JPH02194A - ヒト血清アルブミンのｎ‐未端を含有するポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａ技法により製造することが
できそしてヒト血清アルブミンの多くの既存の用途のた
めに使用することができる新規なポリペプチドに関する
。

〔従来の技術〕 ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）は最も豊富な血漿蛋白質
であって血漿の全蛋白質含量の６０重量％を占める。Ｉ
ＳＡの分子は５８５アミノ酸の、分子ｉ６６、５００の
非グリコジル化単一ポリベプチド鎖から成る。ＩＳＡの
アミノ酸配列は蛋白質配列分析により確立されており　
（Ｍｅｌｏｕｎ等、１９７５゜Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｍ
ｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｕｍａ
ｎ　ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ”ＦＥＢｓ、Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ　：　５８　：　１．１３６−３１７；Ｂｅｈｒｅ
ｍｓ等、１９７５．’５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｈｕ
ｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ”Ｆｅｄ、Ｉ’ｒ
ｏｃ、３４，５９１）、そしてさらに最近では遺伝子分
析により確立されている（Ｌａｗｎ等、１９８１．Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　９　；　６
１０２〜６１１４）。公表されたアミノ酸配列間にはく
い違いがある（幾らかは多形性に基＜）が、第１図はヒ
ト集団中に存在するＩ　Ｓ　Ａを最も代表すると現在信
じられているアミノ酸配列を示す。

その比較的小さい分子量及び生理的ｐＨにおける正味の
負電荷のため（ＰｅＬｅｒｓ、　１９７０．　”Ｓｅｒ
ｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ’。

Ａｄｖ、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、　１３．３７−１１１）
、Ｉ　Ｓ　Ａは正常血漿の浸透圧効果の８５％に寄与す
る。従って、ＩＳＡは血漿体積の主たる１１節因子であ
る。Ｉ　Ｓ　Ａの第二の役割はカタボリック（ｃａ　ｔ
ａｂｏ　Ｉ　ｉｃ）過程により生産される小分子（例え
ば脂肪酸及びビリルビン）を結合することである。アル
ブミンは、生理的ｐ＋＋において難溶であるこれらの重
要な代謝物質の輸送のための主たる手段を代表する。Ｉ
　Ｓ　Ａの物理学的研究、化学的研究、免疫学的研究及
び限定蛋白質分解研究が示すところによれば、その分子
は酵素的手段による親分子からの分離の後にそれらのコ
ンホーメーション（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持
する複数のポリペプチド鎖の領域から構成されている。

これらのポリペプチド鎖はその結合能力を維持しており
、これによって、該ペプチド鎖の特定の領域へのビリル
ビン、脂肪酸及び他の小分子の結合のための部位のマツ
ピングを容易にする（Ｋｒａｇｈ−Ｈａｎｓｅｎ、１９
８１＋”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　
ｌｉｇａｎｄｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ｓｅｒｕｍ　ａｌ
ｂｕｍｉｎ”、Ａ、Ｓｏｃ、Ｐｈａｒｍ、ＥｘｐＬ。

Ｔｈｅｒ、井、１．１７−５３）。この分野における情
報の多くが総説されている（Ｂｒｏｗｎ及び５ｈｏｃｋ
ｌｅｙ、　１９８２＋”５ｅｒｕａ＋　ａｌｂｕｍｉｎ
：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｓａｔｉｏｎｏｆ　ｉｔｓ目ｇａｎｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ
　５ｉｔｅｓ”）。

ＩＳＡの療法用濃縮物の臨床的使用は主として血漿容積
拡張剤としての膨張（Ｏｎｃｏｔｉｃ）作用に特に関連
する。ＨＳ　Ａの濃縮物は１９４０年代以来療法的に、
特に、ショック、火傷、成人呼吸困難症候群、及び心肺
バイパスの症例において使用されてきた。アルブミンは
さらに、急性肝不全、硬変を有する患者からの腹水の除
去後、手術後、象、性腎症において、腎Ｎ透析において
、及び毒性物質を除去するための輸送蛋白質として、例
えば新生児の溶血症における深刻な黄度の場合に使用さ
れてきた。

療法剤としてのその使用に加えて、Ｉ　Ｓ　Ａは組織培
養において補乳類細胞の増殖を支持するために使用され
る培地へ添加される血清の主成分である。直情の消費、
そしてそれ故にアルブミンの消費は、生物工学及び医薬
品会社が研究又は製造のために組織培養を拡張するに従
って、近年非常に増加した。これらの目的のためのより
低価格のそしてよりよく制御された血清の必要性が普遍
的に存在する。

微生物中でｍ換ポリペプチドを発現せしめるためにＩＳ
ＡコードＤＮＡ配列を操作することが知られている、確
かに、エシェリシへ・・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　　ｃｏｌｉ）（英国特許Ｎｏ、　２．１４７，９０３
Ｂ）、バシルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓ
ｕｌ＋Ｌｉ１ｉｓ）（′：３−ロッパ特許出願Ｎｏ、　
８６３０４６５６．１）、及び酵母サン力ロミセス・セ
レビシェ−Ｃ８ａｃｃｈａｒ憇ｙ翌ｃｅｒｅｖ　ｉｓ　
１ａｅ）　（ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、２０１．２３９
．　ＤｅｌｔａＢ　ｉｏ　ｔｅｃｈｎｏ　ｌｏｇｙ社）
において前記の組換ＨＳ　Ａポリペプチドが生産されて
おり、従って、天然Ｉ　ＳＡと実質的に同一な組換ポリ
ペプチドを既知の方法を用いて種々の微生物宿主中で生
産することができることが一般に認められる。しかしな
がら、組換Ｈ３Ａが生産されるすべての場合において、
構造及び生物学的機能が天然のｌ（Ｓ　Ａと同一な（ｎ
ａｔｕｒｅ−４ｄｅｎｔｉｃａｌ）分子を生産すること
が目標である。

