JPH0220067B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はそのコアの高い屈折率が光散乱測定に
高い感度を与えそしてそのシエルが生物学的関心
のある化合物と共有結合的に結合しうる官能基を
有しているようなシエル−コア粒子より成る新し
い粒子試薬に関する。特に生物学的関心ある化合
物は抗体または抗原でありそしてこの粒子試薬は
光散乱イムノアツセーに使用すべく意図されてい
る。 凝集反応は、広範囲の種々の細菌、細胞表面抗
原、血清蛋白またはその他の臨床的に興味あるア
ナライトのための視覚的（半定量的）および定量
的アツセーに長い間使用されて来た。凝集は二価
抗体と多価の関心ある抗原との間の反応から生じ
て凝集物を生成させ、そしてこの凝集物は種々の
方法で検出および／または測定することができ
る。同様に、同じ反応は相当する抗原の添加によ
り生ぜしめられる凝集反応によつて特異抗体を検
出するのに使用することができる。 大きな交叉結合凝集塊を生成させるためには、
抗原上の反応性部位の数は２以上でなくてはなら
ない。従つて、一価ハプテンの検出が所望される
場合にはその反応スキームは次のように修正され
た。すなわち、多価形態の抗原例えばハプテン−
蛋白コンジユゲートを生成させ、そして試料中に
存在するハプテンを抗体の有効結合部位に対して
多価形態のものと拮抗させそれによつて凝集量を
減少させる。この技術は凝集阻害と呼ばれてい
る。 多価形態のハプテンの製造は当技術分野では古
いものである。往々にしてこのハプテンは免疫源
の製造においてなされるようにキヤリア蛋白に結
合されている。反応の化学量論性を調整して蛋白
質分子当り３またはそれ以上のハプテンを置くこ
とができる。正確な数はその物質が使用される所
定のアツセーの要求によつて決定される。 凝集またはその阻害の視覚または機器による検
出の感度の増大は可溶性蛋白または蛋白コンジユ
ゲートではなくて担体としての粒子試薬の使用に
よつて達成することができる。例えば鶏卵アルブ
ミンに対する抗血清は鶏アルブミン自体を沈殿さ
せるよりも、コロジオン粒子上にコーテイングさ
せた鶏卵アルブミン沈殿において2000倍もより感
受性であることが示された〔「Immunology」第
394頁（1974）〕。 抗体粒子試薬もまた知られている。そのような
試薬製造の一般的方法は、抗体を適当な吸着媒の
表面に吸着させることによる。ポリスチレンベー
スラテツクス粒子がこの目的に対して広く使用さ
れている。しかしながらこれら試薬は保存または
使用の間に脱着を受けて試薬の性質の変動を導
く。これは次いでアツセーの感度および再現性に
悪影響を与えうる。 この脱着の問題を克服するために粒子表面に生
物学的関心ある化合物を共有結合的に結合させる
ことによつて粒子試薬を製造することができる。
ポリスチレン重合体を変性させて、共有結合的蛋
白質結合をなしうるような官能基を包含させる。
米国特許第4064080号明細書は末端アミノフエニ
ル基およびそれに蛋白を結合せしめたスチレン重
合体を開示している。米国特許第4181636号明細
書は水溶性活性化剤を介して免疫学的に活性な物
質にカツプリングさせたキシル化ラテツクス重合
体および凝集試験における診断用薬剤としてのそ
れらの使用を開示している。米国特許第4210723
号明細書は粒子表面に遊離エポキシ基を有する
0.15〜1.5μｍ直径のシエル−コアラテツクス重合
体粒子およびこれらエポキシ基を介しての蛋白の
カツプリングを記載している。 免疫学的に活性の物質の後での結合のためにそ
の他の重合体系が開発された。米国特許第
4264766号明細書は0.01〜0.9μｍの粒子サイズを
有しそして活性基例えば水溶性ポリヒドロキシ化
合物を共有結合的に結合させることのできるカル
ボキシルおよびアミノ基を有するラテツクス重合
体を開示している。活性化剤例えばカルボジイミ
ドの使用によつて免疫学的に活性な物質はこのラ
テツクス粒子／ポリヒドロキシ化合物担体に結合
されて診断的に有用な試薬を生成させる。 光散乱凝集アツセーに使用するための高い成度
を有しそして便利には生物学的関心ある化合物を
粒状担体に共有結合的に結合させることにより製
造できる安定な粒子状試薬に対する需要が存在し
ている。 本発明の粒子試薬は高い屈折率を有し、そして
本質的に (A) 内側コアと外側シエルとを有し、その際内側
コアがナトリウムＤ線の波長で測定して1.54以
下でない屈折率を有しそして外側シエルが (1) エポキシ、カルボキシ、アミノ、ヒドロキ
シおよびアルデヒドより成る群から選ばれた
生物学的に関心ある化合物と反応しうる官能
基を有するエチレン性不飽和単量体、 (2) 随意にその他のエチレン性不飽和単量体、
および (3) 外側シエルの10重合部を越えない内側コア
