で用いられ
るプラスミノゲンアクチベーターとは、プラスミンの形
成を触媒するタンパク質、即ちアルギニン及びリジンの
エステル及びペプチドを加水分解してフィブリンを可溶
性生成物に変換する酵素に関する。
そのタンパク質に対するモノクローナル及びボリフロー
ナル抗体は、本発明のタンパク質を単離かつ同定するた
めに有用である。それらは、当業界で公知のいずれか通
常の技術によって産生される。例えばポリクローナル抗
体は、デスモダス・ロタンダスのプラスミノーゲンアク
チベータータンパク質の注入をうけたウサギのような動
物によって合成される。注入後、動物体内の抗体レベル
は上昇する。次いで、抗血清と呼ばれる抗体含有血液が
動物から採取される。次いで、プラスミノーゲンアクチ
ベーター特異的抗体は、いつかの分離技術のうちいずれ
か一つ、例えばアフィニティクロマトグラフィーによっ
て抗血清中の他の抗体から単離される。モノクローナル
抗体は、コーラ−及びミルスタイン、ネーチャー、第２
５６巻、第４９５−４９７頁、１９７５年（Ｋｏｈｌｅ
ｒ ａｎｄ旧１ｓｔｅｉｎ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６
． ｐｐ、４９５−４９７（１９７５） ）の技術を用
いて産生ずることができる。
ナル抗体は、本発明のタンパク質を単離かつ同定するた
めに有用である。それらは、当業界で公知のいずれか通
常の技術によって産生される。例えばポリクローナル抗
体は、デスモダス・ロタンダスのプラスミノーゲンアク
チベータータンパク質の注入をうけたウサギのような動
物によって合成される。注入後、動物体内の抗体レベル
は上昇する。次いで、抗血清と呼ばれる抗体含有血液が
動物から採取される。次いで、プラスミノーゲンアクチ
ベーター特異的抗体は、いつかの分離技術のうちいずれ
か一つ、例えばアフィニティクロマトグラフィーによっ
て抗血清中の他の抗体から単離される。モノクローナル
抗体は、コーラ−及びミルスタイン、ネーチャー、第２
５６巻、第４９５−４９７頁、１９７５年（Ｋｏｈｌｅ
ｒ ａｎｄ旧１ｓｔｅｉｎ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６
． ｐｐ、４９５−４９７（１９７５） ）の技術を用
いて産生ずることができる。
本明細書で用いられる天然タンパク質とは、対応遺伝子
により産生される完全鎖長タンパク質に関する。組換え
体由来とは、所望のタンパク質に関する遺伝子又はｃＤ
ＮＡの単離及び所望のタンパク質を過剰産生ずる細胞を
作製するためのその精製遺伝子又はｃＤＮＡの使用に関
する。断片形は、天然タンパク質よりも少ないアミノ酸
を有するが但しプラスミノーゲンアクチベーターの活性
部位を含んでいるタンパク質又はポリペプチドの一部と
して定義される。本明細書で用いられる微異質形とは、
翻訳後構造的に修正されたＤＮＡの単一遺伝子単位から
産生されるタンパク質である単一遺伝子産物に関する。
により産生される完全鎖長タンパク質に関する。組換え
体由来とは、所望のタンパク質に関する遺伝子又はｃＤ
ＮＡの単離及び所望のタンパク質を過剰産生ずる細胞を
作製するためのその精製遺伝子又はｃＤＮＡの使用に関
する。断片形は、天然タンパク質よりも少ないアミノ酸
を有するが但しプラスミノーゲンアクチベーターの活性
部位を含んでいるタンパク質又はポリペプチドの一部と
して定義される。本明細書で用いられる微異質形とは、
翻訳後構造的に修正されたＤＮＡの単一遺伝子単位から
産生されるタンパク質である単一遺伝子産物に関する。
しかしながら、これらの構造的修正によって、タンパク
質の活性に関しいかなる重要な変化も生じない。修正は
、インビボで又は単離及び精製プロセス時のいずれかで
生じる。インビボ修正の結果、格別限定されないが、Ｎ
末端におけるアセチル化、タンパク質分解、グリコシル
化又はホスホリル化が生じる。タンパク質分解としては
、１以上のアミノ酸が逐次酵素的に開裂されて原遺転子
産物よりも少ないアミノ酸を有する微異質形を生じるよ
うなエキソタンパク質分解がある。タンパク質分解とし
ては更に、アミノ酸配列の特定位置でペプチドを開裂さ
せるエンドプロテアーゼの作用に基づくエンドタンパク
賞分解修正も含む。同様の修正は、微異質形の産生に至
る精製プロセス中にも生じうる。精製中に生じる最も一
般的な修正はタンパク質分解である。
質の活性に関しいかなる重要な変化も生じない。修正は
、インビボで又は単離及び精製プロセス時のいずれかで
生じる。インビボ修正の結果、格別限定されないが、Ｎ
末端におけるアセチル化、タンパク質分解、グリコシル
化又はホスホリル化が生じる。タンパク質分解としては
、１以上のアミノ酸が逐次酵素的に開裂されて原遺転子
産物よりも少ないアミノ酸を有する微異質形を生じるよ
うなエキソタンパク質分解がある。タンパク質分解とし
ては更に、アミノ酸配列の特定位置でペプチドを開裂さ
せるエンドプロテアーゼの作用に基づくエンドタンパク
賞分解修正も含む。同様の修正は、微異質形の産生に至
る精製プロセス中にも生じうる。精製中に生じる最も一
般的な修正はタンパク質分解である。
本発明のもう１つの態様は、第８ａ図で示されたアミノ
酸１−４４１のポリペプチド配列と少なくとも９５％相
同的なポリペプチド配列を有するプラスミノゲン賦活性
タンパク質であって、このタンパク質はフィブリン補因
子（又は共同因子（ｃｏｂａｃ ｔｏｒ）の存在下で促
進されるプラスミノゲン賦活化活性を有しており、しか
もこのタンパク質はフィブリンと強固に結合することが
できる。
酸１−４４１のポリペプチド配列と少なくとも９５％相
同的なポリペプチド配列を有するプラスミノゲン賦活性
タンパク質であって、このタンパク質はフィブリン補因
子（又は共同因子（ｃｏｂａｃ ｔｏｒ）の存在下で促
進されるプラスミノゲン賦活化活性を有しており、しか
もこのタンパク質はフィブリンと強固に結合することが
できる。
本発明の他の態様は、第８ａ図で示されたアミノ酸１−
４４１のポリペプチド配列と少なくとも９０％相同的な
ポリペプチド配列を有するプラスミノーゲン賦活性タン
パク質であって、このタンパク質はフィブリン補因子の
存在下で促進されるプラスミノゲン賦活化活性を有して
おり、しかもこのタンパク質はフィブリンと強固に結合
することができる。
４４１のポリペプチド配列と少なくとも９０％相同的な
ポリペプチド配列を有するプラスミノーゲン賦活性タン
パク質であって、このタンパク質はフィブリン補因子の
存在下で促進されるプラスミノゲン賦活化活性を有して
おり、しかもこのタンパク質はフィブリンと強固に結合
することができる。
本発明の他の態様は、第８ａ図で示されたアミノＭ１−
３及び５０−４４１のポリペプチド配列と少なくとも９
５％相同的なポリペプチド配列を有するプラスミノーゲ
ン賦活性タンパク質であって、このタンパク質はフィブ
リン補因子の存在下で促進されるプラスミノーゲン賦活
化活性を有している。
３及び５０−４４１のポリペプチド配列と少なくとも９
５％相同的なポリペプチド配列を有するプラスミノーゲ
ン賦活性タンパク質であって、このタンパク質はフィブ
リン補因子の存在下で促進されるプラスミノーゲン賦活
化活性を有している。
本発明の他の態様は、第８ａ図で示されたアミノ酸１−
３及び５０−４４１のポリペプチド配列と少なくとも９
０％相同的なポリペプチド配列を有するプラスミノーゲ
ン賦活性タンパク質であって、このタンパク質はフィブ
リン補因子の存在下で促進されるプラスミノーゲン賦活
化活性を有している。
３及び５０−４４１のポリペプチド配列と少なくとも９
０％相同的なポリペプチド配列を有するプラスミノーゲ
ン賦活性タンパク質であって、このタンパク質はフィブ
リン補因子の存在下で促進されるプラスミノーゲン賦活
化活性を有している。
本発明の他の態様は、第８ａ図で示されたアミノ酸１−
３及び８７−４４１のポリペプチド配列（８８位のアミ
ノ酸はトレオニンからプロリンに変わっている）と少な
くとも９５％相同的なポリペプチド配列を有するプラス
ミノーゲン賦活性りンバク質であって、このタンパク質
はフィブリン補因子の存在下で促進されるプラスミノー
ゲン賦活化活性を有している。
３及び８７−４４１のポリペプチド配列（８８位のアミ
ノ酸はトレオニンからプロリンに変わっている）と少な
くとも９５％相同的なポリペプチド配列を有するプラス
ミノーゲン賦活性りンバク質であって、このタンパク質
はフィブリン補因子の存在下で促進されるプラスミノー
ゲン賦活化活性を有している。
本発明の他の態様は、第８ａ図で示されたアミ／酸１−
３及び８７−４４１のポリペプチド配列（８８位のアミ
ノ酸はトレオニンからプロリンに変わっている）と少な
くとも９０％相同的なポリペプチド配列を有するプラス
ミノーゲン賦活性タンパク質であって、上記タンパク質
はフィブリン補因子の存在下で促進されるプラスミノゲ
ン賦活化活性を有している。
３及び８７−４４１のポリペプチド配列（８８位のアミ
ノ酸はトレオニンからプロリンに変わっている）と少な
くとも９０％相同的なポリペプチド配列を有するプラス
ミノーゲン賦活性タンパク質であって、上記タンパク質
はフィブリン補因子の存在下で促進されるプラスミノゲ
ン賦活化活性を有している。
本発明は更に、個々のタンパク質に関する遺伝情報の単
離及び精製と対応タンパク質の発現方法とに関する。
離及び精製と対応タンパク質の発現方法とに関する。
第１図は、精製されたコウモリプラスミノーゲンアクチ
ベーターのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）について示している。サンプル ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の前に２５ｍＭ
ジチオスレイトールで前処理された。１列目は吸光コラ
モリ唾液腺から精製されたアクチベータ−（３．６μｇ
）について示し、２列目はエンドグリコシダーゼＦ〔ベ
ーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ）） （３ ７℃で２４時間０、 １単
位）で処理されたアルチベーター（３．６μｇ）につい
て示し、３列目はエンドグリコシダーゼＦ Ｏ． １単
位に関する。タンパク質分子量マーカーは示されている
とおりである。腺（１列目）及び唾液（２列目）からの
コウモリプラスミノゲンアクチベータ−（ＩＱＯｎｇ）
は、ウサギ抗コウモリプラスミノゲンアクチベーター抗
体及びアルカリホスファターゼ複合化ヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇを用いてウヱスターンブロソト法により分析された。
ベーターのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）について示している。サンプル ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の前に２５ｍＭ
ジチオスレイトールで前処理された。１列目は吸光コラ
モリ唾液腺から精製されたアクチベータ−（３．６μｇ
）について示し、２列目はエンドグリコシダーゼＦ〔ベ
ーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ）） （３ ７℃で２４時間０、 １単
位）で処理されたアルチベーター（３．６μｇ）につい
て示し、３列目はエンドグリコシダーゼＦ Ｏ． １単
位に関する。タンパク質分子量マーカーは示されている
とおりである。腺（１列目）及び唾液（２列目）からの
コウモリプラスミノゲンアクチベータ−（ＩＱＯｎｇ）
は、ウサギ抗コウモリプラスミノゲンアクチベーター抗
体及びアルカリホスファターゼ複合化ヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇを用いてウヱスターンブロソト法により分析された。
Ｉｔ，’！（３列目）及び唾液（４列目）からのアクチ
ベータ−（１５１Ｕ）のフィブリンオートグラフィーは
、レムリ、Ｕ． Ｋ． （Ｌａｅｍｍｌｉ， １１．
Ｋ．）、ネーチャー、第２２７巻、第６８０−６８５
頁、１９７０年で記載されているように行われた。
ベータ−（１５１Ｕ）のフィブリンオートグラフィーは
、レムリ、Ｕ． Ｋ． （Ｌａｅｍｍｌｉ， １１．
Ｋ．）、ネーチャー、第２２７巻、第６８０−６８５
頁、１９７０年で記載されているように行われた。
第１図で示されたデータを得るために、デスモダス・ロ
タンダスコウモリからの凍結された主及び副顎下腺（６
ｇ）がｐＨ７．５のｌＯ＋ｎＭ）リスＨＣｌ。
タンダスコウモリからの凍結された主及び副顎下腺（６
ｇ）がｐＨ７．５のｌＯ＋ｎＭ）リスＨＣｌ。
０、５Ｍ ＮａＣｌ４０ｍｇ中におかれ、ブリンクマ
ン（Ｂｒｉｎｋｎ＋ａｎｎ）ホモゲナイザーを用いて直
ちにホモゲナイズされた。ホモゲネートは２７，０００
Ｘ ｇで２０分間遠心された。上澄分画は１００，Ｏ
ＯＯＸ ｇで３０分間の遠心により清澄化され、ｐＨ７
．０の２０ｍＭ）リスＨＣｌ，０．０１％ツイーン８
０ （Ｔｗｅｅｎ ８０）で５０ｍＭ ＮａＣｌま
で希釈され、ｐＨ７、２の２０ｍＭトリス１１Ｃ１、５
０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０１％ツイーン８０で平衡
化されたホスホセルロース陽イオン交換カラム〔ワット
マンＰ １ １ （Ｗｈａｔｍａｎｎ ｐＨ） ）に
付された。サンプルの適用後、ホスホセルロースカラム
は上記平衡化緩衝液で徹底洗浄された。
ン（Ｂｒｉｎｋｎ＋ａｎｎ）ホモゲナイザーを用いて直
ちにホモゲナイズされた。ホモゲネートは２７，０００
Ｘ ｇで２０分間遠心された。上澄分画は１００，Ｏ
ＯＯＸ ｇで３０分間の遠心により清澄化され、ｐＨ７
．０の２０ｍＭ）リスＨＣｌ，０．０１％ツイーン８
０ （Ｔｗｅｅｎ ８０）で５０ｍＭ ＮａＣｌま
で希釈され、ｐＨ７、２の２０ｍＭトリス１１Ｃ１、５
０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０１％ツイーン８０で平衡
化されたホスホセルロース陽イオン交換カラム〔ワット
マンＰ １ １ （Ｗｈａｔｍａｎｎ ｐＨ） ）に
付された。サンプルの適用後、ホスホセルロースカラム
は上記平衡化緩衝液で徹底洗浄された。
コウモリプラスミノーゲンアクチベーターはｐＨ７、２
の２０１トリスＩｔ（／！ 、 ０． ５ Ｍ Ｎａ
Ｃｌ及び０、０１％ツイーン８０でホスホセルロースカ
ラムから溶離され、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） ）に結合された
エリトリナ（ＩＥｒｙｔｈｒｉｎａ） トリプシンイン
ヒビター（ＥＴ Ｉ）〔アメリカン・ジアグノスチ力（
ＡｍｅｒｉｃａｎＤｊａｇｎｏｓｔｉｃａ） ）を含ん
だアフィニティーカラムに付された。アフィニティーカ
ラムはｐｌ＋７．０の２０ｍＭ ＮａＨｚＰ０４、０
．５Ｍ ＮａＣｌ， ０．１％ツイーン８０で洗浄さ
れ、しかる後アクチベーターはｐＨ４、０の５０ｍＭ酢
酸ナトリウム、０．２Ｍ Ｎａ（Ｊ！、０、 １％ツ
イーン８０で溶離された。アクチベーター含有分画はプ
ールされ、ＩＭ）リス塩基が最終トリス濃度２５ｍＭと
なるように加えられた。精製されたサンプルは一７０℃
で貯蔵された。タンパク質濃度は、標準として牛血清ア
ルブミンを用いバイオランド（Ｂｉｏｒａｄ）色素結合
アッセイで評価された。
の２０１トリスＩｔ（／！ 、 ０． ５ Ｍ Ｎａ
Ｃｌ及び０、０１％ツイーン８０でホスホセルロースカ
ラムから溶離され、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） ）に結合された
エリトリナ（ＩＥｒｙｔｈｒｉｎａ） トリプシンイン
ヒビター（ＥＴ Ｉ）〔アメリカン・ジアグノスチ力（
ＡｍｅｒｉｃａｎＤｊａｇｎｏｓｔｉｃａ） ）を含ん
だアフィニティーカラムに付された。アフィニティーカ
ラムはｐｌ＋７．０の２０ｍＭ ＮａＨｚＰ０４、０
．５Ｍ ＮａＣｌ， ０．１％ツイーン８０で洗浄さ
れ、しかる後アクチベーターはｐＨ４、０の５０ｍＭ酢
酸ナトリウム、０．２Ｍ Ｎａ（Ｊ！、０、 １％ツ
イーン８０で溶離された。アクチベーター含有分画はプ
ールされ、ＩＭ）リス塩基が最終トリス濃度２５ｍＭと
なるように加えられた。精製されたサンプルは一７０℃
で貯蔵された。タンパク質濃度は、標準として牛血清ア
ルブミンを用いバイオランド（Ｂｉｏｒａｄ）色素結合
アッセイで評価された。
第６図は、コウモリプラスミノーゲンアクチベーター及
びｔＰＡで触媒された血餅溶解について示している。凝
固血漿は、（１２５１３フイブリノーゲン（ｔｏｏ，
ＯＯＯｃｐｍ／血餅）含有ヒト血漿１９５７Ｊにヒトト
ｏ７ビン〔ジグ７ （Ｓｉｇｍａ）） ０． ２ １０
及び７．５ｍＭ ＣａＣ１ｚを加えることにより形成
された。各サンプルの最終容量は２００μ！であった。
びｔＰＡで触媒された血餅溶解について示している。凝
固血漿は、（１２５１３フイブリノーゲン（ｔｏｏ，
ＯＯＯｃｐｍ／血餅）含有ヒト血漿１９５７Ｊにヒトト
ｏ７ビン〔ジグ７ （Ｓｉｇｍａ）） ０． ２ １０
及び７．５ｍＭ ＣａＣ１ｚを加えることにより形成
された。各サンプルの最終容量は２００μ！であった。
血餅は小さな木棒の存在下で形成され、それに付着され
、３７℃で３０分間熟成され、液体をしぼり出すために
圧搾され、血漿２５０μｌに移されて、それにヒルジン
（シグマ＞２５Ｕ／ｄが加えられた。プラスミノゲンア
クチベーターを含有したｐＨ８，０の０．１ Ｍ ）リ
スＨＣＪ、０．０１％ツイーン８０の２５μｌが血餅を
入れた溶液に加えられ、サンプルが３７℃でインキュベ
ートされ、その一部が取り出されて、可溶性フィブリン
分割産物について計測された。唾液腺から精製されたコ
ウモリプラスミノーゲンアクチベーター及び２末鎖ｔＰ
Ａがこの試験に用いられた。マ３ｎＭ コラモリ−Ｐ
Ａ；■３ｎＭ ｔ−ＰＡ；・１０ｎＭコウモリーＰＡ
ｉム１０ｎＭ ｔ ＰＡ−コウモリプラスミノーゲ