今や、短い形のＨＳ　Ａを製造することが有利であるこ
とが見出された。

Ｃ本発明の説明〕 本発明の一つの観点は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸
残７ＪｎまでのＮ−末端部分を含んで成るポリペプチド
（ここで、ｎは３６９〜４１９である）及びその誘導体
を提供する。

以後、本発明の新規なポリペプチドをｒｌｌｓＡ（１−
ｎ）」と称する。

「ヒト血清アルブミン」は既知の形の及び今後発見され
る多形（ｐｏｌｙ　ｍｏｒｐｈｉｃ）形のＩ　Ｓ　Ａを
含むがこれに限定されないことが意図される。例えば、
アルブミンＮａ５ｋａｐｉ　はＧｌｕ−３７２の代りに
Ｌｙｓ−３７２を有し、そしてプロ−アルブミンＣｈｒ
ｉｓｔｃｈｕｒｃｈは変化したプロ−配列を有する。「
変異体」は残基１−ｎ中の小さい人為的変化（例えば、
１もしくは少数の残基を欠き、残基の保存的置換もしく
はわずかな挿入を有し、又はアミノ酸構造のわずかな変
化を有する分子）を含むことが意図されるが、これに限
定されない。従って、ｌＨＳＡ（１−ｎ　）化合物と８
０％、好ましくは８５％、９０％、９５％又は９９％の
相同性を有するポリペプチドが「変異体」であると認め
られる。これらの変異体は好ましくは３６０〜４３０ア
ミノ酸長、さらに好ましくは３６９〜４１９アミノ酸長
、そして最も好ましくは３８６〜３８８アミノ酸長を有
する。さらに、これらの変異体はＨＳＡ（１−ｎ　）化
合物に生理的に同等であることが好ましい。すなわち、
変異体は少なくとも１つの薬理学的用途をＨＳＡ（１−
ｎ　）化合物と共有する。さらに、薬理学的に使用され
るべきすべての仮定の変異体は治療される動物（特にヒ
ト）において非−免疫原性であるべきである。

保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　５ｕｂｓｔｉ
ｔｕｔｉｏｎ）は、ポリペプチドの少なくとも二次構造
そして好ましくは三次構造が実質的に変化しないと当業
者が予想するように、１又は複数のアミノ酸が類似の性
質を有する他のアミノ酸によって置き換えられている場
合である。例えば、典型的なこれらの置換には、グリシ
ンに代るアラニン又はバリン、グルタミンに代るアルギ
ニン又はアスパラギン、アスパラギンに代るセリン、及
びリジンに代るヒスチジンが含まれる。これに代えて、
又はこれに加えて、変異体は任意の所与のｌＨＳＡ（１
−ｎ　）と比べて１０個以下（好ましくは１個又は２個
のみ）のアミノ酸残基を欠き、好ましくはこれらの欠失
は分子の１００−３６９部分（成熟Ｉ　Ｓ　Ａそれ自体
に関して）に存在する。同様に、１０個以下、好ましく
は１個又は２個のみのアミノ酸が、好ましくはやはり１
００−３６９の部分において、付加されていてもよい。

「生理的に機能的な同等物」は、前記１−ｎ配列＋Ｎ−
末端における他の配列を含んで成るより大きな分子〔例
えば、プロ−１！ＳＡ（１−ｎ　）、プレ−プロ−ＩＩ
ｓ＾（１−ｎ）　、ｍｅ　ｔ−Ｈ３＾（１−ｎ）、及び
Ｉ　Ｓ　Ａにとって必ずしも本来的ではない適当なリー
ダー配列を有するｎｓ八（ｔ−ｎ）を包含する。

後でさらに詳細に記載するように、形質転換された酵母
（Ｓ、セレビシェ−）を培養することによりＨＳＡ（１
−ｎ）を製造しようとする場合、リーダー配列は例えば
酵母α−ファクター蛋白質と共に天然に見出されるそれ
であることができる。注目の他のポリペプチドとのＣ−
末端融合生成物を製造することができる。ｌ３Ａの既知
の形及び断片、例えば低収量で生産されるペプチド断片
であるｌＨＳＡ（１−３８７）　（Ｇｅｉｓｏｗ及びＢ
ｅａｖｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｊ。

」■、６１９−６２４．１９７７；並びに前記、１６３
，４７７−４８４゜１９７７）は前記の定義から排除さ
れるものと明確にみなされる。これらの先行する論文は
この断片を１−３８６として同定しているが、しかしこ
れは著者が誤って公表された配列情報を使用したためで
あって、この断片は実際は１−３８７であることが明ら
かになった（例えば、Ｌａｗｎ等、前掲を参照のこと）
。同様に、ｆｌｓＡ（１−ｎ　）及び残りのＨ３Ａ残基
（番号ｎ＋１から５８５）を含んで成るＣ−末端融合蛋
白質の本発明の部分ではない。

特に好ましい新規なｌＨＳＡ（１−ｎ　）化合物にはＨ
ＳＡ（１−３７３）　（すなわちＣ−末端ＶａｊＪ、Ｉ
ＩｓＡ（１−３８８）　（すなわらＣ−末端１１　ｅ）
　、ＨＳＡ（１−３８９）　（すなわち、Ｃ−末端Ｌ　
ｙＳ）　、ｌＨＳＡ（１３９０）　（すなわちＣ−末端
Ｇｌｎ）、及びｌＨＳＡ（１４０７）　（すなわち、Ｃ
−末端Ｌｅｕ）が含まれる。

