JPH0475584A - ヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチド及びその製造法 - Google Patents
ヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチド及びその製造法Info
- Publication number
- JPH0475584A JPH0475584A JP2145369A JP14536990A JPH0475584A JP H0475584 A JPH0475584 A JP H0475584A JP 2145369 A JP2145369 A JP 2145369A JP 14536990 A JP14536990 A JP 14536990A JP H0475584 A JPH0475584 A JP H0475584A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- polypeptide
- human
- dna
- human prourokinase
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、遺伝子工学の手法による、血栓と共有結合能
を有するヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドの製造方
法に関するものであり、該ペプチドは血栓溶解剤として
の機能を有する。
を有するヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドの製造方
法に関するものであり、該ペプチドは血栓溶解剤として
の機能を有する。
ヒトウロキナーゼは人尿中に微量に存在する酵素で、不
活性のプラスミノーゲンをプラスミンに活性化する作用
を有し、生成したプラスミンは血栓を溶解することが出
来る。このためヒトウロキナーゼは血栓症治療薬として
広く臨床使用されている。
活性のプラスミノーゲンをプラスミンに活性化する作用
を有し、生成したプラスミンは血栓を溶解することが出
来る。このためヒトウロキナーゼは血栓症治療薬として
広く臨床使用されている。
しかしヒトウロキナーゼは血栓との親和性が低く、且つ
活性型であるため、血栓部位に存在するプラスミノーゲ
ンのみならず循環血中のプラスミノーゲンをも活性化し
、循環血中に大量にプラスミンを生成する。循環血中に
過剰に生成したプラスミンは血小板の機能変換をもたら
しくプラト（Ｂｌｏｏｄ）第６８巻 ２７５頁 １９８
６年）、フィブリノーゲン、血液凝固第Ｖ及び第■因子
を分解しくプラト（Ｂｌｏｏｄ）第６８巻 １２８０頁
１９８６年）、全身性出血傾向の副作用を惹起し死に
至る危険がある。（ジャーナル・オブ・アメリカン弓リ
ーグ・カルデイオロジー Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ ＣｏｌＣｏ１１ｅａ Ｃａｒｄｉｏｌｏ
ｇｙ、第１Ｏ巻 ９７０頁１９８７年）理想的な血栓症
治療薬は血栓成分を攻撃するが、循環血中の血小板や血
液凝固因子を消費して凝固系の崩壊を起さず、且つ望ま
しい血中半減期を有するものである。近年第二世代の血
栓症治療薬として、ヒトプロウロキナーゼ及び組織ブラ
スミノーゲンアクチベーター（以後ｔＰＡと略称する）
が開発中である。これ等は血栓部位特異的にプラスミノ
ーゲンを活性化する。従って大量投与しても全身性出血
傾向の副作用を惹起させる危険性が少い。しかしヒトプ
ロウロキナーゼはヒトウロキナーゼに比較して血栓親和
性か増しているか、なお不充分である。又ｔＰＡは血中
にインヒビター（プラスミノーゲンアクチベーターイン
ヒビター■）が多量に存在すること、血中半減期か短か
く、大量投与しなければ治療効果が比ないこと、血栓溶
解による動脈再開通後再閉塞を起すことか多い（サーキ
ュレーション： Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ第７３巻３４
７頁１９８６年、ニューイングランド・ジャーナル・オ
ブ・メディシン ： Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ第３１７巻５８１頁
１９８７年）等の欠陥かある。理想的な血栓症治療薬
として、ブラスミノーゲンアクチベーターインヒビター
Ｉで不可逆的に失活されることのないヒトプロウロキナ
ーゼの血栓親和性の増大した物質が想定され、かかる物
質の創製が試みられている。
活性型であるため、血栓部位に存在するプラスミノーゲ
ンのみならず循環血中のプラスミノーゲンをも活性化し
、循環血中に大量にプラスミンを生成する。循環血中に
過剰に生成したプラスミンは血小板の機能変換をもたら
しくプラト（Ｂｌｏｏｄ）第６８巻 ２７５頁 １９８
６年）、フィブリノーゲン、血液凝固第Ｖ及び第■因子
を分解しくプラト（Ｂｌｏｏｄ）第６８巻 １２８０頁
１９８６年）、全身性出血傾向の副作用を惹起し死に
至る危険がある。（ジャーナル・オブ・アメリカン弓リ
ーグ・カルデイオロジー Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ ＣｏｌＣｏ１１ｅａ Ｃａｒｄｉｏｌｏ
ｇｙ、第１Ｏ巻 ９７０頁１９８７年）理想的な血栓症
治療薬は血栓成分を攻撃するが、循環血中の血小板や血
液凝固因子を消費して凝固系の崩壊を起さず、且つ望ま
しい血中半減期を有するものである。近年第二世代の血
栓症治療薬として、ヒトプロウロキナーゼ及び組織ブラ
スミノーゲンアクチベーター（以後ｔＰＡと略称する）
が開発中である。これ等は血栓部位特異的にプラスミノ
ーゲンを活性化する。従って大量投与しても全身性出血
傾向の副作用を惹起させる危険性が少い。しかしヒトプ
ロウロキナーゼはヒトウロキナーゼに比較して血栓親和
性か増しているか、なお不充分である。又ｔＰＡは血中
にインヒビター（プラスミノーゲンアクチベーターイン
ヒビター■）が多量に存在すること、血中半減期か短か
く、大量投与しなければ治療効果が比ないこと、血栓溶
解による動脈再開通後再閉塞を起すことか多い（サーキ
ュレーション： Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ第７３巻３４
７頁１９８６年、ニューイングランド・ジャーナル・オ
ブ・メディシン ： Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ第３１７巻５８１頁
１９８７年）等の欠陥かある。理想的な血栓症治療薬
として、ブラスミノーゲンアクチベーターインヒビター
Ｉで不可逆的に失活されることのないヒトプロウロキナ
ーゼの血栓親和性の増大した物質が想定され、かかる物
質の創製が試みられている。
その第１は、ｔＰＡの血栓親和性が高いのは、そのアミ
ノ酸配列のＮ端側の前半部分にあるとの認識から、この
部分のアミノ酸配列とヒトプロウロキナーゼのプラスミ
ノーゲン活性化の酵素機能を有するヒトプロウロキナー
ゼのＣＩ側後半部分のアミノ酸配列とのキメラ構造の物
質で遺伝子組換技術により創製されている。（ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ第２６２巻 １０８５５頁１９８７年、トロンポンス
・アンド・ヘモスタシス Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎ
ｄ Ｈａｅａ＋ｏｓｔａｓｉｓ 第５４巻 ８９３頁
１９８５年）しがし当物質は期待に反し、血栓に対する
親和性がｔＰＡ程高まっていない。
ノ酸配列のＮ端側の前半部分にあるとの認識から、この
部分のアミノ酸配列とヒトプロウロキナーゼのプラスミ
ノーゲン活性化の酵素機能を有するヒトプロウロキナー
ゼのＣＩ側後半部分のアミノ酸配列とのキメラ構造の物
質で遺伝子組換技術により創製されている。（ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ第２６２巻 １０８５５頁１９８７年、トロンポンス
・アンド・ヘモスタシス Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎ
ｄ Ｈａｅａ＋ｏｓｔａｓｉｓ 第５４巻 ８９３頁
１９８５年）しがし当物質は期待に反し、血栓に対する
親和性がｔＰＡ程高まっていない。
その第２は、プラスミノーゲンの血栓と親和性を示すＮ
ｆｆＡ側約５６０のアミノ酸からなる配列と前記と同様
のヒトプロウロキナーゼのＣ端側後半部分のアミノ酸配
列とを化学的に結合させたキメラ構造の物質である（バ
イオケミストリー：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２５巻
３６０３頁１９８６年）。その第３は血栓の主要成分で
あるフィブリンに対する抗体と、前記と同様のヒトプロ
ウロキナーゼのＣ端側後半部分のアミノ酸配列とを化学
的に結合させたキメラ構造の物質である（クリニカルリ
サーチ・アブストラクト： Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｒｅ５
ｅａｃｈ Ａｂｓｔｒａｃｔ第３６巻 ２６５Ａ 、
１９８８年）。この第２、第３の物質は血栓親和性が向
上し、その結果として血栓症治療効果の向上か期待され
ている。しかし、これら第２、第３の物質を経済的に製
造することは困難である。
ｆｆＡ側約５６０のアミノ酸からなる配列と前記と同様
のヒトプロウロキナーゼのＣ端側後半部分のアミノ酸配
列とを化学的に結合させたキメラ構造の物質である（バ
イオケミストリー：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２５巻
３６０３頁１９８６年）。その第３は血栓の主要成分で
あるフィブリンに対する抗体と、前記と同様のヒトプロ
ウロキナーゼのＣ端側後半部分のアミノ酸配列とを化学
的に結合させたキメラ構造の物質である（クリニカルリ
サーチ・アブストラクト： Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｒｅ５
ｅａｃｈ Ａｂｓｔｒａｃｔ第３６巻 ２６５Ａ 、
１９８８年）。この第２、第３の物質は血栓親和性が向
上し、その結果として血栓症治療効果の向上か期待され
ている。しかし、これら第２、第３の物質を経済的に製
造することは困難である。
又、フィブリノーゲンを化学的にウロキナーゼに架橋結
合させ、フィブリノーゲンを介してフィブリンと結合す
るウロキナーゼ誘導体が報告されている。（ＰＣＴ／５
Ｕ８４１００００８ ：ＷＯ更に、ヒト血液凝固箱 ｘ
■因子の作用により酵素的にフィブリンと共有結合を生
ずるオリゴペプチドが紹介され（ＰＣＴ／ＵＳ ８８１
０２２７６・ＷＯ３９１０００５１）、該オリゴペプチ
ドをウロキナーゼに結合させ血栓親和性を改善させるこ
とが示唆されている。然しなから、本発明者らの研究に
よると、該オリゴペプチドをウロキナーゼに結合させて
もウロキナーゼの血栓親和性はそれ程改善されないとい
う知見を得た。
合させ、フィブリノーゲンを介してフィブリンと結合す
るウロキナーゼ誘導体が報告されている。（ＰＣＴ／５
Ｕ８４１００００８ ：ＷＯ更に、ヒト血液凝固箱 ｘ
■因子の作用により酵素的にフィブリンと共有結合を生
ずるオリゴペプチドが紹介され（ＰＣＴ／ＵＳ ８８１
０２２７６・ＷＯ３９１０００５１）、該オリゴペプチ
ドをウロキナーゼに結合させ血栓親和性を改善させるこ
とが示唆されている。然しなから、本発明者らの研究に
よると、該オリゴペプチドをウロキナーゼに結合させて
もウロキナーゼの血栓親和性はそれ程改善されないとい
う知見を得た。
本発明は、ヒトプロウロキナーゼよりも血栓親和性が優
れたヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドであり、更に
該ポリペプチドを経済的に製造する方法を提供するもの
である。
れたヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドであり、更に
該ポリペプチドを経済的に製造する方法を提供するもの
である。
本発明は、ヒト血液凝固第ｘ■因子の酵素作用により血
栓と縮合して共有結合を生ずる構造を有するオリゴペプ
チド（以下本オリゴペプチドと略称することがある）を
ヒトプロウロキナーゼ誘導体 （以下本ヒトプロウロキ
ナーゼ誘導体と略称することかある）のＮ端側に付した
ヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチド（以下本発明のヒ
トプロウロキナーゼ様ポリペプチドと略称することがあ
る）である。
栓と縮合して共有結合を生ずる構造を有するオリゴペプ
チド（以下本オリゴペプチドと略称することがある）を
ヒトプロウロキナーゼ誘導体 （以下本ヒトプロウロキ
ナーゼ誘導体と略称することかある）のＮ端側に付した
ヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチド（以下本発明のヒ
トプロウロキナーゼ様ポリペプチドと略称することがあ
る）である。
次に、本発明の詳細な説明する。
（Ａ）本オリゴペプチドについて
ヒト生体内には血栓の主要成分であるフィブリンと共有
結合する能力を持つ物質がある。本発明者らは、これら
の代表的物質、Ｇ２．アンチプラスミン、フィブロネク
チン及びフィブリノーゲンγ鎖のアミノ酸配列を詳細に
検討した結果、そのＮ側端１０数ケのアミノ酸配列に・
・・Ｇ１ｎ０ＯＶａ１（又はＬｅｕ）ＯＰｒｏ（又はＧ
ｌｙ）−−−の構造（Ｏはアミノ酸を表す）を有してお
り、かかるアミノ酸配列を有するペプチドか血液凝固第
ＸＩＩＩ因子（活性型）の酵素作用により、フィブリン
等と共有結合を生ずる能力を持っているという知見を得
、本発明を完成した。