ンアクチベーター及びｔ−ＰＡは、既に形成された凝固
血漿からの放射線標識フィブリン分解産物の放出を触媒
しうるそれらの能力に関してモニターした場合に同様の
効力を示した。
、３７℃で３０分間熟成され、液体をしぼり出すために
圧搾され、血漿２５０μｌに移されて、それにヒルジン
（シグマ＞２５Ｕ／ｄが加えられた。プラスミノゲンア
クチベーターを含有したｐＨ８，０の０．１ Ｍ ）リ
スＨＣＪ、０．０１％ツイーン８０の２５μｌが血餅を
入れた溶液に加えられ、サンプルが３７℃でインキュベ
ートされ、その一部が取り出されて、可溶性フィブリン
分割産物について計測された。唾液腺から精製されたコ
ウモリプラスミノーゲンアクチベーター及び２末鎖ｔＰ
Ａがこの試験に用いられた。マ３ｎＭ コラモリ−Ｐ
Ａ；■３ｎＭ ｔ−ＰＡ；・１０ｎＭコウモリーＰＡ
ｉム１０ｎＭ ｔ ＰＡ−コウモリプラスミノーゲ
ンアクチベーター及びｔ−ＰＡは、既に形成された凝固
血漿からの放射線標識フィブリン分解産物の放出を触媒
しうるそれらの能力に関してモニターした場合に同様の
効力を示した。
第７図は、フィブリンに対するプラスミノーゲンアクチ
ベーターの結合性について示している。
ベーターの結合性について示している。
１列目、コラモリ−ＰＡ １．８μｍｏｊ！ ； ２
及び３列目、コウモリブラスミノーゲンアクチベーター
含有フィブリンサンプルからの各々１０容量％のペレッ
ト及び上澄分画；４列目、１末鎖ｔＰＡ１．８μｍｏ１
； ５及び６列目、ｔＰＡ含有フィブリンサンプルから
の各々１０容量％のペレット及び上澄分画；７列目、ウ
ロキナーゼ０．５μｍｏＡ ； ８及び９列目、ウロキ
ナーゼ含有フィブリンサンプルからの各々ｌＯ容量％の
ペレット及び上澄分画。
及び３列目、コウモリブラスミノーゲンアクチベーター
含有フィブリンサンプルからの各々１０容量％のペレッ
ト及び上澄分画；４列目、１末鎖ｔＰＡ１．８μｍｏ１
； ５及び６列目、ｔＰＡ含有フィブリンサンプルから
の各々１０容量％のペレット及び上澄分画；７列目、ウ
ロキナーゼ０．５μｍｏＡ ； ８及び９列目、ウロキ
ナーゼ含有フィブリンサンプルからの各々ｌＯ容量％の
ペレット及び上澄分画。
３つのコウモリプラスミノーゲンアクチベーター種（１
列目）は、上澄及びペレット分画間で同等に分布してい
ない。大部分のコラモリ−ＰＡ（１１）はフィブリンペ
レット中に分布しているが（２列目）、一方コウモリー
ＰＡ （１）及びコラモリ−ＰＡ （Ｌ）はフィブリン
に対して識別可能なアフィニティーを有しておらず、上
澄分画中で主に存在する（３列目）。ｔＰＡ（４列目）
及びウロキナーゼ（７列目）の一部も、フィブリンと結
合しうるそれらの能力についてモニターされた。予想ど
おり、ｔＰＡはフィブリンと強固に結合してペレット分
画中に分布しているが（５列目）、ウロキナーゼは上澄
分画中で排他的に存在している（９列目）。
列目）は、上澄及びペレット分画間で同等に分布してい
ない。大部分のコラモリ−ＰＡ（１１）はフィブリンペ
レット中に分布しているが（２列目）、一方コウモリー
ＰＡ （１）及びコラモリ−ＰＡ （Ｌ）はフィブリン
に対して識別可能なアフィニティーを有しておらず、上
澄分画中で主に存在する（３列目）。ｔＰＡ（４列目）
及びウロキナーゼ（７列目）の一部も、フィブリンと結
合しうるそれらの能力についてモニターされた。予想ど
おり、ｔＰＡはフィブリンと強固に結合してペレット分
画中に分布しているが（５列目）、ウロキナーゼは上澄
分画中で排他的に存在している（９列目）。
フィブリン血餅は、ヒトフィブリノーゲン（１ｍｇ／ｒ
ｊ１１） 、ＥＤＴＡ （５ｍＭ）及びコウモリフラス
ミノーゲンアクチベーター（１８μｍｏＪ） 、１末鎖
ｔ ＰＡ （１８μｍｏ／）又はウロキナーゼ（５，５
μｍｏ ｌ ）を含有したｐＨ７，４の１０ ｍＭ
ＮａＨｚＰＯｎ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ１．０．０１
％ツイーン８０２００μｌにトロンビン０．２１Ｕを加
えることにより形成された。１末鎖ｔＰＡは、優先的に
１末鎖ｔＰＡと結合するモノクローナル抗体カラム（Ｐ
ＡＭｌ、アメリカンージアグノスチカ）でのクロマトグ
ラフィーによって、１本鎖及び２零ｕ４ｔ Ｐ Ａの混
合物から精製された。フィブリン血餅は３７℃で１時間
熟成され、１００，０００ ｘ ｇで１０分間遠心され
た。ペレット分画はＮａ１ｌ□’０４ 、ＮａＣｌ１、
ツイーン８０緩衝液４００ｐｌで洗浄され、０．５％Ｓ
ＤＳ １５０μｌで再懸濁され、一定の攪拌下３７℃で
１．５時間インキュベートされた。コウモリブラスミノ
ーゲンアクチベーターを含有したペレット及び上澄分画
はエンドＦで処理された。サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に付され、ＦＡ分析によって分析された。
ｊ１１） 、ＥＤＴＡ （５ｍＭ）及びコウモリフラス
ミノーゲンアクチベーター（１８μｍｏＪ） 、１末鎖
ｔ ＰＡ （１８μｍｏ／）又はウロキナーゼ（５，５
μｍｏ ｌ ）を含有したｐＨ７，４の１０ ｍＭ
ＮａＨｚＰＯｎ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ１．０．０１
％ツイーン８０２００μｌにトロンビン０．２１Ｕを加
えることにより形成された。１末鎖ｔＰＡは、優先的に
１末鎖ｔＰＡと結合するモノクローナル抗体カラム（Ｐ
ＡＭｌ、アメリカンージアグノスチカ）でのクロマトグ
ラフィーによって、１本鎖及び２零ｕ４ｔ Ｐ Ａの混
合物から精製された。フィブリン血餅は３７℃で１時間
熟成され、１００，０００ ｘ ｇで１０分間遠心され
た。ペレット分画はＮａ１ｌ□’０４ 、ＮａＣｌ１、
ツイーン８０緩衝液４００ｐｌで洗浄され、０．５％Ｓ
ＤＳ １５０μｌで再懸濁され、一定の攪拌下３７℃で
１．５時間インキュベートされた。コウモリブラスミノ
ーゲンアクチベーターを含有したペレット及び上澄分画
はエンドＦで処理された。サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に付され、ＦＡ分析によって分析された。
ブースミノ−゛ンアクチベーターア セイフ ブ１ンプ
レー ゛ ：フィブリンプレートは、１％アガロース溶
液（５５℃に保たれている）にウシもしくはヒトフィブ
リノーゲン（２■／！ｎｉ）及びヒトＧｌｕ−プラスミ
ノーゲン（６μｇ／ｍｌ）を溶解させることによって形
成された。次いで、ヒトトロンビン（１，５単位）が検
量された免疫拡散プレートに混合溶液を流し込む前に加
えられた。
レー ゛ ：フィブリンプレートは、１％アガロース溶
液（５５℃に保たれている）にウシもしくはヒトフィブ
リノーゲン（２■／！ｎｉ）及びヒトＧｌｕ−プラスミ
ノーゲン（６μｇ／ｍｌ）を溶解させることによって形
成された。次いで、ヒトトロンビン（１，５単位）が検
量された免疫拡散プレートに混合溶液を流し込む前に加
えられた。
ウェルが固まったフィブリンプレートから打抜かれ、カ
ラム分画が適用された。溶解領域は活性が存在する箇所
で観察された。３７℃でインキュベート時間当たりの溶
解面積（Ｈ２）は、酵素の活性単位と相関つけることが
できる。
ラム分画が適用された。溶解領域は活性が存在する箇所
で観察された。３７℃でインキュベート時間当たりの溶
解面積（Ｈ２）は、酵素の活性単位と相関つけることが
できる。
フィブリンオー グーフィー：サンプルは非還元条件下
でＳＤＳ−ＰＡＧＥに付され、アクリルアミドゲルがト
リトン（Ｔｒｉｔｏｎ） Ｘ −１００（２，５％）
で徹底洗浄され、しかる後プラスミノーゲン含有フィブ
リンアガロースゲル上におかれる。プラスミノーゲンア
クチベーターはトリトン処理で再生し、それらがプラス
ミノーゲンを活性化してプラスミンを生じる場合にアガ
ロースゲル中に拡散する。生じたプラスミンはフィブリ
ンを分解し、その結果未分解フィブリンのバックグラウ
ンドに対して容易に認識されるフィブリン溶解ゾーンが
現われる。
でＳＤＳ−ＰＡＧＥに付され、アクリルアミドゲルがト
リトン（Ｔｒｉｔｏｎ） Ｘ −１００（２，５％）
で徹底洗浄され、しかる後プラスミノーゲン含有フィブ
リンアガロースゲル上におかれる。プラスミノーゲンア
クチベーターはトリトン処理で再生し、それらがプラス
ミノーゲンを活性化してプラスミンを生じる場合にアガ
ロースゲル中に拡散する。生じたプラスミンはフィブリ
ンを分解し、その結果未分解フィブリンのバックグラウ
ンドに対して容易に認識されるフィブリン溶解ゾーンが
現われる。
七人アミトノ＼”ア・セイ：プラスミンを生じるような
プラスミノダン賦活化はデサフイブ（Ｄｅｓａｆｉｂ）
の存在下で試験され、プラスミンの生成は比色用プラス
ミン基質スベクトロザイムＰ Ｌ （Ｓｐｅｃｔｒｏｚ
ｙｍｅＰＬ）でモニターされた。コウモリプラスミノー
ゲンアクチベーターはヒトＧｌｕ−ブラスミノーゲ７
（２０ｕ ｇ／ｍｌ＞ 、スペクトロザイムＰ Ｌ （
０，４ｍＭ）及びデサフィブ（８０μｇ／ｍｌｌ＞ と
共にインキュベートされた。混合物は３７℃で６０分間
インキユヘートされた。反応は１０％ＳＤＳ５０μｌの
添加によって停止された。開裂された基質の吸光度は４
０５ｎｍでモニターされた。コウモリプラスミノーゲン
アクチベーターの活性単位は、３７°Ｃで１分間におい
てスペクトロザイムＰＬＩμｍｏｆｆｉの代謝回転（ｔ
ｕｒｎｏｖｅｒ）を触媒するその酵素量に相当する。
プラスミノダン賦活化はデサフイブ（Ｄｅｓａｆｉｂ）
の存在下で試験され、プラスミンの生成は比色用プラス
ミン基質スベクトロザイムＰ Ｌ （Ｓｐｅｃｔｒｏｚ
ｙｍｅＰＬ）でモニターされた。コウモリプラスミノー
ゲンアクチベーターはヒトＧｌｕ−ブラスミノーゲ７
（２０ｕ ｇ／ｍｌ＞ 、スペクトロザイムＰ Ｌ （
０，４ｍＭ）及びデサフィブ（８０μｇ／ｍｌｌ＞ と
共にインキュベートされた。混合物は３７℃で６０分間
インキユヘートされた。反応は１０％ＳＤＳ５０μｌの
添加によって停止された。開裂された基質の吸光度は４
０５ｎｍでモニターされた。コウモリプラスミノーゲン
アクチベーターの活性単位は、３７°Ｃで１分間におい
てスペクトロザイムＰＬＩμｍｏｆｆｉの代謝回転（ｔ
ｕｒｎｏｖｅｒ）を触媒するその酵素量に相当する。
ｉ ｆｌ ｇ８佼旌定：吸血コウモリプラスミノーゲン
アクチベーターは、官能的モル濃度を羽べるために２つ
の異なる技術で滴定された。第一の技術は、トリプシン
及びプラスミノーゲンアクチベーター双方のクロロメチ
ルケトンインヒビターの検量された標準溶液による検量
されたトリプシン標準の逆滴定原理に基づいていた。ト
リプシン溶液（５００ｎＭ） は４−メチルウンベリフ
ェリーＰ−グアニジンベンゾエート（ＭＵＧＢ）を用い
て直接滴定された。クロロメチルケトン（ダンシル−グ
ルタミル−グリシル−アルギニンクロロメチルケトン、
ＤＮＳ−ＥＧＲＣＫ）はＭＵＧＢ検量化トリプシンに対
して滴定された。このような検量化トリプシン溶液と検
量化クロロメチルケトン溶液との反応は、ＣＫ標準がア
クチベーターと共にブレインキュベートされた場合にお
いてトリプシン標準の阻害に関する減少率の測定を可能
にする。
アクチベーターは、官能的モル濃度を羽べるために２つ
の異なる技術で滴定された。第一の技術は、トリプシン
及びプラスミノーゲンアクチベーター双方のクロロメチ
ルケトンインヒビターの検量された標準溶液による検量
されたトリプシン標準の逆滴定原理に基づいていた。ト
リプシン溶液（５００ｎＭ） は４−メチルウンベリフ
ェリーＰ−グアニジンベンゾエート（ＭＵＧＢ）を用い
て直接滴定された。クロロメチルケトン（ダンシル−グ
ルタミル−グリシル−アルギニンクロロメチルケトン、
ＤＮＳ−ＥＧＲＣＫ）はＭＵＧＢ検量化トリプシンに対
して滴定された。このような検量化トリプシン溶液と検
量化クロロメチルケトン溶液との反応は、ＣＫ標準がア
クチベーターと共にブレインキュベートされた場合にお
いてトリプシン標準の阻害に関する減少率の測定を可能
にする。
コウモリプラスミノーゲンアクチベーターの存在の結果
、プラスミノーゲンアクチベーターの量に比例してトリ
プシン−ＣＫコントロールの場合よりも活性が高まる。
、プラスミノーゲンアクチベーターの量に比例してトリ
プシン−ＣＫコントロールの場合よりも活性が高まる。
第二の技術では、反応が低温（５°Ｃ）で行われた場合
に、ＭＵＧＢＥをコウモリプラスミノーゲンアクチベー
ターに加えた後パース） （ｂｕｒｓ ｔ）動力学につ
いて観察した。
に、ＭＵＧＢＥをコウモリプラスミノーゲンアクチベー
ターに加えた後パース） （ｂｕｒｓ ｔ）動力学につ
いて観察した。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル 気泳動：我々はレムリ
系の修正プロトコール（ネーチャー、第２２７巻、第６
８０−６８５頁、１９７０年）を用いた。ａ前用及び分
離用ゲル（０，７５ｍｍ）は各々４％及び１０％ポリア
クリルアミドを含有していた。ゲルは７５ボルトで２０
時間ランされた。
系の修正プロトコール（ネーチャー、第２２７巻、第６
８０−６８５頁、１９７０年）を用いた。ａ前用及び分
離用ゲル（０，７５ｍｍ）は各々４％及び１０％ポリア
クリルアミドを含有していた。ゲルは７５ボルトで２０
時間ランされた。
タンパク質は銀染色により検出された。
バットプラスミノダン賦活体蛋白質の精製材料： デ
スモダス ロタンダス（ＤｅｓｍｏｄｕｓＲｏｔｕｎｄ
ｕｓ）の唾液及び唾液腺をテキサス州ベツドフォードの
抗体協会（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ。
スモダス ロタンダス（ＤｅｓｍｏｄｕｓＲｏｔｕｎｄ
ｕｓ）の唾液及び唾液腺をテキサス州ベツドフォードの
抗体協会（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ。
Ｂｅｄｆｏｒｄ、 ＴＸ）及びペンシルバニア州フィラ
デルフィアのウィスター・インスティテユートの狂犬病
部のＣ，ルップレヒト博士（叶、 Ｃ，Ｒｕｐｐｒｅｃ
ｈｔ。
デルフィアのウィスター・インスティテユートの狂犬病
部のＣ，ルップレヒト博士（叶、 Ｃ，Ｒｕｐｐｒｅｃ
ｈｔ。
Ｒａｂｉｅｓ Ｌｌｎｉｔ、 Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎ５
ｔｉｔｕｔｅ、 Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ。
ｔｉｔｕｔｅ、 Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ。
ＰＡ）から仕入れた。フィブリノダン・プラスミノダン
、トロンビン及びアミドリティクアソセイ（ａｍｉｄｏ
ｌｙｔｉｃ ａｓｓａｙ）のための基′Ｊｔｉはニュー
ヨーク州ニューヨークのアメリカンデイアノステイカ（
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｎｏｓｔｉｃａ、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、 ＮＹ）から入手した。電気泳動に使われ
る材料はバイオラフト インク、 （Ｂｉ□ Ｒａｄ
Ｉｎｃ、）から、そしてカラムクロマトグラフィに使
われる材料はファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から
人手した。ＨＰＬＣカラムはヴイダソク（νｙｄａｃ）
の製品であった。免疫拡散プレー１−はＩＣＮからのも
のであった。
、トロンビン及びアミドリティクアソセイ（ａｍｉｄｏ
ｌｙｔｉｃ ａｓｓａｙ）のための基′Ｊｔｉはニュー
ヨーク州ニューヨークのアメリカンデイアノステイカ（
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｎｏｓｔｉｃａ、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、 ＮＹ）から入手した。電気泳動に使われ
る材料はバイオラフト インク、 （Ｂｉ□ Ｒａｄ
Ｉｎｃ、）から、そしてカラムクロマトグラフィに使
われる材料はファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から
人手した。ＨＰＬＣカラムはヴイダソク（νｙｄａｃ）
の製品であった。免疫拡散プレー１−はＩＣＮからのも
のであった。
手順： パンパイアバツト唾液からの賦活体の精製は、
ホスホセルロース、フェニル−セファロース及びＣ４逆
相ＨＰＬＣクロマトグラフ段階を含む。
ホスホセルロース、フェニル−セファロース及びＣ４逆
相ＨＰＬＣクロマトグラフ段階を含む。
パンパイアバツト、デスモダス、ロタンダスの唾液を１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、、ｐＨ７、４，５０ｍＦＩ Ｎ
ａＣｌ゜０．０１％トウイーンー２０ （Ｔｗｅｅｎ
−２０）溶液を用いて３倍の体積に希釈した。希釈され
た唾液をエッベンドルフ遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）内で、４℃、１２０００ ｒｐ
ｔｎで５分間遠心させた。上清をホスホセルロースカラ
ム（２５Ｘ１０ｃｍ）に直接かけ、唾液の希釈に用いた
のと同じ緩衝液で洗浄した。カラムを流速６ｄ／ｈで運
転した。フィブリンプレート法を用いた溶解域によって
活性が測定され、蛋白質はＯ，Ｄ、２８０でモニターさ
れた。
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、、ｐＨ７、４，５０ｍＦＩ Ｎ
ａＣｌ゜０．０１％トウイーンー２０ （Ｔｗｅｅｎ
−２０）溶液を用いて３倍の体積に希釈した。希釈され
た唾液をエッベンドルフ遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）内で、４℃、１２０００ ｒｐ