）ＨＳＡ（１−ｎ）分子は好ましくは、天然Ｈ３Ａの化
学的もしくは酵素的分解、又はペプチド合成によってで
はなく、組換ＤＮＡ技法（場合によってはさらに蛋白質
分解的消化）によって製造される。

酵素的分解の場合、トリプシン様酵素はＩＳＡをＬｙｓ
　（３８９）とＧ　Ｉ　ｎ　（３９０）との間で開裂せ
しめるが、しかし同時にさらに他の開裂部位を開裂せし
める。

将来、ペプチド合成は４１９アミノ酸という長い分子に
ついて可能になるであろうが、しかし現在のところ実際
的な計画ではない。酵母における発現が特に好ましい。

形質転換された宿主の培養によりＨＳＡ（１−ｎ　）化
合物が生産される少なくとも幾つかの状況においては、
ＩＩｓＡ（１−３８７）より長い幾つかのｌＨＳＡ（Ｉ
ｎ）化合物は、その系中に天然に存在する酵素によりｌ
ＨＳＡ（１−３８７）に蛋白質分解的に消化される。

従って、所望により、所与のｌＨＳＡ（１−ｎ　）化合
物に対応するヌクレオチド配列を用いて他のＩＳＡ　（
、１ｎ）化合物を製造することができる。

この明細書に記載する新規な分子は、血漿体積拡張剤と
して天然Ｈ３Ａ又は天然物と同じ組換ＨＳ　Ａの有効な
代替物として使用され得る。天然Ｉ　Ｓ　Ａ及び天然物
と同じ組換Ｈ３Ａに対するｌＨＳＡ（１−ｎ）・の利点
は血液のコロイド浸透圧を上昇せしめる効力に関する。

本発明の蛋白質の分子量（約４４ｋｂ）が小さいことは
、同等のコロイド浸透圧効果のために天然Ｈ３Ａ又は天
然物と同じ組換ＨＳ　Ａの個体蛋白質投与量の半分〜３
分の２の投与量で足りることを意味する。従って、組換
ＤＮＡ技法によるこの新規なポリペプチドの任意の製造
方法が、天然物と同じ組換Ｈ３Ａの製造のための既知の
方法に比べて有利な経済的利点を提供する。効果的な投
与量のために実質的に少ない蛋白質材料を製造すれば足
りるからである。

従って、本発明の第二の観点はｌＨＳＡ（１−ｎ　）プ
ラスを含んで成る医薬組成物を提供し、ここで１１ｓＡ
（１−ｎ　）プラスとは前に定義したｌＨＳＡ（１−ｎ
　）又はそれ自体知られているが医薬用としてはまだ提
案されていない任意のｕｓＡＨ−ｎ）分子を意味する。

前記のようにＩＳＡの従来技術のペプシン消化物中に偶
然生産される断片であるＨＳ＾（１−３８７）はこのよ
うな医薬組成物中のＩＩｓＡ（１−ｎ）プラスとして特
に好ましい。この組成物は前に定義した１１ＳＡ（１−
３８７）の「変異体」を含んで成ることができる。

本発明の第三の観点は、ショック、火傷、又はアルブミ
ンを必要とする他の状態のヒトの治療方法を提供し、こ
の方法はｌＨＳＡ（１−ｎ）プラスを含んで成るポリペ
プチドの無菌のパイロジエン不含有）８液の血液増量又
は血液浄化に有効で非毒性の里を静脈内に投与すること
を含んで成る。

本発明の他の観点は、（ａ）ｔｌｓＡ（１−ｎ）プラス
の発現をコードする、ベクター、プラスミド、及びセル
ラインを包含する形質転換された微生物：（ｂ）ＩＳＡ
（１−ｎ）プラスを発現するように形質転換された微生
物（セルラインを包含する）による適切な条件下での発
酵を含んで成るｌＨＳＡ（１−ｎ）プラスの製造方法；
及び（ｃ）ＩＩｓＡ（１−ｎ）プラスを含んで成る実験
室用培地、を提供する。

少なくとも幾種類かのｕｓＡ（ｔ−ｎ）プラス分子の天
然物と同じ組換ＨＳ　Ａに対する他の利点は、それらの
小さいサイズそしてそれ故に少ないアミノ酸含量が、天
然物と同じ組換ＨＳ　Ａについて現在得られる収量に比
べて、微生物宿主中で得られる収量（乾燥細胞重量当り
の分子数）の増加を導くことが見出されたことである。

従って、工程規模を縮小することができるのみならず、
組換宿主生物における生産性をも増強することができる
。

本発明の化合物は血液増量（血漿拡張）剤として、Ｈ３
Ａそれ自体と同様の方法で、そしてそれと同様の製剤と
して使用することができるが、ｌＨＳＡ（１−ｎ）プラ
スの投与量（重量）は一般に、その効果が大きいだけＨ
３Ａのそれよりも少ない。

熟練した薬剤師又は臨床医は日常的且つ非発明的実験に
よってＨＳＡ（１−ｎ）プラス化合物の最適投与量を容
易に決定することができる。一般に、投与されるｌＨＳ
Ａ（１−ｎ　）プラスの量は、投与されるかもしれない
Ｈ３Ａの量の約３分の２である。