の単量体 の重合体であり且つこの外部シエルは前記内側
コアの存在下での重合によつて製造されるもの
である0.03〜0.1μｍの大約の直径範囲を有する
重合体粒子と、 (B) 前記重合体粒子が共有的に結合せしめられて
いる生物学的に関心のある化合物、その抗原ま
たはその抗体 とからなる。 生物学的関心のある化合物は直接または蛋白物
質を介して重合体粒子に結合させることができ
る。 本発明の生物学的に興味ある化合物を測定する
ための方法は、 (A)(1) 本質的に (a) 内側コアと外側シエルとを有し、その際
内側コアがナトリウムＤ線の波長で測定し
て1.54以下でない屈折率を有しそして外側
シエルが (i) エポキシ、カルボキシ、アミノ、ヒド
ロキシおよびアルデヒドより成る群から
選ばれた生物学的に関心ある化合物と反
応しうる官能基を有するエチレン性不飽
和単量体、 (ii) 随意にその他のエチレン性不飽和単量
体、および (iii) 外側シエルの10重量部を越えない内側
コアの単量体 の重合体であり、且つこの外部シエルは前
記内側コアの存在下での重合によつて製造
されるものである0.03〜0.1μｍの大約の直
径範囲を有する重合体粒子と、 (b) 前記重合体粒子が共有的に結合せしめら
れている生物学的に関心のある化合物また
はその抗体 とからなる高屈折率を有する粒子試薬、 (2) 生物学的に関心のある化合物を含有してい
ると推定される液体、および (3) 凝集剤 を培養すること、そして (B) 凝集から生じた増大した粒子サイズを分光分
析的に測定すること の各段階を包含する。 蛋白測定のための本発明の方法は適当な補体的
粒子試薬を使用して凝集剤なしで直接実施するこ
とができる。 本発明は感度の高い光散乱イムノアツセーにお
ける使用に最適の性質を有する新規な粒子試薬に
関する。この粒子試薬は(1)高い屈折率のコア物質
より形成されること、(2)生物学的関心のある化合
物と共有結合的に結合しうるシエル物質を有して
いること、そして(3)イムノアツセーにおける至適
感度のための小形粒子サイズのものであることに
よつて、イムノアツセー感度を最大とすべく構成
されている。 粒子懸濁液の光散乱性はいくつかの変数、最も
重要には粒子サイズ、コアおよび懸濁媒体の屈折
率、および測定に使用される光の波長に依存す
る。すなわちコア物質、粒子サイズおよび凝集反
応検出用波長の選択はすべてアツセーの感度至適
化における重要なフアクターである。これらフア
クターは使用される光散乱検出手段のタイプによ
つて決定することができる。凝集反応の視覚的観
察の間、約400〜650nmの間の広い波長のバンド
が使用される。光散乱応答性はこの波長範囲にわ
たつて変動するのであるから視覚的観測はある粒
子サイズおよび屈折率に対する至適波長を選択す
るよりもより低い感度の多くの波長の効果を平均
化させる結果となる。光の波長に比べて小さい粒
子に対して散乱は波長の４乗の逆数で増大しそし
てその大きさは屈折率に依存する。光の波長が粒
子の吸収バンドに近づいた場合、屈折率は増大し
そして従つて光散乱性は散乱エレメントの光学的
分散にもまた敏感となりそして波長函数は４乗を
越えうる。 ある与えられた測定波長における粒子サイズ変
化の濁度計による検出のためには、注意して粒子
サイズおよび屈折率を選ぶことが重要である。そ
の理由は濁度計シグナルはピークにおいてはほと
んどかまたは全く感度のない二重値応答を示しつ
つ最大値を通過するからである。更に勾配感度は
ピークの小粒子サイズ側において大なる側におけ
るよりも大であり、そしてこれは媒体に対する粒
子屈折率比が増大するにつれて上昇する。 これらの理由の故に、高い感度のためには、短
波長検出を伴なう高い屈折率の小粒子が好まし
い。蛋白およびその他の成分による光吸収の故
に、血清中の試料測定に対しては紫外部には実際
的限界が存在する。すなわち便利な波長は約
320nm以上のものである。より長い波長はより低
い感度をもつて使用することができる。小形粒子
すなわち約0.1μ以下の直径のものが上昇した傾斜
感度および反応速度の両方の故に好ましい。安定
性および合成の便利さの理由の故に、約0.03μｍ
の粒子サイズが好ましい。一般に0.03〜0.1μｍの
粒子サイズ範囲を本発明の粒子試薬に使用するこ
とができる。より短い例えば340nmの波長は例え
ば400nmのより長い波長よりも一層大なるシグナ
ル差を与える。 比濁検出のためには至適感度は粒子サイズおよ
び波長のみならず測定角度にも依存しうる。比濁
計は関連するビームからある角度で散乱される光
の測定を意味する。至適感度のための粒子サイズ
は角度依存性ならびに波長依存性を有している。 凝集反応のその他のタイプの光乱測定としては
粒子計算、準弾性的光散乱、自動補正スペクトロ
スコピーおよび粒子の不対称または分極の測定が
あげられる。これらタイプの測定は粒試薬に対し