ｔｎで５分間遠心させた。上清をホスホセルロースカラ
ム（２５Ｘ１０ｃｍ）に直接かけ、唾液の希釈に用いた
のと同じ緩衝液で洗浄した。カラムを流速６ｄ／ｈで運
転した。フィブリンプレート法を用いた溶解域によって
活性が測定され、蛋白質はＯ，Ｄ、２８０でモニターさ
れた。
バソトプラスミノダン賦活体はホスホセルロースカラム
にしっかりと結合した。ＬＭ ＮａＣｌを用いた溶出
後の活性の回収は９４％であった（第１表）。
にしっかりと結合した。ＬＭ ＮａＣｌを用いた溶出
後の活性の回収は９４％であった（第１表）。
プラスミノダン賦活体活性を含んだホスホセルロースカ
ラムからのフラクションをため、２．５ＭＮａＣｌの存
在下でフェニルセルロースカラム（１，５Ｘ５．Ｏｃｍ
）に直接供した。２Ｍ ＮａＣｌからＯＭＮａＣｌの
勾配と１０ｍＭ Ｔｒｉｓｌｌ衝液中１０％グリセＩ
コールでカラムを洗浄した。１０％グリセロール溶液で
の洗浄は全ての活性が溶離するまで続けた。
ラムからのフラクションをため、２．５ＭＮａＣｌの存
在下でフェニルセルロースカラム（１，５Ｘ５．Ｏｃｍ
）に直接供した。２Ｍ ＮａＣｌからＯＭＮａＣｌの
勾配と１０ｍＭ Ｔｒｉｓｌｌ衝液中１０％グリセＩ
コールでカラムを洗浄した。１０％グリセロール溶液で
の洗浄は全ての活性が溶離するまで続けた。
フェニル−セルロースカラムを用いたクロマトグラフィ
は８２％の活性の回収という結果であった（第１表）。
は８２％の活性の回収という結果であった（第１表）。
しかしながら、その活性は２つのピーク、■と２に分割
し、別々にためた。２つのピークはＳＤＳ−ＰＡＧＥ後
の１艮ステインとフィブリンオートグラフィによって決
定されたような異なった分子量を示した（第５図）。ピ
ーク１は、Ｂａｔ−ＰＡ（Ｌ）を表すと考えられるが、
塩の勾配（２ＭＯＭＮａＣｊりの端に向かって溶離した
。ピーク２はＢａｔ−ＰＡ（ｒ） と考えられる。
し、別々にためた。２つのピークはＳＤＳ−ＰＡＧＥ後
の１艮ステインとフィブリンオートグラフィによって決
定されたような異なった分子量を示した（第５図）。ピ
ーク１は、Ｂａｔ−ＰＡ（Ｌ）を表すと考えられるが、
塩の勾配（２ＭＯＭＮａＣｊりの端に向かって溶離した
。ピーク２はＢａｔ−ＰＡ（ｒ） と考えられる。
フェニルセルロースの後、約６６０群（６６０ｆｏｌｄ
）のＢａｔ−ＰＡ（Ｌ）の精製をおこなった。デサフイ
ブ（Ｄｅｓａｆ ｉｂ）はこのバソトプラスミノダン賦
活体のための効果的な共同因子ではないので、ＢａｔＰ
＾（１）酵素の総括性はプラスミノケン／スペクトロ酵
素（ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ） Ｐ Ｌカンプリング系
を用いたアミドリティクアソセイによっては最適には決
定されなかった。
）のＢａｔ−ＰＡ（Ｌ）の精製をおこなった。デサフイ
ブ（Ｄｅｓａｆ ｉｂ）はこのバソトプラスミノダン賦
活体のための効果的な共同因子ではないので、ＢａｔＰ
＾（１）酵素の総括性はプラスミノケン／スペクトロ酵
素（ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ） Ｐ Ｌカンプリング系
を用いたアミドリティクアソセイによっては最適には決
定されなかった。
第１表
精製の表
段 階
活性
単位
へソト唾液（４ＭＬ）
ホスホセルロース
フェニルセファロース
ピーク１
ピーク２
Ｃ４逆相ＨＰ Ｌ Ｃ
ピーク１ １１９
０デサフイプはこの種類のパン
した共同因子ではない。
Ｎ、Ｄ、・・・決定せず
収率
蛋白質
％
７６．２３０
７．０００
０．０？９
０．０８３
Ｎ、Ｄ。
トＰＡに対する適
蛋白質のための最終の精製段階は０．１％（Ｖ／Ｖ）水
中トリフルオロ酢酸で平衡になったＣ４逆相ＨＰＬＣカ
ラムである。蛋白質のフラクションプールは凍結乾燥に
よってａ縮され、ＨＰＬＣカラムに直接供せられた。酵
素は０．１％ＴＦＡの存在下２５％乃至５５％アセトニ
トリルの勾配によって？容出された。蛍白質ピークはＯ
，Ｄ、２１４によってモニターされ個々に収集された。
中トリフルオロ酢酸で平衡になったＣ４逆相ＨＰＬＣカ
ラムである。蛋白質のフラクションプールは凍結乾燥に
よってａ縮され、ＨＰＬＣカラムに直接供せられた。酵
素は０．１％ＴＦＡの存在下２５％乃至５５％アセトニ
トリルの勾配によって？容出された。蛍白質ピークはＯ
，Ｄ、２１４によってモニターされ個々に収集された。
揮発性物質は真空遠心によって除去し、続いて凍結乾燥
した。蛋白質を１０ｍＭ酢酸に再溶解した。酢酸をＴｒ
ｉｓ・トウイーン緩衝液で中和した後、フィブリンプレ
ート法を用いて活性を評価した。
した。蛋白質を１０ｍＭ酢酸に再溶解した。酢酸をＴｒ
ｉｓ・トウイーン緩衝液で中和した後、フィブリンプレ
ート法を用いて活性を評価した。
パンバイアハツト唾液腺からのバットプラスミノダン賦
活体の精製は以下のように行われた。
活体の精製は以下のように行われた。
パンパイアバツトの主及び副顎下腺を１０ｍＭＴｒｉｓ
−１１ｃｆｆｉ、 ０．５ Ｍ ＮａＣｆ、０．１％
トウイーン８０ （Ｔｗｅｅｎ ８０） 、ｐＨ７、５
を含む緩衝液中に置き、直ちにポリトロン（ｐｏｌｙｔ
ｒｏｎ）でホモジナイズする。遠心してから、澄んだＳ
Ｎフラクションを、アミコンスタートセル（ＹＭ １０
１１り （ａｍｉｃｏｎ５ｔｉｒｒｅｄ ｃｅｌｌ
（ＹＭ １０ ｍｅｍｂｒａｎｅ））を使用して１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ｃｊＬ ５０ｍＭ ＮａＣｌ，
ｐＨ７，２で濃縮して平衡にする。その保守物（ｒｅｔ
ｅｎｔａｔｅ）は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｆ、５
０ｍＭ ＮａＣｌ，０，０１％トウイーン８０．９Ｈ１
，２で平衡にしたホスホセルロースカラム（ホアットマ
ン（Ｗｂａ ｔｍａｎｎ） ）に直接供する。
−１１ｃｆｆｉ、 ０．５ Ｍ ＮａＣｆ、０．１％
トウイーン８０ （Ｔｗｅｅｎ ８０） 、ｐＨ７、５
を含む緩衝液中に置き、直ちにポリトロン（ｐｏｌｙｔ
ｒｏｎ）でホモジナイズする。遠心してから、澄んだＳ
Ｎフラクションを、アミコンスタートセル（ＹＭ １０
１１り （ａｍｉｃｏｎ５ｔｉｒｒｅｄ ｃｅｌｌ
（ＹＭ １０ ｍｅｍｂｒａｎｅ））を使用して１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ｃｊＬ ５０ｍＭ ＮａＣｌ，
ｐＨ７，２で濃縮して平衡にする。その保守物（ｒｅｔ
ｅｎｔａｔｅ）は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｆ、５
０ｍＭ ＮａＣｌ，０，０１％トウイーン８０．９Ｈ１
，２で平衡にしたホスホセルロースカラム（ホアットマ
ン（Ｗｂａ ｔｍａｎｎ） ）に直接供する。
プラスミノダン賦活体蛋白質は量的にホスホセルロース
カラムに吸収され、０．５ Ｍ ＮａＣｌ−補充適用
緩衝液（０，５Ｍ ＮａＣｌ −ｓｕｐｐｌｅｍｅｎ
ｔｅｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）で継溶
出（ｓｔｅｐ−ｅｌｕｔｅｄ）される。活性回収は概し
て８０％より大である。
カラムに吸収され、０．５ Ｍ ＮａＣｌ−補充適用
緩衝液（０，５Ｍ ＮａＣｌ −ｓｕｐｐｌｅｍｅｎ
ｔｅｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）で継溶
出（ｓｔｅｐ−ｅｌｕｔｅｄ）される。活性回収は概し
て８０％より大である。
賦活体活性を含むフラクションはためられてセファロー
ス４Ｂに結合したエリスリナトリプシンインヒビター（
ＩＥｒｙｔｈｒｉｎａ ｔｒｙｐｓｉｎ １ｎｈｉｂｉ
ｔｅｏｒ）（ＥＴりから成る親和カラム（ａｆｆｉｎｉ
ｔｙ ｃｏｌｕｍｎ）に供せられた。活性の大部分は二
〇カラムに吸収され、カラムを５０ｍＭＮａアセテ−）
（ＮａＡｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ４，０，０，２Ｍ
ＮａＣｌ及び０．１％トウイーン８０で洗浄することに
より効果的に溶出された。このプロトコルを用いた線抽
出物からのバットプラスミノーン賦活体活性の最終的な
回収は９１％で６ｇの腺からのバントプラスミノダン賦
活体およそ５．４■を得た。バットプラスミノダン賦活
体調製品の均質性は、評価されたプロティン濃度と４−
メチル−ラムベリフェリルーｐ−グアニジノ−ベンゾエ
ート （４−ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ
−ｐ−ｇｕａｎｉｄｉｎ。
ス４Ｂに結合したエリスリナトリプシンインヒビター（
ＩＥｒｙｔｈｒｉｎａ ｔｒｙｐｓｉｎ １ｎｈｉｂｉ
ｔｅｏｒ）（ＥＴりから成る親和カラム（ａｆｆｉｎｉ
ｔｙ ｃｏｌｕｍｎ）に供せられた。活性の大部分は二
〇カラムに吸収され、カラムを５０ｍＭＮａアセテ−）
（ＮａＡｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ４，０，０，２Ｍ
ＮａＣｌ及び０．１％トウイーン８０で洗浄することに
より効果的に溶出された。このプロトコルを用いた線抽
出物からのバットプラスミノーン賦活体活性の最終的な
回収は９１％で６ｇの腺からのバントプラスミノダン賦
活体およそ５．４■を得た。バットプラスミノダン賦活
体調製品の均質性は、評価されたプロティン濃度と４−
メチル−ラムベリフェリルーｐ−グアニジノ−ベンゾエ
ート （４−ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ
−ｐ−ｇｕａｎｉｄｉｎ。
ｂｅｎｚｏａ ｔｅ）を用いた活性サイト滴定によって
決定されるような計算された機能的モル濃度の一致で示
された（ウラン等、バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジイカル・リサーチ・コミュニケーションズ１５０巻
、４５−５１ （１９８８）（υｒａｎ。
決定されるような計算された機能的モル濃度の一致で示
された（ウラン等、バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジイカル・リサーチ・コミュニケーションズ１５０巻
、４５−５１ （１９８８）（υｒａｎ。
ｅｔ ａｌ、、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ ｈ ｓ
Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｌ１．１５０．４５−５１ （１９８
８） ）。
Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｌ１．１５０．４５−５１ （１９８
８） ）。
ためられた活性フラクションの次に続＜ Ｓ Ｄ ５−
ＰＡＧＥを色づけする蛋白質は、Ｍ、値の範囲を提示す
るバンドの複合体配列を示す。これらの種の移動は、Ｆ
Ａ分析によって明確にされるような活性のゾーンに対応
する。アミノ酸分析、Ｎ末端分析及び活性サイト滴定デ
ータ間の合致に加えてのこの相互関係は、賦活体が首尾
よく同質性に精製されたという証拠を提供する。
ＰＡＧＥを色づけする蛋白質は、Ｍ、値の範囲を提示す
るバンドの複合体配列を示す。これらの種の移動は、Ｆ
Ａ分析によって明確にされるような活性のゾーンに対応
する。アミノ酸分析、Ｎ末端分析及び活性サイト滴定デ
ータ間の合致に加えてのこの相互関係は、賦活体が首尾
よく同質性に精製されたという証拠を提供する。
タンパク質特性指摘 び活性
本発明のプラスミノーゲン賦活体は、プラスミノーゲン
・フリー・フィブリンプレートに対しては活性を示さな
い。フィブリンＩ〔デスアフイプ（Ｄｅｓａｆ ｉｂ）
）の存在下、プラスミノーゲンと賦活体のインキュベ
ーションにより、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔ
ｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）やプラスミン（プラスミノ
ーゲン）抑制物質（ａｎｔｉ−ｐｌａｓｍｉｎ（ｏｇｅ
ｎ） ）抗体による免疫染色（ｉＩｌｌｍｕｎｏｓｔａ
ｉｎｉｎｇ ）により判定されるごとく、プラスミンが
発生する。
・フリー・フィブリンプレートに対しては活性を示さな
い。フィブリンＩ〔デスアフイプ（Ｄｅｓａｆ ｉｂ）
）の存在下、プラスミノーゲンと賦活体のインキュベ
ーションにより、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔ
ｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）やプラスミン（プラスミノ
ーゲン）抑制物質（ａｎｔｉ−ｐｌａｓｍｉｎ（ｏｇｅ
ｎ） ）抗体による免疫染色（ｉＩｌｌｍｕｎｏｓｔａ
ｉｎｉｎｇ ）により判定されるごとく、プラスミンが
発生する。
このプラスミンは、ヒトのフィブリンに結合したヒトの
プラスミノーゲン、ならびに牛のフィブリンに結合した
牛のプラスミノーゲンに対して活性を示す。
プラスミノーゲン、ならびに牛のフィブリンに結合した
牛のプラスミノーゲンに対して活性を示す。
セファロースＧ−２００ゲル濾過クロマトグラフィー上
に、ありのままの唾液中に存在するバントプラスミノー
ゲン賦活体活性は、分子旧約１３０にのブロードピーク
として抽出された。
に、ありのままの唾液中に存在するバントプラスミノー
ゲン賦活体活性は、分子旧約１３０にのブロードピーク
として抽出された。
この分子量は、おそらく、ハツトプラスミノーゲン賦活
体の凝集した分子量であった。０．０１％トウイーン２
０の存在下、ＦＰＬＣセファロースカラム上に約３２に
の領域が現われた。
体の凝集した分子量であった。０．０１％トウイーン２
０の存在下、ＦＰＬＣセファロースカラム上に約３２に
の領域が現われた。
精製を検討する中で、バットプラスミノーゲン賦活体は
りジン−セファロースに対して相互作用を及ぼさなかっ
た。これは、クリングルドメイン（ｋｒｉｎｇｌｅ ｄ
ｏｍａｉｎ）を介してフィブリンと結合しているタンパ
クを精製するための効果的な工程が以前にあったことを
示した。従ってフィブリンに対する賦活体の結合メカニ
ズムは明らかにｔＰＡとは異なる。エンドグリコシダー
ゼＨ及びＦにより賦活体を処理すると、低分子量の活性
タンパクを形成する。これは賦活体は、グリコプロティ
ンであることを示している。これらタンパクと、小麦麦
芽およびコンカナバリンＡ−アガロースとの相互作用は
、この結論をさらに裏付けるものである。
りジン−セファロースに対して相互作用を及ぼさなかっ
た。これは、クリングルドメイン（ｋｒｉｎｇｌｅ ｄ
ｏｍａｉｎ）を介してフィブリンと結合しているタンパ
クを精製するための効果的な工程が以前にあったことを
示した。従ってフィブリンに対する賦活体の結合メカニ
ズムは明らかにｔＰＡとは異なる。エンドグリコシダー
ゼＨ及びＦにより賦活体を処理すると、低分子量の活性
タンパクを形成する。これは賦活体は、グリコプロティ
ンであることを示している。これらタンパクと、小麦麦
芽およびコンカナバリンＡ−アガロースとの相互作用は
、この結論をさらに裏付けるものである。
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを活性化するためのバット−
ＰＡ （Ｈ）の能力を、プラスミン−特異アミトール基
板の入れ代りをモニターする結合検定（ｃｏｕｐｌｅｄ
ａｓｓａｙ）により評価した（表１１）。Ｇｌｕ−プ
ラスミノーゲンに対するバット−ＰＡ（１−１）の比活
性（ＩＵ／ｎｍｏｊりは、フィブリン擬態の不存在下の
検定において、ｔＰＡより少ない約２６０倍であった。
ＰＡ （Ｈ）の能力を、プラスミン−特異アミトール基
板の入れ代りをモニターする結合検定（ｃｏｕｐｌｅｄ
ａｓｓａｙ）により評価した（表１１）。Ｇｌｕ−プ
ラスミノーゲンに対するバット−ＰＡ（１−１）の比活
性（ＩＵ／ｎｍｏｊりは、フィブリン擬態の不存在下の
検定において、ｔＰＡより少ない約２６０倍であった。
しかし、デスアフィブの存在下・Ｇｌｕ−プラスミノー
ゲンに対するバ１．トＰＡ （Ｈ）の比活性は、ｔＰＡ
による活性の約８５％であった。このように、デスアフ
ィブはＬＰＡおよびバ、、）−ＰＡ（Ｈ）の活性を、各
々２０５−４５．０００倍まで刺激した。３つの分子形
態を含む調製のバラ）−ＰＡによって現われる活性は、
デスアフィブの不存在下のパン）−ＰＡ（１−１）に匹
敵するが、このフィブリン助因子の存在下のハツト−Ｐ
Ａ （Ｈ）よりは約３０％少なかった（表■）。バット
−ＰＡ （１）およびバットＰＡ （Ｌ）は、デスアフ
ィブ８０μｇ／−によるバット−ＰＡ （Ｈ）と同じ程
度までは刺激されないと思われる。
ゲンに対するバ１．トＰＡ （Ｈ）の比活性は、ｔＰＡ
による活性の約８５％であった。このように、デスアフ
ィブはＬＰＡおよびバ、、）−ＰＡ（Ｈ）の活性を、各
々２０５−４５．０００倍まで刺激した。３つの分子形
態を含む調製のバラ）−ＰＡによって現われる活性は、
デスアフィブの不存在下のパン）−ＰＡ（１−１）に匹
敵するが、このフィブリン助因子の存在下のハツト−Ｐ
Ａ （Ｈ）よりは約３０％少なかった（表■）。バット
−ＰＡ （１）およびバットＰＡ （Ｌ）は、デスアフ
ィブ８０μｇ／−によるバット−ＰＡ （Ｈ）と同じ程
度までは刺激されないと思われる。
表 ■
バット−ｒ’Ａ（Ｉ＋） 、ハツト−Ｐ八およびｔｐＡ
によるバット−Ｐへ０１） １．０５±０．０４
４７，７００±４５００ ４５．０００（２２０）バ
ット−ＰＡ １．２４±０．０８ ３３，５０
０± ９７０ ２７．０００（１３０）ＬＰＡ
２７０±２０ ５５．４００±１５
００ ２０５（１）これらのデータは、前述した
結合したアミトール検定を用いた比活性（ＩＵ／ｎｍｏ
６）を示すものである。二鎖ｔ Ｐ Ａをこれら検定に
用いた。−１ｊ￥ｔＰＡの触媒活性は示していない。と
