JPH02177886A - 乳酸オキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、１モルのＩ、−乳酸に作用して１モルの酸素
を消費し、１モルのピルビン酸および１モルの過酸化水
素を生成する反応を触媒する酵素である常用名”乳酸オ
キシダーゼ”を構成するポリペプチドをコードする新規
な遺伝子を用いた乳酸オキシダーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、乳酸を基質とする乳酸オキシダーゼとしては、 １７−乳酸＋Ｏ□　−一→ピルビン酸十Ｈ２Ｏ２で示さ
れる酵素反応、すなわちＬ〜乳酸と１分子の酸素からピ
ルビン酸と１分子の過酸化水素との生成反応を触媒する
酵素が報告されており、該酵素はこれまでにペデイオコ
ッカス（Ｐｅｄ　１ｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコ
ッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アエロコツ
カス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌等に存在
することが知られている（特公昭５Ｂ−４５５７号、特
公昭５９−１０１９０号）。これらの乳酸オキシダーゼ
は、Ｌ−乳酸を基質とする酸化酵素であることから、生
体成分、例えば血清または乳酸塩を用いた種々医薬品あ
るいは乳酸発酵におりる乳酸の定量および乳酸試薬の乳
酸純度試験、直接間接に乳酸を生成または乳酸消費に関
与する酵素の活性測定などの分析や血清中の乳酸の除去
等に使用されており、極めて有用な酵素である。一方、
上記乳酸オキシダーゼ以外に以前より公知であった常用
基゛乳酸オキシダーゼ”として、エンザイム・ハン）−
′ブック（ＥｎｚｙＶｌｅ　ｈａｎｄｂｏｏｋ）第１巻
第１１１　ａ　（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　Ｂ
ｅｒｌｉｎ　ｌｌｅｉｄｅｌｂｅｒｇ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ発行、１９６９年、Ｅ　・パーマン著）に記載されて
いるマイコバクテリウム・フレイ　（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ｐｈｌｅｉ）またはネーヂ−＠　　（Ｎａ
ｔｕｒｅ）第１７０巻第２０７頁（１９５２年）に記載
されているマイコバクテリウムアビウム（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）由来のＩ、−ラクテート
：オキシゲン・オキシドレダクターゼ（Ｌ−Ｌａｃｔａ
ｔｅ：ｏｘｙｇｅｎ　ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ、
、酵素番号１．１．３゜２）が知られているが、この乳
酸オキシダーゼは本発明の乳酸オキシダーゼとは異なる
次式の反応を触媒する酵素であり、その反応生成物は酢
酸、二酸化炭素および水を生成する。

ＣＨ２−Ｃ−（１００Ｉ（＋Ｏ，− 従って、以下単に乳酸オキシダーゼと記載する場合ば、
１モルのＬ−乳酸に作用して１モルの酸素を消費し、１
モルのピルビン酸および１モルの過酸化水素を生成する
反応を触媒する酵素を表すものとする。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来より報告されている乳酸オキシダーゼ生産菌は、乳
酸オキシダーゼの生産性が低く、また純度の高い良質な
乳酸オキシダーゼを得るために生成コストが非常に高い
ものとなり、研究用または臨床診断用の酵素試薬として
容易に広く用いるには必ずしも満足のいくものではなか
った。またこれら乳酸オキシダーゼのアミノ酸配列をコ
ー１−’　ｔ。

た詳細な遺伝子の一次構造及び該酵素を構成するポリペ
ブチｌ゛の一次構造は未だ報告されておらず、従って遺
伝子工学的手段を用いる該酵素の生産性向上による上記
問題点の具体的解決法が求められていた。

〔問題点を解決するだめの手段〕

本発明者らは、上記乳酸オキシダーゼの生産性向上によ
る製造コストの低減を図るべく高生産性菌株のスクリー
ニングおよび菌株改良に努力したとごろ、乳酸オキシダ
ーゼをコーｌする詳細な遺伝子の一次構造決定及び該酵
素を構成するポリペプチドの一次構造推定に成功し、さ
らに少なくとも該ＤＮＡを挿入したベクターを保持する
形質転換体を取得し、次いで該形質転換体を培養するこ
とにより目的とする乳酸オキシダーゼの製造法を確立し
、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、 １モルの１．−乳酸に作用して１モルの酸素を消費し、
１モルのピルビン酸および１モルの過酸化水素を生成す
る反応を触媒する酵素である乳酸オキソダーゼを構成す
るポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基
配列を含むＤＮＡ、少なくとも、該ＤＮＡを保持するこ
とを特徴とするヘククーＤＮＡ。