結合する能力を持つ物質がある。本発明者らは、これら
の代表的物質、Ｇ２．アンチプラスミン、フィブロネク
チン及びフィブリノーゲンγ鎖のアミノ酸配列を詳細に
検討した結果、そのＮ側端１０数ケのアミノ酸配列に・
・・Ｇ１ｎ０ＯＶａ１（又はＬｅｕ）ＯＰｒｏ（又はＧ
ｌｙ）−−−の構造（Ｏはアミノ酸を表す）を有してお
り、かかるアミノ酸配列を有するペプチドか血液凝固第
ＸＩＩＩ因子（活性型）の酵素作用により、フィブリン
等と共有結合を生ずる能力を持っているという知見を得
、本発明を完成した。
本オリゴペプチドとは、血液凝固第 ＸＩ［［因子（活
性型）の酵素作用により血栓と縮合して共有結合を生ず
る構造を有するオリゴマーであれば良く、具体的には・
・・Ｇｌ口○○Ｖａｌ（又はＬｅｕ）○Ｐｒ０（又はＧ
ｌｙ）・・・の構造を有するものであり、本発明の主旨
から、フィブリノーゲンγ鎖、Ｇ２ ・アンチプラスミ
ン及びフィブロネクチン各々のＮ端のオリゴペプチドに
限定されない０ 本オリゴペプチドの好ましい具体例として下記が挙げら
れる。
性型）の酵素作用により血栓と縮合して共有結合を生ず
る構造を有するオリゴマーであれば良く、具体的には・
・・Ｇｌ口○○Ｖａｌ（又はＬｅｕ）○Ｐｒ０（又はＧ
ｌｙ）・・・の構造を有するものであり、本発明の主旨
から、フィブリノーゲンγ鎖、Ｇ２ ・アンチプラスミ
ン及びフィブロネクチン各々のＮ端のオリゴペプチドに
限定されない０ 本オリゴペプチドの好ましい具体例として下記が挙げら
れる。
本オリゴペブチＦ 名 ア ミ ノ 酸配列Ａ
（Ｍｅｔ、 ）Ａｓｎ、 Ｇｌｎ、 Ｇｌｕ
、 Ｇｌｎ、 Ｖａｔ、 Ｓｅｒ。
（Ｍｅｔ、 ）Ａｓｎ、 Ｇｌｎ、 Ｇｌｕ
、 Ｇｌｎ、 Ｖａｔ、 Ｓｅｒ。
Ｐｒｏ、Ｌｅｕ 丁ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、ＬｙｓＦ
（Ｎｅ ｔ、 ）Ｇ ｌｒ＋、Ａｌａ
、 Ｇ Ｉｎ、 Ｇ Ｉｎ、 Ｍｅ ｔ、 ｖａ ＩＧ
Ｉｎ、 Ｐｒｏ、 Ｇ Ｉｎ、 Ｓｅｒ、 Ｐｒｏ、
Ｖａ １． Ａ ｌａ。
（Ｎｅ ｔ、 ）Ｇ ｌｒ＋、Ａｌａ
、 Ｇ Ｉｎ、 Ｇ Ｉｎ、 Ｍｅ ｔ、 ｖａ ＩＧ
Ｉｎ、 Ｐｒｏ、 Ｇ Ｉｎ、 Ｓｅｒ、 Ｐｒｏ、
Ｖａ １． Ａ ｌａ。
Ｖａｌ、Ｌｙｓ
（Ｍｅｌ ）Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｍｅｌ Ｖａｌ
、ＧｌｎＰｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ（Ｍｅｔ、）Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＭｅｔＪａ
ｌ、ＧｌｎＰｒｏ、’ＧＩｎ、Ｔｂｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ
、Ｌｙｓ。
、ＧｌｎＰｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ（Ｍｅｔ、）Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＭｅｔＪａ
ｌ、ＧｌｎＰｒｏ、’ＧＩｎ、Ｔｂｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ
、Ｌｙｓ。
（Ｍｅｔ、）ＧＩｎ、Ｇｌｕ、ＧＩｎ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ
、Ｐｒｏ。
、Ｐｒｏ。
Ｇｉｎ、 Ｔｈｒ、 Ｌｅｕ、 Ｌｅｕ、 Ｌｙｓ。
（Ｍｅｔ、）Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｉｎ、Ｖａｌ
、Ｓｅｒ。
、Ｓｅｒ。
Ｐｒｏ、Ｇｉｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（Ｍ
ｅＬ、 ）Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、 Ａｓｎ、Ｖａｌ
、 ５ｅｒＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、
Ｌｙｓ。
ｅＬ、 ）Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、 Ａｓｎ、Ｖａｌ
、 ５ｅｒＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、
Ｌｙｓ。
（Ｍｅｔ、）Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、ｌ／ａ
１．Ｓｅｒ。
１．Ｓｅｒ。
Ｐｒｏ、［；］ｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ。
（Ｍｅｔ）は場合によって存在することがあるメチすＶ
喀 Ｖ＋ ｔ ■ 。
喀 Ｖ＋ ｔ ■ 。
ｉ
ｓ
ニン
（Ｂ）本ヒトプロウロキナーゼ誘導体について斯かる誘
導体としてヒトプロウロキナーゼの全アミノ酸配列を含
むものでなくとも良く、プラスミノーゲン活性化の酵素
機能が発揮されるのに必要充分な領域のアミノ酸配列を
含むものであれば良く、（例えばヒトプロウロキナーゼ
アミノ酸配列１位のセリンから３位のグルタミン酸まで
、或いは１位のセリンから１４３位のグルタミン酸まで
が欠失したもの）又アミノ酸の一部が望ましい態様に変
更された［例えば１３５位のリジン及び１５６位のアル
ギニンのどちらか一方又は両方が塩基性アミノ酸以外の
アミノ酸（例えばグルタミン）に変更されたもの及び１
５７位のフェニルアラニンが酸性アミノ酸（例えばアス
パラギン酸）に変更されたちの］ヒトプロつロキナーゼ
誘導体でも良い。
導体としてヒトプロウロキナーゼの全アミノ酸配列を含
むものでなくとも良く、プラスミノーゲン活性化の酵素
機能が発揮されるのに必要充分な領域のアミノ酸配列を
含むものであれば良く、（例えばヒトプロウロキナーゼ
アミノ酸配列１位のセリンから３位のグルタミン酸まで
、或いは１位のセリンから１４３位のグルタミン酸まで
が欠失したもの）又アミノ酸の一部が望ましい態様に変
更された［例えば１３５位のリジン及び１５６位のアル
ギニンのどちらか一方又は両方が塩基性アミノ酸以外の
アミノ酸（例えばグルタミン）に変更されたもの及び１
５７位のフェニルアラニンが酸性アミノ酸（例えばアス
パラギン酸）に変更されたちの］ヒトプロつロキナーゼ
誘導体でも良い。
（Ｃ）本発明のヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドに
ついて 本発明のヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドは本ヒト
プロウロキナーゼ誘導体と本オリゴペプチドとの組合わ
せで、多種類出来るが、好ましい具体例として天然型ヒ
トプロウロキナーゼのアミノ酸配列と並行して示す。但
し、アミノ酸配列は天然型ヒトプロウロキナーゼのアミ
ノ酸配列と異なる部分及びその周辺のアミノ酸配列を１
文字略号で示した。
ついて 本発明のヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドは本ヒト
プロウロキナーゼ誘導体と本オリゴペプチドとの組合わ
せで、多種類出来るが、好ましい具体例として天然型ヒ
トプロウロキナーゼのアミノ酸配列と並行して示す。但
し、アミノ酸配列は天然型ヒトプロウロキナーゼのアミ
ノ酸配列と異なる部分及びその周辺のアミノ酸配列を１
文字略号で示した。
・・・ ＲＰ ＲＦ Ｋ ｌ’ Ｉ Ｇ Ｇ ・・・
本発明の ヒトプロウロキナーゼ様 ポリペブチ「名 称 ＡＨＵＫ（ｑ、ｑ） （Ｍ）ＮＱＩ！ＱＶＳＰＬＴＬＩＪＬＳＮＥＬＨＱＶＰ
・・−ＧＱＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ Ｒ
ＰＱＰＫＩＩＧＧ・・・ ＡＰ（ＩＫ（ｑ、 ｑ） （Ｍ）ＮＱＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫ［、ＦＩＱＶＰ −
−−ＧＱＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＱＦ
ＫＩＩＧＧ・・・ ＡＰＵＫ（ｋ、ｑ） （Ｍ）ＮＱＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫＬ）ＩＱＶＰ −・
−ＧＫＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＱＦＫ
ＩＩＧＧ・・・ ＡＰＩＩＸ （ｋ、ｄ） （Ｍ）ＮＱＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫＬＨＱＶＰ −−−
ＧＫＫＰＳＳＰＰＥＦ！ＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＲＤＫ
、ＩＩＧＧ・・・ 八ＰＵＫ（ｋ、ｋ） （Ｍ）ＮＱＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫＬＨＱＶＰ −−−
ＧＫＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＲＦＫＩ
ＩＧＧ ・・・ＦＰ［ＪＫ（４，４） （Ｍ）ＱＡＱＱＭＶＱＰＱＳＰＶＡＶＫＬ）ＩＱＶＰ
−・−ＧＱＫＰＳＳＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＱ
ＦＫＩＩＧＧ・・・ Ｖ、ＰＵＫ（ｋ、 ｑ） （Ｍ）ＡＱＫＭＶＧＰＬＴＬＩＪＬ）ＩＱＶＰ −−
−ＧＫＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＱＦＫ
ＩＩＧＧ・・・ ＶｆＰＩＩＫ（ｋ、 Ｑ） （Ｍ）ＡＱＫＭＶＧＰＱＴＬＬＪＬＩ（ＱＶＰ −−
−ＧＫＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＱＦＫ
Ｉ ＩＧＧ・・・ＡＣＵＫ（−、Ｑ）
（Ｍ）ＮＱＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫＬＫＦＱ
Ｃ・・・ ＲＰＱＦＫＩＩＧＧ・・・ ｐｃＵＫ（−、ｑ） （Ｍ）ＱＡ
ＱＱＭＶＱＰＱＳＰＶＡＶＫＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＱ
ＦＫＩＩＧＧ・・・ （Ｍ）は場合によって存在するメチオニン（Ｄ）本発明
のヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドの遺伝子系と製
造方法について、 本発明のヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドをコード
するＤＮＡセグメントは、ヒト血液凝固第ｘ■因子（活
性型）の酵素作用により血栓（主要成分フィブリン等）
と共有結合を生ずる構造を有するオリゴペプチド（本オ
リゴペプチド）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと本
ヒトプロウロキナーゼ誘導体のアミノ酸配列をフードす
るＤＮＡとを連結したものから成る。
本発明の ヒトプロウロキナーゼ様 ポリペブチ「名 称 ＡＨＵＫ（ｑ、ｑ） （Ｍ）ＮＱＩ！ＱＶＳＰＬＴＬＩＪＬＳＮＥＬＨＱＶＰ
・・−ＧＱＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ Ｒ
ＰＱＰＫＩＩＧＧ・・・ ＡＰ（ＩＫ（ｑ、 ｑ） （Ｍ）ＮＱＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫ［、ＦＩＱＶＰ −
−−ＧＱＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＱＦ
ＫＩＩＧＧ・・・ ＡＰＵＫ（ｋ、ｑ） （Ｍ）ＮＱＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫＬ）ＩＱＶＰ −・
−ＧＫＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＱＦＫ
ＩＩＧＧ・・・ ＡＰＩＩＸ （ｋ、ｄ） （Ｍ）ＮＱＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫＬＨＱＶＰ −−−
ＧＫＫＰＳＳＰＰＥＦ！ＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＲＤＫ
、ＩＩＧＧ・・・ 八ＰＵＫ（ｋ、ｋ） （Ｍ）ＮＱＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫＬＨＱＶＰ −−−
ＧＫＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＲＦＫＩ
ＩＧＧ ・・・ＦＰ［ＪＫ（４，４） （Ｍ）ＱＡＱＱＭＶＱＰＱＳＰＶＡＶＫＬ）ＩＱＶＰ
−・−ＧＱＫＰＳＳＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＱ
ＦＫＩＩＧＧ・・・ Ｖ、ＰＵＫ（ｋ、 ｑ） （Ｍ）ＡＱＫＭＶＧＰＬＴＬＩＪＬ）ＩＱＶＰ −−
−ＧＫＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＱＦＫ
ＩＩＧＧ・・・ ＶｆＰＩＩＫ（ｋ、 Ｑ） （Ｍ）ＡＱＫＭＶＧＰＱＴＬＬＪＬＩ（ＱＶＰ −−
−ＧＫＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＱＦＫ
Ｉ ＩＧＧ・・・ＡＣＵＫ（−、Ｑ）
（Ｍ）ＮＱＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫＬＫＦＱ
Ｃ・・・ ＲＰＱＦＫＩＩＧＧ・・・ ｐｃＵＫ（−、ｑ） （Ｍ）ＱＡ
ＱＱＭＶＱＰＱＳＰＶＡＶＫＬＫＦＱＣ・・・ ＲＰＱ
ＦＫＩＩＧＧ・・・ （Ｍ）は場合によって存在するメチオニン（Ｄ）本発明
のヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドの遺伝子系と製
造方法について、 本発明のヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドをコード
するＤＮＡセグメントは、ヒト血液凝固第ｘ■因子（活
性型）の酵素作用により血栓（主要成分フィブリン等）
と共有結合を生ずる構造を有するオリゴペプチド（本オ
リゴペプチド）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと本
ヒトプロウロキナーゼ誘導体のアミノ酸配列をフードす
るＤＮＡとを連結したものから成る。
本オリゴペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは
、各アミノ酸をコードするコドンを連続させたもので、
そのコドンは各アミノ酸の全てのコドンが使用し得るが
、望ましくは使用する宿主内で容易に発現され得るコド
ンを用いると共に、それらコドンの連続によってメツセ
ンジャーＲＮＡレベルの折り壁構造を形成しないコドン
を用いること望ましく、それ等望ましい態様に設計され
たＤＮＡセグメントは合成により容易に作ることが出来
る。
、各アミノ酸をコードするコドンを連続させたもので、
そのコドンは各アミノ酸の全てのコドンが使用し得るが
、望ましくは使用する宿主内で容易に発現され得るコド
ンを用いると共に、それらコドンの連続によってメツセ
ンジャーＲＮＡレベルの折り壁構造を形成しないコドン
を用いること望ましく、それ等望ましい態様に設計され
たＤＮＡセグメントは合成により容易に作ることが出来
る。
本オリゴペプチドをコードするＤＮＡセグメントの好ま
しい例を次に述べる。
しい例を次に述べる。
本オリゴペプチド名
＾ アミノ酸配列 （Ｍｅｔ） Ａｓｎ、Ｇｌ＋＋、Ｇ
ｌｕ、ＧｌｎＪａｌ、Ｓｅｒ。
ｌｕ、ＧｌｎＪａｌ、Ｓｅｒ。
ＤＮＡ ＡＴＧ、 ＡＡＣ，ＣＡＧ、ＧＡＡ、
ＣＡＧ、ＧＴＧ、ＴＣＴＰｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｌｅ
ｕ、Ｌｅｕ、ＬｙｓＣＣＧ、 ＴＴＧ、 ＡＣＴ、 Ｔ
ＴＧ、 ＣＴＴ、 ＡＡＧ。
ＣＡＧ、ＧＴＧ、ＴＣＴＰｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｌｅ
ｕ、Ｌｅｕ、ＬｙｓＣＣＧ、 ＴＴＧ、 ＡＣＴ、 Ｔ
ＴＧ、 ＣＴＴ、 ＡＡＧ。
Ｆ アミノ酸配列 （Ｎｅｔ） ＧＩｎ、Ａｌａ、ＧＩ
ｎ、Ｇｌｎ、ＭｅＬ、ＶａＤＮＡ ＡＴＧ、
ＣＡＧ、ＧＣＡ、ＣＡＡ、ＣＡＧ、ＡＴ［；、ＧＴＴＧ
ｉｎ、 Ｐｒｏ、 Ｇｌｎ、 Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ
、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｙｓＣＡＡ、 ＣＣＴ、 ＣＡＧ
、 ＴＣＡ、 ＣＣＧ、 ＧＴＴ、 ＧＣＴ、 ＧＴＴ
、 ＡＡＣ。
ｎ、Ｇｌｎ、ＭｅＬ、ＶａＤＮＡ ＡＴＧ、
ＣＡＧ、ＧＣＡ、ＣＡＡ、ＣＡＧ、ＡＴ［；、ＧＴＴＧ
ｉｎ、 Ｐｒｏ、 Ｇｌｎ、 Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ
、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｙｓＣＡＡ、 ＣＣＴ、 ＣＡＧ
、 ＴＣＡ、 ＣＣＧ、 ＧＴＴ、 ＧＣＴ、 ＧＴＴ
、 ＡＡＣ。
ｖｌ アミノ酸配列 （Ｍｅｔ、）Ａｌａ、ＧＩｎ、
Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇ１ｎＤＮＡ ＡＴ
Ｇ、 ＧＣＡ、ＣＡＡ、ＡＡＡ、ＡＴＧ、ＧＴＴ、ＣＡ
ＧＰｒｏ、 Ｌｅｕ、 Ｔｈｒ、 Ｌｅｕ、 Ｌｅｕ、
ＬｙｓＣＣＧ、 ＣＴＧ、 ＡＣＣ，ＴＴに、 ＣＴＴ
、 ＡＡＧ■、アミノ酸配列 （Ｍｅｔ、 ）Ａ ｌａ
、 Ｇ Ｉｎ、 Ｌｙｓ、 Ｍｅｔ、 Ｖａ １． Ｇ
ＩｎＤＮＡ ＡＴＧ、 ＧＣＡ、 ＣＡＡ、
ＡＡＡ、 ＡＴＧ、 ＧＴＴ、 ＣＡＧＰｒｏ、ＧＩｎ
、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ＬｅｕｌｙｓＣＣＧ ＣＡＡ、ＡＣ
Ｔ、 ＣＴＴ、 ＣＴＴ、 ＡＡＧＶＪアミノ酸配列
（Ｍｅｔ）、 Ｇｌｎ、 Ｇｌｕ、 Ｇｉｎ、 Ｖａｌ
、 Ｓｅｒ、 Ｐｒ。
Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇ１ｎＤＮＡ ＡＴ
Ｇ、 ＧＣＡ、ＣＡＡ、ＡＡＡ、ＡＴＧ、ＧＴＴ、ＣＡ
ＧＰｒｏ、 Ｌｅｕ、 Ｔｈｒ、 Ｌｅｕ、 Ｌｅｕ、
ＬｙｓＣＣＧ、 ＣＴＧ、 ＡＣＣ，ＴＴに、 ＣＴＴ
、 ＡＡＧ■、アミノ酸配列 （Ｍｅｔ、 ）Ａ ｌａ
、 Ｇ Ｉｎ、 Ｌｙｓ、 Ｍｅｔ、 Ｖａ １． Ｇ
ＩｎＤＮＡ ＡＴＧ、 ＧＣＡ、 ＣＡＡ、
ＡＡＡ、 ＡＴＧ、 ＧＴＴ、 ＣＡＧＰｒｏ、ＧＩｎ
、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ＬｅｕｌｙｓＣＣＧ ＣＡＡ、ＡＣ
Ｔ、 ＣＴＴ、 ＣＴＴ、 ＡＡＧＶＪアミノ酸配列
（Ｍｅｔ）、 Ｇｌｎ、 Ｇｌｕ、 Ｇｉｎ、 Ｖａｌ
、 Ｓｅｒ、 Ｐｒ。
ＤＮＡ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＡＡ ＣＡＧ
ＧＴＧ ＴＣＴ ＣＣＧＧｌｎ、 Ｔｈｒ、 Ｌｅｕ、
Ｌｅａ、 Ｌｙｓ。
ＧＴＧ ＴＣＴ ＣＣＧＧｌｎ、 Ｔｈｒ、 Ｌｅｕ、
Ｌｅａ、 Ｌｙｓ。
ＣＡＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＣＴＴ ＡＡＧＶ、
７ミ／酸配列 （Ｍｅｔ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、
ＧＩｎ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ。
７ミ／酸配列 （Ｍｅｔ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、
ＧＩｎ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ。
ＤＮＡ ＡＴＧ ＡＡＣＣＡＧ
ＧＡＣＣＡＧ ＧＴＧ ＴＣＴＰｒｏ、Ｇｌｎ、
Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、ＬｙｓＣＣＧ ＣＡＧ
ＡＣＴ ＴＴＧ ＣＴＴ ＡＡＧＶｓ７ミノ酸配
列 （Ｍｅｔ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｖ
ａｌ、Ｓｅｒ。
ＧＡＣＣＡＧ ＧＴＧ ＴＣＴＰｒｏ、Ｇｌｎ、
Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、ＬｙｓＣＣＧ ＣＡＧ
ＡＣＴ ＴＴＧ ＣＴＴ ＡＡＧＶｓ７ミノ酸配
列 （Ｍｅｔ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｖ
ａｌ、Ｓｅｒ。
ＤＮＡ ＡＴＧ ＡＡＣＣＡＧ
ＧＡＡ ＡＡＣｆ、ＴＧ ＴＣＴＰｒｏ、ＧＩｎ
、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ。
ＧＡＡ ＡＡＣｆ、ＴＧ ＴＣＴＰｒｏ、ＧＩｎ
、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ。
ＣＣＧ ＣＡＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＣＴＴ
ＡＡＧＶ、アミノ酸配列 （Ｎｅｔ）、Ａｓｎ、 Ｇｉ
ｎ、 Ｓｅｒ、 Ｍｅｌ Ｖａｔ、 Ｓｅｒ。
ＡＡＧＶ、アミノ酸配列 （Ｎｅｔ）、Ａｓｎ、 Ｇｉ
ｎ、 Ｓｅｒ、 Ｍｅｌ Ｖａｔ、 Ｓｅｒ。
ＤＮＡ ＡＴＧ ＡＡＣＣＡＡ
ＴＣＴ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＣＴＰｒｏ、Ｇｌ
ｏ、Ｔｂｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ。
ＴＣＴ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＣＴＰｒｏ、Ｇｌ
ｏ、Ｔｂｒ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ。
ＣＣＧ ＣＡＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＣＴＴ
ＡＡＧ（Ｍｅｔ）は場合によって存在するメチオニン本
ヒトプロウロキナーゼ誘導体をコードするＤＮＡセグメ
ントは、天然のヒトプロウロキナーゼをコードするＤＮ
Ａから得られる。その場合、天然ヒトプロウロキナーゼ
をコードするＤＮＡをそのまま用いても良いが使用する
宿主内で容易に発現出来るコドンに、又メツセンジャー
ＲＮＡレベルの折り畳構造を形成しないコドンに変更し
て用いると更に好ましい結果が得られる。
ＡＡＧ（Ｍｅｔ）は場合によって存在するメチオニン本
ヒトプロウロキナーゼ誘導体をコードするＤＮＡセグメ
ントは、天然のヒトプロウロキナーゼをコードするＤＮ
Ａから得られる。その場合、天然ヒトプロウロキナーゼ
をコードするＤＮＡをそのまま用いても良いが使用する
宿主内で容易に発現出来るコドンに、又メツセンジャー
ＲＮＡレベルの折り畳構造を形成しないコドンに変更し
て用いると更に好ましい結果が得られる。
又、１位セリンから３位グルタミン酸までを欠失させた
ヒトプロウロキナーゼを用いた場合、欠失の無いヒトプ
ロウロキナーゼを用いた場合よりも大腸菌菌体内に多量
に生産・蓄積される。
ヒトプロウロキナーゼを用いた場合、欠失の無いヒトプ
ロウロキナーゼを用いた場合よりも大腸菌菌体内に多量
に生産・蓄積される。
本ヒトプロウロキナーゼ誘導体の好ましい具体例を述べ
ると、 （１） 天然ヒトプロウロキナーゼアミノ酸配列のＮ
端より２位〜８位のアミノ酸をコードするコドンが下記
ｌのコドンであるもの、（１位〜３位のアミノ酸を欠失
したヒトプロウロキナーゼの場合は４位のＬｅｕ〜８位
のＰｒｏアミノ酸をコードするコドン） １、Ａｓｎ”、Ｇｆｕ″Ｌｅｕ’、Ｈｉｓ’、ＧＩｎ”
、Ｖａｌ’。Ｐｒｏ”。
ると、 （１） 天然ヒトプロウロキナーゼアミノ酸配列のＮ
端より２位〜８位のアミノ酸をコードするコドンが下記
ｌのコドンであるもの、（１位〜３位のアミノ酸を欠失
したヒトプロウロキナーゼの場合は４位のＬｅｕ〜８位
のＰｒｏアミノ酸をコードするコドン） １、Ａｓｎ”、Ｇｆｕ″Ｌｅｕ’、Ｈｉｓ’、ＧＩｎ”
、Ｖａｌ’。Ｐｒｏ”。
ＡＡＣ，ＧＡＧ、 ＣＴＣ，ＣＡＣ，ＣＡＧ、 Ｇ
ＴＴ、 ＣＣＧ（２）１位のセリンから１４３位のグ
ルタミン酸までを欠失したヒトプロウロキナーゼ誘導体
の場合１４４位及び１４５位相当のロイシン・リジンを
コードするコドンが２のコドンであるもの２、 Ｌｅ
、ｌ（４、ＬｙｓＩｔｓ ＣＴＣ，ＡＡＧ ｆ３）１５６位のアルギニンをグルタミンに変更したヒ
トプロウロキナーゼ誘導体の場合１５６位のグルタミン
から１６２位のグリシン塩のアミノ酸をコードするコド
ンが３のコドンであるもの３、 ０１ｎ”’、Ｐｈｅ”
’、Ｌｙｓ”’、Ｌｌｅ１ｓ’、Ｌｌｅ”’ＣＡＧ、
ＴＴＴ、 ＡＡＡ、 ＡＴＣ，ＡＴＴ。
ＴＴ、 ＣＣＧ（２）１位のセリンから１４３位のグ
ルタミン酸までを欠失したヒトプロウロキナーゼ誘導体
の場合１４４位及び１４５位相当のロイシン・リジンを
コードするコドンが２のコドンであるもの２、 Ｌｅ
、ｌ（４、ＬｙｓＩｔｓ ＣＴＣ，ＡＡＧ ｆ３）１５６位のアルギニンをグルタミンに変更したヒ
トプロウロキナーゼ誘導体の場合１５６位のグルタミン
から１６２位のグリシン塩のアミノ酸をコードするコド
ンが３のコドンであるもの３、 ０１ｎ”’、Ｐｈｅ”
’、Ｌｙｓ”’、Ｌｌｅ１ｓ’、Ｌｌｅ”’ＣＡＧ、
ＴＴＴ、 ＡＡＡ、 ＡＴＣ，ＡＴＴ。
ＧｌｙｌＩｌ、ＧｌｙｌＩｌ
ＧＧＣ，ＧＧＣ。
本発明のヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドをコード
するＤＮＡフラグメントは発現型プラスミドに組換えら
れる。具体的ＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配
列を第５図（ＦｃＵＫ（−、ｑ）、第６図（ＡＨＵＫ
（Ｑ、 Ｑ））、第７図（八ＰＵＫ（ｋ、 ｋ）及び第
８図（ＡＰＵＫ（ｋ、 ｑ））に示す。その発現型プラ
スミドの導入で形質転換された組換体（宿主細胞）を培
養することにより、宿主細胞又は培養液中に目的物質が
蓄積する。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、目的物
質は通常超音波又はゴーリンホモゲナイザ等による菌体
破砕後に不溶性の凝集物として回収される。
するＤＮＡフラグメントは発現型プラスミドに組換えら
れる。具体的ＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配
列を第５図（ＦｃＵＫ（−、ｑ）、第６図（ＡＨＵＫ
（Ｑ、 Ｑ））、第７図（八ＰＵＫ（ｋ、 ｋ）及び第
８図（ＡＰＵＫ（ｋ、 ｑ））に示す。その発現型プラ
スミドの導入で形質転換された組換体（宿主細胞）を培
養することにより、宿主細胞又は培養液中に目的物質が
蓄積する。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、目的物
