JPH02191226A - アルブミン製剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、アルブミン製剤及びその製造方法に関する。

より詳細には、凝集体含量及び夾雑蛋白質含量が低減さ
れた血清アルブミン製剤及びその製造方法に関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］血清ア
ルブミンは血漿中に最も多く含まれている蛋白質で、血
液中で浸透圧の維持、栄養物質や代謝物質と結合してそ
の運搬などの機能を果たしている。上記血清アルブミン
を含有する製剤は、アルブミンの喪失及びアルブミン合
成低下による低アルブミン血症、出血性ショックなどの
治療に用いられている。アルブミン製剤は、そこに混入
してくる懸念のあるウィルスを不活化するために、通常
、アルブミン含有水溶液の状態での加熱処理が汎用され
ている。このような方法により製造される市販のアルブ
ミン製剤は、製剤中に凝集体（通常ポリマーと称される
ので、以下、ポリマーという）が存在することが知られ
ている。この凝集体は上記の加熱処理前には殆ど存在し
ないことから、加熱処理により熱に不安定な蛋白質が部
分的に変性して凝集化したものと考えられる。市販のア
ルブミン製剤は安全に広く使用されていることから、こ
の凝集体が特に人に害を及ぼすとは考えられていないが
、加熱変性物であることより、製剤中にできるだけ含ま
れていないことが好ましい。

また、アルブミン製剤中には、夾雑蛋白質としてα１−
酸性糖蛋白質が含まれており、該蛋白質は免疫抑制作用
を有する。α１−酸性糖蛋白質はアルブミンと物理化学
的性質の比較的よく似た蛋白質であり、分画法等の慣用
の手段では効率的に分離することが困難である。従って
、通常のアルブミン製剤中には免疫抑制作用を有するα
１−酸性糖蛋白質が残存するおそれがあり、製剤中から
できるだけ除去しておくことが望ましい。

本発明は上記の課題を解決すべく創案されたもので、本
発明者らが種々検討を重ねた結果、ポリマーの形成はア
ルブミン中に混入するポリマー形成因子（凝集体形成因
子）に起因し、該形成因子は熱に不安定な夾雑蛋白質（
主としてハプトグロビン）である知見を得、アルブミン
中のポリマー形成因子を除去することにより、加熱処理
されてもポリマー含量の少ないアルブミン製剤が得られ
、またαｌ−酸性糖蛋白質含量も低減できることを見出
し、本発明を完成した。即ち、本発明は、ポリマー含量
及びα１−酸性糖蛋白質含量が低減されたアルブミン製
剤及びその製造方法を提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 上記の課題を解決すべくなされた本発明のアルブミン製
剤は、血清アルブミン含量に対するポリマー含量が３重
量％以下であり、且つ血清アルブミン含量に対するα１
−酸性糖蛋白質含量が検出限界以下であることを特徴と
するものであり、また本発明のアルブミン製剤の製造方
法は、血清アルブミン含有水溶液を該水溶液中に含まれ
るポリマー形成因子を除去する工程に付した後、加熱処
理することを特徴とするものである。なお、ポリマー形
成因子の除去は、陰イオン交換体を用いる方法又はアフ
ィニティクロマトグラフィー法で行なうのが好ましい。

本発明にかかる製剤の主成分であり且つ本発明の製造方
法の出発原料であるアルブミンの由来には特に制限がな
く、具体的には補乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ウサギ
等に由来するものが挙げられ、特にヒト由来のものが使
用される。アルブミンを調製するための出発原料として
は、例えば、コーン氏の冷アルコール分画によって得ら
れた第Ｖ画分等が例示される。