宿主にとって外来性である該ベクターＤＮＡを保持する
ことを特徴とする形質転換体、 上記の乳酸オキシダーゼを構成し、Ｎ末端側より第１図
にて表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 宿主にとって外来性である」二記ベクターＤＮＡを保持
する形質転換体を培養して、上記の乳酸オキシダーゼを
構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ塩基配列を含むＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、その
培養物から」二記の乳酸オキシダーゼを採取することを
特徴とする乳酸オキシダーゼの製造法、 を提供する。

本発明の乳酸オキシダーゼを構成するポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする新規なりＮＡ遺伝子発現により
得られる本発明の乳酸オキシダゼは、前述の通りＬ−乳
酸と酸素からピルビン酸と過酸化水素を生成する反応を
触媒するものであるが、さらに該酵素における２、３の
特徴としてその理化学的性質を例示すれば次の如くであ
る。

即ち、 ｔａ＋　　作用；反応式（１） Ｌ−乳酸＋Ｏ□　□ピルビン酸十ＨｚＯｚ　　（Ｔ）で
表される反応を触媒する作用。

（ｂ）　　基質特異性；■７−乳酸に基質特異性ををす
る。

ＴＣＩ　　至適ｐ　Ｈ；　ｐ　Ｈ６−７付近。

（ｄｌｐＨ安定性；　ｐ　Ｈ６，８−８，５イ」近で安
定。

（ｅｌ　　至適温度；　３５°Ｃイ」近。

（ｆｌ　　等電点；９丁１４．６　±０．３（キャリア
・アンフオライトを用いる電気泳動法）。

（ｇ）　　分子量；　　８００００±１００００　　。

本発明のＤＮＡは、例えば遺伝子組換え技術を利用し次
の如くして製造される。すなわち、乳酸オキシダーゼ産
生能を有する乳酸オキシダーゼ遺伝子の供与体である微
生物より該微生物のＤＮＡを分離精製した後、超音波、
制限酵素等を用いて切断した該ＤＮＡと切断してリニヤ
−にした発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接着末
端部においてＤｊＪＡリガーゼ等により結合閉環させる
。

次いで、得られた組換えＤＮＡベクターを複製可能な宿
主微生物に移入した後、ベクターのマーカーまたは／お
よび乳酸オキシダーゼの活性とを指標としてスクリーニ
ングして取得した該組換えＤＮＡベクターを保持する微
生物を培養し、該培養菌体から該組換えＤＮＡベクター
を分離精製し、次いで咳組換えベクターから乳酸オキシ
ダーゼ遺伝情報を有する本発明ＤＮＡを採取することに
より製造できる。

ＤＮＡの供与微生物は、乳酸オキシダーゼ産生能を有す
る微生物であればよく、例えば、ペデイオコッカス属、
ストレプトコツカス属、アエロコツカス属に属する生産
菌等の群から適宜選ばれ、例エバ、ペデイオコッカス・
ニス・ビー・Ｂ−０６６７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４６５）
　、ストレプトコッカス　ニス・ピ・Ｂ−０６６８（Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−４６６）　、ストレプトコ・ノカスファ
エシウムＡＴＣＣ１２７５５、アエロコツカス・ビリタ
フ　スＩＦＯ１２２１９、アエロコツカス・ビリダンス
ＩＦ０１２３１７等が挙げられ、好ましくは、アエロコ
ツカス属に属する乳酸オキシダーゼ生産菌としてアエロ
コツカス・ビリダンスＩＦＯ１２２１９が挙げられる。

遺伝子の供与体である微生物に由来するＤＮＡは次の如
くにして採取される。即ち、ＤＮＡの供与微生物を、例
えば、液体培地で約１〜３日間通気攪拌培養し、得られ
る培養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させ
ることによって乳酸オキシダーゼ遺伝子を含有する溶菌
物を調製する。溶菌方法としては、例えばリゾチームや
β−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理が施
され、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリ
ル硫酸すトリウムなどの界面活性剤が併用され、さらに
細胞壁の物理的破壊法である凍結融解やフレンチプレス
処理を上述の溶菌法との組み合せで行ってもよい。この
ようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離、精製する
には、常法に従って、例えばフェノール抽出による除蛋
白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせる
ことにより行うことができる。

分離精製された微生物ＤＮＡを切断する方法は、例えば
、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができ
るが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易な
らしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配
列に作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ　、　Ｈｉｎｄｌｌ
ｌ　、　Ｂａｍ１ｌ　Ｉなどの■型制限酵素が適してい
る。

ベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しう
るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として
構築されたものが適している。

ファージとしては、例えば、エシェリヒア・コリ　（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする
場合には、λｇｔ・λＣ１λｇｔ・λＢなどが使用でき
る。

