JPS63169989A - ピルビン酸オキシダ−ゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 - Google Patents
ピルビン酸オキシダ−ゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途Info
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- JPS63169989A JPS63169989A JP90387A JP90387A JPS63169989A JP S63169989 A JPS63169989 A JP S63169989A JP 90387 A JP90387 A JP 90387A JP 90387 A JP90387 A JP 90387A JP S63169989 A JPS63169989 A JP S63169989A
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- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、新規ピルビン酸オキシダーゼの遺伝情報を有
するポリデオキシリボ核酸に関する。
するポリデオキシリボ核酸に関する。
本発明はまた、該ポリデオキシリボ核酸を保持してなる
形質転換体であり、そして該形質転換体により該ポリデ
オキシリボ核酸の遺伝情報を発現せしめて得られるピル
ビン酸オキシダーゼおよびその製造方法に関する。
形質転換体であり、そして該形質転換体により該ポリデ
オキシリボ核酸の遺伝情報を発現せしめて得られるピル
ビン酸オキシダーゼおよびその製造方法に関する。
（従来の技術）
ピルビン酸オキシダーゼは、ピルビン酸、燐酸および酸
素からアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を
生ずる反応を触媒するものであって、ラクトバチルス・
デルプリウキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌ
ｂｒｕｃｋｉ ） （Ｗｉｌｌｉａｓ＋ｓ、Ｆ、Ｒ，
＆ Ｉ（ａｇｅｒ。
素からアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を
生ずる反応を触媒するものであって、ラクトバチルス・
デルプリウキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌ
ｂｒｕｃｋｉ ） （Ｗｉｌｌｉａｓ＋ｓ、Ｆ、Ｒ，
＆ Ｉ（ａｇｅｒ。
Ｌ、Ｐ、（１９６６） Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 １１６ １６８−１７６〕ペデイオ
コツカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ） 、ストレプト
コッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ） 、アエロ
ッコカス・ビリダンス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒ
ｉｄａｎｓ ） （特公昭５Ｂ−４０４６５号公報〕
に属する細菌に存在することが報告されている。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 １１６ １６８−１７６〕ペデイオ
コツカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ） 、ストレプト
コッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ） 、アエロ
ッコカス・ビリダンス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒ
ｉｄａｎｓ ） （特公昭５Ｂ−４０４６５号公報〕
に属する細菌に存在することが報告されている。
また、ピルビン酸オキシダーゼは、ピルビン酸を基質と
する酸化酵素であるため、血清などの体液中に存在する
ピルビン酸の定量に使用されるだけでなく、グルタミン
酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸−
ピルピン酸トランスアミナーゼ、ラクテートデヒドロゲ
ナーゼ、ノイラミニダーゼ−Ｎアセチルノイラミン酸ア
ルドラーゼなどのピルビン酸生成系において生じたピル
ビン酸量を測定することによりピルビン酸生成系に関与
した酵素の基質である種々の物質の定量またはピルビン
酸生成系に関与した各酵素活性の測定など、研究用試薬
、臨床診断用試薬として極めて有用である。
する酸化酵素であるため、血清などの体液中に存在する
ピルビン酸の定量に使用されるだけでなく、グルタミン
酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸−
ピルピン酸トランスアミナーゼ、ラクテートデヒドロゲ
ナーゼ、ノイラミニダーゼ−Ｎアセチルノイラミン酸ア
ルドラーゼなどのピルビン酸生成系において生じたピル
ビン酸量を測定することによりピルビン酸生成系に関与
した酵素の基質である種々の物質の定量またはピルビン
酸生成系に関与した各酵素活性の測定など、研究用試薬
、臨床診断用試薬として極めて有用である。
従来より報告されているピルビン酸オキシダーゼ生産菌
は、ピルビン酸オキシダーゼの生産性が低（製造コスト
的に高価になるという難点があるだけでなく、共存する
他種酵素等の除去が非常に困難で、純度の高い良質なピ
ルビン酸オキシダーゼを得るために精製コストが非常に
高いものとなり、研究用試薬、臨床診断用試薬として安
易に広（用いるには必ずしも満足のいくものではなかっ
た。
は、ピルビン酸オキシダーゼの生産性が低（製造コスト
的に高価になるという難点があるだけでなく、共存する
他種酵素等の除去が非常に困難で、純度の高い良質なピ
ルビン酸オキシダーゼを得るために精製コストが非常に
高いものとなり、研究用試薬、臨床診断用試薬として安
易に広（用いるには必ずしも満足のいくものではなかっ
た。
また、従来より報告されているピルビン酸、燐酸および
酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素
を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼの詳細
な化学構造は報告されていない。
酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素
を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼの詳細
な化学構造は報告されていない。
本発明者らは、該ピルビン酸オキシダーゼの生産性向上
を計るべく鋭意検討を試みたところ、該ピルビン酸オキ
シダーゼ遺伝子の採取ならびに−次構造解析に成功する
と共に遺伝子工学的手法を応用することによって、以下
に述べる如く、高生産性である製造法を確立した。
を計るべく鋭意検討を試みたところ、該ピルビン酸オキ
シダーゼ遺伝子の採取ならびに−次構造解析に成功する
と共に遺伝子工学的手法を応用することによって、以下
に述べる如く、高生産性である製造法を確立した。
すなわち、本発明は、宿主にとって外来性であって、ピ
ルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリン酸、二酸化
炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒するピルビン
酸オキシダーゼからなるポリペプチドまたはＳ亥ビルヒ
゛ン酸オキシダーゼを構成成分としてなるポリペプチド
のアミノ酸配列をコードする塩基配列であることを特徴
とするポリデオキシリポ核酸であり、また該ポリデオキ
シリボ核酸を保持することを特徴とする形質転換体であ
り、またＮ末端側より式 ％式％ 】 （式中、Ａはアミノ酸残基、水素原子またはアセチル基
を示し、Ｂはアミノ酸残基、−ＯＨまたは−Ｎ Ｈｔを
示す）で表されるピルビン酸、燐酸および酸素からアセ
チルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応
を触媒するピルビン酸オキシダーゼからなるポリペプチ
ドまたはＳ亥ビルヒ゛ン酸オキシダーゼを構成成分とし
てなるポリペブチドであり、またピルビン酸、燐酸およ
び酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水
素を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼ遺伝
子であるポリデオキシリボ核酸または該遺伝子を構成成
分としてなるポリデオキシリボ核酸を発現ベクターに組
み入れた組換えＤＮＡを宿主微生物に移入して形質転換
体を得、該形質転換体を培養して該ポリデオキシリボ核
酸の遺伝情報を発現させ、次いでピルビン酸、燐酸およ
び酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水
素を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼであ
るポリペプチドまたは８亥ピルビン酸オキシダーゼを構
成成分としてなるポリペプチドを採取してなるピルビン
酸オキシダーゼの製造法に関するものである。
ルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリン酸、二酸化
炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒するピルビン
酸オキシダーゼからなるポリペプチドまたはＳ亥ビルヒ
゛ン酸オキシダーゼを構成成分としてなるポリペプチド
のアミノ酸配列をコードする塩基配列であることを特徴
とするポリデオキシリポ核酸であり、また該ポリデオキ
シリボ核酸を保持することを特徴とする形質転換体であ
り、またＮ末端側より式 ％式％ 】 （式中、Ａはアミノ酸残基、水素原子またはアセチル基
を示し、Ｂはアミノ酸残基、−ＯＨまたは−Ｎ Ｈｔを
示す）で表されるピルビン酸、燐酸および酸素からアセ
チルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応
を触媒するピルビン酸オキシダーゼからなるポリペプチ
ドまたはＳ亥ビルヒ゛ン酸オキシダーゼを構成成分とし
てなるポリペブチドであり、またピルビン酸、燐酸およ
び酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水