本発明のアルブミン製剤は、上記のアルブミンを含有す
る水溶液を、該溶液中に含まれるポリマー形成因子を除
去する工程に付した後、加熱処理することにより得られ
る。

上記のアルブミン含有水溶液中のアルブミン含量として
は、通常、０．１〜３０％（Ｗ／　Ｖ　、特に明示のな
い限り以下同様）、好ましくは約１〜１０％に調整され
る。

上記アルブミン含有水溶液中のポリマー形成因子の除去
方法としては、ポリマー形成因子がハプトグロビン、ａ
Ｉ−酸性糖蛋白質等のアルブミンより等電点の低い蛋白
質であるので、これらを除去するために用いられる方法
であればいずれも使用することができ、例えば、陰イオ
ン交換体を用いる方法、アフィニティクロマトグラフィ
ーを用いる方法等が挙げられる。特にポリマー形成因子
の主成分であるハプトグロビンはアルブミンと物理化学
的性質が比較的よく似ており分画法で効率的に分離する
のは困難なので、陰イオン交換体を用いる方法又はアフ
ィニティクロマトグラフィーを用いる方法が好ましい。

上記の方法において、陰イオン交換体を用いる方法を採
用する場合、使用される陰イオン交換体としては陰イオ
ン交換基（例えば、ジエチルアミノエチル基等）を有す
る不溶性担体であればいずれも使用することができ、よ
り具体的には、この分野で慣用の陰イオン交換体、例え
ば、ＤＥＡＥ−セファロース０、Ｑ−セファロース０（
いずれもファルマシア社製）　、ＤＥＡＥ−）ヨパール
０、ＱＡＥ−トヨパール０（いずれも東ソー社製）、Ａ
２００セルロフアイン０（生化学工業社製）、陰イオン
交換樹脂等が例示され、ポリマー形成因子の除去率の点
からしてＱ−セファロース、ＱＡＥ−１ヨパール等の強
陰イオン交換体を用いるのが好ましい。

陰イオン交換体を用いる方法は、ハプトグロビン等のポ
リマー形成因子を含むアルブミン含有水溶液を陰イオン
交換体と接触させることにより行われ、陰イオン交換体
の使用量はアルブミン含有水溶液中のポリマー形成因子
含量、陰イオン交換体の交換能等により適宜調整される
が、アルブミン１ｇ当り、陰イオン交換体２〜５　ｘｌ
、通常３１１程度使用される。本方法はカラム法、バッ
チ法のいずれの方法にて行なってもよいが、ポリマー形
成因子の除去効率の面からカラム法にて行なうのが好ま
しい。

カラム法にて行なう場合、前記のアルブミン含有水溶液
をｐＨ４，８〜９．０程度、好ましくはｐＨ４，９〜５
．５、より好ましくはｐＨ５，１、塩濃度として０．０
０１〜０．２Ｍの塩化ナトリウム程度、好ましくは０．
００１〜０．０５Ｍに調整し、溶出液［例えば、０．０
２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，１）］で平衡化した陰イ
オン交換体カラムを通過させ、次いで溶出液で展開して
非吸着分を回収することにより行われる。上記の操作は
アルブミンの変性を抑制するため、低温（通常、１０℃
以下）にて行なうのが好ましい。

また、バッチ法にて行なう場合、上記条件に調整したア
ルブミン含有水溶液に、陰イオン交換体を添加して接触
させ、１０℃以下にて、３０分〜２時間程度混和した後
、遠心分離等の手段により陰イオン交換体と分離し、上
清を回収することにより行われる。

ポリマー形成因子の除去方法としてアフィニティクロマ
トグラフィー法を採用する場合、該方法に使用される担
体としては、ハプトグロビン等のポリマー形成因子と特
異的親和性を有する物質を固定化した不溶性担体（以下
、アフィニティ担体という）が用いられる。不溶性担体
としてはセルロース、デキストラン等が例示され、また
ハプトグロビン等のポリマー形成因子と特異的親和性を
有する物質としては、夾雑蛋白質の種類に応じて種々の
物質が用い得るが、例えば、ハプトグロビンに対しては
抗ハプトグロビン抗体、ヘモグロビン等、α１−酸性糖
蛋白質に対しては抗α１−酸性糖蛋白質抗体等が例示さ
れる。これらの抗ハプトグロビン抗体、抗α１−酸性糖
蛋白質抗体等の抗体はこの分野で慣用の抗体産生法によ
り調製することができる。上記の特異的親和性を有する
物質と不溶性担体との結合は常法に準じて行なうことが
でき、例えば、ブロムシアン化されたセファロースを膨
潤させた後、塩基性緩衝液中で特異的親和性を有する物
質を不溶性担体にカップリングさせ、緩衝液で十分に洗
浄することにより調製される。