また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コ
リを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２２ｐＢＲ３２
５、ｐＡｃＹｃ１８４．　　ｐＵｃＬ２．　　ｐＵｃ１
３．　　ｐＵｃ１８ｐＵｃ１９などが、バチルス・ズブ
チルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　）を宿主
微生物とする場合にはｐＵＢｌｌｏ　、ｐｃ１９４など
が使用でき、またサツカロマイセス゛セレビンア（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｕａｅ）を宿
主微生物とする場合には、ＹＲｐ７．ｐＹｃｌ、ＹＥｐ
１３１ｐＪＤＢ、　ｙｒｐｌ等が使用できる。さらに、
エシェリヒア・コリおよびサツカロマイセス・セレビシ
アなどの二種以上の宿主微生物の細胞中で自律的に増殖
可能なシャトルベクターを利用することもできる。この
ようなベクターを、先に述べた乳酸オキシダーゼ遺伝子
供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と
同じ制限酵素で切断して、ベクター断片を得ることが好
ましい。

微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は
、公知のＩ）ＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、
例えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の
接着末端とのアニーリングの後、適当なりＮＡリガーゼ
の作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片との組換
えＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリングの後、
宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用
し組換えＤＮＡを作成することもできる。

宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に
増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発現のできるも
のであればよく、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・
コリの場合、エシェリヒア・コリＤ　Ｈ１、エシェリヒ
ア・コリＩ（ＢＩＯＩエシェリヒア・コリＷ３１１０．
エシェリヒア・コリＣ６００等が使用でき、宿主微生物
がバチルス・ズブチルスの場合、バチルス・ズブチルス
２０７−２５　［ジーン（Ｇｅｎｅ）第３４巻、第１〜
８頁、１９８５年］、バチルス・ズブチルス２０７−２
１　［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ）第９５
巻、第８７〜９３頁、１９８４年１、バチルス・ズブチ
ルスＢＤ１７０　［ネーチ＋　　（Ｎａｔｕｒｅ）第２
９３巻、第４８１〜４８３頁、１９８１年）、バチルス
・ズブチルスｈ株（ＡＴＣＣ６０５１）等が使用でき、
宿主微生物がサツカロマイセス・セレビノアの場合、サ
ツカロマイセス・セレビンアΔト２２［ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）第３９巻、第１１７〜１２０頁、１９８５年］、サ
ツカロマイセス・セレビシアＢｗｃ１４１１　［モレギ
ュラーアンド・セルラー　バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ＆Ｃｅ１１ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）第６巻、
第３５５−３６７頁、１９８６年）等が使用できる。

宿主微生物に組換えＤＮＡを移入する方法としては、例
えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場
合には、カルシュラムイオンの存在下で組換えＤＮＡの
移入を行い、またバチルス属に属する微生物の場合には
、コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを採
用することができ、さらにマイクロインジェクション法
を用いてもよい。

宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有無についての
選択は、目的ＤＮＡ断片を保持する組換えＤＮＡである
ベクターのマーカー、好ましくは薬剤耐性マーカーおよ
び／または乳酸オキシダーゼ活性を発現し得る微生物を
検索すればよく、例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選
択培地で生育し、かつ乳酸オキシダーゼを構成するポリ
ペプチドを生成する微生物を選択すればよい。

このようにして−度選択された乳酸オキシダゼ遺伝子を
保有する組換えＤＮＡは、形質転換微生物から取り出さ
れ、他の宿主微生物に移入することもできる。また、乳
酸オキシダーゼ遺伝子を保持する組換えＤＮＡから制限
酵素などにより切断して乳酸オキシダーゼ遺伝子である
ＤＮＡを切り出し、これと同様な方法により切断して得
られる他の開環ベクター末端とを結合させて新規な特徴
を有する組換えＤＮＡを作成して、他の宿主微生物に移
入することもできる。

また本質的に乳酸オキシダーゼ活性のある乳酸オキソダ
ーゼムティンをコードするＤＮＡは、本発明の乳酸オキ
シダーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される
人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は部位特
定的塩基変換法および目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人
工変異ＤＮＡ断片で置換するなどの種々なる遺伝子工学
的方法を使用して得られ、斯くして取得された人工変異
遺伝子のうち特に優れた性質を有する乳酸オキシダーゼ
ムティンＤＮＡをベクターに挿入せしめて組換えＤＮＡ
を作成し、これを宿主微生物に移入させることによって
、乳酸オキシダーゼムティンの製造が可能である。

かくして得られた形質転換体を具体的に例示すれば、ア
エロコツカス・ビリダンスＩＰＯ１２２１９より採取し
た乳酸オキシダーゼをコードするＤＮＡをプラスミドｐ
ＡｃＹｃ１８４に組み込み、該プラスミドｐＯＸＩ８を
宿主微生物に移入して得た形質転換体エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１・
ｐＯＸＩ８株「微工研菌条寄第２１７３号（ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−２１７３）が挙げられる。

かくして得られる本発明ＤＮＡの塩基配列は、５ｃｉｅ
ｎｃｅ　２１４　１２０５〜１２１０　（１９８１年）
に示されているジデオキシ法で解読し、決定することが
できる。