質は通常超音波又はゴーリンホモゲナイザ等による菌体
破砕後に不溶性の凝集物として回収される。
この凝集物を例えば塩酸グアニジノ又は尿素等の水溶液
に溶解後千オール化合物存在下で空気酸化等の処理を行
ない、目的物質本来の立体構造を再現させる。次いで硫
安塩析による分画沈澱、疎水クロマトグラフィー、金属
キレートクロマトグラフィー等の手法を用いて精製され
るかこれら以外の通常用いられる生化学的精製技術を用
いることも出来る。
に溶解後千オール化合物存在下で空気酸化等の処理を行
ない、目的物質本来の立体構造を再現させる。次いで硫
安塩析による分画沈澱、疎水クロマトグラフィー、金属
キレートクロマトグラフィー等の手法を用いて精製され
るかこれら以外の通常用いられる生化学的精製技術を用
いることも出来る。
かくて本発明のヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドが
経済的に有利に製造される。
経済的に有利に製造される。
次に実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例に於ける各制限酵素の使用条件、ＤＮＡ断片の単
離法及び使用した合成二重鎖ＤＮＡを以下に記載する。
離法及び使用した合成二重鎖ＤＮＡを以下に記載する。
（１１各制限酵素の反応
ＤＮＡ （プラスミド又はＤＮＡフラグメント）１μｇ
を含む下記の各反応溶液５０μｌに、１０ユニットの各
制限酵素を加えて、下冨己の各温度で２時間保温した。
を含む下記の各反応溶液５０μｌに、１０ユニットの各
制限酵素を加えて、下冨己の各温度で２時間保温した。
また、部分消化をおこなう場合は、加える制限酵素の量
を１〜２ユニツトとし、保温時間を０５〜１時間とした
。
を１〜２ユニツトとし、保温時間を０５〜１時間とした
。
蕊
＜＜＜＜ロｃｏｃｏ山−！二山≦乙４４−Ｊノｔ２）
Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの平滑化反応直鎖
状ＤＮＡ １〜２μｇを含む下記の反応液５０μｌに、
０５〜１ユニ・ノドのＴ、ＤＮＡポリメラーゼを加え、
３７℃で１時間保温した。
Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの平滑化反応直鎖
状ＤＮＡ １〜２μｇを含む下記の反応液５０μｌに、
０５〜１ユニ・ノドのＴ、ＤＮＡポリメラーゼを加え、
３７℃で１時間保温した。
６７ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，８） ６．７ ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２．１６．６ｕ Ｍ（Ｎ）１１）２ ＳＯ２，１
０ｍＭβ−メルカプトメルカプトエタノールμＶエチレ
ンジアミン四酢酸、０．０１６７％牛血清アルブミン、
３３０μＭ ｄＣＴＰ、 ３３０μＭ （ＩＡＴＰ、
３３０μＭ ｄＧＴＰ及び ３３０μＭ ｄＴＴＰ
ｏ（３） フレノウフラグメントによるＤＮＡの平滑
化反応 直鎖状ＤＮＡ １〜２μｇを含む下記の反応液５０μｌ
に、０５〜ｌユニツトのフレノウフラグメントを加え、
２５℃で１時間保温した。
ｇＣｌ２．１６．６ｕ Ｍ（Ｎ）１１）２ ＳＯ２，１
０ｍＭβ−メルカプトメルカプトエタノールμＶエチレ
ンジアミン四酢酸、０．０１６７％牛血清アルブミン、
３３０μＭ ｄＣＴＰ、 ３３０μＭ （ＩＡＴＰ、
３３０μＭ ｄＧＴＰ及び ３３０μＭ ｄＴＴＰ
ｏ（３） フレノウフラグメントによるＤＮＡの平滑
化反応 直鎖状ＤＮＡ １〜２μｇを含む下記の反応液５０μｌ
に、０５〜ｌユニツトのフレノウフラグメントを加え、
２５℃で１時間保温した。
６７ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐｉ４７．４）、６．
７ｍＭＭｇＣＬ 、１ ｍＭβ−メルカプトエタノール
、３３μＭｄＡＴＰ、 ３３μＭ ｄＴＴＰ、 ３
３μＭ ｄＧＴＰ及び３３μＭ ｄＣＴＰ。
７ｍＭＭｇＣＬ 、１ ｍＭβ−メルカプトエタノール
、３３μＭｄＡＴＰ、 ３３μＭ ｄＴＴＰ、 ３
３μＭ ｄＧＴＰ及び３３μＭ ｄＣＴＰ。
（４）’ Ｔ、ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡの結合反応
結合させるべきＤＮＡフラグメント（約Ｏ１μｇ）を含
む７５μｌのＤＮＡ溶液に、宝酒造（掬製のｒＤＮＡラ
イゲー７ヨンキノト、Ａ液６０μｒ及び同Ｂ液７５μＮ
（Ｔ、ＤＮＡリガーゼを含む）を混合して、１６°Ｃ
で３０分間保温した。
結合させるべきＤＮＡフラグメント（約Ｏ１μｇ）を含
む７５μｌのＤＮＡ溶液に、宝酒造（掬製のｒＤＮＡラ
イゲー７ヨンキノト、Ａ液６０μｒ及び同Ｂ液７５μＮ
（Ｔ、ＤＮＡリガーゼを含む）を混合して、１６°Ｃ
で３０分間保温した。
（５） ＤＮＡ断片の単離、他
各プラスミドを制限酵素で消化した後、アガロース電気
泳動により目的とするＤＮＡ断片を分離し、電気溶出法
で回収したＤＮＡ断片を、フェノールクロロホルム抽出
及びエタノール沈澱法で精製して使用した。作成された
各プラスミドは大腸菌ＪＭ１０３を形質転換し、形質転
換体をアルカリ溶菌法による迅速単離法により調べ、目
的とするプラスミドを有するクローンを得た。
泳動により目的とするＤＮＡ断片を分離し、電気溶出法
で回収したＤＮＡ断片を、フェノールクロロホルム抽出
及びエタノール沈澱法で精製して使用した。作成された
各プラスミドは大腸菌ＪＭ１０３を形質転換し、形質転
換体をアルカリ溶菌法による迅速単離法により調べ、目
的とするプラスミドを有するクローンを得た。
（６） 使用した合成二重鎖ＤＮＡ
目的とするプラスミドの作成に用いた合成二重鎖ＤＮＡ
は、各単鎖のＤＮＡのオリゴマーをアミダイト法により
合成し、ＯＰＣカートリッジ（アプライドバイオシステ
ム社製）で精製乾燥後各対の単離ＤＮＡを２０ｍＭ ）
リス塩酸、１０ｍＭ ＭｇＣＬバツファー（ｐ）１７．
６＞に溶解し、９５°Ｃで２分間加熱後室温迄徐冷、以
後１２°Ｃで１晩保持することでアニールし、下記各二
重鎖ＤＮＡを得た。
は、各単鎖のＤＮＡのオリゴマーをアミダイト法により
合成し、ＯＰＣカートリッジ（アプライドバイオシステ
ム社製）で精製乾燥後各対の単離ＤＮＡを２０ｍＭ ）
リス塩酸、１０ｍＭ ＭｇＣＬバツファー（ｐ）１７．
６＞に溶解し、９５°Ｃで２分間加熱後室温迄徐冷、以
後１２°Ｃで１晩保持することでアニールし、下記各二
重鎖ＤＮＡを得た。
合成二重鎖ＤＮＡ名
ＨＬ−Ａ ５ −ＴＴＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡ
ＡＣＧＡＧＣＴ −３１（Ｌ−Ｂ ３ −Ｃ
ＧＡＣＴＣＧＴＴＧＣ−５ＣＵＫ−Ａ ５ −Ｃ
ＡＡＧＴＴＴＣＡＧＴＧＴＧＧ −３ＣｔｌＫ−Ｂ
３ −ＴＣＧＡＧＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＣＡＣＣ−５Ａ
Ｐ−Ａ ５ − ＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＧＡＡＣ
ＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＡ
ＧＣ丁 −３ ＡＰ−Ｂ ３−−ＴＧＣＡＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣＴ
ＴＧＴＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡＡ
Ｔ −５ ＦＮ−Ａ ５ −ＣＡＴＧＣＡＧＧＣＡＣＡＡＣＡＧ
ＡＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＧＴＴＧ
ＣＴＧ−３ ＦＮ−Ｂ ３ −ＧＴＣＣＧＴＧＴＴＧＴＣＴＡ
ＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＧＡ
ＣＡＡＴＴ−５ Ｖ、−Ａ Ｉ−ＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＡＡＡＡＴＧＧ
ＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣ−３ Ｖｌ−Ｂ ３ − ＣＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＣ
ＡＡＧＴＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＡＡＴＴ −
’： Ｖ、 −Ａ Ｖ、−８ ｓ −Ａ ｓ −Ｂ Ｖ、−Ａ ４−Ｂ ｓ−Ａ ｓ −Ｂ Ｖ、−Ａ ｓ Ｂ ５− −ＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＣＡ
ＧＣＣＧＣＡＡＡＣＴＣＴＣ−３ ３−−ＣＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＣＡＡＧＴＣＧＧＣＧ
ＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＴＴ −５ ５−−ＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＧ
ＣＡＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴ −３ ３’ −ＴＧＣＡＧＴＡＣＧＴＣＣＴＴＧＴＣＣＡＣ
ＡＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧ、ＩｔＡＡＣＧＡＡＴ −５
− ５’ −ＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴ
ＣＴＣＣＧＣＡＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴ −
３ ３’ −ＴＧＣＡＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＣ
ＣＡＣＡＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＧＡＡＴ
−５ ５−−ＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＴＧＴＣＴ
ＣＣＧＣＡＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴ −３ ３−−ＴＧＣＡＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣＴＴＴＴＧＣＡ
ＣＡＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＧＡＡＴ −５ ５−−ＣＡＴＧＡＡＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＣＴ
ＣＣＧＣＡＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴ −３ ３−−ＴＧＣＡＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＡＧＡＴＡＣＣＡ
ＣＡＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＧＡＡＴ −５ ＴＵＫＩＡ ５ ＵＫＩ−Ｂ ＴＵＫ２−Ａ ５ ＵＫＩＢ ＣＲＯ５Ｄ−Ａ ＣＲＯ３Ｄ−Ｂ 実施例１ ブラスミ Ｓａｃ Ｉで消 合成オリゴ しプラスミ ブラスミ Ｓａｃ Ｉで消 合成オリゴ プラスミド プラスミ ＧＣＣＴＣＡＧＴＴＴＡＡＡＡＴＣＡＴＴＧＧＣＧＧＣ
Ｇ −３ＡＧＴＣＡＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡＡＣＣＧＣ
ＣＧＣＴＴＡ −５ＧＣＣＴＣＧＣＧＡＴＡＡＡＡＴＣ
ＡＴ丁ＧＧＣＧＧＣＧ −３ＡＧＣＧＣＴＡＴＴＴＴ
ＡＧＴＡＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＡＡ−５ＣＴＡＧＡＴＡ
ＡＧＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧ−３３−ＴＡＴＴ
ＣＣＴＣＣＡＣＴＴＴＴＧＧＴＡＣ−５プラスミドｐＡ
ＣＵＫ（−、ｑ）１５、プラスミドｐＦＣＵＫ （−、
ｑ）１５ 、プラスミドｐＶ＋ＰＵＫ（ｋｑ）１５及び
プラスミドＩＩＶ２ＰＵＫ （ｋ、Ｑ）１５の作成。
ＡＣＧＡＧＣＴ −３１（Ｌ−Ｂ ３ −Ｃ
ＧＡＣＴＣＧＴＴＧＣ−５ＣＵＫ−Ａ ５ −Ｃ
ＡＡＧＴＴＴＣＡＧＴＧＴＧＧ −３ＣｔｌＫ−Ｂ
３ −ＴＣＧＡＧＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＣＡＣＣ−５Ａ
Ｐ−Ａ ５ − ＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＧＡＡＣ
ＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＡ
ＧＣ丁 −３ ＡＰ−Ｂ ３−−ＴＧＣＡＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣＴ
ＴＧＴＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡＡ
Ｔ −５ ＦＮ−Ａ ５ −ＣＡＴＧＣＡＧＧＣＡＣＡＡＣＡＧ
ＡＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＧＴＴＧ
ＣＴＧ−３ ＦＮ−Ｂ ３ −ＧＴＣＣＧＴＧＴＴＧＴＣＴＡ
ＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＧＡ
ＣＡＡＴＴ−５ Ｖ、−Ａ Ｉ−ＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＡＡＡＡＴＧＧ
ＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣ−３ Ｖｌ−Ｂ ３ − ＣＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＣ
ＡＡＧＴＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＡＡＴＴ −
’： Ｖ、 −Ａ Ｖ、−８ ｓ −Ａ ｓ −Ｂ Ｖ、−Ａ ４−Ｂ ｓ−Ａ ｓ −Ｂ Ｖ、−Ａ ｓ Ｂ ５− −ＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＣＡ
ＧＣＣＧＣＡＡＡＣＴＣＴＣ−３ ３−−ＣＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＣＡＡＧＴＣＧＧＣＧ
ＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＴＴ −５ ５−−ＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＧ
ＣＡＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴ −３ ３’ −ＴＧＣＡＧＴＡＣＧＴＣＣＴＴＧＴＣＣＡＣ
ＡＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧ、ＩｔＡＡＣＧＡＡＴ −５
− ５’ −ＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴ
ＣＴＣＣＧＣＡＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴ −
３ ３’ −ＴＧＣＡＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＣ
ＣＡＣＡＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＧＡＡＴ
−５ ５−−ＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＴＧＴＣＴ
ＣＣＧＣＡＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴ −３ ３−−ＴＧＣＡＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣＴＴＴＴＧＣＡ
ＣＡＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＧＡＡＴ −５ ５−−ＣＡＴＧＡＡＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＣＴ
ＣＣＧＣＡＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴ −３ ３−−ＴＧＣＡＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＡＧＡＴＡＣＣＡ
ＣＡＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＧＡＡＴ −５ ＴＵＫＩＡ ５ ＵＫＩ−Ｂ ＴＵＫ２−Ａ ５ ＵＫＩＢ ＣＲＯ５Ｄ−Ａ ＣＲＯ３Ｄ−Ｂ 実施例１ ブラスミ Ｓａｃ Ｉで消 合成オリゴ しプラスミ ブラスミ Ｓａｃ Ｉで消 合成オリゴ プラスミド プラスミ ＧＣＣＴＣＡＧＴＴＴＡＡＡＡＴＣＡＴＴＧＧＣＧＧＣ
Ｇ −３ＡＧＴＣＡＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡＡＣＣＧＣ
ＣＧＣＴＴＡ −５ＧＣＣＴＣＧＣＧＡＴＡＡＡＡＴＣ
ＡＴ丁ＧＧＣＧＧＣＧ −３ＡＧＣＧＣＴＡＴＴＴＴ
ＡＧＴＡＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＡＡ−５ＣＴＡＧＡＴＡ
ＡＧＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧ−３３−ＴＡＴＴ
ＣＣＴＣＣＡＣＴＴＴＴＧＧＴＡＣ−５プラスミドｐＡ
ＣＵＫ（−、ｑ）１５、プラスミドｐＦＣＵＫ （−、
ｑ）１５ 、プラスミドｐＶ＋ＰＵＫ（ｋｑ）１５及び
プラスミドＩＩＶ２ＰＵＫ （ｋ、Ｑ）１５の作成。
ドｐＨＬＩＫ（Ｑ、 ｑ）１０を制限酵素Ｂａｌ Ｉ及
び化後単離した約３．９ｋｂのＤＮＡ断片とマーＣＩＪ
Ｋ−Ａ／Ｅを丁、 ＤＮＡリガーゼで連結ドｐＣＵＫ（
−、Ｑ） １０を得た。
び化後単離した約３．９ｋｂのＤＮＡ断片とマーＣＩＪ
Ｋ−Ａ／Ｅを丁、 ＤＮＡリガーゼで連結ドｐＣＵＫ（
−、Ｑ） １０を得た。
ドｐｃＵＫ（−、ｑ） １０を制限酵素Ａａｔ ＩＩ及
び化後単離した約３．９ｋｂのＤＮＡ断片とマーＡＰ−
Ａ／ＢをＴ、ＤＮＡリガーゼで連結しｐＡＣＵＫ（−、
ｑ）１０を得た。
び化後単離した約３．９ｋｂのＤＮＡ断片とマーＡＰ−
Ａ／ＢをＴ、ＤＮＡリガーゼで連結しｐＡＣＵＫ（−、
ｑ）１０を得た。
ドｐ ９４２０を制限酵素Ｎｃｏ Ｉで消化後アルカリ
ホスファターゼで処理したＤＮＡ断片と、プラスミドｐ
ＡＣＵＫ（−、Ｑ）１０を制限酵素Ｂｓｐ）Ｉ ｌて消
化後単離したウロキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴ
、 ＤＮＡリガーゼで連結したプラスミドｐＡｃＬＩ
Ｋ（ｑ）１５を得た。
ホスファターゼで処理したＤＮＡ断片と、プラスミドｐ
ＡＣＵＫ（−、Ｑ）１０を制限酵素Ｂｓｐ）Ｉ ｌて消
化後単離したウロキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴ
、 ＤＮＡリガーゼで連結したプラスミドｐＡｃＬＩ
Ｋ（ｑ）１５を得た。
プラスミドｐＡＣＵＫ（−、ｑ）１５を制限酵素Ａａｔ
ＩＩ及びＡｆｔ ｍで消化後単離した約５．４ｋｂの
ＤＮＡ断片と、プラスミドｐ ９４１０を制限酵素Ａａ
ｆ １１及びＮｃｏ Ｉで消化後単離した約０．５ｋｂ
のＤＮＡ断片と合成オリゴマーＦ Ｎ −Ａ 、／ Ｂ
とをＴ、ＤＮＡリガーゼで連結しブラスミ ドｐＦｃＵ
Ｋ（−、ｑ）１５を得た。
ＩＩ及びＡｆｔ ｍで消化後単離した約５．４ｋｂの
ＤＮＡ断片と、プラスミドｐ ９４１０を制限酵素Ａａ
ｆ １１及びＮｃｏ Ｉで消化後単離した約０．５ｋｂ
のＤＮＡ断片と合成オリゴマーＦ Ｎ −Ａ 、／ Ｂ
とをＴ、ＤＮＡリガーゼで連結しブラスミ ドｐＦｃＵ
Ｋ（−、ｑ）１５を得た。
プラスミドｐＡｃｔｌ［ｋ、 ｑ）／ｓを制限酵素Ａａ
ｊ ｉｒ及びＡｆｌ Ｉ［で消化後単離した後約５．８
１ｔｌｌのＤＮＡ断片と、プラスミドｐ ９４１０を制
限酵素Ａａｔ ＩＩ及びＮｃ。
ｊ ｉｒ及びＡｆｌ Ｉ［で消化後単離した後約５．８
１ｔｌｌのＤＮＡ断片と、プラスミドｐ ９４１０を制
限酵素Ａａｔ ＩＩ及びＮｃ。
工で消化後単離した約０．５ｋｂのＤＮＡ断片と合成オ
リゴマー■ビ＾／ＢをＴ、ＤＮＡリガーゼで連結しプラ
スミドｐＶ 、 ＰＵＫ （ｋ、 ｑ）１５を得た。又
、プラスミドｐＡＣＵＫ（ｋ、 ｑ）１５を制限酵素Ａ
ａｔ ＩＩ及びＡｆｌ ＩＩで消化後単離した約５．８
ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐ９４１０を制限酵素
Ａａｔ ＩＩ及びＮｅｏ Ｉで消化後単離した約０．５
ｋｂのＤＮＡ断片と合成オリゴ７− Ｖ２−Ａ／ＢをＴ
、ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐＶｚＰＵＫ（ｋ
ｑ）１５を得た。
リゴマー■ビ＾／ＢをＴ、ＤＮＡリガーゼで連結しプラ
スミドｐＶ 、 ＰＵＫ （ｋ、 ｑ）１５を得た。又
、プラスミドｐＡＣＵＫ（ｋ、 ｑ）１５を制限酵素Ａ
ａｔ ＩＩ及びＡｆｌ ＩＩで消化後単離した約５．８
ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐ９４１０を制限酵素
Ａａｔ ＩＩ及びＮｅｏ Ｉで消化後単離した約０．５
ｋｂのＤＮＡ断片と合成オリゴ７− Ｖ２−Ａ／ＢをＴ
、ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐＶｚＰＵＫ（ｋ
ｑ）１５を得た。
実施例２ プラスミドｐＡＰＵＫ（ｑ、 ｑ）１５及び
プラスミドｐＦＰＩＪＫ（Ｑ、 ｑ）１５の作成。
プラスミドｐＦＰＩＪＫ（Ｑ、 ｑ）１５の作成。
プラスミドｐＨＵＫ（ｑ、 ｑ）１０を制限酵素ＡａＬ
ＩＩ及びＳａｃ Ｔで消化後単離した約４．３ｋｂの
ＤＮＡ断片と、合成オリゴマーＡＰ−Ａ／ＢをＴ、ＤＮ
Ａリガーゼで連結しプラスミドｐＡＰＵＫ（Ｑ、 ｑ）
１０を得た。
ＩＩ及びＳａｃ Ｔで消化後単離した約４．３ｋｂの
ＤＮＡ断片と、合成オリゴマーＡＰ−Ａ／ＢをＴ、ＤＮ
Ａリガーゼで連結しプラスミドｐＡＰＵＫ（Ｑ、 ｑ）
１０を得た。
プラスミドｐＡＰＵＫ （ｑ、 ｑ） １０を制限酵素
Ａｆｌ Ｉ［及びＢａｍＨＩで消化後単離した約１．２
ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＡＣＵＫ（−、ｑ）
１５を制限酵素Ａｆｔ ＩＩ及びＢａｍＨＩで消化後単
離した約５．１ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
で連結しプラスミドｐＡＰＵＫ（Ｑ、 Ｑ）１５を得た
。
Ａｆｌ Ｉ［及びＢａｍＨＩで消化後単離した約１．２
ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＡＣＵＫ（−、ｑ）
１５を制限酵素Ａｆｔ ＩＩ及びＢａｍＨＩで消化後単
離した約５．１ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
で連結しプラスミドｐＡＰＵＫ（Ｑ、 Ｑ）１５を得た
。
プラスミドｐＡＰＵＫ （ｑ、 ｑ） １５を制限酵素
Ａａｔ Ｉ［及びＡｆｌ ｍで消化後単離した約５．８
ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐ ９４１０を制限
酵素Ａａｔ Ｉ［及びＮｅｏ Ｉ消化後単離した約０．
５ｋｂのＤＮＡ断片と合成オリゴマーＦＮ−Ａ／Ｅとを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐＦ、ＰＵＫ（
ｑ、 ｑ）１５を得た。
Ａａｔ Ｉ［及びＡｆｌ ｍで消化後単離した約５．８
ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐ ９４１０を制限
酵素Ａａｔ Ｉ［及びＮｅｏ Ｉ消化後単離した約０．
５ｋｂのＤＮＡ断片と合成オリゴマーＦＮ−Ａ／Ｅとを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐＦ、ＰＵＫ（
ｑ、 ｑ）１５を得た。
実施例３ プラスミドｐＡＨＵＫ（Ｑ、 ｑ）１５．プ
ラスミドｐＡＰｔｌＫ（ｋ、 ｋ）１５． プラスミ
ドｐＡＰＵＫ（ｋ、 Ｑ）／’５プラスミドＩＩＡＰＵ
Ｋ（ｋ、 ｄ）１５の作成。
ラスミドｐＡＰｔｌＫ（ｋ、 ｋ）１５． プラスミ
ドｐＡＰＵＫ（ｋ、 Ｑ）／’５プラスミドＩＩＡＰＵ
Ｋ（ｋ、 ｄ）１５の作成。
プラスミドｐＡＰＵＫ（Ｑ、 ｑ）１５を制限酵素Ａｆ
ｔ ＩＩ及びＢａｍＨＩで消化後単離・した約４．９ｋ
ｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＨＵＫ（ｑ、 ｑ）１
０を制限酵素ＢａｍＨＩ及び５ａｃＩで消化後単離した
約１．４ ｋｂのＤＮＡ断片と、合成オリゴマーＨＬ−
Ａ／ＢとをＴ、ＤＮＡリガーゼて連結したプラスミドｐ
ＡＨＵＫ （Ｑ、 ｑ）１５を得た。
ｔ ＩＩ及びＢａｍＨＩで消化後単離・した約４．９ｋ
ｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＨＵＫ（ｑ、 ｑ）１
０を制限酵素ＢａｍＨＩ及び５ａｃＩで消化後単離した
約１．４ ｋｂのＤＮＡ断片と、合成オリゴマーＨＬ−
Ａ／ＢとをＴ、ＤＮＡリガーゼて連結したプラスミドｐ
ＡＨＵＫ （Ｑ、 ｑ）１５を得た。
プラスミドｐＡＨＵＫ（ｑ、 ｑ）１５を含有する大腸
菌Ｅｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩは工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研条寄第２４６７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−
２４６７）として寄託されている。
菌Ｅｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩは工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研条寄第２４６７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−
２４６７）として寄託されている。
プラスミドｐＡＰＵＫ（ｑ、 ｑ）１５を制限酵素）１
ｉｎｄＩ［［及びＰｓｔ Ｉで消化後単離した約５．２
ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＭＵ７４Ｈを制限
酵素ＨｉｎｄＩ［［及びＰｓｔ Ｉで消化後単離した約
１．１ ｋｂのＤＮＡ断片をＴ＋ＤＮＡリガーゼで連結
しプラスミドｐＡＰＵＫ（ｋ、 ｋ）、／ｓを得た。
ｉｎｄＩ［［及びＰｓｔ Ｉで消化後単離した約５．２
ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＭＵ７４Ｈを制限
酵素ＨｉｎｄＩ［［及びＰｓｔ Ｉで消化後単離した約
１．１ ｋｂのＤＮＡ断片をＴ＋ＤＮＡリガーゼで連結
しプラスミドｐＡＰＵＫ（ｋ、 ｋ）、／ｓを得た。
プラスミドｐＡＰＵＫ（ｋ、 ｋ＞１５を含有する大腸
菌Ｅｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩは工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研条寄第２４６５号（ＦＥＲＮ ＢＰ−
２４６５）として寄託されている。
菌Ｅｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩは工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研条寄第２４６５号（ＦＥＲＮ ＢＰ−
２４６５）として寄託されている。
プラスミドｐＡＰＵＫ（ｋ、 ｋ）１５を制限酵素Ｂａ
ｌ Ｉ及びＢａｍＨＩで消化後単離した約５．５ ｋｂ
のＤＮＡ断片と、プラスミドｐＣＵＫ（−、ｑ）１０を
制限酵素Ｂａｔ Ｉ及びＢａｍＨＩで消化後単離した
約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＴ。
ｌ Ｉ及びＢａｍＨＩで消化後単離した約５．５ ｋｂ
のＤＮＡ断片と、プラスミドｐＣＵＫ（−、ｑ）１０を
制限酵素Ｂａｔ Ｉ及びＢａｍＨＩで消化後単離した
約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＴ。
ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐＡＰｔｌＫ（ｋ、
ｑ）１５を得た。
ｑ）１５を得た。
プラスミドｐＡＰＵＫ （ｋ、 Ｑ） １５を含有する
大腸菌Ｅｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩは工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第２４６６号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２４６６）として寄託されている。
大腸菌Ｅｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩは工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第２４６６号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２４６６）として寄託されている。
プラスミドｐＡＰＵＫ（ｋ、 ｋ）１５を制限酵素Ｂａ
ｌ Ｉ及びＢａｇ）ＩＩで消化後単離した約５．５ ｋ
ｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＨＵＫ（ｑ、 ｄ）１
０を制限酵素Ｂａｔ Ｉ及びＢａ＋ｍ）ＩＩで消化後単
離した約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ リガ
ーゼで連結しプラスミドｐＡＰＵＫ（ｋ、 ｄ）１５を
得た。
ｌ Ｉ及びＢａｇ）ＩＩで消化後単離した約５．５ ｋ
ｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＨＵＫ（ｑ、 ｄ）１
０を制限酵素Ｂａｔ Ｉ及びＢａ＋ｍ）ＩＩで消化後単
離した約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ リガ
ーゼで連結しプラスミドｐＡＰＵＫ（ｋ、 ｄ）１５を
得た。
実施例４ 大腸菌によるヒトプロウロキナーゼ様ポリペ
プチド遺伝子の発現。
プチド遺伝子の発現。
実施例１．２．３及び４により得られたプラスミ ド
ｐＡ）ＩＵＫ（Ｑ、 Ｑ）１５ 、 ｐＡＰＵＫ
（Ｑ、 ｑ）１５ 、 ｐＡＰｌｉＫ（ｋ、 ｑ
）１５ 、ｐＡＰＵＫ（ｋ、ｄ）７’５、 ｐＡＰＵＫ
（ｋ、ｋ）１５、 ｐＦＰＵＫ（ｑ、ｑ）１５、 ｐＡ
ｃＵＫ（−、ｑ）１５、 ｐＦＣＬｉＫ（−、ｑ’）、
１５、 ｐ ■ＩＰ Ｌ Ｋ （ｋ 、 ｑ ’） 、
’ ５ 及 びｐＶ＋ＰＵＫ（ｋ、Ｑ）１５各々を大
腸菌Ｊ Ｍ １０３ 株＋：慣用法に従って形質転換し
た。得られた組換偉容々を５０ｒｎｌのＬ−ブロス中に
３７°Ｃて好気培養し、６００ｎｍにおける吸光度か約
１０になったとき、００ｍＭのイソプロピルチオガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ） ０．５ ｉを添加し、更に
４時間培養を続は各ヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチ
ド遺伝子を発現させた。
ｐＡ）ＩＵＫ（Ｑ、 Ｑ）１５ 、 ｐＡＰＵＫ
（Ｑ、 ｑ）１５ 、 ｐＡＰｌｉＫ（ｋ、 ｑ
）１５ 、ｐＡＰＵＫ（ｋ、ｄ）７’５、 ｐＡＰＵＫ
（ｋ、ｋ）１５、 ｐＦＰＵＫ（ｑ、ｑ）１５、 ｐＡ
ｃＵＫ（−、ｑ）１５、 ｐＦＣＬｉＫ（−、ｑ’）、
１５、 ｐ ■ＩＰ Ｌ Ｋ （ｋ 、 ｑ ’） 、
’ ５ 及 びｐＶ＋ＰＵＫ（ｋ、Ｑ）１５各々を大
腸菌Ｊ Ｍ １０３ 株＋：慣用法に従って形質転換し
た。得られた組換偉容々を５０ｒｎｌのＬ−ブロス中に
３７°Ｃて好気培養し、６００ｎｍにおける吸光度か約
１０になったとき、００ｍＭのイソプロピルチオガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ） ０．５ ｉを添加し、更に
４時間培養を続は各ヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチ
ド遺伝子を発現させた。
実施例５ 大腸菌からの遺伝子産物の抽出と精製。
実施例４で得られた湿菌体各Ｌｏｇ当たり１０〇−のＩ
Ｏ＋ｎＭグリシン−ＮａＯＨバッフｙ−（ｐＨ９，０、
ＮａＣｌ０． Ｉ Ｍ 、 ＥＤＴ＾５ＩＩＭを含む）
に呼濁し、５０■のりゾチームを加え水冷下に１時間攪
はん後超音波により菌体を破砕した。菌体破砕後直ちに
４°Ｃ１１２、ＯＯＯｒｐｍ 、３０分の遠沈て沈澱物
を回収した。
Ｏ＋ｎＭグリシン−ＮａＯＨバッフｙ−（ｐＨ９，０、
ＮａＣｌ０． Ｉ Ｍ 、 ＥＤＴ＾５ＩＩＭを含む）
に呼濁し、５０■のりゾチームを加え水冷下に１時間攪
はん後超音波により菌体を破砕した。菌体破砕後直ちに
４°Ｃ１１２、ＯＯＯｒｐｍ 、３０分の遠沈て沈澱物
を回収した。
沈澱物はｌｏｍＭグリンンーＮａＯＨバッフｙ −（ｐ
Ｈ９，０）で数回洗浄したのち５００ｒｎｌの０．１Ｍ
グリシン−ＮａＯＨバッファー（ｐ）１９．０）に５０
０−の８Ｍの塩酸グアニジンを加え攬はん溶解した。腸
溶液に悦イオン水、１ＭグリンンーＮａＯＨバッファ（
ｐＨ９，０） ＥＤＴＡ及び還元型グルタチオンを加え
４Ｌとしく最終濃度：塩酸グアニジン１０Ｍ１グリンン
０．０４Ｍ。
Ｈ９，０）で数回洗浄したのち５００ｒｎｌの０．１Ｍ
グリシン−ＮａＯＨバッファー（ｐ）１９．０）に５０
０−の８Ｍの塩酸グアニジンを加え攬はん溶解した。腸
溶液に悦イオン水、１ＭグリンンーＮａＯＨバッファ（
ｐＨ９，０） ＥＤＴＡ及び還元型グルタチオンを加え
４Ｌとしく最終濃度：塩酸グアニジン１０Ｍ１グリンン
０．０４Ｍ。
ＥＤＴＡ ｌ ｍＭ、還元型グルタチオン０．２ ｍＭ
） 、−晩室温に放置し、リホールディング（ｒｅｆｏ
ｌｄｉｎｇ）をおこなった。リホールディングか終了し
た溶液を限外濾過装置（分画分子量６０００）で濃縮し
た。次いで硫安塩析により硫安２５〜５５％飽和画分を
粗製品として採取した。粗製品を５０ｍＭリン酸バッフ
ァー（ｐＨ７，５，０，５Ｍ塩酸グアニジン、０．６
Ｍを硫安を含む）に溶解後遠沈で不溶物を除いた上清を
、同バッファーで平衡化したフェニルセファロース（フ
ァルマシャ社製）カラムに吸着、同バッファーで充分洗
浄した後硫安を含まない同バッファーで溶出し、目的物
を含む溶出画分を採取した。当画分をＺｎキレート（但
しＡＣｌｌＫ（−、ｑ）及びＦＣＵＫ（ｑ）はＣｕキレ
ート）セファロース（ファルマンヤ社製）カラムに吸着
させ、５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ６，０，０，５Ｍ
ＮａＣｌを含む）で充分洗浄した後、２０ｍＭ酢酸バ
ッフｙ −ｐＨ５，４（含むＮａＣ１０５Ｍ）で溶出し
、目的物を含む溶出画分を限外濾過膜ＰＭ−１０（アミ
コン社製）を用いて濃縮脱塩しく必要ならばベンズアミ
ジンセファロースカラムに流下して活性型を除き）、そ
れぞれ対応する本発明のヒトプロウロキナーゼ様ポリペ
ブチｌ”（Ａ）ＩｏＫ（ｑ、ｑ） 、ＡＰＵＫ（Ｑ、Ｑ
） 、ＡＰＵＫ（ｋ、ｑ） 、ＡＰＵＫ（ｋ、ｄ）、Ａ
ＰＵＫ（ｋ、ｋ） 、ＦＰＵＫ（ｑ、ｑ） 、ＡＣＵＫ
（−、ｑ） 、ＦＣ［ＩＫ（ｑ） 、Ｖ＋ＰＵＫ（ｋ、
Ｑ）及びＶ２ＰＵＫ（ｋ、 Ｑｌｌｌｌｌｌ各音製品。
） 、−晩室温に放置し、リホールディング（ｒｅｆｏ
ｌｄｉｎｇ）をおこなった。リホールディングか終了し
た溶液を限外濾過装置（分画分子量６０００）で濃縮し
た。次いで硫安塩析により硫安２５〜５５％飽和画分を
粗製品として採取した。粗製品を５０ｍＭリン酸バッフ
ァー（ｐＨ７，５，０，５Ｍ塩酸グアニジン、０．６
Ｍを硫安を含む）に溶解後遠沈で不溶物を除いた上清を
、同バッファーで平衡化したフェニルセファロース（フ
ァルマシャ社製）カラムに吸着、同バッファーで充分洗
浄した後硫安を含まない同バッファーで溶出し、目的物
を含む溶出画分を採取した。当画分をＺｎキレート（但
しＡＣｌｌＫ（−、ｑ）及びＦＣＵＫ（ｑ）はＣｕキレ
ート）セファロース（ファルマンヤ社製）カラムに吸着
させ、５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ６，０，０，５Ｍ
ＮａＣｌを含む）で充分洗浄した後、２０ｍＭ酢酸バ
ッフｙ −ｐＨ５，４（含むＮａＣ１０５Ｍ）で溶出し
、目的物を含む溶出画分を限外濾過膜ＰＭ−１０（アミ
コン社製）を用いて濃縮脱塩しく必要ならばベンズアミ
ジンセファロースカラムに流下して活性型を除き）、そ
れぞれ対応する本発明のヒトプロウロキナーゼ様ポリペ
ブチｌ”（Ａ）ＩｏＫ（ｑ、ｑ） 、ＡＰＵＫ（Ｑ、Ｑ
） 、ＡＰＵＫ（ｋ、ｑ） 、ＡＰＵＫ（ｋ、ｄ）、Ａ
ＰＵＫ（ｋ、ｋ） 、ＦＰＵＫ（ｑ、ｑ） 、ＡＣＵＫ
（−、ｑ） 、ＦＣ［ＩＫ（ｑ） 、Ｖ＋ＰＵＫ（ｋ、
Ｑ）及びＶ２ＰＵＫ（ｋ、 Ｑｌｌｌｌｌｌ各音製品。
参考例１ プラスミドｐＭｔｌＴ９０ｐｍｌ及びｐ９４
２０の作成。
２０の作成。
プラスミドｐＰＬＬを制限酵素Ａａｔ ＩＦ及びＸｂａ
Ｉで消化後単離したプレライラックｐ１０を含むＤＮ
Ａ断片と、プラスミドｐＭＪＲ１５６０（アマジャム社
製）を制限酵素Ｐｓｔ Ｉで消化後Ｔ、ＤＮＡポリメラ
ーゼ処理した。次いで制限酵素ＡａＬ ＩＩで消化後単
離した１ａｃｌ’遺伝子を含む約３．４ｋｂのＤＮＡ断
片と、合成オリゴ７− ＣｒｏＳ、／Ｄ−Ａ／ＥとをＴ
、１ｌＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐ ９４１０を
得た。
Ｉで消化後単離したプレライラックｐ１０を含むＤＮ
Ａ断片と、プラスミドｐＭＪＲ１５６０（アマジャム社
製）を制限酵素Ｐｓｔ Ｉで消化後Ｔ、ＤＮＡポリメラ
ーゼ処理した。次いで制限酵素ＡａＬ ＩＩで消化後単
離した１ａｃｌ’遺伝子を含む約３．４ｋｂのＤＮＡ断
片と、合成オリゴ７− ＣｒｏＳ、／Ｄ−Ａ／ＥとをＴ
、１ｌＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐ ９４１０を
得た。
天然型ヒトプロウロキナーゼ遺伝子を有するｐＭＵＴ８
Ｌを制限酵素Ｎｃｏ Ｉで消化後単離したヘクターフラ
グメントを含むＤＮＡ断片Ｔ、ＤＮＡリガーゼて連結し
プラスミドｐ ６５１４を得た。
Ｌを制限酵素Ｎｃｏ Ｉで消化後単離したヘクターフラ
グメントを含むＤＮＡ断片Ｔ、ＤＮＡリガーゼて連結し
プラスミドｐ ６５１４を得た。
プラスミドｐ ６５１４を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後
フレノウフラグメントで末端相補ＤＮＡを補ったのちＴ
４ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐ ６５１６を得
た。
フレノウフラグメントで末端相補ＤＮＡを補ったのちＴ
４ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐ ６５１６を得
た。
プラスミドｐ ６５１６を制限酵素Ｂａ！ｌｌｌ Ｉで
消化後単離した約４．２ｋｂのＤＮＡ断片をフレノウフ
ラグメントで末端相補ＤＮＡを補った後Ｔ４ＤＮＡＩＪ
ガーゼで連結しプラスミドｐ ６６１０を得た。
消化後単離した約４．２ｋｂのＤＮＡ断片をフレノウフ
ラグメントで末端相補ＤＮＡを補った後Ｔ４ＤＮＡＩＪ
ガーゼで連結しプラスミドｐ ６６１０を得た。
プラスミドｐＭＵＴ８Ｌから誘導作成されたブチスミＦ
ｐＭＵＴ９Ｌｐｍｌ（天然型ヒトプロウロキナーゼア
ミノ酸配列の第１３５位のリジンがグルタミンに置換さ
れたヒトプロウロキナーゼ誘導体遺伝子を有する）を制
限酵素Ｎａｒ Ｉ及びＮｅｏ Ｉで消化後単離した約３
．７ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐ ６６１０を制
限酵素Ｎａｒ Ｉ及びＮｃｏ Ｉで消化後単離した約０
．６ｋｂのＤＮＡ断片をＴ 、 Ｄ Ｎ Ａリガーゼで
連結しプラスミドｐＭＵＴ９０ｐｍｌを得た。
ｐＭＵＴ９Ｌｐｍｌ（天然型ヒトプロウロキナーゼア
ミノ酸配列の第１３５位のリジンがグルタミンに置換さ