いうのは、検定において二鎖ｔ Ｐ Ａの発生は避けら
れないものであり、結果に混乱をきたすからである。検
定には示されているように、デスアフィブを含有した。
によるバット−Ｐへ０１） １．０５±０．０４
４７，７００±４５００ ４５．０００（２２０）バ
ット−ＰＡ １．２４±０．０８ ３３，５０
０± ９７０ ２７．０００（１３０）ＬＰＡ
２７０±２０ ５５．４００±１５
００ ２０５（１）これらのデータは、前述した
結合したアミトール検定を用いた比活性（ＩＵ／ｎｍｏ
６）を示すものである。二鎖ｔ Ｐ Ａをこれら検定に
用いた。−１ｊ￥ｔＰＡの触媒活性は示していない。と
いうのは、検定において二鎖ｔ Ｐ Ａの発生は避けら
れないものであり、結果に混乱をきたすからである。検
定には示されているように、デスアフィブを含有した。
倍刺激（Ｆｏｌｄ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の最初の
記載は、デスアフィブなしに対するデスアフィブの存在
下における比活性の比である。かっこ内の数字は、ｔＰ
Ａによって表わされる刺激に対するデスアフィプによる
プラスミノーゲン賦活体活性の刺激である。
記載は、デスアフィブなしに対するデスアフィブの存在
下における比活性の比である。かっこ内の数字は、ｔＰ
Ａによって表わされる刺激に対するデスアフィプによる
プラスミノーゲン賦活体活性の刺激である。
プラスミノーゲン含有フィプリンタロフトのリーシスを
触媒するためｔＰＡおよびバラ１−−ＰＡ（Ｈ）の能力
も比較した。０．２５〜１ＯｎＨの範囲のｔＰＡｆｉ度
による結果と同一のクロッドリーシス（ｃｌｏｔ １ｙ
ｓｉｓ）の割合を達成するためには、わずかに高い濃度
のバラ）−ＰＡ （Ｈ）が必要である。選択されたクロ
ッドリーシス速度を生ずるｔＰＡおよびバット−ＰＡ
（Ｈ）の濃度（投与量−反応曲線より導かれる）を表■
に示す。ｔＰＡに対するバット−ＰＡ（Ｈ）の比活性の
範囲は５９〜７２％であり、プラスミノーゲン活性濃度
と相関関係があった。より高い濃度において、ｔｐＡに
対するバット−ＰＡ （Ｈ）の上昇した比活性は、フィ
ブリンおよび／またはプラスミノーゲンに対する相互作
用のモードに関する、これらプラスミノーゲン賦活体の
差を反映しているのであろう。
触媒するためｔＰＡおよびバラ１−−ＰＡ（Ｈ）の能力
も比較した。０．２５〜１ＯｎＨの範囲のｔＰＡｆｉ度
による結果と同一のクロッドリーシス（ｃｌｏｔ １ｙ
ｓｉｓ）の割合を達成するためには、わずかに高い濃度
のバラ）−ＰＡ （Ｈ）が必要である。選択されたクロ
ッドリーシス速度を生ずるｔＰＡおよびバット−ＰＡ
（Ｈ）の濃度（投与量−反応曲線より導かれる）を表■
に示す。ｔＰＡに対するバット−ＰＡ（Ｈ）の比活性の
範囲は５９〜７２％であり、プラスミノーゲン活性濃度
と相関関係があった。より高い濃度において、ｔｐＡに
対するバット−ＰＡ （Ｈ）の上昇した比活性は、フィ
ブリンおよび／またはプラスミノーゲンに対する相互作
用のモードに関する、これらプラスミノーゲン賦活体の
差を反映しているのであろう。
表■
ｔＰＡおよびバット−ＰＡ（１１）に媒介されたフィブ
リン０．８５０ ９．３３±１．■１ ０．８２５ ７．５２±０．８８ ０．８００ ６．０５±０．６９ ０．７７５ ４．８８±０．５４ ０．７２５ ３．１６±０．３４ ０．６７５ ２．０５±０．２１ ０．６２５ １゜３３±０．１３ ０．５７５ ０．８６±０．０８ ０．５２５ ０．５６±０．０５ ０．４７５ ０．３６±０．０３ ０．４２５ ０．２４±０，０２ １２．９±１．０５ １０．５３±０．８３ ８．６０±０．６６ ７．０２±０．５２ ４．６８±０．３２ ３．１２±０．２０ ２．０８±０．１２ １．３９±０．０７ ０．９２±０．０５ ０．６１±０．０３ ０．４１±０．０２ ７２．３ ７１．４ ７０．４ ６９．５ ６７．５ ６５．７ ６３．９ ６１．９ ６０．９ ５９．０ ５８．５ 混濁度検定を用いたクロッドリーシス実験を、二鎖ｔｐ
Ａまたはバット−ＰＡ （Ｈ）の下記濃度で４回実施し
た： ０．２５．０，５０．１．０．２．５．５．０．
７．５および１０．ＯｎＭ。クロットリーシス（ｃｌｏ
ｔ １ｙｓｉｓ）速度を、ソフトマックス速度ソフトウ
ェア（Ｓｏｆｔｍａｘ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｏｆｔｗａ
ｒｅ）を用いた各々のクロットリーシスプロファイルの
分析によって決定されるような濁液（−ｍ ＯＤ ７ｍ
１ｎ）の減少の最大速度として表示した。ｔＰＡおよび
ハツト−ＰＡ （Ｈ）各々に対して、４つまたは６つの
独立した一次投与量一反応曲線（速度対Ｉｌｏｇ（プラ
スミノーゲン賦活体〕）が得られた。表中には、表示し
たクロットリーシス速度を生ずるプラスミノーゲン賦活
体の濃度が記載しである。これらの値は、ｔＰＡおよび
バット−ＰＡ（ｌＩ）に対する全ての投与量−反応曲線
の分析から構成された、最もふされしい線を描く等式か
ら導き出したものである。相対効能（ｒｅｌａｔｉｖｅ
ｅｆｆｉｃａｃｙ）値は、表示されたクロットリーシ
ス速度となるバット−ＰＡ（Ｈ）？５度に対するｔＰＡ
Ｏ比である。
リン０．８５０ ９．３３±１．■１ ０．８２５ ７．５２±０．８８ ０．８００ ６．０５±０．６９ ０．７７５ ４．８８±０．５４ ０．７２５ ３．１６±０．３４ ０．６７５ ２．０５±０．２１ ０．６２５ １゜３３±０．１３ ０．５７５ ０．８６±０．０８ ０．５２５ ０．５６±０．０５ ０．４７５ ０．３６±０．０３ ０．４２５ ０．２４±０，０２ １２．９±１．０５ １０．５３±０．８３ ８．６０±０．６６ ７．０２±０．５２ ４．６８±０．３２ ３．１２±０．２０ ２．０８±０．１２ １．３９±０．０７ ０．９２±０．０５ ０．６１±０．０３ ０．４１±０．０２ ７２．３ ７１．４ ７０．４ ６９．５ ６７．５ ６５．７ ６３．９ ６１．９ ６０．９ ５９．０ ５８．５ 混濁度検定を用いたクロッドリーシス実験を、二鎖ｔｐ
Ａまたはバット−ＰＡ （Ｈ）の下記濃度で４回実施し
た： ０．２５．０，５０．１．０．２．５．５．０．
７．５および１０．ＯｎＭ。クロットリーシス（ｃｌｏ
ｔ １ｙｓｉｓ）速度を、ソフトマックス速度ソフトウ
ェア（Ｓｏｆｔｍａｘ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｏｆｔｗａ
ｒｅ）を用いた各々のクロットリーシスプロファイルの
分析によって決定されるような濁液（−ｍ ＯＤ ７ｍ
１ｎ）の減少の最大速度として表示した。ｔＰＡおよび
ハツト−ＰＡ （Ｈ）各々に対して、４つまたは６つの
独立した一次投与量一反応曲線（速度対Ｉｌｏｇ（プラ
スミノーゲン賦活体〕）が得られた。表中には、表示し
たクロットリーシス速度を生ずるプラスミノーゲン賦活
体の濃度が記載しである。これらの値は、ｔＰＡおよび
バット−ＰＡ（ｌＩ）に対する全ての投与量−反応曲線
の分析から構成された、最もふされしい線を描く等式か
ら導き出したものである。相対効能（ｒｅｌａｔｉｖｅ
ｅｆｆｉｃａｃｙ）値は、表示されたクロットリーシ
ス速度となるバット−ＰＡ（Ｈ）？５度に対するｔＰＡ
Ｏ比である。
本発明のバントプラスミノーゲン賦活体は、急激に作用
するタイプ１プラスミノーゲン賦活体阻害剤（ＦＡＩ−
１）による影響をｔＰＡに比べて受けにくい。
するタイプ１プラスミノーゲン賦活体阻害剤（ＦＡＩ−
１）による影響をｔＰＡに比べて受けにくい。
閉塞脈管（ｏｃｃ！ｕｄｅｄ ｖｅｓｓｅｌ）領域中の
ＰＡｌｌの濃度は、血漿研究から概算される濃度よりも
はるかに高いと思われる。血漿中の潜伏性のＰＡＩ−１
、トロンビンにより解放され得るＰＡＩ−１を含む血小
板、アデノシンニりん酸および他の血小板作用物質は、
閉塞領域内の相対的に高い局所濃度に寄与している。Ｆ
ＡＩ−１は、特異的にＬＰＡの活性を妨げる抗賦油体と
して作用する。
ＰＡｌｌの濃度は、血漿研究から概算される濃度よりも
はるかに高いと思われる。血漿中の潜伏性のＰＡＩ−１
、トロンビンにより解放され得るＰＡＩ−１を含む血小
板、アデノシンニりん酸および他の血小板作用物質は、
閉塞領域内の相対的に高い局所濃度に寄与している。Ｆ
ＡＩ−１は、特異的にＬＰＡの活性を妨げる抗賦油体と
して作用する。
ｔＰＡが、パンパイヤハット（吸血こうもり）の唾液の
プラスミノーゲン賦活体よりも、プラスミノーゲン賦活
体阻害剤によって、より容易に不活性化されることを図
４は示している。ｔＰＡおよびパンパイヤバットの唾液
のプラスミノーゲン賦活体を、各々血漿中でインキュベ
ートし、各々の活性を時間の関数としてモニターした。
プラスミノーゲン賦活体よりも、プラスミノーゲン賦活
体阻害剤によって、より容易に不活性化されることを図
４は示している。ｔＰＡおよびパンパイヤバットの唾液
のプラスミノーゲン賦活体を、各々血漿中でインキュベ
ートし、各々の活性を時間の関数としてモニターした。
フィブリンクロットをモニターした時には、ｔＰＡおよ
び４０ｋｄ、タンパク両者によるプラスミノーゲンのＮ
ａＣｌ媒介の阻害（ＮａＣｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｈ
ｉｂｉｔｉｏｎ）は観察されなかった。この例において
クロットは、フィブリノーゲン（ラベルされたものおよ
びラベルされていないもの）、プラスミノーゲン、α−
抗ブラスミン、第Ｘｕｌａ因子および０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｊ２含有または非含有バッファーを含む精製された成
分からできていた。
び４０ｋｄ、タンパク両者によるプラスミノーゲンのＮ
ａＣｌ媒介の阻害（ＮａＣｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｈ
ｉｂｉｔｉｏｎ）は観察されなかった。この例において
クロットは、フィブリノーゲン（ラベルされたものおよ
びラベルされていないもの）、プラスミノーゲン、α−
抗ブラスミン、第Ｘｕｌａ因子および０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｊ２含有または非含有バッファーを含む精製された成
分からできていた。
トリプシン・インヒビター・アフィニティー・カラムか
ら合せた活性画分を得た。これをさらにバイダック（Ｖ
ｙｄａｃ） Ｃ４ＨＰ Ｌ Ｃカラムを利用して分画し
た。このカラムからアセトニドリン／トリフルオロ酢酸
（約４０％−７１％）でプラスミノダンアクチベータプ
ロテインを溶離した。２つの大きな活性ピーク（フィブ
リンプレート自己溶菌として測定）をＨＰＬＣカラムか
らの溶離物中に検出することができた。この二つの大き
な活性ピークを別々に集め、バット−ＰＡ （Ｉ）およ
びバット−ＰＡ （ＩＩ）と名付けた。
ら合せた活性画分を得た。これをさらにバイダック（Ｖ
ｙｄａｃ） Ｃ４ＨＰ Ｌ Ｃカラムを利用して分画し
た。このカラムからアセトニドリン／トリフルオロ酢酸
（約４０％−７１％）でプラスミノダンアクチベータプ
ロテインを溶離した。２つの大きな活性ピーク（フィブ
リンプレート自己溶菌として測定）をＨＰＬＣカラムか
らの溶離物中に検出することができた。この二つの大き
な活性ピークを別々に集め、バット−ＰＡ （Ｉ）およ
びバット−ＰＡ （ＩＩ）と名付けた。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い続いて
フィブリンオートグラフィーにかけた。
フィブリンオートグラフィーにかけた。
バット−ＰＡ （１）および（ＩＩ）の両者は、４２０
００〜４６０００ダルトンの分子量範囲の同様な溶菌帯
のパターンを示す。バット−ＰＡ （１）および（ＩＩ
）の両者を、セリンプロテイナーゼ用のアクチブサイト
＋ｌｔｉ化剤３Ｈ−ＤＦＰ （ジイソプロピルフルオロ
ホスフェート）を用いて標識付けすることができた。
００〜４６０００ダルトンの分子量範囲の同様な溶菌帯
のパターンを示す。バット−ＰＡ （１）および（ＩＩ
）の両者を、セリンプロテイナーゼ用のアクチブサイト
＋ｌｔｉ化剤３Ｈ−ＤＦＰ （ジイソプロピルフルオロ
ホスフェート）を用いて標識付けすることができた。
■および■と名付けたバントブラスミノダンアクチベー
ターのアクリルアミドゲル電気泳動は、ラエムリー系〔
ネイチュアー（Ｎａ Ｌｕｒｅ） 、第２２７巻、第６
８０〜６８５頁１９７０年〕の変態プロトコルを用いて
行なった。スタッキングゲルおよび分離ゲル（０，７５
１Ｍ）は、それぞれ４％および１０％のポリアクリルア
ミドを含有している。
ターのアクリルアミドゲル電気泳動は、ラエムリー系〔
ネイチュアー（Ｎａ Ｌｕｒｅ） 、第２２７巻、第６
８０〜６８５頁１９７０年〕の変態プロトコルを用いて
行なった。スタッキングゲルおよび分離ゲル（０，７５
１Ｍ）は、それぞれ４％および１０％のポリアクリルア
ミドを含有している。
７５ボルトにおいて２０時間ゲルを運転した。
ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離
されたプロティンを、ミリポア（Ｍｉｌｌｉρｏｒｅ）
からカタログ番号ｆｌｈｌＰＶＨ３０４Ｆｏで購入した
インヒビター（ＰＶＤＦ膜）上に電気プロットした。プ
ロティンの電気プロッティングは、マツダイラ〔ジエー
・バイオ口・ケム（Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ）第２６
１巻、第１００３５〜１００３８真１９８７年〕によっ
て記述されているのとほとんど同じように行なった。要
約すれば、３０ボルトにおいて１５時間、プロティンを
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから電気的に溶離する
。次に、インモビロンプロットをコオマシー（Ｃｏｏｍ
ａｓｓ ｉｅ）ブルーを用いて染色してプロット上のプ
ロティンのバンドを顕色する。このプロティンのバンド
をプロットから直接切り取り、ポリブレン予備調整フィ
ルターを用いて、プロツテッドナンプルのすぐ下で、モ
デル４７７Ａガス フェーズ シーケンサ−（ＧａｓＰ
ｈａｓｅ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒ）中に置く。シーケンサ
−プログラムと試剤とは、製造業者〔アプライド バイ
オシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
） ）によって供給される。脱離されたアミノ酸誘導体
をオンーラインＨＰＬＣシステムで同定する。
されたプロティンを、ミリポア（Ｍｉｌｌｉρｏｒｅ）
からカタログ番号ｆｌｈｌＰＶＨ３０４Ｆｏで購入した
インヒビター（ＰＶＤＦ膜）上に電気プロットした。プ
ロティンの電気プロッティングは、マツダイラ〔ジエー
・バイオ口・ケム（Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ）第２６
１巻、第１００３５〜１００３８真１９８７年〕によっ
て記述されているのとほとんど同じように行なった。要
約すれば、３０ボルトにおいて１５時間、プロティンを
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから電気的に溶離する
。次に、インモビロンプロットをコオマシー（Ｃｏｏｍ
ａｓｓ ｉｅ）ブルーを用いて染色してプロット上のプ
ロティンのバンドを顕色する。このプロティンのバンド
をプロットから直接切り取り、ポリブレン予備調整フィ
ルターを用いて、プロツテッドナンプルのすぐ下で、モ
デル４７７Ａガス フェーズ シーケンサ−（ＧａｓＰ
ｈａｓｅ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒ）中に置く。シーケンサ
−プログラムと試剤とは、製造業者〔アプライド バイ
オシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
） ）によって供給される。脱離されたアミノ酸誘導体
をオンーラインＨＰＬＣシステムで同定する。
Ｎ−末端アミノ酸配列
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分画プラスミノゲンアダンヘーターの
Ｎ−末端配列決定を、ポリビニリデン・ジフルオリド膜
〔インモビロン（１ｍｌ１ｏｂ ｉ Ｉｏｎ）、ミリボ
ア（旧１１１ｐｏｒｅ） ）とオンーラインＰＴＨアナ
リシスを備えたアプライド バイオシステムス（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）モデル４７０配列決
定装置とを用いて〔マンダイラ、ピー、ジェー・バイオ
口・ケム・（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）第２６２
巻、第１００３５〜１００３８真１９８７年〕行なった
。プラスミノダンアクチベーターの■８フラグメントを
、ジチオスレイトール／ヨードアセトアミドを用いるア
クチベーターの還元／アルキル化、スタフィロコッカス
アウレウス（旦並打旦飴匹胚 ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プ
ロテアーゼ〔ベーリンガー・マンハイム（［ｌｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉａ＋））を用いる変態プロ
ティンのインキュベーション、およびバイタック（νｙ
ｄａｃ）Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムを用いるタンパク質分
解フラグメントの単離によって、産生じた。アクチブサ
イトペプチドフラグメント、Ｔｌを次の如く同定した。
Ｎ−末端配列決定を、ポリビニリデン・ジフルオリド膜
〔インモビロン（１ｍｌ１ｏｂ ｉ Ｉｏｎ）、ミリボ
ア（旧１１１ｐｏｒｅ） ）とオンーラインＰＴＨアナ