ｏｓＡ（ｔ−ｎ）プラス化合物はさらに、（１）組織培
養培地中でＩＳＡ又はより一般的にはウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）の代替物として使用して、例えばウィルス
及びマイコプラズマによる培地の汚染の危険を低下せし
めることができ；　（２）エナンチオマー等の分離のた
めの液体クロマトグラフィーにおける固定相中のＢＳＡ
の代替物として使用することができる。

次に、本発明を例によってさらに具体的に説明する。

標準的組換ＤＮＡ手順は特にことわらない限りＭａｎｉ
ａｔｉｓ等（１９８２）により記載された通りである。

Ｍ　１３Ｍ１喚クローンの作製及び分析はＭｅｓｓ　ｉ
ｎｇ　（１９８３）及びＳａｎｇｅｒ等（１９７７）に
より記載されている通りである。

下記の分子の作製において使用されたヒト血清アルブミ
ンコード配列はプラスミドＭ１３ｍｐ１９．７（ヨーロ
ッパ特許出願Ｎａ　２０Ｌ２３９　；　Ｄｅｌｔａ　Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ社）に由来し、又はこの配
列の部分と同等のオリゴヌクレオチドの合成によった。

オリゴヌクレオチドはアプライド・ハイオシステムス３
８００オリゴヌクレオチド合成機上でホスホラミデート
法を用いて、製造者の指示（ＡＢ　Ｉｎｃ、ワーリント
ン。

チェスシャー、イングランド）に従って合成した。

以下余白 ［ｊ　　ｌＨＳＡ　（１−３８９） Ｉ　Ｓ　Ａ分泌シグナル及び３８９位のアミノ酸リジン
まで（これを含む）の成ｑＢ　Ｉ　Ｓ　Ａをコードする
ＤＮＡがＳ、セレビシェ−（Ｓ、　　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）ホスホグリセレート・キナーゼ遺伝子（ＰＣ，Ｋ
）プロモーターの下流に置かれており、そしてその後に
終止コドン及びＰＧＫ転写ターミネータ−が置かれてい
る発現ベクターを作製した。次に、このベクターを形質
転換によりＳ、セレビシェ−に導入し、そしてＨ３Ａの
Ｎ−末端側の３８９個のアミノ酸の分子の発現及び細胞
からの分泌を指令した。

既知ＩＳＡコード配列（第２図）のＰｓｔ１部位（１０
９２、第２図）からバリン３８１のコドン（このコドン
はＧＴＣからＧＴＣに変っている）までの部分を代表す
るオリゴヌクレオチド（リンカ−１）を合成した。

以下余白 リンカ−１ 列分析によりｍｆｌＯＢ１２　（第３図）と称する必要
なりＮＡ配列を有する分子を同定した。

Ｍ１３ｍｐ１９．７はＭ１３ｍｐ１９　（Ｎｏｒｒａｎ
ｄｅｒ等、１９８３）中成ＰＨ８Ａのコード配列から成
り、ここでＨ３Ａの第一アミノ酸のコドンＧＡＴがユニ
ークＸｈｏ　Ｉ部位とオーバーラツプして、 ＾５ｐ　　Ａｌａ ５′−Ｗ四へフＡＴＧＣＡ　　３’ ３′髪とシソ口ＴＡＣＧＴ　　５’ Ｖ駈■ となっている（ＥＰＡ　Ｎα２１０２３９　ＡＩ）。旧
３ｍｐ１９．７をＸｈｏ　Ｉで消化し、Ｓｌ−ヌクレア
ーゼ処理により平滑末端化し、そして次に、下記のオリ
ゴヌクレオチド（リンカ−２）： 韮之左二Ｉ ５・ＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣ予７四コ了ＧＧ３’ＡＧＡＡ
ＡＡＴＡＧＧＴ−ニｒＣＧＡＡＣＣ肛ｍｌ■ ＡＴＡ　　八　＾　＾　ＧＡ３’ ＴＡＴＴＴＴＣＴ　５’ と連結した。

次に、連結混合物を用いてＥ、コリＸＬＩ−Ｂｌｕｅを
形質転換し、幾つかのプラークから鋳型ＤＮＡを調製し
、そして次にＤＮＡ配列決定により分析して正しい配列
を有するクローンｐＤＢＤｌ　（第４図）を同定した。

ＨＳ　Ａコード領域の５′−末端及び挿入されたオリゴ
ヌクレオチドリンカーの半分を代表する１、１ｋｂの坦
ｎｄＩ［［−焉３ｔｌ断片をｐ口ＢＤＩからアガロース
ゲル電気泳動により単離した。次に、この断片を、１ｌ
ｉｎｄｌ［ｌ及びＰｓｔｌによりあらかじめ消化した二
本鎖ｍ１ｌＯＢ１２と連結し、そして連結混合物を使用
してＥ、コリＸＬＩ−Ｂｌｕｅをトランスフェクトした
。

幾つかのプラークの成熟バクテリオファージ粒子から単
鎖鋳型ＤＮＡを調製した。デオキシヌクレオシドトリホ
スフェートの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩの１ｅｎｏ
−断片を用いてのアニールされた配列決定ブライマーか
らの延長によりインビトロで二本鎖にした。このＤＮＡ
の制限酵素分析は、正しい配置を有するクローンｍ１ｌ
ＯＢ１５　（第４図）の同定を可能にした。

下記のオリゴヌクレオチド（リンカ−３）は、成熟Ｈ３
Ａの３８２位のアミノ酸のコドン（グルタミン酸、ＧＡ
Ａ）から３８９位のリジンのコドンまで、並びにこれに
続く終止コドン（ＴＡＡ）及び１１ｉｎｄＩ［１部位及
び次にＢａｍＨ［接着末端を表す。