素を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼ遺伝
子であるポリデオキシリボ核酸または該遺伝子を構成成
分としてなるポリデオキシリボ核酸を発現ベクターに組
み入れた組換えＤＮＡを宿主微生物に移入して形質転換
体を得、該形質転換体を培養して該ポリデオキシリボ核
酸の遺伝情報を発現させ、次いでピルビン酸、燐酸およ
び酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水
素を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼであ
るポリペプチドまたは８亥ピルビン酸オキシダーゼを構
成成分としてなるポリペプチドを採取してなるピルビン
酸オキシダーゼの製造法に関するものである。
ポリペプチド（Ｉ）に関し、Ａで示されるアミノ酸残基
としては、−個または複数個のアミノ酸残基よりなり、
Ａとしては、好ましくは、水素原子若しくはＭｅｔまた
はシグナルペプチドが挙げられる。Ｂで示されるものと
しては、酸アミドであってもよく、また−個以上のアミ
ノ酸残基であってもよい。
としては、−個または複数個のアミノ酸残基よりなり、
Ａとしては、好ましくは、水素原子若しくはＭｅｔまた
はシグナルペプチドが挙げられる。Ｂで示されるものと
しては、酸アミドであってもよく、また−個以上のアミ
ノ酸残基であってもよい。
ピルビン酸、ｅ＃酸および酸素からアセチルリン酸、二
酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒するピル
ビン酸オキシダーゼ遺伝子であるポリデオキシリボ核酸
または該遺伝子が構成成分であるポリデオキシリボ核酸
としては、少なくともピルビン酸、燐酸および酸素から
アセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる
反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子それ自体
を含むポリデオキシリボ核酸であればよく、例えば該ピ
ルビン酸オキシダーゼ遺伝子それ自体としてはＮ末端側
より式 ％式％ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｓｐ１１ｅＬｙｓ 、
（Ｉｆ）で表されるピルビン酸、燐酸およ
び酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水
素を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼから
なるポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列
であるポリデオキシリボ核酸を挙げることが出来る。ま
た式（１１）で表されるピルビン酸オキシダーゼである
ポリペプチドのアミノ酸配列において、各アミノ酸に対
応する一連のコドンのうちのいずれか１個のコドンから
なるポリデオキシリボ核酸であればよく、さらに該ポリ
デオキシリボ核酸の５゛末端に１個以上のナンセンスコ
ドン以外のコドンおよび／または３“末端に１個以上の
コドンを有するポリデオキシリボ核酸であってもよい０
例えば、その代表例として５゛末端側より式 ％式％ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＣＡ
ＧＣＴ ＡＡＴ ＡＡＡ ＧＣＡ ＧＧＴＣＡ
ＣＡＣＴ ＧＴＣＧＴＴ ＡＴＣＧＡＣＴＧＴ
ＡＡＧ ＡＴＴ ＡＣＴＣＡＡ ＧＡＴ ＣＧ
Ｔ ＣＣＡ ＡＴＣＣＣＴ ＧＴＡ ＧＡＡ
ＡＣＡ ＴＴＧＡＡＡ ＴＴＡ ＧＡＴ Ｔ
ＣＡ ＡＡＡ ＣＴＴ ＴＡＣＡＧＣＧＡＡ
ＧＡＣＧＡＡ ＡＴＣＡＡＡ ＧＣＴ ＴＡＣＡ
ＡＡ ＧＡＡ ＣＧＣＴＡＣＧＡＡＧＣＴ ＧＣ
Ｔ ＡＡＣＴＴＡ ＧＴＡ ＣＣＡ ＴＴＣＡ
ＧＡ ＧＡＧ ＴＡＣＴＴＡ ＧＡＡ ＧＣＴ
ＧＡＡ ＧＧＣＴＴＡ Ｇ＾八 ＴＣＴ Ａ
ＡＡ ＴＡＣＡＴＣＡＡＡ −Ｙ （ＩＩＩ）
〔式中、ＸはＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧ＾以外のコドン
または水素原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示
す〕で表される塩基配列を有するポリデオキシリボ核酸
を挙げることができる。
酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒するピル
ビン酸オキシダーゼ遺伝子であるポリデオキシリボ核酸
または該遺伝子が構成成分であるポリデオキシリボ核酸
としては、少なくともピルビン酸、燐酸および酸素から
アセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる
反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子それ自体
を含むポリデオキシリボ核酸であればよく、例えば該ピ
ルビン酸オキシダーゼ遺伝子それ自体としてはＮ末端側
より式 ％式％ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｓｐ１１ｅＬｙｓ 、
（Ｉｆ）で表されるピルビン酸、燐酸およ
び酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水
素を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼから
なるポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列
であるポリデオキシリボ核酸を挙げることが出来る。ま
た式（１１）で表されるピルビン酸オキシダーゼである
ポリペプチドのアミノ酸配列において、各アミノ酸に対
応する一連のコドンのうちのいずれか１個のコドンから
なるポリデオキシリボ核酸であればよく、さらに該ポリ
デオキシリボ核酸の５゛末端に１個以上のナンセンスコ
ドン以外のコドンおよび／または３“末端に１個以上の
コドンを有するポリデオキシリボ核酸であってもよい０
例えば、その代表例として５゛末端側より式 ％式％ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＣＡ
ＧＣＴ ＡＡＴ ＡＡＡ ＧＣＡ ＧＧＴＣＡ
ＣＡＣＴ ＧＴＣＧＴＴ ＡＴＣＧＡＣＴＧＴ
ＡＡＧ ＡＴＴ ＡＣＴＣＡＡ ＧＡＴ ＣＧ
Ｔ ＣＣＡ ＡＴＣＣＣＴ ＧＴＡ ＧＡＡ
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ＣＡ ＡＡＡ ＣＴＴ ＴＡＣＡＧＣＧＡＡ
ＧＡＣＧＡＡ ＡＴＣＡＡＡ ＧＣＴ ＴＡＣＡ
ＡＡ ＧＡＡ ＣＧＣＴＡＣＧＡＡＧＣＴ ＧＣ
Ｔ ＡＡＣＴＴＡ ＧＴＡ ＣＣＡ ＴＴＣＡ
ＧＡ ＧＡＧ ＴＡＣＴＴＡ ＧＡＡ ＧＣＴ
ＧＡＡ ＧＧＣＴＴＡ Ｇ＾八 ＴＣＴ Ａ
ＡＡ ＴＡＣＡＴＣＡＡＡ −Ｙ （ＩＩＩ）
〔式中、ＸはＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧ＾以外のコドン
または水素原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示
す〕で表される塩基配列を有するポリデオキシリボ核酸
を挙げることができる。
式（ＩＩＩ）で表される塩基配列に関し、Ｘで示される
コドンは、アミノ酸をコードするコドンであればいずれ
でもよく、更に、その５゛末端側にアミノ酸をコードす
るコドンを１個以上有してもよいが、好ましくはＡＴＣ
またはシグナルペプチドに対応するポリデオキシリボ核
酸を挙げることができる。
コドンは、アミノ酸をコードするコドンであればいずれ
でもよく、更に、その５゛末端側にアミノ酸をコードす
るコドンを１個以上有してもよいが、好ましくはＡＴＣ
またはシグナルペプチドに対応するポリデオキシリボ核
酸を挙げることができる。
Ｙで示されるコドンは、翻訳終止コドンまたはアミノ酸
をコードするコドンであればいずれでもよく、更に、そ
の３”末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上
有していてもよいが、その場合には、この複数個のコド
ンの３°末端に翻訳終止コドンを有することが好ましい
。
をコードするコドンであればいずれでもよく、更に、そ
の３”末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上
有していてもよいが、その場合には、この複数個のコド
ンの３°末端に翻訳終止コドンを有することが好ましい
。
ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を構成成分としてなるポ
リデオキシリボ核酸または、式（ｎ）で表されるアミノ
酸配列をコード−する塩基配列からなる遺伝子であるポ
リデオキシリボ核酸または、式（ＩＩＩ＞で表されるポ
リデオキシリボ核酸は、例えばピルビン酸オキシダーゼ
を生産するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の供与体であ
る微生物より該微生物のＤＮＡを分離精製した後、超音
波、制限酵素などを用いてＤＮＡと切断したリニヤ−な
発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接着末端部にお
いてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、かくして
得られた組換えＤＮＡベクターを複製可能な宿主微生物
に移入した後、ベクターのマーカーとピルビン酸オキシ
ダーゼの活性とを指標としてスクリーニングして取得し
た該組換えＤＮＡベクターを保持する微生物を培養し、
該培養面体から該組換えＤＮＡベクターを分離精製し、
次いで該組換えＤＮＡベクターからピルビン酸オキシダ
ーゼ遺伝子であるポリデオキシリボ核酸を採取すればよ
い。
リデオキシリボ核酸または、式（ｎ）で表されるアミノ
酸配列をコード−する塩基配列からなる遺伝子であるポ
リデオキシリボ核酸または、式（ＩＩＩ＞で表されるポ
リデオキシリボ核酸は、例えばピルビン酸オキシダーゼ
を生産するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の供与体であ
る微生物より該微生物のＤＮＡを分離精製した後、超音
波、制限酵素などを用いてＤＮＡと切断したリニヤ−な
発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接着末端部にお
いてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、かくして