例えば、乳酸オキシダーゼ遺伝子供与体としてアエロコ
ツカス属に属する菌を用い、宿主微生物としてエシェリ
ヒア・コリを用いて得られたプラスミド中の遺伝子の塩
基配列は第２図の通りである。

第２図において、Ｎ末端の１位Ａｓｎを示すコドンＡＡ
Ｔの上流たる５゛末端側はアミノ酸をコードするコドン
であればいずれでもよく、さらにその５゛末端側にアミ
ノ酸をコードするコドンを１個以上有してもよいが、好
ましくはＡＴＧまたはＡＴＧ以外の開始コドンやシグナ
ルペプヂドに対応するポリデオキシリポ核酸を挙げるこ
とができる。またＣ末端のＴｙｒを示ずＴＡＣの下流た
る３”末端側には、翻訳終始コドンまたはアミノ酸をコ
ードするコドンであればいずれでもよく、さらにその３
゛末端側にアミノ酸をコードするコア ）−ンを１個以上有していてもよいが、その場合にはこ
の複数個のコドンの３゛末端にさらに翻訳終始コドンを
有することが好ましい。

さらに、本発明の乳酸オキソダーゼの塩基配列の解明に
より、今後コロニーハイブリダイゼーション法により目
的乳酸オキシダーゼ構造遺伝子をクローニングすること
もできる。その場合、まず本発明で得られる乳酸オキシ
ダーゼのＤＮＡの断片を取り出し、該ＤＮＡ断片を３２
Ｐ等でラヘルし、コロニーハイブリダイゼーションによ
り、乳酸オキソダーゼＤＮＡ供与微生物の培養細胞より
採取した遺伝子ライブラリーの中から、乳酸オキシダー
ゼの構造遺伝子を含むプラスミドで形質転換された株の
選択をすることにより目的乳酸オキンダーゼ構造遺伝子
をクローニングすればよい。

また、本発明ＤＮＡを発現させることにより生産される
乳酸オキシダーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配
列は、ＤＮＡの塩基配列より予測決定できる。なお、該
ペプチドのＮ−末端部を構成する部分アミノ酸配列は、
以下の如くして決定できる。すなわち、乳酸オキシダー
ゼ産生能を有する乳酸オキシダーゼ遺伝子供４Ｒｉ生物
を栄養培地で培養して菌体内に乳酸オキシダーゼを産生
蓄積せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過または
遠心分離等の手段により菌体を採取し、次いでこの菌体
を機械的方法またはりゾチーム等の酵素的方法破壊し、
また必要に応してＥＤＴＡおよび／またば適当な界面活
性剤等を添加すれば、乳酸オキソダーゼが可溶化され、
水溶液として分離採取される。この様にして得られた乳
酸オキシダーゼの水溶液を濃縮するか、または濃縮する
ことなく硫安分画、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィ、
イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、高純度
な乳酸オキシダーゼが得られ、高純度乳酸オキシダーゼ
を用いて液相プロティン・ンケンサ＝（ヘノクマン社製
：Ｉ３ＥＣＫＭＡＮ　　Ｓｙｓｔｅｍ　８９０Ｍｇ）に
より乳酸オキシダーゼであるペプチドのＮ末端部を構成
する部分アミノ酸配列が決定される。また、このように
して得られたポリペプチドは少なくとも該部分アミノ酸
配列において、遺伝子操作によって得られた乳酸オキシ
ダーゼのＮ末端部分アミノ酸配列と一致するものである
ことを確認し、第２図で示す塩基配列から、上記の如く
して決定されたアミノ酸配列は第１図に表される通りで
ある。ここで、本発明で得られる乳酸オキシダーゼは、
分子量と本発明の第１図にて示されるポリペプチドのア
ミノ酸数との比較から、前述のポリペプチドの二量体で
あると推定される。

第１図のアミノ酸配列において、Ｎ末端のＡｓｎで示さ
れる上流のアミノ酸残基としては、−個または複数個の
アミノ酸残基よりなり、好ましくは、水素原子若しくは
Ｍｅｔまたはシグナルペプチドが挙げられる。Ｃ末端の
Ｔｙｒで示される下流のものとしてはそのまま、または
酸アミドであってもよく、また１個以上のアミノ酸残基
であってもよい。

かくして得られる形質転換体である微生物は、栄養培地
に培養されることにより多量の乳酸オキシダーゼを安定
して産生じ得る。

形質転換体である微生物の培養形態はその栄養生理的性
質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場
合は、液体培養で行うか、工業的には深部通気攪拌培養
を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物
の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素
源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例え
ばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルト−ス
、フラクトース、糖蜜、などが使用される。窒素源とし
ては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが
使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグ
ネシウム、カルシウムカリウム、鉄、マンガン、亜鉛な
どの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要
に応じて使用される。