て異つた制限を与える。 しかしながらすべてのタイプの測定において選
ばれた波長における粒子の屈折率がより高い程、
光散乱シグナルはより高い。 本発明の粒子試薬使用の免疫反応の測定の好ま
しい方法は、濁度（turbidity）によるものであ
る。その理由はそれが臨床実験室で一般に利用可
能な分光光度計以外の特別の装置を何も要求しな
いからである。この分光光度計は凝集反応から生
じた粒子サイズ上昇に由来する吸収の上昇を測定
する。この上昇した吸収はアナライトにより生ぜ
しめられた凝集の直接の尺度でありまたはこれは
アナライトにより生ぜしめられた凝集阻害の関接
的尺度である。凝集の間に生ずる濁り変化を至適
化させるためには、注意して粒子サイズを選択す
ることが重要である。 凝集反応の間、有効粒子サイズは上昇する。従
つて感度測定のためにはある与えられた粒子サイ
ズ変化に対するシグナル変化が至適となるように
波長を選ぶことが重要である。 凝集反応の濁度分析での検出のために屈折率の
重要性の故に、コア物質は所望のアツセイ感度の
ために許容しうるシグナル変化を生成させるもの
に限定される。高濃度（μｇ/mlの範囲）のアナ
ライトに対してはその選択は臨界的ではない。し
かしナノグラム１ml範囲のアナライトに対して
は、高い屈折率を有する粒子が必要である。すな
わち高い芳香化度および原子量置換基を有するコ
ア重合体が、脂肪族重合体よりも好ましく、そし
て一般に高い屈折率の重合体が低い屈折率の重合
体よりも好ましい。 重合体粒子の内側コアは高い屈折率を有する大
なる物質群から選ぶことができる。好ましいもの
は最終粒子サイズが制御可能でありかつ実質的に
均一となるような方法での乳化重合により製造し
うる物質である。重合体粒子の内側コアに使用さ
れる典型的重合体は1.54以上の屈折率（NaD線、
569nｍにおいて）を有しておりそしてこれらは
表１に列記されている。屈折率は波長の函数なの
であるから、散乱性は測定波長に依存する。一般
に屈折率はより短い波長においてより大である。

【表】

【表】

【表】 ド樹脂

【表】 前記の重合体のすべてを本発明の粒子試薬用内
側コアとして使用できるわけではない。その理由
はコア単量体物質の選択に適用されるべきその他
の基準が存在するからである。例えばセルロース
は均一粒子サイズ球体として容易には製造されな
い。縮合重合体もまた有用ではない。その理由は
その重合工程は乳化重合により得ることのできる
タイプの球形粒子を生じないからである。いくつ
かの熱可塑性重合体例えばポリ（オキシエチレン
−オキシテレフタレート）およびいくつかの尿素
−ホルムアルデヒドタイプの熱硬化性樹脂は適当
ではない。 関心ある単量体は高い屈折性を付与する置換基
例えばハライド、芳香族、複素環、不飽和または
炭素環基の他にビニルまたはアリル基を含有する
ものである。 本発明の粒子試薬の製造のために有用な重合体
粒子は優先的に乳化重合により製造することがで
きる。段階的乳化重合はn_D＝1.54以下ではない所
望の屈折率に近いコア／シエル重合体を導きう
る。所望の屈折率の重合体を得るためには、シエ
ル重合体が重合体粒子の約10重量部を越えないこ
とが好ましい。 重合体粒子の粒子サイズ制御のための便利な方
法は第一に種乳剤を製造することであるがそのサ
イズは使用される表面活性剤の量によつて制御す
ることができる。種乳剤の製造の後、制御された
速度で追加の単量体および表面活性剤を加えて種
乳剤中の粒子サイズを増大させることができる。 重合体粒子の外側のシエル重合体は、生物学的
関心ある化合物と反応しうる官能基を有する広範
囲のエチレン性不飽和単量体から製造することが
できる。場合により外側シエルにはまたその他の
エチレン性不飽和単量体を含有させることができ
る。コアに対するシエル重合体の結合は、コア重
合体中の残存エチレン性不飽和基への官能性単量
体のグラフト重合により達成することができるし
または官能性単量体をコアのまわりに重合させて
隣接シエルを生成させることができる。好ましい
単量体としてはエポキシ基含有のもの例えばグリ
シジルメタクリレート、グリシジルアクリレー
ト、ビニルグリシジルエーテルおよびメタアリル
グリシジルエーテルがあげられる。その他の官能
基としてはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ
およびアルデヒドがあげられる。 実質的完了までコア単量体の変換を実施してそ
の結果シエル重合体が未知の組成の共重合体でな
くてむしろ既知組成のホモ重合体または共重合体
であるようにすることが好ましい。重合の終りに
コア乳剤の温度を約95℃まで上昇させることによ
つて98％以上の変換を達成することができる。そ
の表面が未知の組成の共重合体である粒子を生成
させる可能性を更に低下させるために、シエル単