リンカ−３ ＥＥＰＱＮＬＴＫ ５　　’　　ＧＡＡ　　ＧＡＧ　　ＣＣＴ　　ＣＡＧ　
　ＡＡＴ　　ＴＴＡ　　ＡＴＣＡＡＡ３　’　ＣＴＴ　
ＣＴＣＧＧＡ　ＧＴＣＴＴＡ　ＡＡＴ　ＴＡＧ　ＴＴＴ
ＴＡＡ　ＧＣＴＴＧ　　　　３　’ ＡＴＴ　ＣＧＡＡＣＣＴＡＧ　５　’ これを、ＨｉｎｃＵ及びＢａｍＨＩによりあらかじめ消
化された二本鎖ｍＨＯＢ１５に連結した。連結の後、Ｄ
ＮＡをＨｉｎｃＵにより消化してすべての非組換分子を
破壊し、そして次にＥ、コリＸＬＩ−Ｂｌｕｅをトラン
スフェクトするために用いた。多数のクローンのバクテ
リオファージ粒子から一本１Ｎ　Ｄ　Ｎ　Ａを調製し、
そしてＤＮＡ配列分析にかけた。正しいＤＮＡ配列を有
する１つのクローンをｍＨＯ［１１６（第４図）と命名
した。

成ｇｔ５　ＨＳ　Ａコード領域がＩＳＡ分泌シグナルに
融合している分子を次の様にして形成した。次のリンカ
−４ニ リンカ−４ ＭＫＷＶＳＦＩＳ ５　’　ＧＡＴＣＣＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴＡ　
ＡＧＣＴＴＴ　ＡＴＴ　ＴＣＣＧ　　ＴＡＣＴＣＣＡＣ
ＣＣＡＴ　　ＴＣＧ　　ＡＡＡ　　ＴＡＡ　　ＡＧＧＬ
ＬＦＬＦＳＳＡＹＳ ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＣＴＣＴＴＴ　ＡＧＣＴＣＧ
　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＴＣＣＧＡＡ　　ＧＡＡ　　ＡＡＡ
　　ＧＡＧ　　＾へＡ　　ＡＣＧ　　ＡＧＣＣＧＡ　　
ＡＴＡ　　ＡＧＧＧＶＦＲＲ ＡＧＧ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　ＣＧ　　　　３　’
ＴＣＣＣＣＡ　　ＣＡＣＡＡＡ　　ＧＣＡＧＣＴ　　　
５　　’を、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏ　ｌで消化したＭ１
３ｍｐ１９．７に挿入することによりｐＤＢＤ２を形成
した（第５図）。このリンカ−において、最初のメチオ
ニンの後の４番目のアミノ酸のコドン、すなわちＩＳＡ
プレ−プロ−リーダー配列（Ｌａｗｎ等、１９８１）中
のスレオニンのＡＣＣがセリンのＡＧＣに変えられ、Ｈ
ｉｎｄＩ［［部位が形成されている。

この構成物の５′−末端を□Ｉｔ　Ｉ　−Ｐｖｕ　ＩＩ
断片として取り出し、そして二本ｔＭｍｌｌＯＢ１６の
Ｐｖｕ　ＩＩＢａｍＨＩ断片（端が切られたＨ３Ａ遺伝
子の３′末端を示す）と共にｐＭＡ９１　（Ｍｅｌｌｏ
ｒ等、１９８３）に町ＢＩＩ部位において連結してｐＨ
０Ｂ３１を形成した（第４図）。この分子は、Ｓ、セレ
ビシェ−ＰＧＫ遺伝子のプロモーターとターミネータ−
との間に端が切られたＨ３Ａコード領域と共にＨ３Ａ３
Ａシグナルを含有し、該遺伝子の５′末端が該プロモー
ターに接している。この分子はまた、酵母形質転換のた
めの選択マーカー国及び酵母２趨プラスミドの部分を含
有し、酵母中での自律複製が可能にされている。

標準的方法（Ｂｅｇｇｓ、　１９７８）を用いる形質転
換により、プラスミド９１１０８３１をＳ、セレビシェ
−Δ！１２２（ｌｌｉｎｎｅｎ等、１９７８）に導入し
た。純化された形質転換体をＹεＰＤブロス（１％酵母
エキス、２％ペプトン、２％グルコース）中で３０°Ｃ
にて３日間増殖せしめ、そして次に培養上清をロケット
ゲル電気泳動によりＩＳＡ−関連物質の存在について分
析して、好結果を得た。第５図は電気泳動図を示す。ｌ
ＨＳＡ（１−３８９）をコードするプラスミドを有する
形質転換体からのＨＳＡ−関連物質の収量は、天然成熟
ｔｌ　Ｓ　Ａを分泌する形質転換体からの収量より顕著
に高かった。

しかしながら、ＨＳＡ（１−３８９）の生産は、アミン
末端配列分析及びカルボキシ末端配列分析の両者により
ｌＨＳＡ（１−３８７）　（例２を参照のこと）と区別
される生成物をもたらした。これはおそらく、ＣＯＯＩ
＋−末端配列ＩＬｅ−Ｌｙｓの効率的な除去により説明
される。

ｌ　　邦人０−二邪の− １１ＳＡ（１−３８７）をコードするプラスミドの作製
は、１１ｓＡ（１−３８９）プラスミドｐＨ０Ｂ３１の
作製方法と同じであった。但し、リンカ−３の代りに下
記のリンカ−５を用いた。