培養温度は微生物が発育し、乳酸オキシダーゼを生産す
る範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合
、好ましくは２０〜４２°Ｃ程度である。培養時間は、
条件によって多少異なるが、乳酸オキノダーゼが最高収
量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了す
ればよく、通常は１２〜４８時間程度である。培地ｐ　
Ｈは菌が発育し、乳酸オキシダーゼを生産する範囲で適
宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６，０〜８．０程
度である。

培養物中の乳酸オキシダーゼは、菌体を含む培養液その
ままを採取し、利用することもできるが、一般には常法
に従って、乳酸オキシダーゼが培養液中に存在する場合
には、濾過、遠心分離などにより乳酸オキシダーゼ含有
溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。乳酸オ
キシダーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養
物を濾過または遠心分離などの手段により、菌体を採取
し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチムなどの
酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキ
レート剤および／または界面活性剤を添加して乳酸オキ
ノダーゼを可溶化し水溶液として分離採取する。

この様にして得られた乳酸オキシダーゼ含有溶液を、例
えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸すｌ・リウ
ムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメ
タノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法
により沈澱せしめればよい。次いでこの沈澱物を、水に
溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純
物を除去することができる。また吸着剤あるいはゲル濾
過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィイオン
交換クロマトグラフィーにより精製し、これらの手段を
用いて得られる乳酸オキシダーゼ含有溶液は、必要に応
して凍結乾燥のための安定化剤を添加して、減圧濃縮凍
結乾燥等の処理により精製された乳酸オキシダーゼを得
ることができる。

本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核酸、核酸関連
物質、その他に関する略号は、それらの当該分野におけ
る慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記す
る。またすべてのアミノ酸は５体を示すものとする。

ＤＮＡ　　・　デオキシリボ核酸 ＮＡ ｌａ ｒｇ ５ｎ ＡＳＴ） ＹＳ ｉｎ ｌｕ 　ｌｙ 　　ｌ　ｓ １ａ 　ｅ　ｕ ｙ　Ｓ 　ｅ　　ｔ ｈｅ Ｐｒ。

リボ核酸 アデニン チミン グアニン シトシン アラニン アルギニン アスパラギン アスパラギン酸 システィン グルタミン グルタミン酸 グリシン ヒスチジン イソロイシン ロイシン リジン メチオニン フェニルアラニン プロリン ３ｅｒ　　：　　セリン Ｔｈｒ　　：　　スレオニン Ｔｒｐ　：　　トリプトファン Ｔｙｒ　：　チロシン Ｖａｌ　　：　　バリン 〔実施例〕 以下、実施例を挙げて本発明の詳細な説明するが、本発
明はこれらによって何ら限定されるもの〔実施例〕 実施例１．〔染色体ＤＮＡの分離〕 Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｉｒｉｄａｎｓ　（Ｉ　Ｆ　
Ｏ％　１２２１９　）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離
した。同菌株を１５０ｒ／Ｉｌの普通ブイヨン培地（０
，５％チオ硫酸ソーダ含有）で３７℃−晩振盪培養後遠
心（３，０００回転１０分）Ｑこより集菌した。１０％
サッカロース、５０　ｍ　Ｍ　）　！Ｉ　ｙ、塩酸（ｐ
Ｈ８，０）５０ｍＭＥＤＴＡを含んだ溶液５ゴに懸濁さ
せ、１Ｍのリゾチーム溶液（ｌＱｍ＠／ｍＩりを加えて
３７℃、１５分間保温し、次いでＩＭの１０％ＳＤＳ　
（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を加えた。この懸濁ｐ
ｔこ等量のクロロホルム−フェノ−／Ｉ／混液（１：１
）を加え、攪拌混合し、１０，０００　ｒ　ｐｍ３分の
遠心で水層と溶媒層ｅこ分け、水層を分取した。

この水層に２倍量のエタノールを静かｔこ重層し、ガラ
ス棒でゆっくり攪拌しながらＤＮＡをガラス棒？こまぎ
つかせて分離した。これを１０ｍ１の１０ｍＭ）ｌＪ７
　塩酸　（ｐＨ８，０）　　、　１ｍ　Ｍ　　　ＥＤＴ
Ａを含んだ溶液（以下ＴＥと略すうで溶解した。これヲ
等量のクロロホルム−フェノール混液て処理後、遠心に
より水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて上記の
方法でもう一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解し
た。