量体をバツチ的ではなく徐々に加えることができ
る。そのような方法においては、シエル重合体形
成の初期の段階の間に残存コア単量体は消費され
うる。使用される単量体がエポキシ基含有のもの
である場合には、シエル重合体はホモ重合体であ
ることが好ましいが、しかし実際問題として外側
シエルの10重量部までの内側コア単量体を存在さ
せることができる。 ヒドロキシル、アミノ、アルデヒドまたはカル
ボン酸基を含有するシエル単量体の場合には、水
溶性重合体の形成を除外するように注意が払われ
なくてはならない。すなわち例えばアクロレイン
またはメタクリル酸を単独で使用してホモ重合体
シエル構造を生成させることはできない。しかし
ながらこれらはその他の単量体と共重合させて水
不溶性重合体粒子を生成させることはできる。 また後でそれに代る化学技術により処理して外
側シエル重合体を変性して共有結合しうる表面を
生成させることもまた可能である。例えばエポキ
シ基を加水分解して蛋白質中のアミン基に対して
カツプリング剤として作用しうるシアノゲンブロ
ミドと反応しうるジオール化合物を生成させるこ
とができる。 アルデヒドを直接アミンと反応させてシツフ塩
基を生成させこれを次いで還元させて共有結合を
生成させることができる。あるいはまた、アルデ
ヒドを酸化させて酸を生成させ、そしてカルボジ
イミドを以後のアミンとの反応に使用してアミド
結合を生成させることができる。 外側シエルは好ましくはホモ重合体である。し
かしこれは外側シエルの重量基準で10部以下、好
ましくは５部以下そして更により好ましくは２部
以下の内側コアの単量体を含有しうる。これら単
量体は内側コア重合からの残存単量体でありう
る。 本発明の粒子試薬は数種の異つた機能的シエル
物質を含有しうる。好ましいものは、生物学的関
心ある化合物例えばハプテン、抗体、蛋白質また
はハプテン−蛋白コンジユゲートと共有結合形成
するために便利に使用しうるエポキシ基を含有す
る。そのような反応は本発明の粒子試薬を生成さ
せる結果となる。 粒子試薬の製造は次のようにして実施すること
ができる。ハプテンまたは蛋白性物質を例えば重
合体粒子表面に吸着させ、次いで官能基例えばエ
ポキシド基を、適当なPH条件下にハプテンまたは
蛋白物質の補合的官能基と反応させることができ
る。次いですべての未反応物質を粒子試薬から分
離させる。反応条件は粒子の実質的交叉結合が生
じない筈のものである。実質的な交叉結合は不均
一試薬粒子および以後のイムノアツセーの間に予
期せざるにごり変化を生成させる結果となる。 蛋白物質を介して共有結合的に結合された生物
学的関心ある化合物を含有する粒子試薬の製法に
は２種の方法が存在しうる。生物学的関心のある
化合物例えばハプテンを第一に担体蛋白に結合さ
せそして次いで重合体粒子に結合させる。あるい
はまた蛋白質をまず重合体粒子に結合させそして
次いでハプテンをこの蛋白に結合させることがで
きる。第２のアプローチは生物学的関心のある
種々の化合物をそれらに結合させた粒子試薬の合
成に対して同一の蛋白−粒子試薬を使用するとい
う利点を有している。 ハプテンまたは蛋白質物質による重合体粒子の
表面被覆すなわち生物学的関心のある化合物に対
する重合体粒子の比は反応時間、生物学的関心あ
る化合物の不活性希釈剤による希釈、または粒子
分散を助ける添加剤により変化させることができ
る。完全な被覆は最も迅速な凝集速度を生成させ
うるけれども、より少ない表面被覆はアツセー感
度を上昇させるにあたつて重要でありうる。 得られる粒子試薬を更にバツフアー、血清成分
および表面活性剤を含有しうる実質的に水性の媒
体中に懸濁させて光散乱イムノアツセーにおいて
使用するための単分散粒子試薬を生成させること
ができる。 本発明は更に生物学的関心ある化合物の測定の
ために感度の高い光散乱イムノアツセーにおいて
使用するための免疫学的に活性な安定な粒子試薬
に関する。アツセーの対象は生物学的流体、細胞
および組織抽出液中のそれに対する免疫学的対応
反応成分が産生されたものでありうる広範囲な
種々の物質を包含する。生物学的関心ある化合物
としては血清、血漿、唾液、尿または乳蛋白、薬
物、ビタミン、ホルモン、酵素、抗体、多糖体、
細菌、プロトゾア、真菌、ビールス、細胞および
組織抗原およびその他の血液細胞または血液流体
物質があげられる。特に興味のあるのは、疾患の
状態および種々の薬物の評価のためにその定量的
測定の要求されている物質である。 このイムノアツセーはアナライトのタイプおよ
び要求される感度によつて種々の方法で実施する
ことができる。 比較的高濃度のアナライト例えばある種の血清
蛋白に対しては適当な抗体試薬を直接粒子強化濁
度計イムノ沈降アツセイにおいて使用することが
できる。本発明の方法は通常のイムノ沈降技術に
比べて上昇した検出度、試薬コストの相当する節