アフィニティクロマトグライーを用いる方法は、ハプト
グロビン等のポリマー形成因子を含むアルブミン含有水
溶液を、アフィニティ担体と接触させることにより行わ
れ、例えば、それぞれの夾雑蛋白質と特異的親和性を有
する複数の物質を固定化したアフィニティ担体と接触さ
せたり、またハプトグロビンに対して特異的親和性を有
する物質を固定化したアフィニティ担体と接触させ、次
いでα１−酸性糖蛋白質に対して特異的親和性を有する
物質を固定化したアフィニティ担体と接触させ、さらに
必要に応じて他の夾雑蛋白質に対して特異的親和性を有
するアフィニティ担体と接触させることにより行われる
。

アフィニティ担体の使用量はアルブミン含有水溶液中の
ハプトグロビン等のポリマー形成因子含量、該アフィニ
ティ担体の吸着能等により適宜調整されるが、アルブミ
ン１ｇ当り、アフィニティ担体２〜５　ｘｌ、通常４１
！程度使用される。本方法はポリマー形成因子の除去効
率の面がらカラム法にて行なうのが好ましく、例えば、
前記のアルブミン含有水溶液をｐＨ４，０〜９．０程度
、好ましくはｐＨ５，０〜８．０、より好ましくはｐＨ
６，８に調整し、アルブミンの溶解用液で平衡化した上
記アフィニティ担体カラムを通過させ、必要に応じてカ
ラムを溶解用液で洗浄し、非吸着分を回収することによ
り行われる。上記の操作はアルブミンの変性を抑制する
ため、低温（通常１０℃以下）にて行なうのが好ましい
。

上記工程により夾雑蛋白質が除去され、得られたアルブ
ミン含有水溶液はポリマー形成因子含量が低減された溶
液である。

かかる精製工程によりポリマー形成因子が低減されたア
ルブミン含有水溶液は適当な濃度に調整し、例えば、バ
イアルに充填するなど所望の製剤形態に製剤化された後
、加熱処理されて本発明のアルブミン製剤が得られる。

上記の加熱処理はアルブミン製剤中に混入するおそれの
あるウィルスを不活化するもので、アルブミン濃度５〜
２０時間度、通常５又は２０〜２５％程度に調整した水
溶液として行われ、加熱温度としては、夾雑ウィルスを
不活化するに十分な温度及び時間行なえばよく、例えば
、５０〜７０℃、好ましくは約６０℃で、５〜２０時間
、好ましくは約１０時間行われる。なお、上記の加熱処
理に際しては、必要に応じて、アルブミンの安定化剤、
例えば、Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム、カプ
リル酸ナトリウム等を単独で又は混合して添加してもよ
い。

これらアルブミンの安定化剤は、製剤中に含有されるア
ルブミン１ｇ当り２０〜６０■、好ましくは４０１ｇ程
度使用される。

斯くして得られたアルブミン製剤は、アルブミン含量に
対するポリマー含量が３重量％以下であり、且つアルブ
ミン含量に対するα１−酸性糖蛋白質含量が検出限界以
下である。

本発明のアルブミン製剤は、従来のアルブミン製剤と同
様な用量、用法にて使用される。

［発明の効果］ 本発明のアルブミン製剤は、加熱処理によりウィルスが
不活化されていると共にポリマー含量及びα１−酸性糖
蛋白質含量が極めて少なく、安全性、安定性等に優れた
製剤である。

また、本発明の製造方法によれば、混入が危惧されるウ
ィルスが加熱処理により不活化され、また加熱処理によ
り生成するポリマーの形成因子であるハプトグロビン等
の熱に不安定な夾雑蛋白質が予め除去されているので、
ポリマー含量及び夾雑蛋白質含量の少ないアルブミン製
剤を得ることができる。