得られた組換えＤＮＡベクターを複製可能な宿主微生物
に移入した後、ベクターのマーカーとピルビン酸オキシ
ダーゼの活性とを指標としてスクリーニングして取得し
た該組換えＤＮＡベクターを保持する微生物を培養し、
該培養面体から該組換えＤＮＡベクターを分離精製し、
次いで該組換えＤＮＡベクターからピルビン酸オキシダ
ーゼ遺伝子であるポリデオキシリボ核酸を採取すればよ
い。
ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の供与体である微生物と
しては、ピルビン酸オキシダーゼ産生能を有する微生物
であればよく、例えば、特開昭５４−１２６７９１号公
報、特開昭５９−１５９７７７号公報、特開昭５９−１
６２８７７号公報、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 １旦 １６８−１７６ （１９６６）など
に示されているラクトバチルス・デルプリウキイ（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｃｋｉ ） 、
ペディオコッカス・エスピー（Ｐｅｄｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ） ＋ ストレプトコッカス・エスピー（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ） 、アエロコツカス・ビ
リダンス（＾ｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）
、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｔ
ｌｌｕｓ Ｐｌａｎｔａｒｕｓ ） 、 ラクトバチル
ス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ５ａ
ｌｉｖａｒｉｕｓ） 、 ロイコノストック・メセン
テロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ Ｍｅｓｅｎｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ ）等のラクトバシラセア科またはストレ
プトコッカセア科などの微生物が適宜選ばれる。
しては、ピルビン酸オキシダーゼ産生能を有する微生物
であればよく、例えば、特開昭５４−１２６７９１号公
報、特開昭５９−１５９７７７号公報、特開昭５９−１
６２８７７号公報、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 １旦 １６８−１７６ （１９６６）など
に示されているラクトバチルス・デルプリウキイ（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｃｋｉ ） 、
ペディオコッカス・エスピー（Ｐｅｄｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ） ＋ ストレプトコッカス・エスピー（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ） 、アエロコツカス・ビ
リダンス（＾ｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）
、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｔ
ｌｌｕｓ Ｐｌａｎｔａｒｕｓ ） 、 ラクトバチル
ス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ５ａ
ｌｉｖａｒｉｕｓ） 、 ロイコノストック・メセン
テロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ Ｍｅｓｅｎｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ ）等のラクトバシラセア科またはストレ
プトコッカセア科などの微生物が適宜選ばれる。
また、遺伝子組換え技術を駆使して、ピルビン酸オキシ
ダーゼ産生能を付与せしめた形質転換微生物をピルビン
酸オキシダーゼ遺伝子の供与体として利用してもよい。
ダーゼ産生能を付与せしめた形質転換微生物をピルビン
酸オキシダーゼ遺伝子の供与体として利用してもよい。
遺伝子の供与体である微生物から由来するＤＮＡは次の
如くにして採取される。即ち、供与微生物である上述し
た細菌のいずれかを、例えば、液体培地で約１〜３日間
通気攪拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し
、次いでこれを溶菌させることによってピルビン酸オキ
シダーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。
如くにして採取される。即ち、供与微生物である上述し
た細菌のいずれかを、例えば、液体培地で約１〜３日間
通気攪拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し
、次いでこれを溶菌させることによってピルビン酸オキ
シダーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。
溶菌方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナー
ゼなどの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によ
りプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウ
ムなどの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的
破壊法である凍結融解やフレンチプレス処理を上述の溶
菌法との組み合せで行ってもよい。
ゼなどの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によ
りプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウ
ムなどの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的
破壊法である凍結融解やフレンチプレス処理を上述の溶
菌法との組み合せで行ってもよい。
このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離、精製
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による
除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理
、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わ
せることにより行うことができる。
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による
除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理
、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わ
せることにより行うことができる。
分離精製された微生物ＤＮＡを切断する方法は、例えば
、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができ
るが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易な
らしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配
列に作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ ＋’ １ｌｉｎｄ
ｌｌｌ 、 Ｂａｍ１ｌ Ｉなどの■型制限酵素が適し
ている。
、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができ
るが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易な
らしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配
列に作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ ＋’ １ｌｉｎｄ
ｌｌｌ 、 Ｂａｍ１ｌ Ｉなどの■型制限酵素が適し
ている。
ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖しうるフ
ァージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築
されたものが適している。
ァージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築
されたものが適している。
ファージとしては、例えば、エシェリヒア・コリ （Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする
場合には、λｇｔ・λＣ１λｇｔ・λＢなどが使用でき
る。
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする
場合には、λｇｔ・λＣ１λｇｔ・λＢなどが使用でき
る。
また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コ
リを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２２。
リを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２２。
ｐＢＲ３２５、ｐＡｃＹｃ１８４． ｐＵｃ１２．
ｐＵｃ１３． ｐＵｃ１８゜ｐＵｃ１９などが、バ
チルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌ
ｉｓ）を宿主微生物とする場合にはｐＵＢｌｌｏ 、ｐ
ｃ１９４などが使用でき、さらに、エシェリヒア・コリ
およびサツカロマイセス・セレビシアなどのダラム陰・
陽画性にまたがる二種以上の宿主微生物で自律的に増殖
可能なシャトルヘクターを利用することもできる。この
ようなベクターを、先に述べたピルビン酸オキシダーゼ
遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限