リシスを備えたアプライド バイオシステムス（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）モデル４７０配列決
定装置とを用いて〔マンダイラ、ピー、ジェー・バイオ
口・ケム・（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）第２６２
巻、第１００３５〜１００３８真１９８７年〕行なった
。プラスミノダンアクチベーターの■８フラグメントを
、ジチオスレイトール／ヨードアセトアミドを用いるア
クチベーターの還元／アルキル化、スタフィロコッカス
アウレウス（旦並打旦飴匹胚 ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プ
ロテアーゼ〔ベーリンガー・マンハイム（［ｌｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉａ＋））を用いる変態プロ
ティンのインキュベーション、およびバイタック（νｙ
ｄａｃ）Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムを用いるタンパク質分
解フラグメントの単離によって、産生じた。アクチブサ
イトペプチドフラグメント、Ｔｌを次の如く同定した。
プラスミノダンアクチベーターを〔１゜１’Ｈ）ジイソ
プロピル フルオロホスフェートにュー イングランド
ヌークリア（Ｎｅｗ［ＥｎＨＩａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ））を用いてデサフイプ（Ｄｅｓａｆｉｂ）〔アメリ
カン ダイアグノスチ力（八ｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃａ） ）の存在下においてインキュベートし
、ジチオスレイトールとヨードアセトアミドとを用いて
処理し、トリプシンを用いて消化し、そしてＨＰ Ｌ
Ｃによって放射性同位元素標識フラグメントを単離して
配列の解析に付した。
プロピル フルオロホスフェートにュー イングランド
ヌークリア（Ｎｅｗ［ＥｎＨＩａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ））を用いてデサフイプ（Ｄｅｓａｆｉｂ）〔アメリ
カン ダイアグノスチ力（八ｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃａ） ）の存在下においてインキュベートし
、ジチオスレイトールとヨードアセトアミドとを用いて
処理し、トリプシンを用いて消化し、そしてＨＰ Ｌ
Ｃによって放射性同位元素標識フラグメントを単離して
配列の解析に付した。
プラスミノダンアクチベーター活性を示す８種のプロテ
ィンバンドを、インモビロンプロット上で同定し、配列
解析にかけた。得られた配列は下記の通りである。−（
）−は、おそらくはプロティンシーツアンサ−から何か
のアミノ酸の回収率が低かったかその安定性がよくない
ために、その特定の位置にアミノ酸を同定することがで
きなかった事を示すものです。
ィンバンドを、インモビロンプロット上で同定し、配列
解析にかけた。得られた配列は下記の通りである。−（
）−は、おそらくはプロティンシーツアンサ−から何か
のアミノ酸の回収率が低かったかその安定性がよくない
ために、その特定の位置にアミノ酸を同定することがで
きなかった事を示すものです。
バンド１−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
５ｅｒ−Ｇｌｕ−（）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ バンド２−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
５ｅｔ−Ａｌａ−（）−（）−Ｔｙｒ−（）−Ａｓｐ−
Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔバンド３−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｕ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−（Ｔｈｒ） −
Ｔｙｒバンド４−八ｌａ−↑ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａ
ｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−八ｓｐ−Ｇｌｕ１１ｅ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−（Ｔｈｒ） −Ｔｙｒ−Ｌｙｓバン
ド５−八１ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−５ｅ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−（）−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−１１ｅ−
Ｇｌｙ、−Ｇｌｙハンド６−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ΔＩａ−
Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−八５ｐ−Ｇｌｎ−ＧｌｙへＶａｌハ′
ンド７−八１ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−１
１ｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ＣｙｓＴｙｒ−Ｌｙｓ−八５
ｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−νａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
ｃ＋ｙ バンド８−八１ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Δ５ｐ−Ｐｒｏ−
１１ｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ＣｙｓＴｙｒ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Δｒ
ｇＧｌｙ−Ｔｈｒ バットプラスミノーゲン賦活体ｃＤＮＡの分子クローニ
ング 組換えＤＮＡ技術は異なった細胞から、通常ＤＮＡが得
られた微生物の外部で末端−末端に結合されるべき、そ
してこの雑種ＤＮＡを元のＤＮＡをコードする蛋白質の
生成する細胞中に組み入れるべき異なった微生物から、
遺伝子情報のセグメント、ＤＮＡ、をあたえる技術とこ
こでは定義される。遺伝子情報、ＤＮＡ或は１ＲＮＡは
分離されそして適当なりローニングベクター中に組入れ
られ、また適当な宿主細胞中に移される。
５ｅｒ−Ｇｌｕ−（）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ バンド２−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
５ｅｔ−Ａｌａ−（）−（）−Ｔｙｒ−（）−Ａｓｐ−
Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔバンド３−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｕ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−（Ｔｈｒ） −
Ｔｙｒバンド４−八ｌａ−↑ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａ
ｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−八ｓｐ−Ｇｌｕ１１ｅ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−（Ｔｈｒ） −Ｔｙｒ−Ｌｙｓバン
ド５−八１ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−５ｅ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−（）−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−１１ｅ−
Ｇｌｙ、−Ｇｌｙハンド６−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ΔＩａ−
Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−八５ｐ−Ｇｌｎ−ＧｌｙへＶａｌハ′
ンド７−八１ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−１
１ｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ＣｙｓＴｙｒ−Ｌｙｓ−八５
ｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−νａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
ｃ＋ｙ バンド８−八１ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Δ５ｐ−Ｐｒｏ−
１１ｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ＣｙｓＴｙｒ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Δｒ
ｇＧｌｙ−Ｔｈｒ バットプラスミノーゲン賦活体ｃＤＮＡの分子クローニ
ング 組換えＤＮＡ技術は異なった細胞から、通常ＤＮＡが得
られた微生物の外部で末端−末端に結合されるべき、そ
してこの雑種ＤＮＡを元のＤＮＡをコードする蛋白質の
生成する細胞中に組み入れるべき異なった微生物から、
遺伝子情報のセグメント、ＤＮＡ、をあたえる技術とこ
こでは定義される。遺伝子情報、ＤＮＡ或は１ＲＮＡは
分離されそして適当なりローニングベクター中に組入れ
られ、また適当な宿主細胞中に移される。
ここで用いられるクローニングベクターは特定の実験的
外来ＤＮＡの、安定な方法で存在しそして実験ＤＮＡに
よって書き取られる蛋白質を発現することのできる宿主
細胞中に導入される結合されたＤＮＡとの組込みを与え
るＤＮＡ配列として定義される。ベクターＤＮＡと結合
した外来ＤＮＡは組換え技術から導かれる組換えＤＮＡ
分子を構成する。クローニングベクターはプラスミド、
バクテリオファージ、ウィルス及びコスミドを含む。
外来ＤＮＡの、安定な方法で存在しそして実験ＤＮＡに
よって書き取られる蛋白質を発現することのできる宿主
細胞中に導入される結合されたＤＮＡとの組込みを与え
るＤＮＡ配列として定義される。ベクターＤＮＡと結合
した外来ＤＮＡは組換え技術から導かれる組換えＤＮＡ
分子を構成する。クローニングベクターはプラスミド、
バクテリオファージ、ウィルス及びコスミドを含む。
どのクローニングベクターも新規デスモダス（Ｄｅｓｍ
ｏｄｕｓ）蛋白ＤＮＡ配列をクローンするのに使用でき
ると理解される。発現ベクターはここでは遺伝子のクロ
ーン化されたコピーの転写及び適当な宿主中でのそれら
ｍＲＮＡの翻訳に要求されるＤＮＡ配列として定義され
る。そのようなベクターはバクテリア、イースト、昆虫
、及び哺乳類細胞のような各種の細胞中での前核類及び
真正核類遺伝子の発現に使用される。この蛋白質は多く
のウィルス系でも発現する。適当に構築された発現ベク
ターは以下のものを含む：宿主細胞での自律複製用複製
首点、選択マーカー、有用制限酵素部の幾つか、高コピ
ー数、及び強力プロモーター等。プロモーターはＤＮＡ
に結合しそしてＲＮＡ合成を開始し、ＲＮＡポリメラー
ゼを指向するＤＮＡ配列として定義される。強力プロモ
ーターはｍＲＮＡに高い頻度で開始させる。発現ベクタ
ーは以下のものを含むがそれに限定されるものではない
：クローニングベクター、修飾クローニングベクター、
特別に設計されたプラスミド又はウィルス。
ｏｄｕｓ）蛋白ＤＮＡ配列をクローンするのに使用でき
ると理解される。発現ベクターはここでは遺伝子のクロ
ーン化されたコピーの転写及び適当な宿主中でのそれら
ｍＲＮＡの翻訳に要求されるＤＮＡ配列として定義され
る。そのようなベクターはバクテリア、イースト、昆虫
、及び哺乳類細胞のような各種の細胞中での前核類及び
真正核類遺伝子の発現に使用される。この蛋白質は多く
のウィルス系でも発現する。適当に構築された発現ベク
ターは以下のものを含む：宿主細胞での自律複製用複製
首点、選択マーカー、有用制限酵素部の幾つか、高コピ
ー数、及び強力プロモーター等。プロモーターはＤＮＡ
に結合しそしてＲＮＡ合成を開始し、ＲＮＡポリメラー
ゼを指向するＤＮＡ配列として定義される。強力プロモ
ーターはｍＲＮＡに高い頻度で開始させる。発現ベクタ
ーは以下のものを含むがそれに限定されるものではない
：クローニングベクター、修飾クローニングベクター、
特別に設計されたプラスミド又はウィルス。
本発明の蛋白質はデスモダス（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ）陰性
蛋白で定義された遺伝子によって特定された完全蛋白或
はそれらの小片又はサブユニット或は完全蛋白の雑種或
はそれらの小片又はサブユニット、但しこの蛋白質はフ
ィブリンの存在にたいする厳重な要件を持つデスモダス
・ロタンダス（Ｄｅｓｍｏｄｕｓｒｏ ｔｕｎｄｕｓ）
唾液から誘導されるプラスミノーゲン賦活体の性質を示
す、として存在するが、それに限定されるものではない
。ここで使用される完全蛋白はデスモダス遺伝子によっ
て作られた後転写的に修飾されたポリペプチドの全長を
示す。この完全蛋白デスモダス・ロタンダス唾液から精
製する事によって又は対応する組換え遺伝子産物の適当
な発現ベクター中に発現する事によって得ることができ
る。蛋白の小片又はサブユニットは完全蛋白よりも少な
いアミノ酸を含み父兄の蛋白質が行なうのと同じ条件で
賦活されたプラスミノーゲンへの能力を保持する蛋白質
のどの部分を示す。
蛋白で定義された遺伝子によって特定された完全蛋白或
はそれらの小片又はサブユニット或は完全蛋白の雑種或
はそれらの小片又はサブユニット、但しこの蛋白質はフ
ィブリンの存在にたいする厳重な要件を持つデスモダス
・ロタンダス（Ｄｅｓｍｏｄｕｓｒｏ ｔｕｎｄｕｓ）
唾液から誘導されるプラスミノーゲン賦活体の性質を示
す、として存在するが、それに限定されるものではない
。ここで使用される完全蛋白はデスモダス遺伝子によっ
て作られた後転写的に修飾されたポリペプチドの全長を
示す。この完全蛋白デスモダス・ロタンダス唾液から精
製する事によって又は対応する組換え遺伝子産物の適当
な発現ベクター中に発現する事によって得ることができ
る。蛋白の小片又はサブユニットは完全蛋白よりも少な
いアミノ酸を含み父兄の蛋白質が行なうのと同じ条件で
賦活されたプラスミノーゲンへの能力を保持する蛋白質
のどの部分を示す。
雑種蛋白は融合蛋白或は発現ベクター中に発現する複数
の遺伝子からの蛋白質を含むがそれに限定されるもので
はない。融合蛋白は発現ベクターによってコードされた
アミノ酸の幾つかが発現しそしてその発現が特定のプラ
スミノーゲン賦活体ポリペプチドへの付加をもたらす蛋
白として定義される。複数の遺伝子から得られる蛋白は
第二のポリペプチド又はプラスミノーゲン賦活を増進す
るペプチド−ペプチド結合にリンクした特定の賦活体ポ
リペプチドを含む。
の遺伝子からの蛋白質を含むがそれに限定されるもので
はない。融合蛋白は発現ベクターによってコードされた
アミノ酸の幾つかが発現しそしてその発現が特定のプラ
スミノーゲン賦活体ポリペプチドへの付加をもたらす蛋
白として定義される。複数の遺伝子から得られる蛋白は
第二のポリペプチド又はプラスミノーゲン賦活を増進す
るペプチド−ペプチド結合にリンクした特定の賦活体ポ
リペプチドを含む。
唾液線は１０匹の屠殺直後の吸血こうもりから取られ、
ポリＡ” ＲＮＡの分離に使用された。このＲＮＡは２
×ｌＯｂ以上の組換えバクテリオファージからなるλｇ
ｔ２２単方向ｃＤＮ、Ａライブラリーを作るために使用
された。ノーザンブロッテソング分析に使用される付加
ＲＮＡはドライアイスで急速冷凍された腺から分離して
調整された。
ポリＡ” ＲＮＡの分離に使用された。このＲＮＡは２
×ｌＯｂ以上の組換えバクテリオファージからなるλｇ
ｔ２２単方向ｃＤＮ、Ａライブラリーを作るために使用
された。ノーザンブロッテソング分析に使用される付加
ＲＮＡはドライアイスで急速冷凍された腺から分離して
調整された。
このＲＮＡの品質は新鮮な組繊から分離されたそれと比
較された。
較された。
全ＲＮＡは吸血こうもりの第−及び補助下顎腺から低温
グアニヂニウム・トリオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｎ
ｉｕｍ ｔｒｉｏｃｙａｎａｔｅ）法（Ｉｌａｎ他、Ｂ
ｉｏｃｔ（ｅｍ。
グアニヂニウム・トリオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｎ
ｉｕｍ ｔｒｉｏｃｙａｎａｔｅ）法（Ｉｌａｎ他、Ｂ
ｉｏｃｔ（ｅｍ。
２６．１６１７−１６２５ （１９８７））によって分
離された。ポリ（Ａ）”ＲＮＡはオリゴ（ＪＴ）セルロ
ーズクロマトグラフィーによって分離さた。二重らせん
ｃＤＮＡは先の記１ｉ１２ （Ｄｉｘｏｎ’、 Ｒ。
離された。ポリ（Ａ）”ＲＮＡはオリゴ（ＪＴ）セルロ
ーズクロマトグラフィーによって分離さた。二重らせん