［実施例］ 以下、本発明をより詳細に説明するため、実施例を挙げ
るが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定され
るものではない。

実施例１ コーン氏の冷アルコール分画によって得られた第Ｖ画分
をアセトンで脱アルコールし、アセトンパウダーを得た
。次いで、アルブミン濃度が１０％となるように水に溶
解し、ｐＨを５．１に調整した。この溶液をＤＥＡＥ−
セファデックスカラムで処理した。溶出液に安定化剤と
してＮ−アセチルトリプトファンナトリウム及びカプリ
ル酸ナトリウムをそれぞれ２０ｍＭ添加し、６０℃で１
０時間加熱処理し、アルブミン製剤を得た。該製剤中の
ポリマー含量をゲル濾過分析法にて測定した。その結果
、ポリマー含量は、４回の繰り返し実験で３．０％以下
（アルブミン含量に対する相対重量％、ポリマー含量に
関して以下同様）であった。また、比較例として、ＤＥ
ＡＥ−セファデックス処理をしていない溶液に安定化剤
を添加し、同様に加熱した溶液中のポリマー含量を測定
した。

その結果、ポリマー含量は６．３％（４回の繰り返し実
験の平均値）であった。

次いで、上記のＤＥＡＥ−セファデックスに吸着した両
分を溶出させ、ゲル濾過法とセルロースアセテート膜電
気泳動法で分析した結果、吸着画分はハプトグロビンを
主体とする蛋白質であった。

実施例２ ブロムシアン化セファロース４Ｂ　（５，８ｇ）を１ｍ
Ｍ塩酸で１５分間膨潤させ、水洗した後、塩基性緩衝液
［０，１Ｍ炭酸水素ナトリウム及び０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム含有（ｐＨ８，３）］で洗浄した。ヒトヘモグロビ
ン（１００■）を上記塩基性緩衝液（４０ｙＺ）に溶解
し、ここに上記膨潤したゲル（２０ｙＺ）を添加し２時
間攪拌した。

次いで、１Ｍグリシン（ｐＨ８，０）を１５鱈を添加し
、４℃にて一夜攪拌した。ゲルを濾別し、塩基性緩衝液
で十分に洗浄した後、リン酸緩衝食塩水で平衡化した。

斯くして、ヒトヘモグロビン固定化セファロースを調製
した。

一方、実施例１で使用した第Ｖ画分アセトンパウダーを
水に溶解し、１０％アルブミン溶液（炭酸ナトリウム及
び水酸化ナトリウムにてｐＨ６゜８に調整）を調製した
。この溶液を、上記セファロースゲル（２０ｉｆ）を充
填したカラムにとおし、溶出液を２０１１ずつ分画した
。フラクションに２〜８について、−次免疫拡散法（Ｍ
ａｎｃｉｎｉ法）でハプトグロビンを定量した。また各
サンプル（５１１）をセントリカット−５０にて２１１
に濃縮し、安定化剤溶液（１１！中、Ｎ−アセチルトリ
プトファンナトリウム３６■ｇ及びカプリル酸ナトリウ
ム２４ａ＋ｇ含有）を２８０μｇを添加し、６０℃にて
１０時間加熱し、アルブミン製剤を得た。該製剤中のポ
リマー含量をゲル濾過分析法により測定した。

溶出液のハプトグロビン（Ｈｐ）濃度とポリマー含量と
の関係を第１表に示す。

（以下余白） 第　　１ 表 上記表に示されるように、溶出液中のハプトグロビン濃
度が低いほどポリマー含量が低い結果となった。実施例
１及び２の結果を勘案すると、アルブミンより等電点の
低い夾雑蛋白質（主としてハプトグロビン）を除去する
ことによりポリマー含量を低減化できることが判明した
。