酵素と同じ制限酵素で切断して、ベクター断片を得るこ
とが好ましい。
ｐＵｃ１３． ｐＵｃ１８゜ｐＵｃ１９などが、バ
チルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌ
ｉｓ）を宿主微生物とする場合にはｐＵＢｌｌｏ 、ｐ
ｃ１９４などが使用でき、さらに、エシェリヒア・コリ
およびサツカロマイセス・セレビシアなどのダラム陰・
陽画性にまたがる二種以上の宿主微生物で自律的に増殖
可能なシャトルヘクターを利用することもできる。この
ようなベクターを、先に述べたピルビン酸オキシダーゼ
遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限
酵素と同じ制限酵素で切断して、ベクター断片を得るこ
とが好ましい。
微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は
、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例
えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接
着末端とのアニーリングの後、適当なりＮＡリガーゼの
作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片との組換え
ＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿
主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用し
組換えＤＮＡを作成することもできる。
、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例
えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接
着末端とのアニーリングの後、適当なりＮＡリガーゼの
作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片との組換え
ＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿
主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用し
組換えＤＮＡを作成することもできる。
宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に
増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発現のできるも
のであればよく、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・
コリの場合、エシェリヒア・コリＤＨ１，エシェリヒア
・コリＨＢ １０１゜エシェリヒア・コリＷ３１１０．
エシェリヒア・コリＣ６００等が利用出来る。
増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発現のできるも
のであればよく、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・
コリの場合、エシェリヒア・コリＤＨ１，エシェリヒア
・コリＨＢ １０１゜エシェリヒア・コリＷ３１１０．
エシェリヒア・コリＣ６００等が利用出来る。
宿主微生物に組換えＤＮＡを移入する方法としては、例
えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場
合には、カルシュラムイオンの存在下で組換えＤＮＡの
移入を行い、またバチルス属に属する微生物の場合には
、コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを採
用することができ、さらにマイクロインジェクション法
を用いてもよい、かくして得られた形質転換体である微
生物は、栄養培地に培養されることにより多量のピルビ
ン酸オキシダーゼを安定して産生じ得ることを見出した
。
えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場
合には、カルシュラムイオンの存在下で組換えＤＮＡの
移入を行い、またバチルス属に属する微生物の場合には
、コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを採
用することができ、さらにマイクロインジェクション法
を用いてもよい、かくして得られた形質転換体である微
生物は、栄養培地に培養されることにより多量のピルビ
ン酸オキシダーゼを安定して産生じ得ることを見出した
。
宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有無についての
選択は、目的組換えＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐
性マーカーとピルビン酸オキシダーゼとを同時に発現し
得る微生物を検索すればよく、例えば、薬剤耐性マーカ
ーに基づく選択培地で生育し、かつピルビン酸オキシダ
ーゼを生成する微生物を選択すればよい “ このようにして一度選択されたピルビン酸オキシダ
ーゼ遺伝子を保有する組換えＤＮＡは、形質転換微生物
から取り出され、他の宿主微生物に移入することも容易
に実施できる。また、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を
保持する組換えＤＮＡから制限酵素などにより切断して
ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子であるＤＮＡを切り出し
、これと同様な方法により切断して得られるベクター断
片とを結合させて、宿主微生物に移入することも容易に
実施できる。
選択は、目的組換えＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐
性マーカーとピルビン酸オキシダーゼとを同時に発現し
得る微生物を検索すればよく、例えば、薬剤耐性マーカ
ーに基づく選択培地で生育し、かつピルビン酸オキシダ
ーゼを生成する微生物を選択すればよい “ このようにして一度選択されたピルビン酸オキシダ
ーゼ遺伝子を保有する組換えＤＮＡは、形質転換微生物
から取り出され、他の宿主微生物に移入することも容易
に実施できる。また、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を
保持する組換えＤＮＡから制限酵素などにより切断して
ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子であるＤＮＡを切り出し
、これと同様な方法により切断して得られるベクター断
片とを結合させて、宿主微生物に移入することも容易に
実施できる。
また本質的にピルビン酸オキシダーゼ活性であるピルビ
ン酸オキシダーゼムティンのＤＮＡは、本発明のピルビ
ン酸オキシダーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作
製される人工変異遺伝子であり、この人工変異遺伝子は
上述の種々なる方法を使用して増幅され、最終的には、
この変異遺伝子をベクターに挿入せしめて組換えＤＮＡ
を作成し、これを宿主微生物に移入させることによって
、ピルビン酸オキシダーゼムティンの製造が可能である
。
ン酸オキシダーゼムティンのＤＮＡは、本発明のピルビ
ン酸オキシダーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作
製される人工変異遺伝子であり、この人工変異遺伝子は
上述の種々なる方法を使用して増幅され、最終的には、
この変異遺伝子をベクターに挿入せしめて組換えＤＮＡ
を作成し、これを宿主微生物に移入させることによって
、ピルビン酸オキシダーゼムティンの製造が可能である
。
さらに上述の方法により得られたピルビン酸オキシダー
ゼ遺伝子の塩基配列は、５ｃｉｅｎｃｅ ２１４１２０
５〜１２１０ （１９８１年）に示されているジデオキ
シ法で解読し、またピルビン酸オキシダーゼのアミノ酸
配列は、塩基配列より決定した。一方、ピルビン酸オキ
シダーゼであるペプチドのＮ末端部を構成する部分アミ
ノ酸配列は、以下の如くにして決定した。即ち、ピルビ
ン酸オキシダーゼ産生能ををするピルビン酸オキシダー
ゼ遺伝子供与微生物を栄養培地で培養して菌体内にピル
ビン酸オキシダーゼを産生蓄積せしめ、培養終了後、得
られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌
体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチ
ームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤ
ＴＡおよび／または適当な界面活性剤等を添加してピル
ビン酸オキシダーゼが可溶化され、水溶液として分離採
取される。この様にして得られたピルビン酸オキシダー
ゼの水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安
分画、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィーにより処理して、高純度ピルビン酸
オキシダーゼが得られ、高純度ピルビン酸オキシダーゼ
を用いて液相プロティン シーケンサ−（ベックマン社
製：ＢＥＣＫＭＡＮ Ｓｙｓｔｅｍ ８９０ＭＥ）に
よりピルビン酸オキシダーゼであるペプチドのＮ末端部
を構成する部分アミノ酸配列が決定され、少なくとも、
該部分アミノ酸配列は、遺伝子操作によって得られたピ
ルビン酸オキシダーゼのＮ末端部分アミノ酸配列と一致
するものであることを確認した。
ゼ遺伝子の塩基配列は、５ｃｉｅｎｃｅ ２１４１２０
５〜１２１０ （１９８１年）に示されているジデオキ
シ法で解読し、またピルビン酸オキシダーゼのアミノ酸
配列は、塩基配列より決定した。一方、ピルビン酸オキ
シダーゼであるペプチドのＮ末端部を構成する部分アミ
ノ酸配列は、以下の如くにして決定した。即ち、ピルビ
ン酸オキシダーゼ産生能ををするピルビン酸オキシダー
ゼ遺伝子供与微生物を栄養培地で培養して菌体内にピル
ビン酸オキシダーゼを産生蓄積せしめ、培養終了後、得
られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌
体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチ
ームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤ
ＴＡおよび／または適当な界面活性剤等を添加してピル
ビン酸オキシダーゼが可溶化され、水溶液として分離採
取される。この様にして得られたピルビン酸オキシダー
ゼの水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安
分画、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィーにより処理して、高純度ピルビン酸
オキシダーゼが得られ、高純度ピルビン酸オキシダーゼ
を用いて液相プロティン シーケンサ−（ベックマン社
製：ＢＥＣＫＭＡＮ Ｓｙｓｔｅｍ ８９０ＭＥ）に
よりピルビン酸オキシダーゼであるペプチドのＮ末端部
を構成する部分アミノ酸配列が決定され、少なくとも、
該部分アミノ酸配列は、遺伝子操作によって得られたピ
ルビン酸オキシダーゼのＮ末端部分アミノ酸配列と一致
するものであることを確認した。
形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生
理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多
くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気攪
拌培養を行うのが有利である。 培地の栄養源としては
、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得
る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよ
く、例エバクルコース、シュクロース、ラクトース、マ
ルトース、フラクトース、ＩＪ！蜜、ピルビン酸などが
使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であ
ればよく、例えばペプトン、肉エキス。
理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多
くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気攪
拌培養を行うのが有利である。 培地の栄養源としては
、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得
る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよ
く、例エバクルコース、シュクロース、ラクトース、マ
ルトース、フラクトース、ＩＪ！蜜、ピルビン酸などが
使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であ
ればよく、例えばペプトン、肉エキス。
酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用される。そ
の他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カル
シウム、カリウム、鉄、マンガン。
の他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カル
シウム、カリウム、鉄、マンガン。
亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなど
が必要に応じて使用される。
が必要に応じて使用される。
培養温度は菌が発育し、ピルビン酸オキシダーゼを生産
する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場
合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は、
条件によって多少異なるが、ピルビン酸オキシダーゼが
最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を
終了すればよ（、通常は１２〜４８時間程度である。培
地ｐＨは菌が発育し、ピルビン酸オキシダーゼを生産す
る範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐ Ｈ６，
０〜８．０程度である。
する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場
合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は、
条件によって多少異なるが、ピルビン酸オキシダーゼが
最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を
終了すればよ（、通常は１２〜４８時間程度である。培
地ｐＨは菌が発育し、ピルビン酸オキシダーゼを生産す
る範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐ Ｈ６，
０〜８．０程度である。
培養物中のピルビン酸オキシダーゼは、菌体を含む培養
液そのままを採取し、利用することもできるが、−ｇに
は常法に従って、ピルビン酸オキシダーゼが培養液中に
存在する場合には、濾過、遠心分離などによりピルビン
酸オキシダーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に
利用される。
液そのままを採取し、利用することもできるが、−ｇに
は常法に従って、ピルビン酸オキシダーゼが培養液中に
存在する場合には、濾過、遠心分離などによりピルビン
酸オキシダーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に
利用される。
ピルビン酸オキシダーゼが菌体内に存在する場合には、
得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により
、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリ
ゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じて
ＥＤＴＡ等のキレート剤および／または界面活性剤を添
加してピルビン酸オキシダーゼを可溶化し水溶液として
分離採取する。
得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により
、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリ
ゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じて
ＥＤＴＡ等のキレート剤および／または界面活性剤を添
加してピルビン酸オキシダーゼを可溶化し水溶液として
分離採取する。
この様にして得られたピルビン酸オキシダーゼ含有溶液
を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナト
リウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例え
ばメタノール、エタノール。
を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナト
リウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例え
ばメタノール、エタノール。
アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよ
い０次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析
せしめて、より低分子量の不純物を除去することができ
る。また吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過
、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィーにより精製し、これらの手段を用いて得られるピル
ビン酸オキシダーゼ含有溶液は、減圧濃縮凍結乾燥等の
処理にてより精製されたピルビン酸オキシダーゼを得る
。
い０次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析
せしめて、より低分子量の不純物を除去することができ
る。また吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過
、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィーにより精製し、これらの手段を用いて得られるピル
ビン酸オキシダーゼ含有溶液は、減圧濃縮凍結乾燥等の
処理にてより精製されたピルビン酸オキシダーゼを得る
。
本明細書に・記載のアミノ酸、ペプチド、核酸、核酸関
連物質、その他に関する略号は、それらの当該分野にお
ける慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記
する。またすべてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。
連物質、その他に関する略号は、それらの当該分野にお
ける慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記
する。またすべてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ： デオキシリボ核酸
ＲＮＡ ： リボ核酸
Ａ ： アデニン
Ｔ ： チミン
Ｇ ； グアニン
Ｃ： シトシン
Ａｌａ ： アラニン
Ａｒｇ ： アルギニン
Ａｓｎ ： アスパラギン
Ａｓｐ ： アスパラギン酸
Ｃｙｓ ： システィン
Ｇｌｎ ： グルタミン
Ｇｌｕ ： グルタミン酸
ｃｔｙ ： グリシン
Ｈｉｓ ： ヒスチジン
１１ｅ ： イソロイシン
Ｌｅｕ ： ロイシン
１、ｙｓ ： リジン
Ｍｅｔ ： メチオニン
Ｐｈｅ ： フェニルアラニン
Ｐｒｏ ： プロリン
Ｓｅｒ ： セリン
Ｔｈｒ ： スレオニン
Ｔｒｐ ： ）リブトファン
’ｌ”ｙｒ： チロシン
Ｖａｌ ： バリン
以下、実施例で本発明の詳細な説明する。
実施例／、〔染色体ＤＮＡの分離〕
Ａｅｒｏｅｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ （Ｉ Ｆ
ＯＯ／ ２２ ／り）の染色体ＤＮＡを次の方法で分
離した同菌株を７５０１の普通ブイヨン培地（０５％チ
オ硫酸ソーダ含可）で３７℃−晩振盪培養後遠心（３，