以下余白 ユ詠ぜじ二足 Ｅ　　　Ｅ　　　Ｐ　　　Ｑ　　　Ｎ　　　Ｌ　　５ｔ
ｏｐ５　　’　　ＧＡＡ　　ＧＡＧ　　ＣＣＴ　　ＣＡ
Ｇ　　ＡＡＴ　　ＴＴＡ　　ＴＡＡ　　ＧＣＴＴＧ　　
　　　　　３　　’３　　’　　ＣＴＴ　　ＣＴＣＧＧ
Ａ　　ＧＴＣＴＴＡ　　ＡＡＴ　　ＡＴＴ　　ＣＧＡＡ
ＣＣＴＡＧ　　５　　’このリンカ−５は成熟Ｉ　Ｓ　
Ａの３８２位のアミノ酸のコドン（グルタミン酸、ＧＡ
Ａ）から３８７位のロイシンのコドンまで、並びにこれ
に続く終止コドン及び旧ｎｄｌ１１部位及びＢａｍ１ｌ
　Ｉ接着末端を有する。作製法の他の部分はｐＨ０Ｂ３
１について前記した通りであり、プラスミドｐＤＢＤ５
を得た。

炭３．　　ＨＳＡ（１−３６９） ＩＳＡ（１−３６９）をコードするプラスミドを作製す
るため、成熟Ｈ３Ａの均１１部位（１０９２位、第３図
）から３６９位のシスティンのコドン並びにこれに続く
終止コドン（ＴＡＡ）　、ＨｉｎｄＩ［１部位及び次に
Ｂａｎ＋）Ｉ　Ｉ接着末端から成るリンカ−６を合成し
た。

リンカ−６ Ｄ　　　Ｐ　　　ＨＥ　　　Ｃ５ｔｏｐ５　’　　　　
　　ＧＡＴ　　ＣＣＴ　ＣＡＴ　ＧＡＡ　　ＴＧＣＴＡ
Ａ　　ＧＣＴＴＧ３　’　　Ａ　ＣＧＴ　ＣＴＡ　　Ｇ
ＧＡ　　ＧＴＡ　　ＣＴＴ　　ＡＣＧ　　ＡＴＴ　　Ｃ
ＧＡＡＣＣＴＡＧこのリンカ−を、プレプロＨ３Ａの５
′部分に相当するｐＤＢＤ２のＢａｍ１ｌ　Ｉ　−Ｐｓ
ｔ　Ｉ断片と共に、ｐＭＡ９１にＩ１１部位において連
結した。正しい配置を有するプラスミｆ’ｐＤＢＤ３と
命名した（第６図）。

ｐＤＢＤ３により形質転換されたＳ、セレビシェ−を培
養すること炙こよるｌＨＳＡ（１−３６９）の生産は低
収量をもたらし、この生成物は使用された酵母発現系に
おいて不安定であることが示された。

■土　ＨＳＡ（１−４１９） Ｈ５＾（１−４１９）をコードするプラスミドの作製の
ため、ｐＤＢＤ２のＢａｎ＋ＨＩ　　１ｌｉｎｃ　ＩＩ
断片を、アニールされた自己相補的オリゴヌクレオチド
（リンカ−７）ニ リンカーフ ５’ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴ　
　　３’と連結し、そしてこの連結混合物をＢａｍ１ｌ
　ｒにより消化し、そしてその断片をｐＭＡ９１に連結
してｐＤＢＤ４を得た（第７図）。コの構成物中、ｐＤ
ＢＤ２の１Ｉｉｎｃ１１部位（１２５６、第３図）が４
１９位のセリンのコドンの第二塩基の後に平滑末端を生
じさせ、そしてこのコドンはリンカ−６によって再生さ
れ、このコドンの後に終止コドン、ＨｉｎｄＨ［部位及
びＢａｍ１ｌ　１部位がくる。

Ｓ、セレビシェ−でのプラスミドｐＤＢＤ５によるＩＩ
ｓ＾（１−４１９）の発現は正しいアミノ末端配列（Ａ
ｓｐＡｌａ−旧Ｓ・・・）を有する分子を生成したがＣ
００Ｈ−末端残基はセリンではなくロイシンであった。

システィン３９２に結合するはずである共有結合標識を
用いてＣ００Ｈ−末端ペプチドを単離する試みも不成功
であった。ＨＳＡ（１−４１９）のＣ００１１−末端の
部分の蛋白質分解が起ったと結論された。このことは、
酵母において同様にして生産された全長ＩＩ　Ｓ　Ａの
同じ部位で小比率での蛋白質分解が観察される（Ｓｌｅ
ｅｐ等、１９８８）　ことと−敗する。