実施例２．ＣｐＡＣＹＣ１８４プラスミドＤＮＡの分離
〕 ｐＡＣＹＣ１８４を保有スるエシェリヒア・コ！ｌｐＭ
１９１（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　　　１３４．　　１
１４１（１９８１）；ＡＴＣＣ３７０３３）を１ｔのＢ
　Ｈ■培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で振盪培養した。濁度が
０Ｄ６６０＝　１．０　ｔ＝増殖したとき、ヌペクチノ
マイシン（最終濃度３００μ７／〜〕を加え、さらに３
７℃で１６時間以上振盪を続けた。３０００ｒｐｍｌ’
０分間の遠心？こより集菌し、リゾチームＳＤＳ法とセ
シウムクロライド−エチジウムブロマイド法（Ｍａｎｉ
ｏｒｔ　ｉｓら：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ　ｐｐＨ　６　〜９　４　　　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ　　（１９８２）　　）ｆこ従いプラスミ
ドＤＮＡを調製した。

実施例３　〔乳酸オキンダーゼ遺伝子を有するプラスミ
ドｐＯＸＩ８の作成〕 （１）実施例１で調製したＡ、　ｖｉｒｉｄａｎｓの染
色体ＤＮＡ２．ｃｒｔ（約０５μ７）と１００倍量のＥ
　ｃｏＲＩ切断用バッファー（５００ｍＭＩ−リヌ塩酸
（ｐＨ７，５）　、　７０　ｍＭＭｇｃ］２．　　ＩＭ
ＮａＣｌ、　７０　ｍＭメルカプトエタノール）１μＬ
、　ＥｃｏＲＩ　（宝酒造製　１０　ｕｎｉもｉａｌ　
）　１　ｐｔ、水６ｐＬを混合し、３７℃１時間切断し
た。別に調製したプラスミドｐＡＣＹＣ１８４Ｄ　Ｎ　
Ａ約０３μ２を同様の方法を用いてＥｃｏＲＩで切断し
、さらンこアルカリ性フォスファターゼ（以下ＢＡＰと
略すことがある。宝酒造製）　Ｑ、　５　ｕｎｉｔを加
え、６５℃１時間処理した。これらのＥｃｏＲＩで切断
した２種のＤＮＡ溶液を混合し、そのＨｏ量の３Ｍ酢酸
す）　ＩＪウムを加え、さらに全体量と等量のクロロホ
ルム−フェノール混液で処理し、遠心分離Ｑこより水層
を分取した。この水層ｅこ２倍容のエタノールを加え、
遠心でＤＮＡを沈澱させたのち減圧乾燥した。水８９μ
ｔで溶解後、１０１４度のライゲーションバッファ（０
，５Ｍトリヌ塩酸（ｐＨ７，６）　、　　０．１ＭＭｇ
ＣＩ２．　　Ｑ、１Ｍジチオスレイト−ｚｙ、１０ｍＭ
スペルミジン。

１０ｍＭＡＴＰ　）１０　ｔｔｔとＴ　４ＤＮＡ　＋Ｊ
ガーゼ１μｔ（宝酒造製　１７５ｕｎｉｔ）を加え混合
し４℃で一晩放置した。このＤＮＡ溶液をクロロホルム
−フェノール処理し、エタノール沈澱を集め減圧乾燥し
た後、１０μｔのＴＥで溶解した。

（ｉ）ｌＱＱｉのＢＨＩ培地（Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ
Ｉｎｆｕｓｉｏｎ、　Ｄｉｆｃｏ社製〕で培養した対数
増殖期のエシェリヒア・コリＤＨ１株〔国立遺伝学研究
所より分与を受けた、ストック番号　ＭＥ８５６９　）
を遠心分離ｔこより集菌しく１０．００Ｏｒｐｍ、　　
２分間）４０ｍ（７）氷冷した３ｏｍｌＶＩ酢酸カリウ
ム、１００　ｍＭＲｂｃｌ、１０　ｍ　Ｍ　ＣａＣｌ２
．５０ｍＭＭｎＣ１２および１５％グリセリンを含んだ
溶液（ｐＨ５，８）で懸濁した。０℃で５分間放置後、
遠心し上清をすて、さらしこ４ｍｌの１０ｍ　Ｍ　Ｍ　
ＯＰ　Ｓ緩衝液（ドータイト社製）、７５ｍ　Ｍ　Ｃａ
Ｃｌ　２．１０　ｍ　Ｍ　ＲＴ）ＣＩおよび１５％グリ
セリンを含んだ溶液（ｐＨ６，５）で懸濁し、０℃で１
５分間放置してコンピテント細胞とした。

（ＴＩＩ）　　この大腸菌懸濁液２００μｍ１こ（］）
で調製したＤＮＡ溶液１０μＬを加え、３０分間０℃で
放置した。ＢＨＩ培地ｌ　ｍｌを加え、３７℃で９０分
間保温後、この１００μＬをテトラサイクリン（１５／
Ｊ　９　／　ｍｌ）を含んだＢＨＩ寒天プレトＶこまき
、３７℃で一晩培養し形質転換体を得た。この形質転換
体を乳酸オキシダーゼ培地（組成はペプトン５２、Ｎａ
Ｃ１１Ｓ’、Ｋ２ＨＰＯ４１？　、　Ｍｇ５Ｏ，０，５
ｆ、パーオキシダーゼ５００ＩＵ。