約を与え、そしてこれはより少量の患者試料体積
の使用を可能ならしめる。逆に関心ある循環性抗
体の検出のためには対応反応性抗原または抗体粒
子試薬を直接アツセイにおいて使用することがで
きる。 本発明の阻害イムノアツセー法はまた、粒子試
薬の他に二官能性または多官能性の薬剤を要求す
る。これらは以後本明細書中では粒子試薬の凝集
を生ぜしめるための凝集剤として参照される。生
物学的関心ある化合物によつて阻害されうるもの
はこの凝集である。この凝集剤は生物学的関心あ
る化合物に対する抗体または前述したように生物
学的関心ある化合物の抗体に共有結合的に結合さ
れた重合体粒子に基く粒子試薬でありうる。これ
ら凝集剤はこの方法において使用される粒子試薬
が生物学的関心ある共有結合的に結合された化合
物を含有しているような場合に使用される。 凝集剤はまた生物学的関心ある化合物と蛋白と
の多価コンジユゲートでありうる。そのようなコ
ンジユゲートは、本発明の方法に使用される粒子
試薬が生物学的関心ある化合物の共有結合的に結
合した孔体を含有している場合に使用される。 ハプテンの測定のためには、いくつかの異つた
アツセー構成を使用することができる。一つのそ
のような構成においては、抗原性粒子試薬（ハプ
テン−粒子またはハプテン−蛋白−粒子試薬）を
製造することができ、そして生物学的関心ある化
合物によるこれら粒子の抗体との反応の阻害が測
定される。この反応は粒子と患者ハプテンとの間
の抗体に対する直接拮抗反応によるか、またはハ
プテンと抗体との一連の反応およびそれに続く抗
原粒子試薬の添加により行われうる。 ハプテンに対するその他のアツセー構成は可溶
性多ハプテン−蛋白コンジユゲートとの抗体粒子
試薬の凝集はアナライトにより阻害される抗体粒
子試薬を利用するものである。そのようなアツセ
ーもまた拮抗的または順次的様式で実施すること
ができる。更にその他のアツセーにおいては同一
または異つたサイズの抗体および抗原粒子試薬の
両方を存在させることができ、そしてハプテンに
よる阻害を拮抗的または順次的（一連）様式で実
施することができる。 本発明の方法で起る凝集反応は凝集促進剤の存
在によつて促進させることができる。そのような
促進剤はポリエチレングリコールまたは表面活性
剤例えばドデシル硫酸ナトリウムでありうる。こ
の後者はジゴキシン−HSA−粒子試薬を使用す
るジゴキシンアツセーにおいて特に有用である。 以下の実施例は本発明を説明する。 例 １ ポリスチレン／ポリグリシジルメタクリレート
シエル−コア重合体粒子の製造 (a) 撹拌機およびサーモスタツトつき加熱マント
ルを付した３丸底フラスコが重合に使用され
る。その重合は窒素雰囲気中で70℃で実施され
る。６ｇの「ガフアク（Gafac）」RE610（GAF
社より入手可能な陰イオン表面活性剤）および
２ｇの過硫酸カリウムを含有する２の水に50
mlのスチレンを加えることによつて種乳剤が製
造される。半時間の後、400mlのスチレン、４
mlのアリルメタクリレートおよび1.5ｇのエア
ロゾルOT−100（ジオクチルナトリウムスルホ
サクシネート、アメリカン・シアナミド社より
入手可能）より成る単量体供給物の添加を４
ml／分の速度で開始する。供給の完了後、乳剤
を70℃に１時間保持してスチレンの完全な変換
を確実ならしめる。最終固体分含量は15.9％で
あり、コアポリスチレン乳剤の粒子サイズ
（546nｍにおける濁度測定により決定）は
0.067μｍであり、そして表面張力〔ド・ノイ
（du Nouy）リング法を使用してテンシオメー
ターにより測定〕は65ダイン／cm²である。 (b) シエル−コア重合体の製造のためには300ml
丸底フラスコが使用される。重合は80℃で窒素
雰囲気下で実施される。200mlのコアポリスチ
レン乳剤（例1a）を0.2ｇの過硫酸カリウムお
よび0.2ｇの無水炭酸カリウムを含有する水50
mlに加え、次いで0.1ml／分の速度で3.9mlのグ
リシジルメタクリレートを加える。45分後この
混合物を冷却させる。最終シエル−コア重合体
は0.069μｍの粒子サイズを有している。 例 ２ ポリスチレン／ポリグリシジルメタクリレート
シエル−コア重合体粒子の製造 (a) 撹拌機およびサーモスタツトつき加熱マント
ルを付した３丸底フラスコが重合に使用され
る。塩基性アルミナを充填されたカラムに通す
ことによつて重合前にスチレンを精製する。重
合は緩徐な窒素流れ下に70℃で実施される。 45mlのスチレン、５mlのエチレングリコール
ジメタクリレート、50mlの30％ナトリウムドデ
シルサルフエート水溶液および２ｇの過硫酸カ
リウムを２の脱イオン水に加えることによつ
て重合を開始させる。この混合物を70℃で20分
重合せしめる。この時点において、粒子サイズ
は0.021μｍでありそしてその表面張力は38.8ダ