、ｉ郊１．５１）１ｓＡ（１−ｎ　　７””ス（７）実
験室発酵槽に、その名目有効容積の半分まで初期回分培
地を入れた。この培地は５０ｄ／Ｆ、塩混合物（１１４
ｇ　／　１のにｏｚｐｏｎ、１２　ｇ／１．のＭｇ５Ｏ
，，３，０ｇ／ｌのＣａＣｌ　２　・６８ｚＯ及び２．
０ｇ／ｎのＮａｚＥＤＴＡを含有する）；１０ｍ１／ｌ
の微量元素溶液（３ｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７１１ｚＯ１
１０ｇ／ｌのＦｅ５Ｏａ・７１ｈＯ１３，２ｇ　／　１
．のＭｎ５Ｏａ　　・４ＨｚＯ１７９ｍｇ／Ｉ！、のＣ
ｕ５ＯＪ・５Ｈｇ８　　１．５　ｇ　／　ｌのＨ２ＢＯ
：ｌ　、０．２　ｇ　／２のＫｌ、０．５　ｇ　／　ｉ
のＮａｚＭｏＯ６・２ＨｚＯ１０，５６ｇ／ＩｌのＣｏ
Ｃｊ２　ｚ　　’　６１１２０及び１５ｍＲ／ｌのｌｌ
□Ｐｏ、を含有する）；２０ｇ／ｉ！、のシュークロー
ス；５０ｍ１／１．のビタミン混合物（１，６ｇ／ｆの
パントテン酸カルシウム、１．２ｇ／Ｉ！、のニコチン
酸、１２．８ｇ　／　ｌのイノシトール、０．３２　ｇ
　／　１２のチアミン１１　Ｃ／、８■／Ｉ！、のピリ
ドキシンＨＣｆ及び８　ｍｇ／ｌのビオチンを含有する
）を含有する。■００戚／１の前記塩溶液、２０ｄ／ｆ
ｆの微量元素？８液、５００ｇ／ｊ！のシュークロース
及び１００ｍ１／ｌのビタミン溶液を含有する同容量の
フィード培地を、計量ポンプによって前記発酵槽に連結
された別の容器に保持した。

例２からのプラスミドｐＤＢＤ３により前記の様にして
形質転換されたサッカロミセス・セレビシエーを前記の
発酵槽に接種した。アンモニア又は硫酸の自動添加によ
りｐＨを５．７±０．２に維持し、温度を３０°Ｃに維
持し、そしてｌ　ｖ　／　ｖ　／ｍｉｎの空気流速にお
いて空気飽和の２０％以上の溶存酸素濃度（ＤＯＴ）を
与えるように撹拌速度を調整した。最初の基質が消費さ
れた時、計量ポンプのスイッチを入れ、約０．１５ｈ″
１の増殖速度を維持した。

許容される最小値である空気飽和の１５％より低くＤＯ
Ｔを下げることなくポンプ速度を増加することができな
い最高値に撹拌速度が達するまでこの増殖速度を維持す
るようにポンプ速度を増加する。発泡センサーに応答し
てＰＰＧ２０００が添加される。フィード溶液の５０％
以上が添加されるまでなにも添加されない。添加の最終
レベルは０．２ｇ／！である。

＋１ｓＡ（１−３８７）は培地中に分泌される。

形　ＨＳＡ　１−３８７へのビｉルピンの　入ＵＳＡ（
１−３８７）へのヘム代謝産物ビリルビンへの結合を蛍
光増強法（Ｂｅａｖｅｎ及びＧｒａｔｚｅｎ（１９７３
）Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、３３，５００−５１０）により行
った。第８図が示すところによれば、蛋白質／ビリルビ
ン比率の関数としてのビリルビン蛍光の増強はｌＨＳＡ
（１−３８７）及び臨床グレードのＨＳＡについて区別
できない。

ＨＳＡ及びビリルビンの相互作用は蛋白質のコンホーメ
ーションに対して非常に敏感であり（Ｈｅａｖｅｎ及び
Ｇｒａｔｚｅｎ　、前掲）そしてこれらの結果は、ｌＨ
ＳＡ（１−３８７）により代表されるＩ　Ｓ　Ａの領域
のコンホーメーションの大きな変化はより短い分子の発
現の間に生じなかったことを示している。

桝工　１１ＳＡ（１−３８７）の暖吸星執１１５Ａ（１
−３８７）を０．９　ｖ　／　ｖ％塩溶液に、５４ｍｇ
／　ｍｌの最終蛋白質濃度まで濃縮した。この濃縮物の
稀釈物を臨床グレードのＨＳ　Ａ　（１００ｍｇ／　ｍ
ｌ　）の稀釈物と共にコロイド浸透圧計において浸透圧
効果について比較した。第９図が示すところによれば、
所与の蛋白質濃度において、ｌＨＳＡ（１−３８７）は
全長［Ｉ　Ｓ　Ａのコロイド浸透圧に比べて約３分の１
高いコロイド浸透圧を与えた。重要なことには、蛋白質
濃度に伴うコロイド浸透圧の上昇は血漿濃度である５　
ｖ　／　ｖ％までの範囲にわたっておよそ直線的であっ
た。

このことは、ＨＳＡ（１−３８７）が有用な実用臨床濃
度範囲において自己会合しないことを示している。

ｌ　庄■■盟剋 本発明のｌＨＳＡ（１−ｎ　）プラスは、種々の（典型
的には２％〜１７％の、例えば３％、１３％又は１７％
の濃度で、２０ｍｆｔ〜５００ｄの範囲の大きさの容器
に入れることができる。

投与用溶液は無菌であり、そしてパイロジエン不含であ
る。３％溶液は浸透圧的にヒトの血漿に類似する。全蛋
白質の９６％以上が好ましくはアルブミンである。ナト
リウムイオン含量は一般に１３０＝１６０ｍｍｏｆｆ　
／　ｌであり、そしてカリウムイオン含量は一般に２　
ｍｍｏｊ！　／　１未満である。ｐＨは６．９±０．５
に調整される。クエン酸塩の濃度は一般に２０　ｏ＋ｍ
ｏｊ？　／　１未満であり、そして全く存在しなくても
よい。

安定剤、例えば、ｌＨＳＡ（１−ｎ　）プラスｇ当り０
、１６ｍＭナトリウムアセチルトリプトファネート、又
は０．０８ｍＭナトリウムアセチルトリプトファネート
及び０．０ＢｒａＦＩカプリル酸ナトリウムを用いるこ
とができる。