ｃＤＮＡは先の記１ｉ１２ （Ｄｉｘｏｎ’、 Ｒ。
Ａ、 Ｆ、他、Ｎａｔｕｒｅ３２１．７５−７９ （１
９８６））のようにＧｕｂｌｅｒ及びＩｌｏｆｆｍａｎ
法（Ｇｅｎｅ ２５．２６３−２６９ （１９８３）
の修飾法によって作られた。ｃＤＮＡはアガロースゲル
電気泳動法でラムダＺＡＰアーム（ストラタダン）のＩ
ＥｃｏＲＩ部に結ばれた１−２ｋｂ及び２−７ｋｂ部分
に分割された。ライブラリーはＥ、 ｃｏｌｉ系ＬＥ３
９２に増幅され又先の記載（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌ
１ａｒｂｏｒＬａｔｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ！１ａｂｏｒ＋ ＮＹ）のようにｔ容菌班雑
種化によってスクリーンされた。ペプチドＮ−１，Ｎ−
３、Ｖ−２及びＴ−１に相当する部分的に重複した補足
オリゴヌクレオチドの一対はアニールされ、Ｋｌｅｎｏ
ｗ小片及び４個の（３２Ｐ ）α−ｄＮＴＰでラヘルさ
れ、そしてライブラリーからのニトロセルローズフィル
ターリフトを調べるために使用された。雑種化及び洗浄
条件は先の記ｉ１ （Ｍａｎｉａｔｉｓ他、同上）のよ
うであった。陽性クローンは溶菌班精製されそして、ｃ
ＤＮＡの挿入人は供給者の指示に従ってヘルパーファー
ジを共感染させて救済された。単及び二重らせんＤＮＡ
配列はジデオキシヌクレオチド（ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ）法によって行なわれた。Ｓａｎｇｅｒ
他、Ｐｒｏｃ、 ＮａｔｌＡｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、
Ｓ、 Ａ、 Ｖｏｌ、 ７４． Ｉｌり、 ５４６３
−５４６７（１９７７）参照。
９８６））のようにＧｕｂｌｅｒ及びＩｌｏｆｆｍａｎ
法（Ｇｅｎｅ ２５．２６３−２６９ （１９８３）
の修飾法によって作られた。ｃＤＮＡはアガロースゲル
電気泳動法でラムダＺＡＰアーム（ストラタダン）のＩ
ＥｃｏＲＩ部に結ばれた１−２ｋｂ及び２−７ｋｂ部分
に分割された。ライブラリーはＥ、 ｃｏｌｉ系ＬＥ３
９２に増幅され又先の記載（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌ
１ａｒｂｏｒＬａｔｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ！１ａｂｏｒ＋ ＮＹ）のようにｔ容菌班雑
種化によってスクリーンされた。ペプチドＮ−１，Ｎ−
３、Ｖ−２及びＴ−１に相当する部分的に重複した補足
オリゴヌクレオチドの一対はアニールされ、Ｋｌｅｎｏ
ｗ小片及び４個の（３２Ｐ ）α−ｄＮＴＰでラヘルさ
れ、そしてライブラリーからのニトロセルローズフィル
ターリフトを調べるために使用された。雑種化及び洗浄
条件は先の記ｉ１ （Ｍａｎｉａｔｉｓ他、同上）のよ
うであった。陽性クローンは溶菌班精製されそして、ｃ
ＤＮＡの挿入人は供給者の指示に従ってヘルパーファー
ジを共感染させて救済された。単及び二重らせんＤＮＡ
配列はジデオキシヌクレオチド（ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ）法によって行なわれた。Ｓａｎｇｅｒ
他、Ｐｒｏｃ、 ＮａｔｌＡｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、
Ｓ、 Ａ、 Ｖｏｌ、 ７４． Ｉｌり、 ５４６３
−５４６７（１９７７）参照。
第８ａ図はプラスミノーゲン賦活体ｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列及びその賦活体のアミノ酸配列を示している。
チド配列及びその賦活体のアミノ酸配列を示している。
ヌクレオチド配列は最長クローンの５′末端からそして
開放読出し枠を通して広がっている。３′未翻訳配列の
ポリ（Ａ）足部で終っている付加８００ｎｔは示されて
いない。ヌクレオチド配列は最初の塩基である計画開始
コドンを持っている各ラインの左で番号付けされる。予
期されたアミノ酸配列は単字コードで示されまた各ライ
ンの右で番号付けされる。
開放読出し枠を通して広がっている。３′未翻訳配列の
ポリ（Ａ）足部で終っている付加８００ｎｔは示されて
いない。ヌクレオチド配列は最初の塩基である計画開始
コドンを持っている各ラインの左で番号付けされる。予
期されたアミノ酸配列は単字コードで示されまた各ライ
ンの右で番号付けされる。
ＢａＬ−ＰＡ（Ｉｆ） 、Ｂａｔ−ＰＡ（Ｉ）及びＢａ
ｔ−ＰＡ（Ｌ） として決定されたアミノ酸配列は下
線を付けそして各ｈＮ−１，Ｎ−２及びＮ−３と名付け
られた。ＢａｔＰＡ（Ｈ）はシグナルペプチドがｔＰＡ
に於けるシグナル解裂と同様な位置で解裂されている全
長型に相当する。Ｂａｔ−ＰＡ（１）はＢａ Ｌ ＰＡ
Ｏｆ） と同じ３個のアミノ酸で始まり、続いてＥ
ＧＦドメインに相当するＮ−２で配列が始まる。だから
、Ｂａｔ−ＰＡ（１）はＢａｔ−ＰＡ（Ｈ）のフィンガ
ーマイナス型に相当する。
ｔ−ＰＡ（Ｌ） として決定されたアミノ酸配列は下
線を付けそして各ｈＮ−１，Ｎ−２及びＮ−３と名付け
られた。ＢａｔＰＡ（Ｈ）はシグナルペプチドがｔＰＡ
に於けるシグナル解裂と同様な位置で解裂されている全
長型に相当する。Ｂａｔ−ＰＡ（１）はＢａ Ｌ ＰＡ
Ｏｆ） と同じ３個のアミノ酸で始まり、続いてＥ
ＧＦドメインに相当するＮ−２で配列が始まる。だから
、Ｂａｔ−ＰＡ（１）はＢａｔ−ＰＡ（Ｈ）のフィンガ
ーマイナス型に相当する。
Ｂａｔ−ＰＡ（Ｌ）の独特のアミノ酸配列は、Ｎ−３の
第２アミノ酸が、ＥＧＦドメインの後で、スレオニンか
らプロリンに変化し、蛋白のフィンガーマイナス型及び
ＥＧＦマイナス型を生ずる事を除いては、同じ３個のア
ミノ酸で始まり、続いてＮ−３で始まるポリペプチドの
部分で始まる。２個のブドウ球菌■８蛋白質分解小片（
■−１、■−２）のアミノ酸配列及びトリプシン小片（
Ｔ−１）もまた下線を付けた。破線の下線は決定できな
かった成はｃＤＮＡから予期されたアミノ酸と一致しな
かったアミノ酸残基を示す。
第２アミノ酸が、ＥＧＦドメインの後で、スレオニンか
らプロリンに変化し、蛋白のフィンガーマイナス型及び
ＥＧＦマイナス型を生ずる事を除いては、同じ３個のア
ミノ酸で始まり、続いてＮ−３で始まるポリペプチドの
部分で始まる。２個のブドウ球菌■８蛋白質分解小片（
■−１、■−２）のアミノ酸配列及びトリプシン小片（
Ｔ−１）もまた下線を付けた。破線の下線は決定できな
かった成はｃＤＮＡから予期されたアミノ酸と一致しな
かったアミノ酸残基を示す。
（’Ｈ） Ｄ Ｉ Ｆ Ｐでラヘルした活性部位Ｓｅｔ
の位置を（＊）で示す。予期されたＮ−結合グリコシル
化部位は４角で囲ったアミノ酸で示す。
の位置を（＊）で示す。予期されたＮ−結合グリコシル
化部位は４角で囲ったアミノ酸で示す。
オリゴヌクレオチドプライマーは、バットＰＡのｃＤＮ
Ａを含む３個のファージクローンを基礎にして合成した
。このバットＰＡｃＤＮＡクローンに対してポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）型増幅（米国特許第４．８００．
１５９号、第２欄第３６〜６８行目、第３〜４欄および
第５欄第１〜２０行目を参照、この文献はここに援用す
る）を行った。
Ａを含む３個のファージクローンを基礎にして合成した
。このバットＰＡｃＤＮＡクローンに対してポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）型増幅（米国特許第４．８００．
１５９号、第２欄第３６〜６８行目、第３〜４欄および
第５欄第１〜２０行目を参照、この文献はここに援用す
る）を行った。
ｃＤＮＡ鎖を加熱により分離し、分離した時点で各々の
鎖に結合するプライマーを加えた。このプライマーは複
製機能を司るＤＮＡポリメラーゼに対して当該鎖の特定
の部分を複製するよう指示するものである。このプロセ
スは一連の加熱及び冷却のサイクル、すなわち加熱して
鎖を分離し、冷却して複製体を生産するサイクルで連続
して行った。この・す゛イクルをくり返して、特定の鎖
の複製体を大量に生産した。増幅により、末端制限部位
が付随したコード領域が得られた。
鎖に結合するプライマーを加えた。このプライマーは複
製機能を司るＤＮＡポリメラーゼに対して当該鎖の特定
の部分を複製するよう指示するものである。このプロセ
スは一連の加熱及び冷却のサイクル、すなわち加熱して
鎖を分離し、冷却して複製体を生産するサイクルで連続
して行った。この・す゛イクルをくり返して、特定の鎖
の複製体を大量に生産した。増幅により、末端制限部位
が付随したコード領域が得られた。
３つのバットプラスミノーゲン賦活体形（バットＰＡ（
Ｉ（）、ハントＰＡ （１）およびバットＰＡ （Ｌ）
）の発現ベクターを以下のようにして調製し、−時的（
ｔｒａｎｓｉｅｎｔ） ）ランスフェクション法（発現
が成功したかどうかを定性的に調べるのに用いる）また
は安定（ｓｔａｂｌｅ） ｈランスフエクション法（
生存クローンを得るのに好適に用いる）にしたがって細
胞へのトランスフェクションを行った。
Ｉ（）、ハントＰＡ （１）およびバットＰＡ （Ｌ）
）の発現ベクターを以下のようにして調製し、−時的（
ｔｒａｎｓｉｅｎｔ） ）ランスフェクション法（発現
が成功したかどうかを定性的に調べるのに用いる）また
は安定（ｓｔａｂｌｅ） ｈランスフエクション法（
生存クローンを得るのに好適に用いる）にしたがって細
胞へのトランスフェクションを行った。
一時的トランスフエクション法では、２．５×１０ｂａ
ｔａ胞／１ ｏ ０ｗｍ皿をトランスフェクション前２
４時間１〇−培地中で培養する。トランスフェクション
の２〜４時間前に培地を変える。濾過して無菌化した組
換えバラ１−ＰＡ−ｐＤ５プラスミドＤＮＡを１００１
皿のそれぞれについて５μｇ／２５０μｍ ６ｄＨｚＯ
の濃度で調製することにより、Ｄ Ｎ Ａ ／ ＣａＰ
Ｏａ沈澱物を調製する。これを０、５ Ｍ ＣａＣ１、
およびｄｄｌｌ□０の５００μＪと混合して最終体積を
１−とする。２ Ｘ ＨＢ Ｓのｌ ｍｌを軽く撹拌し
ながら滴下して加える。この調製物を室温でｌＯ〜３０
分管静置すると、沈澱が軽くうずを巻きながら培養皿の
底に均一に沈降する。この工程の後はトランスフェクシ
ョンされる細胞によって手順が少し異ってくる。ＣＶＩ
細胞は３７℃におよび１０％ ＣＯ□で４時間培養する
が、ＣＯ３７および２９３細胞は３７℃および６％ＣＯ
□で４時間培養する。トランスフェクション４時間後、
２９３細胞の場合は培地を除去する。トランスフェクシ
ョン４゛時間後、ＣＶｌおよびＣＯ３７細胞の場合は２
分間のグリセロールショ・ツク（培地中１５％グリセロ
ール）を与え、ＰＢＳで２回すすぐ。その後、新鮮な培
地を加える。細胞は３７℃で培養し、トランスフェクシ
ョン後２４時間、４８時間、７２時間経過時にアッセイ
を行う。
ｔａ胞／１ ｏ ０ｗｍ皿をトランスフェクション前２
４時間１〇−培地中で培養する。トランスフェクション
の２〜４時間前に培地を変える。濾過して無菌化した組
換えバラ１−ＰＡ−ｐＤ５プラスミドＤＮＡを１００１
皿のそれぞれについて５μｇ／２５０μｍ ６ｄＨｚＯ
の濃度で調製することにより、Ｄ Ｎ Ａ ／ ＣａＰ
Ｏａ沈澱物を調製する。これを０、５ Ｍ ＣａＣ１、
およびｄｄｌｌ□０の５００μＪと混合して最終体積を
１−とする。２ Ｘ ＨＢ Ｓのｌ ｍｌを軽く撹拌し
ながら滴下して加える。この調製物を室温でｌＯ〜３０
分管静置すると、沈澱が軽くうずを巻きながら培養皿の
底に均一に沈降する。この工程の後はトランスフェクシ
ョンされる細胞によって手順が少し異ってくる。ＣＶＩ
細胞は３７℃におよび１０％ ＣＯ□で４時間培養する
が、ＣＯ３７および２９３細胞は３７℃および６％ＣＯ
□で４時間培養する。トランスフェクション４時間後、
２９３細胞の場合は培地を除去する。トランスフェクシ
ョン４゛時間後、ＣＶｌおよびＣＯ３７細胞の場合は２
分間のグリセロールショ・ツク（培地中１５％グリセロ
ール）を与え、ＰＢＳで２回すすぐ。その後、新鮮な培
地を加える。細胞は３７℃で培養し、トランスフェクシ
ョン後２４時間、４８時間、７２時間経過時にアッセイ
を行う。
安定なトランスフェクション法では、上記の一時的トラ
ンスフエクション法と次の点が異なる。
ンスフエクション法と次の点が異なる。
２．５Ｘ１０ｈ／１００ｍ皿ではなく、５Ｘ１０５個細
胞／ １００ ａｍ皿を培養する。Ｇ４１８セレクシヨ
ンのために、Ｎｅｏ発現プラスミド０．５μｇがＤＮＡ
／ＣａＰＯ４沈澱物中に含ませる。細胞は４８時間セレ
クションにかけ、２〜３日おきに培地を変えてやると、
やがてＧ４１８耐性のコロニーが増殖してくる。
胞／ １００ ａｍ皿を培養する。Ｇ４１８セレクシヨ
ンのために、Ｎｅｏ発現プラスミド０．５μｇがＤＮＡ
／ＣａＰＯ４沈澱物中に含ませる。細胞は４８時間セレ
クションにかけ、２〜３日おきに培地を変えてやると、
やがてＧ４１８耐性のコロニーが増殖してくる。
中間体および発現ベクターは、種々のバットプラスミノ
ーゲン賦活体形につき、以下のようにして８周製した。
ーゲン賦活体形につき、以下のようにして８周製した。
■、バットＰＡ （Ｈ）
１．５′天然ＮＴＬ
ハントＰＡ （Ｈ）ｃＤＮＡは、下記に示すオリゴデオ
キシヌクレオチド対１４１＆１４２及び２７＆１９をプ
ライマーとして用いるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により、ｃ
ＤＮＡライブラリーから誘導した。
キシヌクレオチド対１４１＆１４２及び２７＆１９をプ
ライマーとして用いるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により、ｃ
ＤＮＡライブラリーから誘導した。
８μｍ ｎ
１４１ ５ ’ ＞ ＡＴＡ ＴＡＴ
ＡＧＡ ’ｒＣＴ ＡＧＧ ＧＡＣＡＣＣＧＣＡ
ＣＡ八 八１’Ｇ ＧＴＧ ＞ ３ ’Ｓｐｅ
Ｉ ［１μｍ Ｉ！ １４２ ５ ’ ＞ ＡＴＡ ＴＡＴ
ＧＡＧ ＣＴＣＡＧＡ ＴＣＴ ＣＡＧ Ｇ
ＧＡＧＴＴ ＧＣＧ ＴＡＴ ＴＣＴ ＴＧＧ ＞ ３
’Ｈｉｎｄ ｍ Ｓｐｅ １ ２７ ５’＞ 八ＴＡ Ｔへへ ＧＣＴ
Ｔ ＡＣＴＡＧ ＴＡＧ ＧＧＡ ＣＡＣＣＧ
ＣＡＣＡ Ａ紅ＧＧＴＧ＞３’ ｅｔ Ｘｂａｌ Ｓａｃ １ ＰＣＲは、１０ｍＭのトリス（ＪｐＨ８，３，５０ｍＭ
のＫｌ！、１．５ ｍＭのＭｇＣ＃ｚ 、２００ 、Ｉ
ｊＭの各ｄＮＴＰ 。
ＡＧＡ ’ｒＣＴ ＡＧＧ ＧＡＣＡＣＣＧＣＡ
ＣＡ八 八１’Ｇ ＧＴＧ ＞ ３ ’Ｓｐｅ
Ｉ ［１μｍ Ｉ！ １４２ ５ ’ ＞ ＡＴＡ ＴＡＴ
ＧＡＧ ＣＴＣＡＧＡ ＴＣＴ ＣＡＧ Ｇ
ＧＡＧＴＴ ＧＣＧ ＴＡＴ ＴＣＴ ＴＧＧ ＞ ３
’Ｈｉｎｄ ｍ Ｓｐｅ １ ２７ ５’＞ 八ＴＡ Ｔへへ ＧＣＴ
Ｔ ＡＣＴＡＧ ＴＡＧ ＧＧＡ ＣＡＣＣＧ
ＣＡＣＡ Ａ紅ＧＧＴＧ＞３’ ｅｔ Ｘｂａｌ Ｓａｃ １ ＰＣＲは、１０ｍＭのトリス（ＪｐＨ８，３，５０ｍＭ
のＫｌ！、１．５ ｍＭのＭｇＣ＃ｚ 、２００ 、Ｉ
ｊＭの各ｄＮＴＰ 。
１００ピコモルの各ＰＣＲプライマー １０〜１００Ｂ
のｃ ＤＮＡまたはライブラリーＤＮＡ、および２．５
ユニツトのＴａｑポリメラーゼから成る１００μｌの反
応体積で行った。反応はＤＮＡザーモサイクラー（ｔｈ
ｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）中で３０サイクル行うプログラ
ムとした。各ザイクルは９４°Ｃでの２分間の変性、６
０℃での２分間のアニーリングおよび７２℃での２分間
の合成（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａ Ｌｉｏｎ）を含むよう
にした。増幅したｃＤＮＡはゲル精製し、次いでＢｇＡ
ＩＴで切断し、ｐＳＰ７３のＢｇｊ！１１部位に挿入し
た。配列を確Ｌ２し、八ソ１−ＰＡ（ｆ（）の開放読取
り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ）を、
アデノウィルス メジャー し・ｆト プロモーター（
ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ １ａｔｅ ｐｒｏ
ｍｏｔｅｒ）を含む真核細胞性発現ベクターｐＤ５にサ
ブクローニングして、ｐＳＺ８８−１０４−２０を製造
した（第９図参照）。２９３細胞をｐＳ２８８−１０４
−２０でトランスフェクションして、２９３−バットＰ
Ａ−１１１ｉ乳動物細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１０１８
０）を製造した。Ｅ、 ｃｏｌｔ細胞をｐｓ２８Ｂ−１
０４−２０でトランスフェクションして、ＢＰＡ−ＣＮ
−ｐＳＺ８Ｂ−１０４−２０バクテリア細胞（ＡＴＣＣ
番号６８０５０）を製造した。
のｃ ＤＮＡまたはライブラリーＤＮＡ、および２．５
ユニツトのＴａｑポリメラーゼから成る１００μｌの反
応体積で行った。反応はＤＮＡザーモサイクラー（ｔｈ
ｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）中で３０サイクル行うプログラ
ムとした。各ザイクルは９４°Ｃでの２分間の変性、６
０℃での２分間のアニーリングおよび７２℃での２分間
の合成（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａ Ｌｉｏｎ）を含むよう
にした。増幅したｃＤＮＡはゲル精製し、次いでＢｇＡ
ＩＴで切断し、ｐＳＰ７３のＢｇｊ！１１部位に挿入し
た。配列を確Ｌ２し、八ソ１−ＰＡ（ｆ（）の開放読取
り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ）を、
アデノウィルス メジャー し・ｆト プロモーター（
ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ １ａｔｅ ｐｒｏ
ｍｏｔｅｒ）を含む真核細胞性発現ベクターｐＤ５にサ
ブクローニングして、ｐＳＺ８８−１０４−２０を製造
した（第９図参照）。２９３細胞をｐＳ２８８−１０４
−２０でトランスフェクションして、２９３−バットＰ
Ａ−１１１ｉ乳動物細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１０１８
０）を製造した。Ｅ、 ｃｏｌｔ細胞をｐｓ２８Ｂ−１
０４−２０でトランスフェクションして、ＢＰＡ−ＣＮ
−ｐＳＺ８Ｂ−１０４−２０バクテリア細胞（ＡＴＣＣ
番号６８０５０）を製造した。
２、５′コザツク（Ｋｏｚａｋ） Ｎ Ｔ ＬハントＰ
Ａ （Ｈ）ｃＤＮＡを、オリゴデオキシヌクレオチド対
１Ｂ＆１９をプライマーとして用いて、上記のようにＰ
ＣＲ増幅した。
Ａ （Ｈ）ｃＤＮＡを、オリゴデオキシヌクレオチド対
１Ｂ＆１９をプライマーとして用いて、上記のようにＰ
ＣＲ増幅した。
１１ｉｎｄＩ［Ｉ Ｓｐｅ Ｉ Ｎ
ｃｏ ｒ１８ ５’ ＞ ＡＴＡ ＴＡ
Ａ ＧＣＴ ＴＡＣＴＡＧ ＴＣＣＡＣＣＡＴＧ
ＧＴＧｅＬ 八ＡＴ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＣ＞
３’増幅したｃＤＮＡはゲル精製し、次いでＸｂａｌお
よび１ｌｉｎｄ ｍで開裂し、これを中間ベクターｐｓ
Ｐ７３のＸｂａｌおよびｌ１ｉｎｄ Ｉ１１部位間に挿
入して、ｐＳＺ８９−１０９、ｐｓＺ８１−１１０、ｐ
８９Ｗｏ−１０およびｐ８９Ｗｏ−８を製造した。ハン
トＰＡ（■１）開放読取り枠を、当初のＢａｍ１ｌ １
クロ一ニング部位の代わりにマルチクローニング部位を
有するｐ Ｄ ５−ｍｃｓベクターの５ａｃｌ／５ｐｅ
１部位にサブクローニングして、ｐＳＺ８９−１１１−
１７、ｐＳＺ８９−１１２およびｐｓＺ８９−１１３を
製造した（第１０図参照）。
ｃｏ ｒ１８ ５’ ＞ ＡＴＡ ＴＡ
Ａ ＧＣＴ ＴＡＣＴＡＧ ＴＣＣＡＣＣＡＴＧ
ＧＴＧｅＬ 八ＡＴ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＣ＞
３’増幅したｃＤＮＡはゲル精製し、次いでＸｂａｌお
よび１ｌｉｎｄ ｍで開裂し、これを中間ベクターｐｓ
Ｐ７３のＸｂａｌおよびｌ１ｉｎｄ Ｉ１１部位間に挿
入して、ｐＳＺ８９−１０９、ｐｓＺ８１−１１０、ｐ
８９Ｗｏ−１０およびｐ８９Ｗｏ−８を製造した。ハン
トＰＡ（■１）開放読取り枠を、当初のＢａｍ１ｌ １
クロ一ニング部位の代わりにマルチクローニング部位を
有するｐ Ｄ ５−ｍｃｓベクターの５ａｃｌ／５ｐｅ
１部位にサブクローニングして、ｐＳＺ８９−１１１−
１７、ｐＳＺ８９−１１２およびｐｓＺ８９−１１３を
製造した（第１０図参照）。
Ｅ、ｃｏｌｉ １１胞をｐＳＺ８９−１１１−１７でト
ランスフェクションして、Ｂ ＰＡ−ＣＫ−ｐ Ｓ Ｚ
８！−１１１−１７バクテリア細胞（ＡＴＣＣ番号６８
０５２）を製造した。
ランスフェクションして、Ｂ ＰＡ−ＣＫ−ｐ Ｓ Ｚ
８！−１１１−１７バクテリア細胞（ＡＴＣＣ番号６８
０５２）を製造した。
■、ハツトＰＡ（１）
バラ）ＰＡ （ｒ）開放読取り枠は上記と同じＰＣＲ法
によりｃ ＤＮＡライブラリーから誘導し、完全なアイ
ソフオーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）に比べて大きさが小さい
ことにより確認された。天然ＮＴＬを含むバットＰＡ
（１）はオリゴデオキシヌクレオチド対２７＆１９から
誘導し、コザックＮＴＬを含むハツトＰＡ（＋）はオリ
ゴデオキシヌクレオチド対１８＆１９から誘導した。増
幅したバットＰＡ（１）開放読取り枠は、ｔｌｉｎｄ
ｍおよびＸｂａＩで切断してｐＳＰ７３にクローニング
することによりｐ８９Ｗｏ−１４、ｐ８９Ｗｏ−５，６
、ｐ８９ＷＯ−９およびｐ８９Ｗｏ−１２を製造するか
、またはＳｐｅ［および５ａｃＩで切断してｐＤ ５−
ｍｃｓべ・フタ−にクローニングすることによりｐ８９
Ｗ０１、ｐ８９Ｗｏ−２，Ａ、Ｂ、Ｃ，ｐ８９Ｗ。
によりｃ ＤＮＡライブラリーから誘導し、完全なアイ
ソフオーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）に比べて大きさが小さい
ことにより確認された。天然ＮＴＬを含むバットＰＡ
（１）はオリゴデオキシヌクレオチド対２７＆１９から
誘導し、コザックＮＴＬを含むハツトＰＡ（＋）はオリ
ゴデオキシヌクレオチド対１８＆１９から誘導した。増
幅したバットＰＡ（１）開放読取り枠は、ｔｌｉｎｄ
ｍおよびＸｂａＩで切断してｐＳＰ７３にクローニング
することによりｐ８９Ｗｏ−１４、ｐ８９Ｗｏ−５，６
、ｐ８９ＷＯ−９およびｐ８９Ｗｏ−１２を製造するか
、またはＳｐｅ［および５ａｃＩで切断してｐＤ ５−
ｍｃｓべ・フタ−にクローニングすることによりｐ８９
Ｗ０１、ｐ８９Ｗｏ−２，Ａ、Ｂ、Ｃ，ｐ８９Ｗ。
３およびＰ８９ＷＯ−４を製造した（第１１図参照）
ｏ Ｅ、 ｃｏｌｉ細胞をｐ８９−ＷＯ−２Ｃでトラン
スフェクションして、ＢＰＡ−ＦＮ−ｐ ８９Ｗ Ｏ−
２Ｃバクテリア細胞（ＡＴＣＣ番号６８０５３）を製造
した。
ｏ Ｅ、 ｃｏｌｉ細胞をｐ８９−ＷＯ−２Ｃでトラン
スフェクションして、ＢＰＡ−ＦＮ−ｐ ８９Ｗ Ｏ−
２Ｃバクテリア細胞（ＡＴＣＣ番号６８０５３）を製造
した。
■、バットＰＡ （Ｌ）
ハラ）ＰＡ （Ｌ）開放読取り枠は、オリゴデオキシヌ
クレオチド対１Ｂ＆１１．４をプライマーとして用いる
ライブラリーＤＮＡの同様なＰＣＲ増幅により、ｃＤＮ
Ａライブラリーから誘導した。
クレオチド対１Ｂ＆１１．４をプライマーとして用いる
ライブラリーＤＮＡの同様なＰＣＲ増幅により、ｃＤＮ
Ａライブラリーから誘導した。
１１．４ ５ ＞ ＣＣＴ ＴＴＣＴＣＣＴＧＡ Ｔ
ＧＡ ＣＣＴ ＴＣ＞ ３’増幅したＤＮＡは、ゲル精
製してからＮｃｏｌで切断し、３つのＮｃｏ断片のうち
の最小のもの（これがバットＰＡ （Ｌ）の５′部分を
コードする）を再度ゲル精製してｐ８９ＷＯ−１１（ｐ
ＳＰ７３中のバットＰＡ（Ｈ）開放読取り枠）のＮｃａ
ｌ切断部位に挿入し、それぞれｐ８９ＷＰ−１７および
ｐ８９ＷＰ−１８を得た。続いて、バットＰＡ（Ｌ）開
放読取り枠を５ａｃｌおよび５ｐｅｌを用いた開裂によ
り中間ベクターから解放し、ｐＤ５−ｍｃｓベクターに
サブクローニングしてｐ８９Ｗ２ＯＡ＆Ｂおよびｐ ８
９ＷＰ−１９Ａ＆Ｂを製造した（第１２図参照） 、
Ｅ、ｃｏｌｉ細胞をＰ８９ＷＰ＝２ＯＡでトランスフェ
クションしてＢＰＡ−ＤＫ−ｐ ８９Ｗｒ’−２０Ａハ
タテリア細胞（ＡＴＣＣ番号６８０４９）を製造した。
ＧＡ ＣＣＴ ＴＣ＞ ３’増幅したＤＮＡは、ゲル精
製してからＮｃｏｌで切断し、３つのＮｃｏ断片のうち
の最小のもの（これがバットＰＡ （Ｌ）の５′部分を
コードする）を再度ゲル精製してｐ８９ＷＯ−１１（ｐ
ＳＰ７３中のバットＰＡ（Ｈ）開放読取り枠）のＮｃａ
ｌ切断部位に挿入し、それぞれｐ８９ＷＰ−１７および
ｐ８９ＷＰ−１８を得た。続いて、バットＰＡ（Ｌ）開
放読取り枠を５ａｃｌおよび５ｐｅｌを用いた開裂によ
り中間ベクターから解放し、ｐＤ５−ｍｃｓベクターに
サブクローニングしてｐ８９Ｗ２ＯＡ＆Ｂおよびｐ ８
９ＷＰ−１９Ａ＆Ｂを製造した（第１２図参照） 、
Ｅ、ｃｏｌｉ細胞をＰ８９ＷＰ＝２ＯＡでトランスフェ
クションしてＢＰＡ−ＤＫ−ｐ ８９Ｗｒ’−２０Ａハ
タテリア細胞（ＡＴＣＣ番号６８０４９）を製造した。
ＣＯ３−７のトランスフェクション４８ 時間ｆ＆に除
去した調整培地のフィブリン寒天プレー１アツセイは、
バットＰＡ５０ｎｇ／ｍを示した。
去した調整培地のフィブリン寒天プレー１アツセイは、
バットＰＡ５０ｎｇ／ｍを示した。
クローンｐｓ２８Ｅｌ−１０４−２０が最良の発現体で
あることがわかった。このクローンは２９３細胞内で確
立され、バラ）ＰＡ活性／融合性単層（ｃｏｎｆｌｕｅ
ｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を０．５ ｕ ｇ ／ｍｌ
／ｍｌ土日現した。ブチラードへの継続的接触および培
地の最適化により、発現レベルは１０μｇ／ｎｄｌ１日
以上に上がった。他の好適な発現ベクターは、ｐＳＺ８
９−１１１−１７ （ｐＳ２８Ｂ−１０４２０の天然５
’−ＮＴＬではなくコザック５′ＮＴＬによる誘導体）
、ＥＢＶ／ＥＢＮＡ／Ｄ５バットＰＡ−ＣおよびＣＭＶ
Ｉ Ｅ−ＡＫｌ−バットＰＡ−Ｃ，ならびにＨＩＶ
ＬＴＲ／バットＰＡ−Ｃである。
あることがわかった。このクローンは２９３細胞内で確
立され、バラ）ＰＡ活性／融合性単層（ｃｏｎｆｌｕｅ
ｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を０．５ ｕ ｇ ／ｍｌ
／ｍｌ土日現した。ブチラードへの継続的接触および培
地の最適化により、発現レベルは１０μｇ／ｎｄｌ１日
以上に上がった。他の好適な発現ベクターは、ｐＳＺ８
９−１１１−１７ （ｐＳ２８Ｂ−１０４２０の天然５
’−ＮＴＬではなくコザック５′ＮＴＬによる誘導体）
、ＥＢＶ／ＥＢＮＡ／Ｄ５バットＰＡ−ＣおよびＣＭＶ
Ｉ Ｅ−ＡＫｌ−バットＰＡ−Ｃ，ならびにＨＩＶ
ＬＴＲ／バットＰＡ−Ｃである。
ヒト プラスミノーゲン賦活
本発明のバット（Ｂａｔ）−ＰＡ（Ｉｆ）とヒト組織プ
ラスミノーゲン賦活体の主要なアミノ酸配列の比較が以
下に示される。
ラスミノーゲン賦活体の主要なアミノ酸配列の比較が以
下に示される。
ヒトｔ−ＰＡ Ｇ Ａ ＲＳ Ｙ Ｑ
ν ＩＣＲＤＩＥハツト−ＰＡ（Ｉｔ） Ｇ
Ｓ １１ Ａ Ｙ Ｇ Ｖ Ａ ＣＲＤ
ＥＫＴ ロ Ｍ Ｉ Ｙ
Ｑ Ｑ １１ Ｑ Ｓ
ＷＫＴＱＭＩＹロロロＥＳＷ ＬＩ？ＰＶＬＲ３ＮＲＶＥＹ Ｌ ＲＰ ＨＶ ＲＳ Ｋ ＲＶ Ｅ
１１ＣＷ ＣＮ Ｓ Ｇ ＲＡ Ｑ
ＣＩＩ ５ＣＲＣＤＲＧＬ ＾ ロ
ＣＩＩ ＴＶＰＶＫＳＣ５Ｉ！ＰＲＣＦ ＶＰＶＫＳＣＳＥＬＲＣＦ ヒトｔ−ＰＡ Ｎ Ｇ Ｇ Ｔ ＣＱ
Ｎ Ａ Ｌ Ｙ Ｐ Ｓハｙ Ｉ−ＰＡ
（Ｈ） Ｎ Ｇ Ｇ Ｔ Ｉ？ Ｗ Ｎ
Ａ Ａ Ｓ Ｆ ＳＤＦＶＣＮＣＰＥＧＦ
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Ｐ Ｇ Ｖ Ｙ Ｔ Ｋハフ
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Ｐ Ｇ Ｖ Ｙ Ｔ ＫＶＴＮＹＬＤＷ
ｒＲＤＮ ＦＩ ＶＴＮＹＬＧＷＩＲＤＮＭ Ｐ Ｐ ヒトｔＰＡ（配列９−４６）のフィブロネクチン（ｆｉ
ｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）ユビドメインはバット−ＰＡ（Ｉ
Ｉ）配列６−４３を有するホモロジーを持っている。
ν ＩＣＲＤＩＥハツト−ＰＡ（Ｉｔ） Ｇ
Ｓ １１ Ａ Ｙ Ｇ Ｖ Ａ ＣＲＤ
ＥＫＴ ロ Ｍ Ｉ Ｙ
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ｒＲＤＮ ＦＩ ＶＴＮＹＬＧＷＩＲＤＮＭ Ｐ Ｐ ヒトｔＰＡ（配列９−４６）のフィブロネクチン（ｆｉ
ｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）ユビドメインはバット−ＰＡ（Ｉ
Ｉ）配列６−４３を有するホモロジーを持っている。
ヒ）ｔＰＡ（配列４６−９５）の表皮性の生長ファクタ
ードメインはバット−ＰＡ （Ｈ）配列４３−９２を有
するホモロジーを持っている。ヒトｔＰＡ（配列９５−
１７７）の第１のクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメイ
ンはバット−ＰＡ （Ｈ）配列９２−１７４を有する６
７％ホモロジーを持っている。
ードメインはバット−ＰＡ （Ｈ）配列４３−９２を有
するホモロジーを持っている。ヒトｔＰＡ（配列９５−
１７７）の第１のクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメイ
ンはバット−ＰＡ （Ｈ）配列９２−１７４を有する６
７％ホモロジーを持っている。
ヒトｔＰＡ（配列１７ Ｂ−２６５）の第２のクリング
ルはバラ）−ＰＡ （Ｈ）中に相対物をもっていない。
ルはバラ）−ＰＡ （Ｈ）中に相対物をもっていない。
バット−ＰＡ （Ｈ）アミノ酸１７５及び１７６はリシ
ン及びアラニンである。バット−ＰＡ （Ｈ）のアミノ
酸１９０−４４１、“軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）
”はヒトｔＰＡ軽鎖配列２８０５３１を有する７４％ホ
モロジーを持っている。
ン及びアラニンである。バット−ＰＡ （Ｈ）のアミノ
酸１９０−４４１、“軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）
”はヒトｔＰＡ軽鎖配列２８０５３１を有する７４％ホ
モロジーを持っている。
図８ｂはバット−ＰＡ（Ｈ）のアミノ酸配列の概略的な
描写であり、ヒ１−ｔ−ＰＡとの比較である（Ｐｅｎｎ
ｉｃａ等、Ｎａｔｕｒｅ３０１巻、２１４−２２１ペー
ジ（１９８３年））。バット−ＰＡの個々のアミノ酸は
単一レターコードとして示されている。
描写であり、ヒ１−ｔ−ＰＡとの比較である（Ｐｅｎｎ
ｉｃａ等、Ｎａｔｕｒｅ３０１巻、２１４−２２１ペー
ジ（１９８３年））。バット−ＰＡの個々のアミノ酸は
単一レターコードとして示されている。
閉環はバット−ＰＡ （Ｈ）とヒトＬ−ＰＡとの間のア
ミノ酸の同一性を示している。開環は分岐残基を示す。
ミノ酸の同一性を示している。開環は分岐残基を示す。
提室されたジスルフィドパターンはｔＰＡに対するもの
で類推によっている。仮定されたＮ−結合グリコシル化
部位は括弧をつけることによって示される。
で類推によっている。仮定されたＮ−結合グリコシル化
部位は括弧をつけることによって示される。
このプラスミノーゲン賦活体の天然誘導体に加えて本発
明内の他の誘導体はユビドメイン領域（アミノ酸（−３
）−４３）又は外皮生長ファクター領域（アミノ酸４３
−８４）のいずれかを除外したプラスミノーゲン賦活体
である。もう１つの誘導体は突然変異炭水化物所有アミ
ノ酸残基を有するバット−ＰＡ （Ｈ）である。各々は
望ましいプラスミノーゲン賦活化特性を示し、より長い
半減基を有する。
明内の他の誘導体はユビドメイン領域（アミノ酸（−３
）−４３）又は外皮生長ファクター領域（アミノ酸４３
−８４）のいずれかを除外したプラスミノーゲン賦活体
である。もう１つの誘導体は突然変異炭水化物所有アミ
ノ酸残基を有するバット−ＰＡ （Ｈ）である。各々は
望ましいプラスミノーゲン賦活化特性を示し、より長い
半減基を有する。
また本発明の範囲内には軽鎖バット−ＰＡｓ（配列１９
０−４４１）と重鎖ヒトｔＰＡ（配列１−２７８）との
融合たん白質及びプラスミノーゲンを賦活する性質を存
するその誘導体がある。
０−４４１）と重鎖ヒトｔＰＡ（配列１−２７８）との
融合たん白質及びプラスミノーゲンを賦活する性質を存
するその誘導体がある。
バット−ＰＡｓのたん白質分解ドメインはタイプ１プラ
スミノーゲン賦活体阻害剤によって有意には不活性化さ
れないので、融合たん白はヒｌ−）Ｊｌ織プラスミノー
ゲン賦活体よりも改良された医薬的性質をもっていると
いうことが考えられる。
スミノーゲン賦活体阻害剤によって有意には不活性化さ
れないので、融合たん白はヒｌ−）Ｊｌ織プラスミノー
ゲン賦活体よりも改良された医薬的性質をもっていると
いうことが考えられる。
前述の如く、バットプラスミノーゲン賦活体の活性はフ
ィブリンコファクターの存在において著しく刺激される
。フィブリン結合プラスミノーゲンに対するＬＰＡより
も少なくとも９０倍以上選択的であるように思われる。
ィブリンコファクターの存在において著しく刺激される
。フィブリン結合プラスミノーゲンに対するＬＰＡより
も少なくとも９０倍以上選択的であるように思われる。
ｔＰＡの第２のクリングルドメインは活性のフィブリン
誘発刺激を媒介することによって決定的な役割を演する
と信じられるリジン結合部位をもっている。逆に、本発
明の賦活体のアミノ酸配列は、その著しいフィブリン選
択性がｔＰＡの第２のクリングルドメインに類似する部
位の存在のためであるということを現わしている。さら
に、Ｌｙｓ−セファロースへ結合すべきバントプラスミ
ノーゲン賦活体の不能は、リジン結合部位の存在がプラ
スミノーゲンのフィブリン特異賦活に無関係であるとい
うことを示す。
誘発刺激を媒介することによって決定的な役割を演する
と信じられるリジン結合部位をもっている。逆に、本発
明の賦活体のアミノ酸配列は、その著しいフィブリン選
択性がｔＰＡの第２のクリングルドメインに類似する部
位の存在のためであるということを現わしている。さら
に、Ｌｙｓ−セファロースへ結合すべきバントプラスミ
ノーゲン賦活体の不能は、リジン結合部位の存在がプラ
スミノーゲンのフィブリン特異賦活に無関係であるとい
うことを示す。
本発明の賦活体のクリングルドメインは、ｔｐへの第２
のクリングル領域とのその異なりにもかかわらず活性の
フィブリン誘発刺激を媒介する。
のクリングル領域とのその異なりにもかかわらず活性の
フィブリン誘発刺激を媒介する。
賦活体もまたバット酵素のプラスミン惑受性プロセッシ
ング部位の不存在によってｔＰＡから構造的に異なって
いる。
ング部位の不存在によってｔＰＡから構造的に異なって
いる。
上記バラ１−−ＰＡたん白は決定されたＤＮＡ１Ｉ！伝
子及び推論的なアミノ酸配列によって明らかにされてい
る。天然の対立遺伝子の変化が存在すると理解されるで
あろう。これらの変化を、全体的配列の相違によって又
は該配列中のアミノ酸の削除、置換、挿入、逆転又は付
加によって表わすことができる。さらに、グリコシル化
の位置又は度合はホストの細胞的な環境の性質に依存す
るであろう。
子及び推論的なアミノ酸配列によって明らかにされてい
る。天然の対立遺伝子の変化が存在すると理解されるで
あろう。これらの変化を、全体的配列の相違によって又