イン／cm²である。このことは実質的にすべての
表面活性剤が粒子の安定化に使用されているこ
とを意味する。 次いで徐々に４ml／分の速度で400mlのスチ
レンおよび10ｇの「エアロゾル」OT−100を
加えることによつて粒子を0.043μｍの最終サイ
ズまで生長させる。その最終サイズは初期粒子
サイズおよび添加スチレンの体積に基づいて
0.044μｍであると予測される。 前記で製造された590mlの種乳剤（エマルジ
ヨン）を1.5ｇの過硫酸カリウムを含有する脱
イオン水1510mlに加えそして70℃に加熱する。
この混合物が70℃に達したら340mlのスチレン
および3.4ｇの「エアロゾル」OT−100を４
ml／分の速度で加える。供給が完了した時点で
温度を95℃に0.5時間の間上昇させて単量体の
高い変換を確実ならしめる。乳剤のエーテル抽
出物のガスクロマトグラフイーにより測定した
場合その変換は98.4％完了している。最終コア
サイズは0.070μｍである（初期サイズおよび添
加スチレンの体積から計算される予測値は
0.069μｍである）。 (b) ２ｇの炭酸カリウムおよび２ｇの過硫酸カリ
ウムを含有する200mlの水を前記(a)で製造され
たコア重合体に加え、そして反応温度を80℃に
調整する。50mlのグリシジルメタクリレートを
次いで1.5ml／分の速度で加える。シエル重合
に対して合計で45分を与える。最終粒子サイズ
は0.71μｍであり、そしてグリシジルメタクリ
レート変換率は97.3％である（スチレンと同様
にガスクロマトグラフイー測定を使用）。最終
的にスチレン変換は完全と考えられる。その理
由はクロマトグラフイーによりスチレンは検出
可能ではないからである。 例 ３ ポリビニルカルバゾール／ポリグリシジルメタ
クリレートシエル−コア重合体粒子の製造 蒸留ヘツドおよび機械的撹拌機を付した300ml
丸底フラスコが使用される。0.5ｇの過硫酸カリ
ウム、0.5ｇの燐酸トリナトリウムに水加物およ
び1.5ｇのナトリウムドデシルサルフエートを含
有する水200mlを窒素雰囲気中で70℃に加熱する。
4.5mlのスチレンおよび0.5mlのエチレングリコー
ルジメタクリレートの添加によつて種乳剤を生成
させる。30分後、この種乳剤は0.021μｍの粒子サ
イズおよび8.5のPHを有している。10mlのジクロ
ロメタン中20ｇのビニルカルバゾールおよび１ｇ
の「エアロゾル」OT−100の溶液を次いで0.1
ml／分の速度で加える。それを加えた後直ちにジ
クロロメタンを蒸留により除去する。コア乳剤の
完了後、10mlの水中の0.1ｇの過硫酸カリウムを
加え次いで2.5mlのグリシジルメタクリレートを
0.1ml／分の供給速度で加える。45分を重合に対
して与える。最終粒子サイズは0.041μｍである。
最終固体分含量は10.5％である。 例 ４ ポリスチレン／ポリグリシジルメタクリレート
シエル−コア重合体粒子の製造 (a) 例１(a)の方法を次のように使用する。２ｇの
アゾビスイソブチルアミジン塩酸塩を含有する
水２に、50mlのスチレンおよび２ｇのセチル
トリメチルアンモニウムブロミドを加えそして
30分間重合させる。次いで200mlのスチレンと
２mlのアリルメタクリレートとの混合物を４
mg／分の速度で加える。100mlの添加後そして
再び添加完了した後、0.75ｇのセルトリメチル
アンモニウムブロミドを加える。最終固体分含
量は10.5％でありそして粒子サイズは0.106μｍ
である。 (b) 前記例４(a)で製造された200mlのコア乳剤、
0.2ｇのアゾビスイソブチルアミジン塩酸塩お
よび0.2ｇの酢酸ナトリウム（無水）を10mlの
水に溶解させたものの混合物を窒素雰囲気下に
70℃に加熱する。温度を安定化させた後、３ml
のグリシジルメタクリレートを0.1ml／分の速
度で加える。45分を重合に対して与える。最終
乳剤は4.85ダイン／cm²の表面張力を有してい
る。 例 ５ ゲンタマイシン粒子試薬の製造およびその使用 ５mlの水中の50mgのゲンタマイシンサルフエー
トを、それ以上の沈殿が生成しなくなるまで水酸
化バリウムを加えることにより中和する。この硫
酸バリウムの沈殿を遠心により除去する。この上
澄み液を５mlのポリスチレン／ポリグリシジルメ
タクリレート重合体粒子（例４で製造）および５
mlの0.1％「シエルコゾリン（Schercozoline）」
Ｓ（シエル・ケミカル社から入手可能なステアリ
ン酸からの置換イミダゾリン）懸濁液の水酸化カ
リウムでPH8.5に調整した混合物に加える。この
混合物を75℃に約30分加温し、200mlの水で希釈
しそして混合イオン交換樹脂床を使用して脱イオ
ン化させる。得られる粒子試薬0.4mmを20mlの0.1
％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に加え、次い