実施例３ コーン氏の冷アルコール分画によって得られた第Ｖ画分
ペースト（３００ｇ、アルブミン含量１１０．２ｇ）を
冷無菌蒸溜水１．２１に溶解し、約１時間攪拌した。次
いで、１０　（Ｖ／Ｖ）％酢酸を用いてｐＨを４．６に
調整した後、約−２℃にて濾過（フィルター：０．４５
μｍ）Ｌ、さらに冷無菌蒸溜水１．２ｇを加え、０．８
Ｍ炭酸水素ナトリウムでｐＨ５，１に調整し、アルブミ
ン水溶液を得た。

一方、ＱＡＥ−トヨパール（３５０ｉｊ）をカラムに充
填し、０．５Ｍ塩化ナトリウム（５００ｙｆ）で十分に
洗浄した後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，１）
で平衡化し、陰イオン交換体カラムを調製した。このカ
ラムに上記のアルブミン水溶液をとおし、さらに０．０
２Ｍ酢酸ナトリウム（１，２４７）で洗浄した。通過液
と洗浄液とを合わせ、ＩＮ水酸化ナトリウムにてｐ′Ｈ
を６．２に調整した後、透析・濃縮し、全量３３ＯＮＩ
Ｃアルブミン濃度：約２８％）とした（以下、アルブミ
ン調整液という）。

このアルブミン調整液に安定化剤溶液（１００１！中、
Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム５．５５ｇ及び
カプリル酸ナトリウム３．８９ｇ含有）を３９．６１１
添加し、０．ＩＮ水酸化ナトリウムにてｐＨを６．８５
に調整した後、除菌濾過した。アルブミン濃度が２５％
となるように調整した後、所定量をバイアルに分注し、
６０℃にて１０時間加熱処理してアルブミン製剤を得た
。

得られた製剤中のポリマー含量をゲル濾過分析法により
測定したところ、１．９９％であった。

なお、比較として、ＱＡＥ−トヨパールカラムを使用し
ない点以外は、上記製法と実質的に同様にして調製した
アルブミン製剤の加熱後のポリマー含量は６．４９％で
あり、本発明の製造方法により得られたアルブミン製剤
のポリマー含量は著しく低いものである。

また、アルブミン製剤及び前記のアルブミン調整液中の
夾雑蛋白質含量の測定を一次免疫拡散法０１Ｈｃｉｎｉ
法：　Ｍａｎｃｉｎｉ　Ｇ、ら、ｌ５ｖｕｎｏｃｈｅｓ
ｉｓｔｒｙ、第２巻、第３号、第２３５−２５４頁、１
９８５年）により行い、その結果を第２表に示す。なお
、この際、用いた抗α１−酸性糖蛋白質血清、抗ハプト
グロビン血清及び抗プレアルブミン血清は、ウサギを免
疫動物として常法により調製したものである。これらの
抗血清より作製した一次免疫拡散法ゲルを用い、それぞ
れに対応する夾雑蛋白質に対する沈降輪面積の標準曲線
を第１図〜第３図に示す。

第２表に示されるように、本発明のアルブミン製剤及び
アルブミン調整液は夾雑蛋白質含量の極めて少ないもの
であることが判明した。なお、第１図〜第３図から明ら
かなように、ハプトグロビンの検出限界は６．５■／ｄ
ｉであり、α１−酸性糖蛋白質の検出限界は４■ｇ／ｄ
ｌであり、プレアルブミンの検出限界は４■ｇ　／　ｄ
　Ｉである。

第　　２　　表 白質、ハプトグロビン及びプレアルブミンに対する一次
免疫拡散法による標準曲線を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルブミン製剤において、血清アルブミン含量に対
   する凝集体含量が３重量％以下であり、且つ血清アルブ
   ミン含量に対するα＿１−酸性糖蛋白質含量が検出限界
   以下であることを特徴とするアルブミン製剤。 ２、アルブミン製剤の製造方法において、血清アルブミ
   ン含有水溶液を、該水溶液中に含まれる凝集体形成因子
   を除去する工程に付した後、加熱処理することを特徴と
   するアルブミン製剤の製造方法。 ３、凝集体形成因子の除去を、陰イオン交換体を用いる
   方法又はアフィニティクロマトグラフィー法で行なう請
   求項２記載のアルブミン製剤の製造方法。