０００回転′Ｏ分）により集菌した。１０％サッカロー
ス、３ （） ｍ Ｍ ）リス塩酸（ｐＨざ０）！；Ｏ
ｍＭ ＥＤ＝Ａを含んだ溶液ＳＲ１に懸濁させ、／ｄ
のリゾチーム溶液Ｃｌ０１１９７Ｉｌｌ）を加えて３７
℃、７５分４保温し、次いで１ｍｌの１０％ＳＤＳ （
ドデシル１酸ナトリウム）溶液を加えた、この懸濁液に
等量のクロロホルム−フェノ−／１４＋’［（／：／）
を１え、攪拌混合し、１０，００Ｏｒｐｍ３分の遠心で
水層と溶媒層に分け、水層を台数した。この水１に２倍
量のエタノールを静かに重層し、ガラス庫でゆっくり攪
拌しながらＤＮＡをガラス棒にまぎつかせて分離した。
ＯＯ／ ２２ ／り）の染色体ＤＮＡを次の方法で分
離した同菌株を７５０１の普通ブイヨン培地（０５％チ
オ硫酸ソーダ含可）で３７℃−晩振盪培養後遠心（３，
０００回転′Ｏ分）により集菌した。１０％サッカロー
ス、３ （） ｍ Ｍ ）リス塩酸（ｐＨざ０）！；Ｏ
ｍＭ ＥＤ＝Ａを含んだ溶液ＳＲ１に懸濁させ、／ｄ
のリゾチーム溶液Ｃｌ０１１９７Ｉｌｌ）を加えて３７
℃、７５分４保温し、次いで１ｍｌの１０％ＳＤＳ （
ドデシル１酸ナトリウム）溶液を加えた、この懸濁液に
等量のクロロホルム−フェノ−／１４＋’［（／：／）
を１え、攪拌混合し、１０，００Ｏｒｐｍ３分の遠心で
水層と溶媒層に分け、水層を台数した。この水１に２倍
量のエタノールを静かに重層し、ガラス庫でゆっくり攪
拌しながらＤＮＡをガラス棒にまぎつかせて分離した。
これを１０ｒｌｌの１０ｍＭ）Ｊ２塩酸（ＰＨ，ｒ、Ｏ
）、７ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液（以下ＴＥと略す
）で溶解した。これを等量のクロロホルム−フェノール
混液で処理後、遠心により水層を分取し、２倍量のエタ
ノールを加えて上記の方法でもう一度ＤＮＡを分離し１
．１ｒｎｌのＴＥで溶解した。
）、７ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液（以下ＴＥと略す
）で溶解した。これを等量のクロロホルム−フェノール
混液で処理後、遠心により水層を分取し、２倍量のエタ
ノールを加えて上記の方法でもう一度ＤＮＡを分離し１
．１ｒｎｌのＴＥで溶解した。
実施例２− ＣｐＡＣＹＣ／ざｌプラスミドＤＮＡの
分離〕 ｐへ〇Ｙｃ／、ｒ４Ｚを保有スるエシェリヒア・コ’Ｊ
ｐＭ／ タ ／ （Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ ／３１１． ／／ＩＡ／ （＝／、Ｏに増殖
したとき、スペクチノマイシン（最終濃度３００・μＶ
／ｍｌ、プラスミドの耐性マーカーとしてクロラムフェ
ニコールが含まれているとき）を加え、さら１こ３７℃
で７６時間以上振盪を続けた。３ｏｏｏｒｐｍｉｏ分間
の遠心により集菌し、リゾチーム−８ＤＳ法とセシウム
クロライド−エチジウムブロマイド法（Ｍａｎｉｏｒｔ
ｉｓら：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｐｐ
ｇ乙〜りＱ Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
（／り１２））に従いプラスミドＤＮＡを調製した。
分離〕 ｐへ〇Ｙｃ／、ｒ４Ｚを保有スるエシェリヒア・コ’Ｊ
ｐＭ／ タ ／ （Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ ／３１１． ／／ＩＡ／ （＝／、Ｏに増殖
したとき、スペクチノマイシン（最終濃度３００・μＶ
／ｍｌ、プラスミドの耐性マーカーとしてクロラムフェ
ニコールが含まれているとき）を加え、さら１こ３７℃
で７６時間以上振盪を続けた。３ｏｏｏｒｐｍｉｏ分間
の遠心により集菌し、リゾチーム−８ＤＳ法とセシウム
クロライド−エチジウムブロマイド法（Ｍａｎｉｏｒｔ
ｉｓら：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｐｐ
ｇ乙〜りＱ Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
（／り１２））に従いプラスミドＤＮＡを調製した。
実施例３． 〔ヒルピン酸オキシダーゼ（ｐｏｐ）遺
伝子を有するプラスミドｐＯＸＩｊの作成〕（ｉ）
実施例Ｘで調製したＡ、ｖｉｒｉｄａｎｓ ノ染色体Ｄ
ＮＡ２μｔ（約０５μ？）と１００倍量のＥωＲＩ切断
用バッファー＜！；００ｍＭトリヌ塩酸（ｐＨり−６）
、 ７ ０ ｍＭＭｇｃｌ □ 、 ／ Ｍ
ＮａＣｌ 、 ７ＱｍＭメルカプトエタノー１Ｖ
） ／ Ａ”ｔ 、 ＥｃｏＲＩ （宝酒造製 ７０
ｕｎｉｔ／、ｇ ） ／ ｐ Ｌ 、水層ｐＬを混合し
、３７℃／時間切断した。別に調製したプラスミドｐＡ
ＣＹＣ／ ｇ ’ｌ Ｄ Ｎ Ａ約０３μ２を同様の方
法を用いてＥｃｏ ＲＩで切断し、さらｔこアルカリ性
フォスファターゼ（以下ＢＡＰと略ｔことがある。宝酒
造製）０乙ｕｎｉｔ を加え、乙５℃／時間処理した。
伝子を有するプラスミドｐＯＸＩｊの作成〕（ｉ）
実施例Ｘで調製したＡ、ｖｉｒｉｄａｎｓ ノ染色体Ｄ
ＮＡ２μｔ（約０５μ？）と１００倍量のＥωＲＩ切断
用バッファー＜！；００ｍＭトリヌ塩酸（ｐＨり−６）
、 ７ ０ ｍＭＭｇｃｌ □ 、 ／ Ｍ
ＮａＣｌ 、 ７ＱｍＭメルカプトエタノー１Ｖ
） ／ Ａ”ｔ 、 ＥｃｏＲＩ （宝酒造製 ７０
ｕｎｉｔ／、ｇ ） ／ ｐ Ｌ 、水層ｐＬを混合し
、３７℃／時間切断した。別に調製したプラスミドｐＡ
ＣＹＣ／ ｇ ’ｌ Ｄ Ｎ Ａ約０３μ２を同様の方
法を用いてＥｃｏ ＲＩで切断し、さらｔこアルカリ性
フォスファターゼ（以下ＢＡＰと略ｔことがある。宝酒
造製）０乙ｕｎｉｔ を加え、乙５℃／時間処理した。
これらのＥｃｏＲＩで切断した２種のＤＮＡ溶液を混合
し、その！／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、さら
に全体量と等量のクロロホルム−フェノール混液で処理
し、遠心分離により水層を分取した。この水層に２倍容
のエタノールを加え、遠心でＤＮＡを沈澱させたのち減
圧乾燥した。水ざりμｔで溶解後、７００倍量のライゲ
ーンヨンパツファ（０！；Ｍトリス塩酸（ｐＨ７乙）
、 Ｏ，／ Ｍ ＭｇＣｌ２． Ｑ、 ／Ｍジチオス
レイトール、１０ｍＭスペルミジン。
し、その！／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、さら
に全体量と等量のクロロホルム−フェノール混液で処理
し、遠心分離により水層を分取した。この水層に２倍容
のエタノールを加え、遠心でＤＮＡを沈澱させたのち減
圧乾燥した。水ざりμｔで溶解後、７００倍量のライゲ
ーンヨンパツファ（０！；Ｍトリス塩酸（ｐＨ７乙）
、 Ｏ，／ Ｍ ＭｇＣｌ２． Ｑ、 ／Ｍジチオス
レイトール、１０ｍＭスペルミジン。
１０ｍＭＡＴＰ ）１０ｐＬとＴ４！ＤＮＡリガーゼ／
μＬ（宝酒造製／７ｊｕｎｉｔ）を加え混合し≠℃で一
晩放置した。このＤＮＡ溶液をクロロホルム−フェノー
ル処理し、エタノール沈澱を集め減圧乾燥した後、７０
μＬのＴＥで溶解した。
μＬ（宝酒造製／７ｊｕｎｉｔ）を加え混合し≠℃で一
晩放置した。このＤＮＡ溶液をクロロホルム−フェノー
ル処理し、エタノール沈澱を集め減圧乾燥した後、７０
μＬのＴＥで溶解した。
（ｉＩ）１０ＯｄのＢＨＩ培地（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒ
ｔＩｎｆｕｓｉｏｎ、Ｄｉｆｃｏ社製）で培養した対数
増殖期のエシェリヒア・コリＷ３／１０株Ｃ国立遺伝学
研究所より分与を受けた、ストック番号ＭＥ７７７ｇ、
ＡＴＣＣ２７３２！；’Ｊを遠心分離により集菌しく
／ ０．０００ ｒ ｐｍ、 ２分間）ｔｔｏｒａｌ
の氷冷した３ＱｍＭ酢酸カリウム、１０１省ＲｈＣｌ、
／ Ｏｍ Ｍ ＣａＣｌ２、ｊ Ｑ ｍ Ｍ ＭｎＣｌ
２および７５％グリセリンを含んだ溶液（ｐＩ（５ｇ
）で懸濁した。０℃でＳ分間放置後、遠心し上清をすて
、さらに＜ｚゴの／にＪｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ドータイ
ト社製）、７ ！； ｍ Ｍ ＣａＣｌ２、ｉｏｍＭＲ
ｂＣｌ および７５％グリセリンを含んだ混液（ｐＨ６
，５）で懸濁し、０℃でｌＳ分間放置してコンピテント
細胞とした。
ｔＩｎｆｕｓｉｏｎ、Ｄｉｆｃｏ社製）で培養した対数
増殖期のエシェリヒア・コリＷ３／１０株Ｃ国立遺伝学
研究所より分与を受けた、ストック番号ＭＥ７７７ｇ、
ＡＴＣＣ２７３２！；’Ｊを遠心分離により集菌しく
／ ０．０００ ｒ ｐｍ、 ２分間）ｔｔｏｒａｌ
の氷冷した３ＱｍＭ酢酸カリウム、１０１省ＲｈＣｌ、
／ Ｏｍ Ｍ ＣａＣｌ２、ｊ Ｑ ｍ Ｍ ＭｎＣｌ
２および７５％グリセリンを含んだ溶液（ｐＩ（５ｇ
）で懸濁した。０℃でＳ分間放置後、遠心し上清をすて
、さらに＜ｚゴの／にＪｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ドータイ
ト社製）、７ ！； ｍ Ｍ ＣａＣｌ２、ｉｏｍＭＲ
ｂＣｌ および７５％グリセリンを含んだ混液（ｐＨ６
，５）で懸濁し、０℃でｌＳ分間放置してコンピテント
細胞とした。
＋＝＋ この大腸菌懸濁液２００μｔに（ｉ）で調製
したＤＮＡ溶液１０μｔを加え、３０分分間℃で放置し
た。ＢＨＩ培地／ｄを加え、３７℃でり０分間保温後、
この１００μｔをテトラサイクリン（７５μｔ ／１ｌ
ｌｊ ）を含んだＢＨＩ寒天プレートにまき、３７℃で
一晩培養し形質転換体を得た。この形質転換体をＰＯＰ
培地（組成はペプトン５？、肉エキス２？、イーストエ
キス３ ｙ。
したＤＮＡ溶液１０μｔを加え、３０分分間℃で放置し
た。ＢＨＩ培地／ｄを加え、３７℃でり０分間保温後、
この１００μｔをテトラサイクリン（７５μｔ ／１ｌ
ｌｊ ）を含んだＢＨＩ寒天プレートにまき、３７℃で
一晩培養し形質転換体を得た。この形質転換体をＰＯＰ
培地（組成はペプトン５？、肉エキス２？、イーストエ
キス３ ｙ。
ＮａＣ１／ ｔ、、 Ｋ２）ＬＰ０１ ／ ？ 、Ｍｇ
５０．０．３； ｆｆ 、パーオキシダーゼ！；００
ＩＵ、ＦＡＤ７ｇ３〜、ジアニンジン０／？、チアミン
ピロフォスフェート≠２ｑη、ピルビン酸／ｄ、寒天１
５ｖ、蒸留水／ｌ、ｐＨ７０）のプレートをこレプリカ
し、３７℃でさらｔこ一晩培養した。
５０．０．３； ｆｆ 、パーオキシダーゼ！；００
ＩＵ、ＦＡＤ７ｇ３〜、ジアニンジン０／？、チアミン
ピロフォスフェート≠２ｑη、ピルビン酸／ｄ、寒天１
５ｖ、蒸留水／ｌ、ｐＨ７０）のプレートをこレプリカ
し、３７℃でさらｔこ一晩培養した。
約ｔｔｓｏｏコロニーの形質転換体を調べたところ、コ
ロニーの周辺が茶褐色ｅこ変色したもの／株を得、この
株をエシェリヒア・コｌ）’Ｗ３／１Ｏ−ｐＯＸＩ３株