丞二」跋 Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ、　Ｄ、　（１９７８）　、Ｎａ　ｔ
ｕｒｅ、２７５．１０４−１０９゜Ｂｒｏｗｎ、Ｊ、Ｒ
，及び５ｈｏｃｋｌｅｙ、　Ｐ、　＋　（１９８２）　
ｉｎ″Ｌｉｐｉｄ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ
ｉｏｎｓ’よ、２５−６８．　）！集１１ａｙｅｓ。

０、及びＪｏｓｔ、Ｐ、Ｃ。

１１ｉｎｎｅｎ、Ａ、等（１９７８）　、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ＋互、　１９２９−
１９３３゜ Ｌａｗｎ＋Ｒ，Ｍ、　　等（１９８１）、Ｎｕｃｌ、八
ｃｉｄ、Ｒｅｓ、　　　９．６１０３−６１１４゜ Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、等（１９Ｂ２）、Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：八１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｎ
＋ａｎｕａ１．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　ｌ１ａｒｂｏｒ、　ニューヨーク。

Ｍｅｌｌｏｒ、Ｊ、等（１９８３）　、Ｇｅｎｅ、　２
４．１−１４゜Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、（１９８３）、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｎ＋ｏ１．１０１．２０−７８
゜Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、Ｊ、等（１９８３）、Ｇｅｎｅ
、２６．１０１−１０６゜Ｓａｎｇｅｒ＋Ｆ、等（１９
７７）　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ。

７４．５４６３−５４６７゜ ５Ｉｅｅｐ、Ｄ、Ｂｅ１ｆｉｅｌｄ、Ｇ、Ｐ、及びＧｏ
ｏｄｅｙ、八、Ｒ，（１９８８）Ｙｅａｓｔ　　４．５
１６８゜ 以下余白

【図面の簡単な説明】

第１図は、天然Ｉ　Ｓ　Ａを最も代表するものと現在考
えられているアミノ酸配列を示し、ＨＳＡ（１−ｎ）の
代替され得るＣ−末端が枠で囲んである。 第２図は、成熟ＩＳＡをコードするＤＮＡ配列を示す。 第３図は、ｎ＋ＨＯＢ１６の作製を模式的に示す。 第４図は、ｐＨ０Ｂ３１の作製を模式的に示す。 第５図は、完全なｌ３Ａに比べて（７）ＩＩｓＡ（１−
３８９）の収量の増加を示ずロケッ］・電気泳動図であ
る。 レーン！〜４は完全なＩ　Ｓ　Ａコード領域を含有する
プラスミドにより形質転換されたＳ、セレビシェ−ＡＩ
＋２２からの培養上清についての結果であり、レーン５
〜８はｌＨＳＡ（１−３８９）をコードするプラスミド
についての同様な結果を示す。 第６図は、ｐＤＢＤ３の作製を模式的に示す。 第７図は、ｐＤＢＤｌｌの作製を模式的に示す。 第８図は、ＨＳＡ（１−３８７）及び臨床用Ｈ３Ａ（７
）、蛋白質／ビリルビン比率とビリルビン蛍光強度との
関係を示す。 第９図は、ｌＨＳＡ（１−３８７）及び全長ＩＳＡの、
蛋白質濃度とコロイド浸透圧との関係を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、成熟ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基ｎまでのＮ
   −末端部分（ｎは３６９〜４１９であるが３８７ではな
   い）を含んで成るポリペプチド、及びその変異体。 ２、前記ポリペプチドがＨＳＡ（１−３７３）、ＨＳＡ
   （１−３８８）、ＨＳＡ（１−３８９）、ＨＳＡ（１−
   ３９０）及びＨＳＡ（１−４０７）並びにこれらの変異
   体から選択されたものである、請求項１に記載のポリペ
   プチド。 ３、請求項１又は２に記載のポリペプチドを含んで成る
   医薬組成物。 ４、前記ポリペプチドがＨＳＡ（１−３８７）又はその
   変異体である請求項３に記載の組成物。 ５、成熟ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基ｎまでのＮ
   −末端部分（ｎは３６９〜４１９である）を含んで成る
   ポリペプチド又はその変異体ポリペプチドをコードする
   ヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列はその
   ３′末端において成熟ヒト血清アルブミンのアミノ酸残
   基ｎ＋１から５８５までをコードする他のヌクレオチド
   配列に連結されていないことを特徴とする、ヌクレオチ
   ド配列。 ６、ｎが３８７である、請求項５に記載のヌクレオチド
   配列。 ７、請求項５又は６に記載のヌクレオチド配列がその５
   ′−末端においてＨＳＡのプロ−、プレ−もしくはプレ
   −プロ−位、メチオニン残基又は他のリーダー配列に対
   応するペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結さ
   れているヌクレオチド配列。 ８、請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列か
   ら成るヌクレオチド配列を含んで成るベクターであって
   、選択された宿主の形質転換及び該宿主中での発現のた
   めに適当な発現ベクター。 ９、請求項８に記載のベクターにより形質転換された宿
   主生物。 １０、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒ
   ｏ−ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項
   ９に記載の宿主生物。 １１、請求項９又は１０に記載の宿主微生物を適切な条
   件下で培養することを含んで成る、前記ヌクレオチド配
   列によりコードされたポリペプチドの製造方法。 １２、請求項１に記載のポリペプチドを含んで成る、微
   生物の増殖用実験室培地。 １３、ｎが３８７である、請求項１２に記載の培地。