れたヒトプロウロキナーゼ誘導体遺伝子を有する）を制
限酵素Ｎａｒ Ｉ及びＮｅｏ Ｉで消化後単離した約３
．７ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐ ６６１０を制
限酵素Ｎａｒ Ｉ及びＮｃｏ Ｉで消化後単離した約０
．６ｋｂのＤＮＡ断片をＴ 、 Ｄ Ｎ Ａリガーゼで
連結しプラスミドｐＭＵＴ９０ｐｍｌを得た。
プラスミドｐ ９４１０を制限酵素Ｋｐｎ Ｊて消化後
Ｔ４ＤＮＡポリメラーセで処理し、さらに制限酵１Ａａ
Ｌ■で消化後単離したプレライランクｐ ／ ｏを含む
ＤＮＡ断片と、プラスミドｐＭＬＩＴ９０ｐｍｌを制限
酵素Ｐｓｔ Ｉで消化後Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼで処
理し、更に制限酵素ＡａＬ ＩＩて消化後単離したｔａ
ｃｐｌｏを含む約３．５ｋｂのＤＮＡ断片をＴ、ＤＮＡ
リガーゼで連結しプラスミドｐ ９４２０を得た。
Ｔ４ＤＮＡポリメラーセで処理し、さらに制限酵１Ａａ
Ｌ■で消化後単離したプレライランクｐ ／ ｏを含む
ＤＮＡ断片と、プラスミドｐＭＬＩＴ９０ｐｍｌを制限
酵素Ｐｓｔ Ｉで消化後Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼで処
理し、更に制限酵素ＡａＬ ＩＩて消化後単離したｔａ
ｃｐｌｏを含む約３．５ｋｂのＤＮＡ断片をＴ、ＤＮＡ
リガーゼで連結しプラスミドｐ ９４２０を得た。
参考例２ プラスミドｐ）ｔＵＫ（ｑ、 ｄ）１０及び
ｐ）ｔＵＫ（ｑ、 ｑ）１０の作成。
ｐ）ｔＵＫ（ｑ、 ｑ）１０の作成。
ヒトプロウロキナーゼの遺伝子を有するプラスミドｐＭ
ＵＴ８Ｌを制限酵素Ａｘｙ Ｉ及びＨｉｎｄＩ［［で消
化後単離した約’４．４ ｋｂのＤＮＡ断片をフレノウ
フラグメントで末端相補ＤＮＡを補った後Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結しプラスミドｐＭｔｌＴ４）１を得た。
ＵＴ８Ｌを制限酵素Ａｘｙ Ｉ及びＨｉｎｄＩ［［で消
化後単離した約’４．４ ｋｂのＤＮＡ断片をフレノウ
フラグメントで末端相補ＤＮＡを補った後Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結しプラスミドｐＭｔｌＴ４）１を得た。
プラスミド１１Ｍ１］Ｔ４Ｈを制限酵素Ａｃｅ ｍ及び
Ｎａｒ Ｉで消化後単離した約３．１ｋｂのＤＮＡ断片
と、プラスミドｐＭＵＴ９０ｐＩＩｌｌを制限酵素Ａｃ
ｃ ｍ及びＮａｒ Ｉで消化後単離した約１．３ｋｂの
ＤＮＡ断片を７４ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐ
６０２８を得た。
Ｎａｒ Ｉで消化後単離した約３．１ｋｂのＤＮＡ断片
と、プラスミドｐＭＵＴ９０ｐＩＩｌｌを制限酵素Ａｃ
ｃ ｍ及びＮａｒ Ｉで消化後単離した約１．３ｋｂの
ＤＮＡ断片を７４ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐ
６０２８を得た。
プラスミドｐ ６０２８を制限酵素Ｅｃｏ４７ ＩＩ及
びＨｉｎｄ■で消化後単離した約３．７ｋｂのＤＮＡ断
片をフレノウフラグメントで末端相補ＤＮＡを補った後
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐ６Ｎ１７を得
た。
びＨｉｎｄ■で消化後単離した約３．７ｋｂのＤＮＡ断
片をフレノウフラグメントで末端相補ＤＮＡを補った後
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐ６Ｎ１７を得
た。
プラスミドｐ ６Ｎ１７を制限酵素Ｄｒａ ＩＩ及びＥ
ｃｏＲ１で消化後単離した約３．７ｋｂのＤＮＡ断片と
、合成オリゴマーＴＵＫＩ−Ａ／Ｂ及びＴＵＫ２−Ａ／
ＢそれぞれをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐ
７２１４及びプラスミドｐ ７２２４を得た。
ｃｏＲ１で消化後単離した約３．７ｋｂのＤＮＡ断片と
、合成オリゴマーＴＵＫＩ−Ａ／Ｂ及びＴＵＫ２−Ａ／
ＢそれぞれをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結しプラスミドｐ
７２１４及びプラスミドｐ ７２２４を得た。
プラスミドｐＭＵＴ９０ｐｍｌを制限酵素Ｂａｎ Ｉ［
で消化後単離した約３．８ｋｂのＤＮＡ断片と、プラス
ミドｐ ？２１４及びプラスミドｐ ７２２４それぞれ
を制限酵素Ｂａｎ Ｉ［で消化後単離した各々約０．５
ｋｂのＤＮＡ断片を７４ＤＮＡリガーゼて連結しプラス
ミドｐｉ（ＵＫ（Ｑ、 Ｑ）１０及びプラスミドｐＦＩ
［１Ｋ（ｑ、 ｄ）１０を得た。
で消化後単離した約３．８ｋｂのＤＮＡ断片と、プラス
ミドｐ ？２１４及びプラスミドｐ ７２２４それぞれ
を制限酵素Ｂａｎ Ｉ［で消化後単離した各々約０．５
ｋｂのＤＮＡ断片を７４ＤＮＡリガーゼて連結しプラス
ミドｐｉ（ＵＫ（Ｑ、 Ｑ）１０及びプラスミドｐＦＩ
［１Ｋ（ｑ、 ｄ）１０を得た。
参考例 ３ フィブリンに結合する能力を有するヘフチ
トをＮ端側に付加されたウロキナーゼ様ポリペプチドＡ
ＴＵＫ （ｑ、ｑ）の作製実施例５で得られたヒトプロ
ウロキナーゼ様ポリペプチドＡＨＵＫ （ｑ、ｑ）の精
製標品１０万単位をｌ０Ｃ１μＩのＯ，１ＭＮａＣ］を
含む５０ ｍ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に
溶解し、０．０１５ｃｕの血清プラスミン（ミトリ＋字
社製）を添加して、３７°Ｃで１時間保温した。次いで
、１０μｇのトリプシンインヒビター（シグマ社製）を
添加して反応を止め、ヘンズアミンンセファロースカラ
ムに吸着させた後、０５Ｍ ＮａｃＩを含む２（１ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）で溶出し、溶出画分を限外濾
過膜ＰＭ−１０（アミコン社製）を用いて濃縮脱塩し、
ウロキナーゼ様ポリペプチドＡＴＵＫ （Ｑ、Ｑ）を得
た。Ｎ端付近のアミノ酸配列分析の結果、この精製標品
はプロウロキナーゼ様ポリペプチドＡＨＵＫ （Ｑｑ）
のＮ端付近と同一の配列を有するウロキナーゼ様ポリペ
プチドであることかＭｉＢされた。
トをＮ端側に付加されたウロキナーゼ様ポリペプチドＡ
ＴＵＫ （ｑ、ｑ）の作製実施例５で得られたヒトプロ
ウロキナーゼ様ポリペプチドＡＨＵＫ （ｑ、ｑ）の精
製標品１０万単位をｌ０Ｃ１μＩのＯ，１ＭＮａＣ］を
含む５０ ｍ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に
溶解し、０．０１５ｃｕの血清プラスミン（ミトリ＋字
社製）を添加して、３７°Ｃで１時間保温した。次いで
、１０μｇのトリプシンインヒビター（シグマ社製）を
添加して反応を止め、ヘンズアミンンセファロースカラ
ムに吸着させた後、０５Ｍ ＮａｃＩを含む２（１ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）で溶出し、溶出画分を限外濾
過膜ＰＭ−１０（アミコン社製）を用いて濃縮脱塩し、
ウロキナーゼ様ポリペプチドＡＴＵＫ （Ｑ、Ｑ）を得
た。Ｎ端付近のアミノ酸配列分析の結果、この精製標品
はプロウロキナーゼ様ポリペプチドＡＨＵＫ （Ｑｑ）
のＮ端付近と同一の配列を有するウロキナーゼ様ポリペ
プチドであることかＭｉＢされた。
本発明のヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドは、血栓
生成部位に出現する血液凝固第 ｘ■因子（活性型）の
酵素作用により血栓と共有結合をもって結合し、゛活性
化すると推定され、活性イヒされたものか血栓から離税
しないから、血栓特異性の優れた、且つ全身性出血傾向
等の副作用の少なｌ、ｓ、ブチスミノーゲンアクチベー
ターインヒビターエの阻害を受けない理想的な血栓溶解
剤となり得るものであり、遺伝子工学的手法により経済
的ｔこ製造できる。
生成部位に出現する血液凝固第 ｘ■因子（活性型）の
酵素作用により血栓と共有結合をもって結合し、゛活性
化すると推定され、活性イヒされたものか血栓から離税
しないから、血栓特異性の優れた、且つ全身性出血傾向
等の副作用の少なｌ、ｓ、ブチスミノーゲンアクチベー
ターインヒビターエの阻害を受けない理想的な血栓溶解
剤となり得るものであり、遺伝子工学的手法により経済
的ｔこ製造できる。
試験例１ 血栓の主成分フィブリンに対する結合能試験
。
。
精製された本発明のヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチ
ド各々（以下被験サンプルと略称）のフィブリン塩に対
する結合能をｔＰＡ、ヒトプロウロキナーゼ及びウロキ
ナーゼ様ポリペプチドＡＴＵＫ （ｑ、ｑ）と比較した
。結合能試験は次の三方法で行った。
ド各々（以下被験サンプルと略称）のフィブリン塩に対
する結合能をｔＰＡ、ヒトプロウロキナーゼ及びウロキ
ナーゼ様ポリペプチドＡＴＵＫ （ｑ、ｑ）と比較した
。結合能試験は次の三方法で行った。
（試薬）
１）トリス−塩酸バッファー；５０ｍＭトリス、３
８ ｍ Ｍ ＮａＣｌ 、 ０． ０ ｌ
９’ｏ ト リ ト ン Ｘ−１００゜ｐＨ７
，５。
８ ｍ Ｍ ＮａＣｌ 、 ０． ０ ｌ
９’ｏ ト リ ト ン Ｘ−１００゜ｐＨ７
，５。
２）フィブリノーゲン溶液、ノグマ社製プラスミノーゲ
ンフリーヒトフィブリノーケノ１０■／ｍ１トリス−塩
酸バッファー ３）トロンビン溶液、シグマ社製ヒトトロンビン１００
単 ４）プラスミン溶液，ミトリ＋字社製皿清プラスミン１
５ Ｃ Ｕ ２’ ｍ Ｉ Ｈ ｒ ０ ０５）トリ
プノンインヒビター溶液；ノグマ社製トリプノンインヒ
ビター５■／ ＩＩＩ ８２０ ０６）ヒルジン、シグ
マ社製ヒルジン。
ンフリーヒトフィブリノーケノ１０■／ｍ１トリス−塩
酸バッファー ３）トロンビン溶液、シグマ社製ヒトトロンビン１００
単 ４）プラスミン溶液，ミトリ＋字社製皿清プラスミン１
５ Ｃ Ｕ ２’ ｍ Ｉ Ｈ ｒ ０ ０５）トリ
プノンインヒビター溶液；ノグマ社製トリプノンインヒ
ビター５■／ ＩＩＩ ８２０ ０６）ヒルジン、シグ
マ社製ヒルジン。
７）被験サンプル溶液，被験サンプル５０００国際車位
／１トリス−塩酸バッファー ■．フィブリン塊影形成過程おける結合能試験法水冷下
で！５ｍｌ容のエラペンチューブにフィブリノーゲン溶
液７ ５ ｕ ｌ 、０． １ Ｍ， ＣａＣｌ２水溶
液５μｍ、各被験サンプル１ｏｏμｌを採り、これにト
リス−塩酸バッファーを加えて２９７μｍとして良く混
合したのち、トロンビン溶液３μｍを加えて混合後３７
°Ｃの水浴中で６０分処理しフィブリン塩を生成させた
。直ちに４℃で遠沈しく１６０００ｒｐｍ 、 ｌ
０分）、沈澱をトリスハソファーで洗浄後ＩＮＩＨのヒ
ルジンと５〜１５μｍのプラスミン溶液を加えて溶解す
ると共に被験サンプルを活性化した。トリプンンインヒ
ビターをプラスミンの５倍量加えてプラスミン活性を抑
えたのち、カビ社製合成基質Ｓ −２４４４の分解活性
から被験サンプル量を測定し被験サンプル結合量とした
。
／１トリス−塩酸バッファー ■．フィブリン塊影形成過程おける結合能試験法水冷下
で！５ｍｌ容のエラペンチューブにフィブリノーゲン溶
液７ ５ ｕ ｌ 、０． １ Ｍ， ＣａＣｌ２水溶
液５μｍ、各被験サンプル１ｏｏμｌを採り、これにト
リス−塩酸バッファーを加えて２９７μｍとして良く混
合したのち、トロンビン溶液３μｍを加えて混合後３７
°Ｃの水浴中で６０分処理しフィブリン塩を生成させた
。直ちに４℃で遠沈しく１６０００ｒｐｍ 、 ｌ
０分）、沈澱をトリスハソファーで洗浄後ＩＮＩＨのヒ
ルジンと５〜１５μｍのプラスミン溶液を加えて溶解す
ると共に被験サンプルを活性化した。トリプンンインヒ
ビターをプラスミンの５倍量加えてプラスミン活性を抑
えたのち、カビ社製合成基質Ｓ −２４４４の分解活性
から被験サンプル量を測定し被験サンプル結合量とした
。
■ フィブリン塊形成後における結合能試験法Ｉと同様
な方法、但し被験サンプル非添加でフィブリン塩を形成
させた後被験サンプル溶液１００μ１１ トリス−塩酸
バッファー２００μｍを加え３７℃の水浴で６０分処理
後■と同様に処理した遠沈沈澱中の被験サンプル量を測
定した。
な方法、但し被験サンプル非添加でフィブリン塩を形成
させた後被験サンプル溶液１００μ１１ トリス−塩酸
バッファー２００μｍを加え３７℃の水浴で６０分処理
後■と同様に処理した遠沈沈澱中の被験サンプル量を測
定した。
（補）上記試験方法に於いて、被験サンプルが°ヒトプ
ロウロキナーゼ及びＡＰＵＫ（ｋ、 ｋ）の場合は被験
サンプルのトロンビンによる分解失活を防ぐためヒルジ
ン存在下で行った。
ロウロキナーゼ及びＡＰＵＫ（ｋ、 ｋ）の場合は被験
サンプルのトロンビンによる分解失活を防ぐためヒルジ
ン存在下で行った。
各被験サンプルのフィブリン塩との結合能をで次表に示
した。
した。
なおフィブリン塊形成過程に於いて結合したｔＰＡ及び
ＡＰＵＫ（ｑ、 ｑ）の結合後のフィブリン塩からの離
脱量を経時的に測定した。２時間後においてｔＰＡは２
３％の離脱がありその後も徐々に離脱か進むのが認めら
れたか、ＡＰＵＫ（ｑ、ｑ）は２時間後の離脱量は８％
でその後の離脱は認められなかつた。
ＡＰＵＫ（ｑ、 ｑ）の結合後のフィブリン塩からの離
脱量を経時的に測定した。２時間後においてｔＰＡは２
３％の離脱がありその後も徐々に離脱か進むのが認めら
れたか、ＡＰＵＫ（ｑ、ｑ）は２時間後の離脱量は８％
でその後の離脱は認められなかつた。
試験例２ 血栓の主成分フィブリンに対する溶解活性試
験。
験。
精製された本発明のヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチ
ド各々（以下被験サンプルと略称）のフィブリンに対す
る溶解活性を、標準ウロキナーゼ（国立衛生試験所配布
）を基準に測定した。
ド各々（以下被験サンプルと略称）のフィブリンに対す
る溶解活性を、標準ウロキナーゼ（国立衛生試験所配布
）を基準に測定した。
試験方法
牛フィブリノーゲン（生化学工業製）２％及びＣａＣｌ
２１０ｍＭを含むＯ−Ｉ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４
）５−に、加温溶解した０２５％アガロース水溶液５−
及び牛トロンビン（持田製薬製）溶液（１００活性単位
／＋＋／）０．１−を加え、混合後直径９．０ ａｎの
ペトリ皿に流し込んでフィブリン平板を作製した。
２１０ｍＭを含むＯ−Ｉ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４
）５−に、加温溶解した０２５％アガロース水溶液５−
及び牛トロンビン（持田製薬製）溶液（１００活性単位
／＋＋／）０．１−を加え、混合後直径９．０ ａｎの
ペトリ皿に流し込んでフィブリン平板を作製した。
このフィブリン平板上に１単位のヒルジンを含む５μｍ
の各被験サンプルをスポットし、３７℃１８時間インキ
ュベート後、溶解円の大きさから活性値を算出した。各
被験サンプルの２８０ｎｍに於ける単位吸光度に対する
フィブリン溶解活性を国際単位で下記表に示した。
の各被験サンプルをスポットし、３７℃１８時間インキ
ュベート後、溶解円の大きさから活性値を算出した。各
被験サンプルの２８０ｎｍに於ける単位吸光度に対する
フィブリン溶解活性を国際単位で下記表に示した。
ＡＰＵＫ（ｋ、ｄ） ８．７
ｘ １０’ＡＰＵＫ（ｋ、ｋ）
９．２ ｘ １０’Ｖ２ＰＵＫ（ｋ、ｑ）
１ ０．４ ｘ １０’
ｘ １０’ＡＰＵＫ（ｋ、ｋ）
９．２ ｘ １０’Ｖ２ＰＵＫ（ｋ、ｑ）
１ ０．４ ｘ １０’
第１図は実施例１及び実施例２の、第２図は実施例３の
、第３図は参考例１の及び第４図は参考例２の作成系統
図である。 第５図、第６図、第７図及び第８図はそれぞれ本発明の
ヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドＰＣＵＫ（−、ｑ
） 、ＡＨＵＫ（ｑ、ｑ） 、ＡＰＵＫ（ｋ、ｋ）及び
ＡＰＵＫ（ｋ、 ｑ）をコードするＤＮＡの塩基配列及
び対応するアミノ酸配列（−文字略号）である。 出願人 （４３０）日本曹達株式会社代理人 （７１
２５）横 山 吉 実間 （９６４Ｂ＞東
海 裕 作第５−１図 第５−２図 ＴＣｒＡＧＡＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＡＩＮ
ｆＡＧＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＭＱＡＱＱＭＶＱＰＱＳＰ
Ｖ ＳＨＲＥＣＱＱＰＨＹＹＧＳＥＶＴＴＫＭＬＴＧＣＴＧ
ＴＴ
ＡＡＡＡＴＣＡＴＡＶＫＬＫ
ＦＱＣＧＱＫＴＬＲＰＱＦＫＩＩＣＡＡＤＰＱＷＫＴＤ
ＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＴＧＧＣＧＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣ
ＣＡＣＣＡ
ＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＧＥＦＴＴＩＥＮＱＰ
ＷＦＡＡＩＹＲＲＨＶＣ５ＬＱＧＲＭＴＬＴＧＩＶＳＷ
ＧＲＧＣＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＩ’ＣＴＧＴＣＡＣＣｒ
Ｔ′ＣＡＧＣＣ［Ａ
ＴＲＧＧＳＶＴＹＶＣＧＧＳＬＩＳＰＣＷＶＩＡＬＫＤ
ＫＰＧＶＹＴＲＶＳＨＦＬＰＷＩＲＣＡＧＣＧＣＣＡＣ
ＡＣＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴｒＡＣＣＣＡＡＡＧ
ＡＡＧＧＡＧＧＡＣＴＡＣＡＴＣＧＴＣＴＡＣＣ’］℃
ＧＧＳＡＴＨＣＦＩＤＹＰＫＫＥＤＹＩＶＹＬＧＳＨＩ
ＫＥＥＮＧＬＡＬ 畳 ＴＩ’ＴＴＧＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣ
ＡＣ；ＣｒＧｒＡＡＧＡＲ３ＲＬＮＳＮＴＱＧＥＭＫＦ
ＥＶＥＮＬＩＣＣＴＡＣＡＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＡＧＣ
ＧＣＩＹ；Ａ、ＣＡ
’ＩＴＧＣＣＴＴα？１１ｕＡＡＬＨＫＤＹＳＡＤＴ
ＬＡＨＨＮＤＩＡＬＬＫＡＧＡＧＣＩＹ；ＧＧＡＡＴＡ
ＴＡＧＧＣ′ｒｃｒＧＣＡＣＡＧＡＴＧＡＧＡ Ａ ＩＲ５ＫＥＧＲＣＡＱＰＳＲＴＩＱＴＩＣＬＣＡＡＴＡ
ＧＣＩＴＴＡＣＣＣＴＣＡ１０４０ＣＡＡＴＡＧＣＩＴ
ＴＡＣＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴｒＰＳ ５６
０ ５７０ ５８０ ５９０
６００ＡＧ Ａ ＧＡ ＡＴＴＣＴＡ ＣＣ
Ｇ ＡＣＴＡＴＣＴＣＴＡＴＣＣＧＧＡＧＣＡ ＧＣＴ
ＧＡＡＡＡＴＧＡσｒＧＴＴＧＴＧＡＡα：ＴＧＡＴＥ
ＮＳＴＤＹＬＹＰＥＱＬＫＭＴＶＶＫＬＩ第６−１図 第６−２図 ＭＮＱＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫ ＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡ
ＴＧＬＳＮＥＬＨＱＶＰＳＮＣＤＣＬＮＧＧＴＣＧＣＡ
ＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＡＡＧＴＣＡＡＡＡ
ＡＣＣＴＧＣＴＡＴＧＡＧＧＣＧＡＡＴＧＧＴＣＡ σ
１ＴＴＴＡＣＣＧＱＨＣＥＩＤＫＳＫＴＣＹＥＧＮＧＨ
ＦＹＲＣσロ’ＣＡＧＣＡＡＡα７ＡＣＣＡＴＧＣα：
：ＡＣＡＧＡＴ（ＴＧＡＬＱＱＴＹＨＡＨＲ５ＤＡＬＱ
ＬＧＬＧＫ）１ＴＡＡＴＴ
ＡＴＧＴＧＣＡ
απＧＧＧＣＣＴＮＹＣＲＮＰＤＮＲＲＲＰＷＣＹＶＱ
ＶＧＬＫＬＬＶＱＥＣＭＶＨＤＣＡＤＧＱＫＰＳＳＴＣ
ＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＧＴＧ
ＴＧＧＣＣＡＡＡＡにＡＣＴＣＩ℃ＡＧＧＣＣＴＣＡＧ
’ｍＡＡＡＡＴＰＰＥＥＬＫＦＱＣＧＱＫＴＬＲＰＱＦ
ＫＩＣＡＴＴＩＩＩ；ＧＣα；ＣＣ；ＡＡＴｒＣＡＣＣ
ＡＣＣＡ
ππＡＣＡＧＧＡＧＩＧＧＥＦＴＴＩＥＮＱＰＷＦＡＡ
ＩＹＲＲＬＶにＳＬＱＧＲＭＴＬＴＧＩＶＳＷＧＲＧ第
６−３図 第７−１図 Ｃ Ａ Ｌ Ｋ Ｄ Ｋ Ｐ Ｇ ■ Ｙ Ｔ Ｒ ■ Ｓ Ｈ Ｆ Ｌ Ｐ Ｗ ■ Ｈ Ｎ Ｑ Ｅ Ｑ ■ Ｓ Ｐ Ｌ Ｔ Ｌ Ｌ Ｋ Ｒ Ｓ Ｈ Ｔ Ｋ Ｅ Ｅ Ｎ Ｇ Ｌ Ａ Ｌ ＴＴＴｒＧＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＡＴＣＴＣＣＡＥＡＧ
ＣＴＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡＴＡＴＡＧＧ
ＣＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＴＧＡ■ Ｄ Ｋ Ｓ Ｋ Ｔ Ｃ Ｙ Ｅ Ｇ Ｎ Ｇ Ｈ Ｆ Ｙ Ｒ Ｇ Ｋ Ａ Ｓ ＣＧＡＣＡＡＴＡＧ（７１ＴＡＣＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣ
ＴｒＮ Ｐ Ｄ Ｎ Ｒ Ｒ Ｒ Ｐ Ｗ Ｃ Ｙ ■ Ｑ ■ Ｇ Ｌ Ｋ Ｌ Ｌ ■ Ｌ Ｋ Ｆ Ｑ Ｃ Ｇ Ｑ Ｋ Ｔ Ｌ Ｒ Ｐ Ｒ Ｆ Ｋ ■ ■ Ｇ Ｇ Ｅ Ｆ Ｔ Ｔ ■ Ｅ Ｎ Ｑ Ｐ Ｗ Ｆ Ａ Ａ ■ Ｙ Ｒ Ｒ Ｈ Ｒ Ｇ Ｇ 第７−２図 第７−３図 ＴＡＣＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴ 第８−１図 第８−２図
、第３図は参考例１の及び第４図は参考例２の作成系統
図である。 第５図、第６図、第７図及び第８図はそれぞれ本発明の
ヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドＰＣＵＫ（−、ｑ
） 、ＡＨＵＫ（ｑ、ｑ） 、ＡＰＵＫ（ｋ、ｋ）及び
ＡＰＵＫ（ｋ、 ｑ）をコードするＤＮＡの塩基配列及
び対応するアミノ酸配列（−文字略号）である。 出願人 （４３０）日本曹達株式会社代理人 （７１
２５）横 山 吉 実間 （９６４Ｂ＞東
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ＧＲＧＣＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＩ’ＣＴＧＴＣＡＣＣｒ
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ＡＴＧＴＧＣＡ
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６−３図 第７−１図 Ｃ Ａ Ｌ Ｋ Ｄ Ｋ Ｐ Ｇ ■ Ｙ Ｔ Ｒ ■ Ｓ Ｈ Ｆ Ｌ Ｐ Ｗ ■ Ｈ Ｎ Ｑ Ｅ Ｑ ■ Ｓ Ｐ Ｌ Ｔ Ｌ Ｌ Ｋ Ｒ Ｓ Ｈ Ｔ Ｋ Ｅ Ｅ Ｎ Ｇ Ｌ Ａ Ｌ ＴＴＴｒＧＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＡＴＣＴＣＣＡＥＡＧ
ＣＴＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡＴＡＴＡＧＧ
ＣＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＴＧＡ■ Ｄ Ｋ Ｓ Ｋ Ｔ Ｃ Ｙ Ｅ Ｇ Ｎ Ｇ Ｈ Ｆ Ｙ Ｒ Ｇ Ｋ Ａ Ｓ ＣＧＡＣＡＡＴＡＧ（７１ＴＡＣＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣ
ＴｒＮ Ｐ Ｄ Ｎ Ｒ Ｒ Ｒ Ｐ Ｗ Ｃ Ｙ ■ Ｑ ■ Ｇ Ｌ Ｋ Ｌ Ｌ ■ Ｌ Ｋ Ｆ Ｑ Ｃ Ｇ Ｑ Ｋ Ｔ Ｌ Ｒ Ｐ Ｒ Ｆ Ｋ ■ ■ Ｇ Ｇ Ｅ Ｆ Ｔ Ｔ ■ Ｅ Ｎ Ｑ Ｐ Ｗ Ｆ Ａ Ａ ■ Ｙ Ｒ Ｒ Ｈ Ｒ Ｇ Ｇ 第７−２図 第７−３図 ＴＡＣＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴ 第８−１図 第８−２図
Claims (4)
- （１）ヒト血液凝固第ＸIII因子の酵素作用により血栓
と共有結合を生ずる構造を有するオリゴペプチドを、ヒ
トプロウロキナーゼ誘導体のＮ端側に付したヒトプロウ
ロキナーゼ様ポリペプチド。 - （２）特許請求の範囲第１項記載の血栓と共有結合を生
ずる構造を有するオリゴペプチドが付加されたヒトプロ
ウロキナーゼ様ポリペプチドのアミノ酸配列、又は、こ
れと実質上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡセグメント。 - （３）特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡセグメント、
その発現のための制御領域及び大腸菌で複製するのに必
要なＤＮＡ配列を含有するプラスミド。 - （４）特許請求の範囲第３項のプラスミドで形質転換さ
れた大腸菌を培養し、その培養菌体から前記ヒトプロウ
ロキナーゼ様ポリペプチドを採取することを特徴とする
ヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチドの製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15016189 | 1989-06-13 | ||
| JP1-150161 | 1989-06-13 | ||
| JP2-123163 | 1990-05-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0475584A true JPH0475584A (ja) | 1992-03-10 |
Family
ID=15490839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2145369A Pending JPH0475584A (ja) | 1989-06-13 | 1990-06-05 | ヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチド及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0475584A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994001543A1 (fr) * | 1992-07-03 | 1994-01-20 | Nippon Soda Co., Ltd. | Polypeptide humain de faible masse moleculaire semblable a la pro-urokinase, et sa production |
-
1990
- 1990-06-05 JP JP2145369A patent/JPH0475584A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994001543A1 (fr) * | 1992-07-03 | 1994-01-20 | Nippon Soda Co., Ltd. | Polypeptide humain de faible masse moleculaire semblable a la pro-urokinase, et sa production |
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