で0.3M NaClおよび0.1％SDSを含有する0.020M
ホスフエートバツフアー（PH7.43）0.2mlを加え
る。 別々に人血清、ゲンタマイシン、抗ゲンタマイ
シン（兎抗血清、カレスタツド・ラボラトリーズ
社製品）を、そして抗ゲンタマイシンとゲンタマ
イシンとの混合物を加えることによりそしてその
濁度を測定することによつてこの混合物1.5mlの
免疫学的反応性を試験する。 濁度変化速度として表２に表わされている結果
は、その粒子試薬が免疫学的に活性であることそ
してこれをゲンタマイシンの測定に使用しうるこ
とを示している。

【表】 例 ６ テオフイリンの測定 (a) ８−（３−カルボキシプロピル）−１，３−ジ
メチルキサンチンの製造 ８−置換テオフイリン誘導体である８−（３
−カルボキシプロピル）−１，３−ジメチルキ
サンチンは「Chemical Pathology＆
Pharmacology」第13巻第497〜505頁（1976）
の発表された方法によつて、次のようにして合
成される。グルタル酸無水物（6.8ｇ）および
４，５−ジアミノ−１，３−ジチルピリミジン
−２，６−ジオン（6.2ｇ）を窒素下に15mlの
Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン中で３時間デイーン
スタークトラツプを使用して還流させる。この
混合物を冷却させ、過しそして固体生成物
（3.6ｇ）を水から２回再結晶させる。精製され
た誘導体は254〜255℃の融点および質量スペク
トルにおいてm/e＝266に予想される親イオン
ピークを有している。 (b) 重合体粒子へのテオフイリン誘導体の結合 前記(a)で製造された８−置換テオフイリン誘
導体を次のようにして例１で製造されたポリス
チレン／ポリグリシジルメタクリレート重合体
粒子に直接結合させる。８−（３−カルボキシ
プロピル）−１，３−ジメチルキサンチン（50
mg）および0.6mlのラテツクス（17％固体分）
を0.015M燐酸ナトリウムバツフアー（PH7.3、
50ml）中で１時間加熱させる。混合物のPHを
5.4に調整しそして更に１時間加熱する。次い
でPHを2.3に調整しそして最後の１時間加熱す
る。次いでこの混合物を遠心（80分、40000×
ｇ）し、等容量の0.1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム中に再懸濁させ、再遠心し、そして再び0.1
％ポリエチレングリコール（PEG）6000を含
有する0.015燐酸ナトリウム（PH78）に懸濁さ
せる。次いで試薬を同一のバツフアーに対して
透析する。 (c) テオフイリンの測定 この測定は37℃で「aca 」装置（デユポン
社製品）上で実施される。0.020mlの未知量の
テオフイリンを含有する試料を2.5％(W/V)
PEG6000を含有する0.15Mホスフエートバツフ
アー（PH7.8）4.98mlに加える。0.004mlの兎抗
テオフイリン抗血清（カレスタツド・ラボラト
リーズ社製品）を加え、そして3.5分の培養
（インキユベーシヨン）期間の後、３％固体分
を含有する前記(b)で製造された粒子試薬0.150
mlを添加することにより反応を開始させる。粒
子凝集による濁度上昇は粒子の添加後29秒と46
秒との間の340nｍの吸光差（変化速度）とし
て測定される。表３は血清テオフイリンアツセ
イ用の標準曲線のためのデータを示す。未知試
料について得られた結果をこの曲線に比べるこ
とにより存在するテオフイリン量を与える（テ
オフイリン標準は人血清を使用して水中の既知
濃度のテオフイリン溶液を適当に希釈すること
により調製され、標準からのアツセイ結果は標
準曲線用データを与える）。

【表】 例 ７ 人血清アルブミンの重合体粒子への結合 ここに記載と同様の方法をIgG、種々の薬物お
よび薬物コンジユゲート例えばジゴキシン−
HSA、テオフイリン−HSA、ゲンタマイシン−
HSA、トブロマイシン−HSAおよびサイロキシ
ン−カタラ−ゼコンジユゲートの重合体粒子への
結合に使用することができる。 １mg/mlのHSAを含有する溶液（0.3M NaCl、
0.02Mホスフエート、PH9.7）1.2に、撹拌およ
び超音波処理を行いつつ例１で製造された６mlの
ラテツクス重合体粒子（10％w/v）を滴加する。
この懸濁液を撹拌し、超音波処理しそして加熱す
る（50℃、１時間）。次いでこの懸濁液を７時間
12500rpmでデユポン社「ソーバル（Sorvall）
」型式RC−5B遠心機およびGSローターを使
用して遠心してすべての非結合HSAを除去する。
粒子ペレツトを前記バツフアー中の0.1％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）500ml中に再懸濁させ、