は該配列中のアミノ酸の削除、置換、挿入、逆転又は付
加によって表わすことができる。さらに、グリコシル化
の位置又は度合はホストの細胞的な環境の性質に依存す
るであろう。
組換え体ＤＮＡ技術の使用によって、種々なバットプラ
スミノーゲン賦活体誘導体を調製できる可能性が存在し
ている。この誘導体は、例えば基礎のＤＮＡの部位に関
する突然変異生成によって得られた単一又は複数のアミ
ノ酸の置換、削除、付加又は置き換えによって修飾され
ている。バットプラスミノーゲン賦活体の誘導体を生じ
るそのようなすべての対立遺伝子変化及び修飾は、本質
的な特徴的なバットプラスミノーゲン賦活体活性が本質
的に影響されないまま残っている限り本発明の範囲内に
含まれる。バットプラスミノーゲン賦活体力９周製され
るが、それは、（１）その第１番目のアミノ酸としてメ
チオニン（ＡＴＣ，出発シグナルコドン挿入のために構
造遺伝子の前にある）を有するものであるか又は（２）
メチオ・ニンが細胞内又は外で開裂される場合、その正
常な第１番目のアミノ酸を有するものであるか、又は（
３）通常のシグナルポリペプチド以外のそのシグナルポ
リペプチド又は複合たん白質のいずれかと共にあって、
シグナルポリペプチド又は複合体は細胞内又は外の環境
で特異的に開裂可能であるものであるか（イギリス特許
出願公開筒２，００７，６７６Ａ号明細書参照）、又は
（４）外側にある余計なあらゆるポリペプチドを開裂す
る必要のない完全な形における直接的な発現によるもの
である。後者は、発現ビヒクルがそのシグナルペプチド
と共にプラスミノーゲン賦活体を発現するようにデザイ
ンされている場合のシグナルペプチドが与えられたホス
トによって除去されないか又は十分には除去できない場
合に特に重要である。とにかく、このように調製された
パットプラスミノーゲン賦活体はその種々な形態におい
て回収されそして種々な血管の状態又は病状の治療用に
それを適合させるレベルまで精製される。
スミノーゲン賦活体誘導体を調製できる可能性が存在し
ている。この誘導体は、例えば基礎のＤＮＡの部位に関
する突然変異生成によって得られた単一又は複数のアミ
ノ酸の置換、削除、付加又は置き換えによって修飾され
ている。バットプラスミノーゲン賦活体の誘導体を生じ
るそのようなすべての対立遺伝子変化及び修飾は、本質
的な特徴的なバットプラスミノーゲン賦活体活性が本質
的に影響されないまま残っている限り本発明の範囲内に
含まれる。バットプラスミノーゲン賦活体力９周製され
るが、それは、（１）その第１番目のアミノ酸としてメ
チオニン（ＡＴＣ，出発シグナルコドン挿入のために構
造遺伝子の前にある）を有するものであるか又は（２）
メチオ・ニンが細胞内又は外で開裂される場合、その正
常な第１番目のアミノ酸を有するものであるか、又は（
３）通常のシグナルポリペプチド以外のそのシグナルポ
リペプチド又は複合たん白質のいずれかと共にあって、
シグナルポリペプチド又は複合体は細胞内又は外の環境
で特異的に開裂可能であるものであるか（イギリス特許
出願公開筒２，００７，６７６Ａ号明細書参照）、又は
（４）外側にある余計なあらゆるポリペプチドを開裂す
る必要のない完全な形における直接的な発現によるもの
である。後者は、発現ビヒクルがそのシグナルペプチド
と共にプラスミノーゲン賦活体を発現するようにデザイ
ンされている場合のシグナルペプチドが与えられたホス
トによって除去されないか又は十分には除去できない場
合に特に重要である。とにかく、このように調製された
パットプラスミノーゲン賦活体はその種々な形態におい
て回収されそして種々な血管の状態又は病状の治療用に
それを適合させるレベルまで精製される。
始濃遺Ｕり肱Ｎ
これらのたん白質を、血流中へ実質的な量を分配するあ
らゆる従来の手段によって投与することができる。今の
ところ静脈内への投与が好ましい経路として考えられて
いる。それらは水中に可溶であり、そのために、溶液で
効果的に投与することができる。
らゆる従来の手段によって投与することができる。今の
ところ静脈内への投与が好ましい経路として考えられて
いる。それらは水中に可溶であり、そのために、溶液で
効果的に投与することができる。
１つの例示的な適用において、適当量の本発明のたん白
質を心臓発作を起した人に静脈内に投与する。血栓消散
を達成するために適当な投与■は２００ｍｇまであり、
好ましくは２５■と１５０ ｍｇの間であり、そしてよ
り好ましくは約２５■と５Ｏｎ＋ｇの間である。
質を心臓発作を起した人に静脈内に投与する。血栓消散
を達成するために適当な投与■は２００ｍｇまであり、
好ましくは２５■と１５０ ｍｇの間であり、そしてよ
り好ましくは約２５■と５Ｏｎ＋ｇの間である。
本たん白質を、数時間に亘る逐次的な注射によって上述
の投与量で適用することもできる。
の投与量で適用することもできる。
本たん白質を血小板凝集害剤と一緒に投与して血栓消散
及び血小板凝集阻害の結合的な効果を得ることかできる
。−緒の投与には血小板凝集阻害剤の静脈内投与があり
、投与量は血小板凝集を阻害するための量、例えば０．
０５−２μＭの間の定常常態のブラスマ濃度を達成する
量である。
及び血小板凝集阻害の結合的な効果を得ることかできる
。−緒の投与には血小板凝集阻害剤の静脈内投与があり
、投与量は血小板凝集を阻害するための量、例えば０．
０５−２μＭの間の定常常態のブラスマ濃度を達成する
量である。
第１図は精製吸血コウモリタブラスミノーゲン賦活体の
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。試料
は吸血コラモリ唾液腺（レーン１及び３）と唾液（レー
ン２及び４）である。各試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ前にエ
ンドグリコシダーゼＦで処理した。レーンｌ及び２：ウ
エスターンブロソティング及び免疫染色、レーン３及び
４：フィブリンオートグラフィー 第２図はｔＰＡ及び４０ｋｄコウモリプラスミノ一ゲン
賦活体タンパク質によって触媒される血小板の乏しい血
漿凝塊の溶解％を示す。 第３図はｔＰＡ及び４０ｋｄコウモリプラスミノ一ゲン
賦活体タンパク質によって触媒される血小板の豊富な血
漿凝塊の溶解％を示す。 第４図は、血漿成分によるプラスミノーゲン賦活体の不
活性化を示す。 第５図は、銀ステイン（ｓｔａｉｎ）及びフィブリンオ
ートグラフィーで同定された４０ｋｄ及び４５ｋｄタン
パク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を示す。 第６図は、Ｂａｔ−ＰＡ及びｔＰＡによって触媒される
血餅溶解を示す。 第７図は、フィブリンのプラスミノーゲン賦活体の結合
を示す。 第８ａ図は、チスイコウモリプラスミノーゲン賦活体ｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列及びプラスミノーゲン賦活体
のアミノ酸配列を示す。 第８ｂ図は吸血コラモリプラスミノーゲン賦活体のアミ
ノ酸配列の図式及びヒｌ−１ＰＡとの比較を示す。 第９図は、既知のプラスミドｐＳＰ７３から誘導され、
Ｂａｔ−ＰＡ（Ｈ）遺伝子配列を含むプラスミドｐ （
８Ｂ）ＳＺ−１００−２０の合成、最後には既知のプラ
スミドｐＤ５から誘導され、Ｂａｔ−ＰＡ（Ｈ）遺伝子
配列を含むプラスミドｐＳ２８Ｂ−１０４−２０の合成
を図形で示す。 第１０図は、既知のプラスミドｐＳＰ７３から誘導され
Ｂａｔ−ＰＡ （Ｈ）遺伝子配列を含むプラスミドｐＳ
Ｚ８９−１０９、ｐＳＺ８９−１１０、ｐ８９Ｗｏ−１
０及びｐ８９Ｗｏ−８及び既知のプラスミドｐＤ５から
誘導され、Ｂａｔ−ＰＡ（Ｈ）遺伝子配列を含むプラス
ミドｐＳＺ８９−１１１、ｐＳＺ８９−１１２及びｐＳ
Ｚ８９−１１３の合成を図形で示す。 第１１図は、既知のプラスミドｐＳＰ７３から誘導され
、Ｂａｔ−ＰＡ（Ｉ）遺伝子配列を含むプラスミドｐ８
９Ｗｏ−１４、ｐ８９Ｗｏ−５，６、ｐ８９Ｗｏ−９及
びｐ８９Ｗ○−１２及び既知のプラスミドｐＤ５から誘
導されＢａｔ−ＰＡ（１）遺伝子配列を含むプラスミド
ｐ８９Ｗｏ−１、ｐ８９ＷＯ−２Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｐ８９Ｗ
Ｏ−３及びｐＱ９ＷＯ−４の合成を図形で示す。 第１２図は、既知のプラスミドｐＤ５から誘導されるρ
８９ＷＰ−２０Ａ＆Ｂ及びｐ ８９ＷＰ１９Ａ＆Ｂ及び
ｐ８９ＷＰ−１７及びｐ ８９ＷＰ１８の合成を各々図
形で示す。ｐ ８９ＷＰ１７はｐ３９Ｗｏ−１１から、
ｐ８９Ｗｏ−１８はｐ８９Ｗｏ−９から得られた。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。試料
は吸血コラモリ唾液腺（レーン１及び３）と唾液（レー
ン２及び４）である。各試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ前にエ
ンドグリコシダーゼＦで処理した。レーンｌ及び２：ウ
エスターンブロソティング及び免疫染色、レーン３及び
４：フィブリンオートグラフィー 第２図はｔＰＡ及び４０ｋｄコウモリプラスミノ一ゲン
賦活体タンパク質によって触媒される血小板の乏しい血
漿凝塊の溶解％を示す。 第３図はｔＰＡ及び４０ｋｄコウモリプラスミノ一ゲン
賦活体タンパク質によって触媒される血小板の豊富な血
漿凝塊の溶解％を示す。 第４図は、血漿成分によるプラスミノーゲン賦活体の不
活性化を示す。 第５図は、銀ステイン（ｓｔａｉｎ）及びフィブリンオ
ートグラフィーで同定された４０ｋｄ及び４５ｋｄタン
パク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を示す。 第６図は、Ｂａｔ−ＰＡ及びｔＰＡによって触媒される
血餅溶解を示す。 第７図は、フィブリンのプラスミノーゲン賦活体の結合
を示す。 第８ａ図は、チスイコウモリプラスミノーゲン賦活体ｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列及びプラスミノーゲン賦活体
のアミノ酸配列を示す。 第８ｂ図は吸血コラモリプラスミノーゲン賦活体のアミ
ノ酸配列の図式及びヒｌ−１ＰＡとの比較を示す。 第９図は、既知のプラスミドｐＳＰ７３から誘導され、
Ｂａｔ−ＰＡ（Ｈ）遺伝子配列を含むプラスミドｐ （
８Ｂ）ＳＺ−１００−２０の合成、最後には既知のプラ
スミドｐＤ５から誘導され、Ｂａｔ−ＰＡ（Ｈ）遺伝子
配列を含むプラスミドｐＳ２８Ｂ−１０４−２０の合成
を図形で示す。 第１０図は、既知のプラスミドｐＳＰ７３から誘導され
Ｂａｔ−ＰＡ （Ｈ）遺伝子配列を含むプラスミドｐＳ
Ｚ８９−１０９、ｐＳＺ８９−１１０、ｐ８９Ｗｏ−１
０及びｐ８９Ｗｏ−８及び既知のプラスミドｐＤ５から
誘導され、Ｂａｔ−ＰＡ（Ｈ）遺伝子配列を含むプラス
ミドｐＳＺ８９−１１１、ｐＳＺ８９−１１２及びｐＳ
Ｚ８９−１１３の合成を図形で示す。 第１１図は、既知のプラスミドｐＳＰ７３から誘導され
、Ｂａｔ−ＰＡ（Ｉ）遺伝子配列を含むプラスミドｐ８
９Ｗｏ−１４、ｐ８９Ｗｏ−５，６、ｐ８９Ｗｏ−９及
びｐ８９Ｗ○−１２及び既知のプラスミドｐＤ５から誘
導されＢａｔ−ＰＡ（１）遺伝子配列を含むプラスミド
ｐ８９Ｗｏ−１、ｐ８９ＷＯ−２Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｐ８９Ｗ
Ｏ−３及びｐＱ９ＷＯ−４の合成を図形で示す。 第１２図は、既知のプラスミドｐＤ５から誘導されるρ
８９ＷＰ−２０Ａ＆Ｂ及びｐ ８９ＷＰ１９Ａ＆Ｂ及び
ｐ８９ＷＰ−１７及びｐ ８９ＷＰ１８の合成を各々図
形で示す。ｐ ８９ＷＰ１７はｐ３９Ｗｏ−１１から、
ｐ８９Ｗｏ−１８はｐ８９Ｗｏ−９から得られた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ａ）プラスミノゲンを賦活するためにフィブリン共
同因子を必要とし、 ｂ）血漿凝塊の溶解を触媒し、 ｃ）血漿凝塊が存在する場合に、ＮａＣｌにより阻害さ
れない、精製グリコシル化プラスミノゲン賦活性タンパ
ク質であって、脱グリコシル化された形態のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分析により決定された分子量が５０，０００ドル
トン未満であるプラスミノゲン賦活性タンパク質。 ２、分子量が約４４，０００ドルトンである請求項１記
載の糖タンパク質。 ３、分子量が約４０，０００ドルトンである請求項１記
載の糖タンパク質。 ４、分子量が約３８，０００ドルトンである請求項１記
載の糖タンパク質。 ５、約８×１０＾３Ｕ／ｕｍｏｌと２５×１０＾３Ｕ／
ｕｍｏｌの間のフィブリン−結合プラスミノゲンに対す
る比プラスミノゲン活性を有する請求項１の糖タンパク
質。 ６、以下のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同関係
を有し、プラスミノゲンを賦活するために、フィブリン
共同因子を必要とするグリコシル化されたプラスミノゲ
ン賦活性タンパク質： 【アミノ酸配列があります】 ７、以下のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同関係
を有し、プラスミノゲンを賦活するために、フィブリン
共同因子を必要とするグリコシル化されたプラスミノゲ
ン賦活性タンパク質： 【アミノ酸配列があります】 ８、以下のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同関係
を有し、プラスミノゲンを賦活するために、フィブリン
共同因子を必要とするグリコシル化されたプラスミノゲ
ン賦活性タンパク質： 【アミノ酸配列があります】 ９、以下のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同関係
を有し、プラスミノゲンを賦活するために、フィブリン
共同因子を必要とするグリコシル化されたプラスミノゲ
ン賦活性タンパク質： 【アミノ酸配列があります】 １０、請求項６の糖タンパク質をコード化しているＤＮ
Ａ配列。 １１、請求項７の糖タンパク質をコード化しているＤＮ
Ａ配列。 １２、請求項８の糖タンパク質をコード化しているＤＮ
Ａ配列。 １３、請求項９の糖タンパク質をコード化しているＤＮ
Ａ配列。 １４、請求項１０の糖タンパク質をコード化しているＤ
ＮＡ配列。 １５、請求項１１の糖タンパク質をコード化しているＤ
ＮＡ配列。 １６、請求項１２糖タンパク質をコード化しているＤＮ
Ａ配列。 １７、請求項１３の糖タンパク質をコード化しているＤ
ＮＡ配列。 １８、請求項１の糖タンパク質の有効量を含むフィブリ
ン結合プラスミノゲンを賦活するための薬学組成物。 １９、請求項１の糖タンパク質と特異的に反応する抗原
。 ２０、５０，０００未満の分子量を有するプラスミノゲ
ン賦活性タンパク質を精製する方法において、（ａ）￥
デスモダス￥￥ロタンダス￥バンパイヤバットからの顎
下腺をホモジナイズし混合物 を形成し、そしてその混合物を遠心分離し て上澄み画分を形成し、 （ｂ）その上澄み画分を清澄化しそして濃縮し、（ｃ）
濃縮物をホスホセルロース陽イオン交換カラム処理をし
て、そのカラムにプラスミ ノゲン賦活体を吸着し、 （ｄ）そのカラムを溶出処理してプラスミノゲン賦活性
タンパク質を含む画分を得、 （ｅ）その画分を合わせ、それを固定化エリトリナトリ
プシン阻害剤を有するアフィニテ ィカラム処理をし、 （ｆ）高圧液体クロマトグラフィーによりプラスミノゲ
ン賦活体を画分し、そして （ｇ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
プラスミノゲン賦活体を分離する ことを含んでなる方法。 ２１、ａ）約５０ｋＤ未満の分子量を有し、ｂ）活性部
位と、ヒト組織プラスミノゲン 賦活体の相当するドメインを少なくとも９０％の相同関
係にあるフィンガー、上皮成長因子及びクリングル１の
ドメインを含み、そして ｃ）プラスミノゲンを賦活化するために、 フィブリン共同因子を必要とするグリコシル化プラスミ
ノゲン賦活性タンパク質。 ２２、フィブリンに結合している請求項２１のタンパク
質。 ２３、含炭水化物アミノ酸残基を変異させる請求項２１
のタンパク質。 ２４、ａ）約５０ｋＤ未満の分子量を有し、ｂ）活性部
位と、ヒト組織プラスミノゲン 賦活体の相当するドメインを少なくとも９０％の相同関
係にある上皮成長因子及びクリングル１のドメインを含
み、そして ｃ）プラスミノゲンを賦活化するために、 フィブリン共同因子を必要とするグリコシル化プラスミ
ノゲン賦活性タンパク質。 ２５、ａ）約５０ｋＤ未満の分子量を有し、ｂ）活性部
位と、ヒト組織プラスミノゲン 賦活体の相当するドメインを少なくとも９０％の相同関
係にあるフィンガー及びクリングル１のドメインを含み
、そして ｃ）プラスミノゲンを賦活化するために、 フィブリン共同因子を必要とするグリコシル化プラスミ
ノゲン賦活性タンパク質。 ２６、ａ）約５０ｋＤ未満の分子量を有し、ｂ）ヒト組
織プラスミノゲン賦活体の相当 するドメインを少なくとも９０％の相同関係にあるクリ
ングル１のドメインを含み、そして ｃ）プラスミノゲンを賦活化するために、 フィブリン共同因子を必要とするグリコシル化プラスミ
ノゲン賦活性タンパク質。 ２７、第８ａ図に示されるアミノ酸１９０−４４１に相
当するアミノ酸配列及び組織タイプのプラスミノゲン賦
活体からの重鎖配列を含むグリコシル化プラスミノゲン
賦活性融解タンパク質であって、タイプ−１のプラスミ
ノゲン賦活体阻害剤の存在下におけるプラスミノゲン賦
活活性が、タイプ−１のプラスミノゲン賦活体阻害剤の
存在下における組織プラスミノゲン賦活体よりも大きい
タンパク質。 ２８、請求項１６のクローニングビヒクルで形質転換さ
れた哺乳類細胞。 ２９、請求項１６のクローニングビヒクルで形質転換さ
れた細菌細胞。
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