シアニジン０．１　ｒ　、乳酸ナトリウム５．６？、寒
天１５２、蒸留水Ｌ　Ｌ、　ｐＨ７，０）のプレートシ
こレプリカし、３７℃でさら１こ一晩培養した。

約８０００コロニーの形質転換体を調べたところ、コロ
ニーの周辺が茶褐色ｅこ変色したもの４株を得、このう
ちの１株をエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＯＸＩ８株［
微生物受託番号　微工研条寄第２７７３号、ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−２１７３］と命名した。この菌を純粋分離後Ｂ
ＨＩ培地で３７℃−晩培養し、乳酸オキシダーゼの生、
３／ 産性を後述する乳酸オキシダーゼ活性測定法により調べ
たところ、約０．５ｕ／ｍｇの乳酸オキシダーゼ活性を
有していた。

この菌株の保有していたプラスミドを実施例２と同様に
してプラスミドを分離し、乳酸オキシダーゼ遺伝子を含
み、ｐ　Ａ　ＣＹ　Ｃ１８４ａ伝子を含むプラスミドを
ｐＯＸＩ８と命名した。

乳酸オギシダーゼ活性測定法 本発明の乳酸オキシダーゼの活性測定法は次の通りであ
る。

反応第１液 ＋ｉミーオキシダーゼ　５０　ｕ　７ｍ１４　）　　　
　　０．１　ｍ１０．２Ｍ　　３．３−ジメチルグルク
レート−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，５）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　０．２′′１５ｍＭ４−アミノ
アンチピリン　　０．１　ｍｌ！０．５ＭＤＬ−乳酸（
ｐＨ６，５）　　　　　　０．１耐水　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　０．３ｄ合計　０８は 反応第２腋 ０２％Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン 、３２ 反応停止液 ０２５％　ラウリルベンゼン硫酸ナトリウム液上記の組
成の反応第１液０８Ｍと反応第２液０２祷を混合し、３
７℃、３分間予備加温した後、酵素液２０ｐｔを加えて
３７℃、１０分間度心金行い、反応後、２０威の反応停
止液を加えて反応を停止し、生じた紫色を５６５　ｎｍ
の波長にて比色定量する。１分間１こ１μｍｏｌｅの過
酸化水素を生じる活性を１単位（Ｕ）とした。

実施例４．（ｐＯＸＩ８のマツピングおよび乳酸オキシ
ダーゼ遺伝子の塩基配列の決定〕エシェリヒア・コリＤ
Ｈ１・ｐＯＸＩ　８株からｐＡＣＹＣ１８４と同様の方
法でｐＯＸＩ８プラスミドＤＮＡを調製した。

ｐ　ＯＸ　Ｉ　８　ＤＮＡｒ！１ツいて制限酵素Ｅ　ｃ
　ｏ　ＲＶ　、　Ｈｐ　ａ　Ｉ　。

ＭＩｕＩ、　Ｓｃａ　Ｉ、　Ｐｓｔ　ｌ、　Ｘｂａ　ｌ
、　Ｘｈｏ　ｌ　（いずれも宝酒造製）Ｆこよる切断地
図を作成した。その結果を第３図ｔこ示した。乳酸オキ
シダーゼ遺伝子を含んだＤＮＡの塩基配列をＭ１３ファ
ージを用いたジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ２１４　１
２０５−１２１０（１９８１））を用いて決定した。乳
酸オキシ列を第１図口ｌへ覧匂激蟲ぴ徴トｌＮ心粒た〜
１葉黴＼に示した。

実施例５．〔乳酸オキシダーゼの製造〕エシェリヒア・
コリＤＨＩ・ｐＯＸＩ８株を２０７のＢＨＩ培地（Ｄｉ
ｆｃｏ社製）で３７℃１８時間ジャーファーメーターｅ
こより培養し、ｓ、ｏｏ。

ｒｐｍｌＱ分間の遠心で集菌した。生理食塩水２ｔで洗
浄後、２ｔの１０　ｍ　Ｍ　ＩＪン酸バッファ（ｐＨ７
，０）で懸濁した。リゾチームを１〜１ｍＡ’。

ＥＤＴＡ−２Ｎａ　　を　２　ｍＭ、）　　リ　ト　ｙ
Ｘ−１００を０１％となるように加えて３７℃３０分間
保温し、５．ＯＯＯｒｐｍｌＯ分の遠心（こより上清液
を分離した。