［微生物受託番号 微工研菌寄第２０７／号、Ｆ Ｅ
ＲＭ−ｉイソｌ）７／」と命名した。この菌を純粋分離
後ＢＨＩ培地で３７℃−晩培養し、ピルビン酸オキシダ
ーゼの生産性を後述するピルビン酸オキシダーゼ活性測
定法により調べたところ、約３ ｕ ／ｍｌのピルビン
酸オキシダーゼ活性を有していた。
ロニーの周辺が茶褐色ｅこ変色したもの／株を得、この
株をエシェリヒア・コｌ）’Ｗ３／１Ｏ−ｐＯＸＩ３株
［微生物受託番号 微工研菌寄第２０７／号、Ｆ Ｅ
ＲＭ−ｉイソｌ）７／」と命名した。この菌を純粋分離
後ＢＨＩ培地で３７℃−晩培養し、ピルビン酸オキシダ
ーゼの生産性を後述するピルビン酸オキシダーゼ活性測
定法により調べたところ、約３ ｕ ／ｍｌのピルビン
酸オキシダーゼ活性を有していた。
この菌株の保有していたプラスミドを実施例２と同様を
こしてプラスミドを分離し、ピルビン酸オキシダーゼ遺
伝子を含み、ｐＡＣＹＣ／、ｒ≠遺伝子を含むプラスミ
ドをｐＯＸＩ３と命名した。
こしてプラスミドを分離し、ピルビン酸オキシダーゼ遺
伝子を含み、ｐＡＣＹＣ／、ｒ≠遺伝子を含むプラスミ
ドをｐＯＸＩ３と命名した。
ピルビン酸オキシダーゼ活性測定法
本発明のピルビン酸オキシダーゼの活性測定法は次の通
りである。
りである。
０、 ｊ Ｍピルビン酸カリウム ０．／ｍｌ
Ｏ，ｊ Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７１（１）、、２
ｔｎｔ０２％≠−アミノアンチピリン ０．／ｍ１０
２％Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン Ｏ２ゴ／（７ｍＭＭ
ｇＣ］２ ！；ＯｕＬ／Ｑｍ
Ｍチアミノピロフオヌフエート ２０ ｕＬぺｌオ
’ｈＶダーセＣＩ／−３Ｕ／ｍｌ） Ｏ，／ ｍ
ｌｍＭＦＡＤ １０ ！ｄ。
Ｏ，ｊ Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７１（１）、、２
ｔｎｔ０２％≠−アミノアンチピリン ０．／ｍ１０
２％Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン Ｏ２ゴ／（７ｍＭＭ
ｇＣ］２ ！；ＯｕＬ／Ｑｍ
Ｍチアミノピロフオヌフエート ２０ ｕＬぺｌオ
’ｈＶダーセＣＩ／−３Ｕ／ｍｌ） Ｏ，／ ｍ
ｌｍＭＦＡＤ １０ ！ｄ。
蒸留水 ０．２２ ｍｌ上記
の組成の反応液／Ｑｍｌを試験管Ｆこ分取し、３７℃、
３分間予備加温した後、酵素液２０μｔを加えて３７℃
、１０分間反応を行い、反応後、０３ゴの０．／ＭＥＤ
ＴＡ （ｐＨ’７５ ）を加えて度広を停止し、次いで
これに蒸留水／、 ７ ｍｌを加えた後生じた紫色を５
乙５ｎｍの波長にて比色定量する。７分間に／μｍｏｌ
ｅの過酸化水素を生じる活性を／単位（Ｕ）とした。
の組成の反応液／Ｑｍｌを試験管Ｆこ分取し、３７℃、
３分間予備加温した後、酵素液２０μｔを加えて３７℃
、１０分間反応を行い、反応後、０３ゴの０．／ＭＥＤ
ＴＡ （ｐＨ’７５ ）を加えて度広を停止し、次いで
これに蒸留水／、 ７ ｍｌを加えた後生じた紫色を５
乙５ｎｍの波長にて比色定量する。７分間に／μｍｏｌ
ｅの過酸化水素を生じる活性を／単位（Ｕ）とした。
実施例≠、 〔ｐＯＸＩ３のマツピングおよびｐＯｐ遺
伝子の塩基配列の決定〕 エシェリヒア・コリＷ３／１０ｐＯＸ工３株かうｐ Ａ
ＣＹ Ｃ／ ｇ ’Ｉ 、！：同様の方法でＰＯＸ工
３プラヌミドＤＮＡを調製した。
伝子の塩基配列の決定〕 エシェリヒア・コリＷ３／１０ｐＯＸ工３株かうｐ Ａ
ＣＹ Ｃ／ ｇ ’Ｉ 、！：同様の方法でＰＯＸ工
３プラヌミドＤＮＡを調製した。
ｐＯＸ工３ＤＮＡ について制限酵素Ｃ１ａ Ｉ 。
ＥｃｏＲＶ、 Ｈ４ｎｄ Ｉ［Ｉ、 Ｓｃａ ｌ、
Ｐｓｔ、 ｌ、 Ｐｖｕ １１ 。
Ｐｓｔ、 ｌ、 Ｐｖｕ １１ 。
Ｘｂａ ｒ （いずれも宝酒造製）Ｉ（Ｐａ（（東洋紡
製）による切断地図を作成した。その結果を第１図に示
した。ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を含んだＤ Ｎ
Ａの塩基配列をＭ／３ファージを用いたジデオキシ法（
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２／’Ｉ ／２０！； ／２１０
−＠ ■ 示した。
製）による切断地図を作成した。その結果を第１図に示
した。ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を含んだＤ Ｎ
Ａの塩基配列をＭ／３ファージを用いたジデオキシ法（
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２／’Ｉ ／２０！； ／２１０
−＠ ■ 示した。
実ｍｅｌｔ、 （ピルビン酸オキシダーゼの製造〕エ
シェリヒア・コリＷ３／１０ｐＯＸＩ３株を２０１のＢ
ＨＩ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３７℃／ｇ時間ジャーフ
ァーメーターにより培養し、友ｏ ｏ 。
シェリヒア・コリＷ３／１０ｐＯＸＩ３株を２０１のＢ
ＨＩ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３７℃／ｇ時間ジャーフ
ァーメーターにより培養し、友ｏ ｏ 。
ｒ ｐｍｌＱ分間の遠心で集菌した。生理食塩水コｔで
洗浄後、２ｔのｉｏｍＭｖン酸バッファ（ｐＨ７０）で
懸濁した。リゾチームを／／Ｉｌｆ／ｍｌ、ＥＤＴＡ−
，２Ｎａ を−２ｍＭ、 ） リ ト ７Ｘ−
１００を０７％となるようｔこ加えて３７℃３０分間保
温し、３．００Ｏｒｐｍ１０分の遠心より上清液を分離
した。
洗浄後、２ｔのｉｏｍＭｖン酸バッファ（ｐＨ７０）で
懸濁した。リゾチームを／／Ｉｌｆ／ｍｌ、ＥＤＴＡ−
，２Ｎａ を−２ｍＭ、 ） リ ト ７Ｘ−
１００を０７％となるようｔこ加えて３７℃３０分間保
温し、３．００Ｏｒｐｍ１０分の遠心より上清液を分離
した。
この上清液／りｔｐこついて儲安塩析（ＩａＯ％〜乙６
％）全６％、沈澱物を遠心（５０００ｒ ｐｒｎ３０分
）により集めた。この沈澱物を２００１１１１の／Ｑｍ
Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７０，１０ＩＪＭのＦＡＤを含
む）で溶解し、セファデックスＧ−２５で脱塩処理をし
た。この後、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−乙Ｂを用い
てイオン交換クロマトを行い活性画分を分取後脱塩し、
凍結乾燥により粉末標品を得た。この酵素標品を前述の
ピルビン酸オキシダーゼ活性測定法により測定した結果
５／Ｕ／■の比活性を有していた。
％）全６％、沈澱物を遠心（５０００ｒ ｐｒｎ３０分
）により集めた。この沈澱物を２００１１１１の／Ｑｍ
Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７０，１０ＩＪＭのＦＡＤを含
む）で溶解し、セファデックスＧ−２５で脱塩処理をし
た。この後、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−乙Ｂを用い
てイオン交換クロマトを行い活性画分を分取後脱塩し、
凍結乾燥により粉末標品を得た。この酵素標品を前述の
ピルビン酸オキシダーゼ活性測定法により測定した結果
５／Ｕ／■の比活性を有していた。
実施例乙、 〔組換え体より分離精製したピルビン酸オ
キシダーゼのアミノ末端部分のアミノ酸配列の決定〕 実施例Ｓで分離精製したピルビン酸オキシダーゼについ
てベックマン社のアミノ酸シークエンサ−（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ ＳｙｓｔｅｍりｇＯＭＥ）を用いてアミノ末端か
ら１０個のアミノ酸の配列を調べた。
キシダーゼのアミノ末端部分のアミノ酸配列の決定〕 実施例Ｓで分離精製したピルビン酸オキシダーゼについ
てベックマン社のアミノ酸シークエンサ−（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ ＳｙｓｔｅｍりｇＯＭＥ）を用いてアミノ末端か
ら１０個のアミノ酸の配列を調べた。
その結果、約ｇθ％のものにＮ末ｔこＭｅｔが存在しア
ミノ酸配列の７位からＳｅｒ肩ｐ巧ａ、 Ｉｌｅ Ａｓ
ｎＩ ｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅ’ｕ ”Ｚ）煽列であること
を確認した〇〔発明の効果〕 本発明によって、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子および
、ピルビン酸オキシダーゼのアミノ酸配列が明らかにな
り、また、遺伝子工学手法による効率的なピルビン酸オ
キシダーゼの製造方法を提供した。また、本発明のピル
ビン酸オキシダーゼ遺伝子と種々の遺伝子工学的手法と
を用いることによって、より効率的なピルビン酸オキシ
ダーゼの製造方法をもたらしめるものである。
ミノ酸配列の７位からＳｅｒ肩ｐ巧ａ、 Ｉｌｅ Ａｓ
ｎＩ ｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅ’ｕ ”Ｚ）煽列であること
を確認した〇〔発明の効果〕 本発明によって、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子および
、ピルビン酸オキシダーゼのアミノ酸配列が明らかにな
り、また、遺伝子工学手法による効率的なピルビン酸オ
キシダーゼの製造方法を提供した。また、本発明のピル
ビン酸オキシダーゼ遺伝子と種々の遺伝子工学的手法と
を用いることによって、より効率的なピルビン酸オキシ
ダーゼの製造方法をもたらしめるものである。
第１図はｐ・０ＸＩ３ベクターの構成を示す模式図、第
２図（第２−１図および第２−２図に渡って示す）は、
ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子ＤＮＡのコード鎖（５’
−３’ ）および得られる翻訳生成物のそれぞれの配
列を示す。
２図（第２−１図および第２−２図に渡って示す）は、
ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子ＤＮＡのコード鎖（５’
−３’ ）および得られる翻訳生成物のそれぞれの配
列を示す。
Claims (13)
- （１）宿主にとって外来性であるポリデオキシリボ核酸
が、ピルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリン酸、
二酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒するピ
ルビン酸オキシダーゼからなるポリペプチドまたは該ピ
ルビン酸オキシダーゼを構成成分としてなるポリペプチ
ドのアミノ酸配列をコードする塩基配列であることを特
徴とするポリデオキシリボ核酸。 - （２）宿主にとって外来性であるポリデオキシリボ核酸
が、Ｎ末端側より式 【遺伝子配列があります】 〔式中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂは
アミノ酸残基または−ＯＨを示す〕で表わされるピルビ
ン酸オキシダーゼであるポリペプチドまたは該ピルビン
酸オキシダーゼを構成成分としてなるポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列からなる特許請求の範
囲第１項記載のポリデオキシリボ核酸。 - （３）宿主にとって外来性であるポリデオキシリボ核酸
が、５′末端側より式 【遺伝子配列があります】 〔式中、ＸはＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡ以外のコドン
または水素原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示
す〕で表わされるピルビン酸オキシダーゼからなるポリ
ペプチドまたは該ピルビン酸オキシダーゼを構成成分と
してなるポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基
配列である特許請求の範囲第１項記載のポリデオキシリ
ボ核酸。 - （４）宿主微生物が、宿主にとって外来性であって、ピ
ルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリン酸、二酸化
炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒するピルビン
酸オキシダーゼからなるポリペプチドまたは該ピルビン
酸オキシダーゼを構成成分としてなるポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列であるポリデオキシリ
ボ核酸を保持することを特徴とする形質転換体。 - （５）宿主微生物が、Ｎ末端側より式 【遺伝子配列があります】 〔式中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を示し、【遺
伝子配列があります】 Ｂはアミノ酸残基または−ＯＨを示す〕で表わされるピ
ルビン酸オキシダーゼであるポリペプチドまたは該ピル
ビン酸オキシダーゼが構成成分であるポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリデオキシ
リボ核酸を保持する特許請求の範囲第４項記載の形質転
換体。 - （６）宿主微生物が、５′末端側より式 【遺伝子配列があります】 〔式中、ＸはＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡ以外のコドン
または水素原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示
す〕で表わされるピルビン酸オキシダーゼからなるポリ
ペプチドまたは該ピルビン酸オキシダーゼを構成成分と
してなるポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基
配列であるポリデオキシリボ核酸を保持する特許請求の
範囲第４項記載の形質転換体。 - （７）宿主微生物が、エシェリヒア属に属する特許請求
の範囲第４項記載の形質転換体。 - （８）エシェリヒア属に属する宿主微生物が、エシェリ
ヒア・コリに属する微生物である特許請求の範囲第７項
記載の形質転換体。 - （９）Ｎ末端側より式 【遺伝子配列があります】 〔式中、Ａはアミノ酸残基、水素原子またはアセチル基
を示し、Ｂはアミノ酸残基、−ＯＨまたは−ＮＨ＿２を
示す〕で表わされるアミノ酸配列であるピルビン酸、燐
酸および酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素および過
酸化水素を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキシダー
ゼからなるポリペプチドまたは該ピルビン酸オキシダー
ゼを構成成分としてなるポリペプチド。 - （１０）ピルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリン
酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒す
るピルビン酸オキシダーゼ遺伝子であるポリデオキシリ
ボ核酸または該遺伝子が構成成分であるポリデオキシリ
ボ核酸を発現ベクターに組み入れた組換えＤＮＡを宿主
微生物に移入して形質転換体を得、 該形質転換体を培養して該ポリデオキシリボ核酸の遺伝
情報を発現させ、次いでピルビン酸、燐酸および酸素か
らアセチルリン酸，二酸化炭素および過酸化水素を生ず
る反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼであるポリペ
プチドまたは該ピルビン酸オキシダーゼが構成成分であ
るポリペプチドを採取してなるピルビン酸オキシダーゼ
の製造法。 - （１１）ピルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリン
酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒す
るピルビン酸オキシダーゼ遺伝子であるポリデオキシリ
ボ核酸または該遺伝子が構成成分であるポリデオキシリ
ボ核酸が、Ｎ末端側より式【遺伝子配列があります】 〔式中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂは
アミノ酸残基または−ＯＨを示す〕で表わされるピルビ
ン酸オキシダーゼであるポリペプチドまたは該ピルビン
酸オキシダーゼを構成成分としてなるポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリデオキシ
リボ核酸であることを特徴とする特許請求の範囲第１０
項記載の製造法。 - （１２）該ポリデオキシリボ核酸が、ラクトバシラセア
科またはストレプトコッカセア科に属する微生物から由
来してなるピルビン酸オキシダーゼ遺伝子または該遺伝
子を構成成分としてなる特許請求の範囲第１０項記載の
製造法。 - （１３）ストレプトコッカセア科に属する微生物から由
来してなるピルビン酸オキシダーゼ遺伝子が、アエロコ
ッカス属の該ピルビン酸オキシダーゼ生産菌より得られ
たポリデオキシリボ核酸である特許請求の範囲第１２項
記載の製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62000903A JPH0767390B2 (ja) | 1987-01-06 | 1987-01-06 | ピルビン酸オキシダ−ゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 |
| EP19880300073 EP0274425B1 (en) | 1987-01-06 | 1988-01-06 | Pyruvate oxidase, its preparation and use |
| DE19883886225 DE3886225T2 (de) | 1987-01-06 | 1988-01-06 | Pyruvat-Oxidase, ihre Herstellung und Verwendung. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62000903A JPH0767390B2 (ja) | 1987-01-06 | 1987-01-06 | ピルビン酸オキシダ−ゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7004738A Division JP2706223B2 (ja) | 1995-01-17 | 1995-01-17 | ピルビン酸オキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａの用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63169989A true JPS63169989A (ja) | 1988-07-13 |
| JPH0767390B2 JPH0767390B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=11486638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62000903A Expired - Lifetime JPH0767390B2 (ja) | 1987-01-06 | 1987-01-06 | ピルビン酸オキシダ−ゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0767390B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE602004030328D1 (de) | 2003-05-21 | 2011-01-13 | Asahi Kasei Pharma Corp | Verfahren zur messung von glykoliertem hämoglobin a1c, dafür zu verwendendes enzym und verfahren zur herstellung davon |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5840465A (ja) * | 1981-09-03 | 1983-03-09 | 松下精工株式会社 | 空冷式冷凍機 |
-
1987
- 1987-01-06 JP JP62000903A patent/JPH0767390B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5840465A (ja) * | 1981-09-03 | 1983-03-09 | 松下精工株式会社 | 空冷式冷凍機 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0767390B2 (ja) | 1995-07-26 |
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