コノ上清液１．９　！！Ａこついてアセトン沈澱（３０
％〜６５％）を行い、沈澱物を遠＋ｌ：）（５，００Ｏ
ｒｐｍ３０分）ｅこより集めた。この沈澱物を２００　
ｍｌの１０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７，０，１０μＭ
のＦＡＤを含む）で溶解し、セファデックスＧ−２Ｂ ３り ５で脱塩処理をした。この後、 ＤＥＡＥ セファ ロー７ＣＬ−６Ｂを用いてイオン交換クロマトをオキシ
ダーゼ活性測定法により測定した結果〔発明の効果〕 本発明によって、乳酸オキシダーゼ遺伝子および乳酸オ
キシダーゼのアミノ酸配列が明らかになり、遺伝子工学
手法による効率的な乳酸オキシダーゼの製造方法を提供
した。これにより、乳酸オキシダーゼの生産性が高く、
また純度の高い良質な乳酸オキシダーゼを構成するポリ
ペプチドを大量に生産することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例４で得られる乳酸オキシダーゼを構成す
るポリペプチドをコードするアミノ酸配列を示す図面で
ある。第２図は実施例４で得られるＤＮＡの塩基配列を
示す図面である。第３図はプラスミドｐｏｘ　Ｉ　８の
制限酵素地図を示す図面である。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）１モルのＬ−乳酸に作用して１モルの酸素を消費
   し、１モルのピルビン酸および１モルの過酸化水素を生
   成する反応を触媒する酵素である乳酸オキシダーゼを構
   成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
   塩基配列を含むＤＮＡ。
2. （２）少なくとも、乳酸オキシダーゼを構成するポリペ
   プチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基配列がＮ
   末端側より第１図にて表されるアミノ酸配列をコードす
   ることを特徴とする請求項１項記載のＤＮＡ。
3. （３）ＤＮＡ塩基配列が、５’末端側より第２図にて表
   されることを特徴とする請求項第２項記載のＤＮＡ。
4. （４）乳酸オキシダーゼが下記の理化学的性状を示すこ
   とを特徴とする酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
   塩基配列を含む請求項第１項記載のＤＮＡ。 （ａ）作用；反応式〔 I 〕 Ｌ−乳酸＋Ｏ＿２→ピルビン酸＋Ｈ＿２Ｏ＿２〔 I 〕
   で表される反応を触媒する作用。 （ｂ）基質特異性；Ｌ−乳酸に基質特異性を有する。 （ｃ）至適ｐＨ；ｐＨ６−７付近。 （ｄ）ｐＨ安定性；ｐＨ６．８−８．５付近で安定。
5. （５）少なくとも、請求項第１項記載のＤＮＡを保持す
   ることを特徴とするベクター。
6. （６）宿主にとって外来性である請求項第５項記載のベ
   クターＤＮＡを保持することを特徴とする形質転換体。
7. （７）宿主が、エシェリヒア属に属する微生物である請
   求項第６項記載の形質転換体。
8. （８）エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア
   ・コリに属する微生物である請求項第７項記載の形質転
   換体。
9. （９）エシェリヒア・コリに属する微生物が、エシェリ
   ヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ１
   ・ｐＯＸＩ８「微生物受託番号；微工研条寄第２１７３
   号、ＦＥＲＭＢＰ−２１７３」である請求項第８項記載
   の形質転換体。
10. （１０）１モルのＬ−乳酸に作用して１モルの酸素を消
    費し、１モルのピルビン酸および１モルの過酸化水素を
    生成する反応を触媒する酵素である乳酸オキシダーゼを
    構成し、Ｎ末端側より第１図にて表されるアミノ酸配列
    からなるポリペプチド。
11. （１１）宿主にとって外来性である請求項第５項記載の
    ベクターＤＮＡを保持する形質転換体を培養して請求項
    第１項記載のＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、その培養
    物から１モルのＬ−乳酸に作用して１モルの酸素を消費
    し、１モルのピルビン酸および１モルの過酸化水素を生
    成する反応を触媒する酵素である乳酸オキシダーゼを採
    取することを特徴とする乳酸オキシダーゼの製造法。
12. （１２）乳酸オキシダーゼが下記の理化学的性状を示す
    ことを特徴とする酵素である請求項第１１項記載の製造
    法。 （ａ）作用；反応式〔 I 〕 Ｌ−乳酸＋Ｏ＿２→ピルビン酸＋Ｈ＿２Ｏ＿２〔 I 〕
    で表される反応を触媒する。 （ｂ）基質特異性；Ｌ−乳酸に基質特異性を有する。 （ｃ）至適ｐＨ；ｐＨ６−７付近。 （ｄ）ｐＨ安定性；ｐＨ６．８−８．５付近で安定。
13. （１３）少なくとも乳酸オキシダーゼが、Ｎ末端側より
    第１図にて表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
    で構成されることを特徴とする請求項第１１項記載の乳
    酸オキシダーゼの製造法。