50℃に１時間加熱し、そして同一条件を使用して
再び遠心させる。粒子ペレツトを250mlの0.1％
SDSに再び懸濁させ、超音波処理しそしてSS34
ローターを使用して19500rpmで２時間遠心する。
粒子ペレツトを0.1％HSAを含有する0.15M
NaCl含有の0.1Mグリシンバツフアー（GBSバツ
フアー）（PH7.6）60ml中に再懸濁させそして次い
でSM24ローターを使用して19500rpmで80分遠心
する。粒子ペレツトを最終的にグリシンバツフア
ー化食塩水／HSA溶液60mlに再懸濁させて、可
能性ある以後の生物学的関心ある化合物の共有結
合のためにその表面に結合させた蛋白質を有する
粒子試薬の１％(w/v)懸濁液を生成させる。それ
は４℃で保存される。 例 ８ 牛血清アルブミンの測定 (a) BSAの重合体粒子への結合 20mgのBSA（シグマ・ケミカル社製品、フラ
クシヨンＶ）を、10mlの20mM燐酸ナトリウム
（PH9.7）を伴なう0.3M NaClに溶解させること
によつて2.0mg/mlの牛血清アルブミン（BSA）
溶液を製造する。次いで0.060ml区分量のラテ
ツクス重合体粒子（例１）（14％w/v懸濁液、
0.069μｍ直径）をこのBSA溶液に加え、そし
て50℃で１時間超音波にかける。以後の遠心お
よび超音波処理の条件は使用される体積に応じ
て適当に減少させて例７に与えられている通り
である。 (b) BSAのアツセイ アツセイは2.0mlのバツフアー〔0.15M燐酸
ナトリウム、PH7.8、4.5％(w/v)ポリエチレン
グリコールPEG6000含有〕を含有する3.0mlキ
ユベツトを使用して37℃でキヤリー（Cary）
219分光光度計で実施される。異つた水準の
BSA含有試料0.050mlおよび0.050mlの抗血清
（マイルズ・バイオケミカルズ社製品、抗
BSA、非希釈）をこのキユベツトに加えそし
て５分間培養させ、その後で0.050mlのBSAコ
ーテイングした粒子を包含させる。前記(a)で製
造されたBSA粒子試薬を加えた時のその凝集
程度を340nｍの吸光度変化を追跡することに
よりモニターする。表４は試料中のBSA水準
の上昇によつて凝集速度が阻害されることを示
す。

【表】 例 ９ ハプトグロビンの測定 (a) ハプトグロビンの重合体粒子への結合 0.030ml区分量のポリスチレン／ポリグリシ
ジルメタクリレート重合体粒子ラテツクス（17
％w/v懸濁液、0.076μｍ直径、例１と同様の方
法で製造）を20ｍＭ燐酸ナトリウム（PH9.7）
中に1.0mg/mlの人ハプトグロビン（カルビオケ
ムーベーリング社）を含有する溶液５mlに加え
る。50℃で１時間「ブランソン（Branson）
」型式Ｂ−22−４水溶ソニケーター中で超音
波処理した後、この懸濁液をデユポン社「ソー
バル 」型式RC−SB遠心機中で19000rpmで
で遠心分離させる。２時間後に得られた粒子ペ
レツトを５mlの0.1％(w/v)ドデシル硫酸ナトリ
ウム中に再懸濁させる。更に40分遠心させた後
に生ずるペレツトを５mlの0.2Mグリシン（PH
7.4））中に再懸濁させそして再び遠心する。完
全に粒子を分散させるために「ヒートシステム
ズ・ウルトラソニツクス（Heat Systems
Ultrasonics） 」型式Ｗ−185−Ｆソニケータ
ーを使用して５分間超音波処理することによつ
て最終ペレツトを0.2Mグリシン１ml中に再懸
濁させる。 (b) ハプトグロビンアツセイ アツセイは37℃で2.0mlの0.150M燐酸ナトリ
ウムバツフアー（PH7.8）を含有する3.0ml石英
キユベツトを使用してキヤリー219分光光度計
上で実施される。0.050mlの抗人ハプトグロビ
ン抗血清（カルビオケム−ベーリング社製品）
を、前記バツフアー中に遊離ハプトグロビンを
含有する試料0.040mlと共に37℃で３分間培養
する。その培養期間の後、0.050mlの前記(a)で
製造されたハプトグロビン粒子試薬（0.10％
ｗ／ｖ粒子）を加えそして340nｍの吸光度変化の
初期速度を追跡する。表５はハプトグロビン濃
度の函数としての測定された速度を示す。

【表】 例 10 ゲンタマイシンの測定 (a) 重合体粒子へのゲンタマイシン−人血清アル
ブミンコンジユゲートの結合 50mlの蒸留水中の1.5ｇのゲンタマイシンサ
ルフエート（シグマ・ケミカル社製品）および
1.5ｇ人血清アルブミン（グロブリンなし、シ
グマ・ケミカル社製品）の溶液に6.25ｇのＮ−
エチル−N′−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩を撹拌しつつ加える。溶
液のPHを0.1N塩酸の添加によつて6.0に調整す
る。この混合物を室温に18時間保持し、次いで
15mM燐酸ナトリウムバツフアー（PH7.8）に
対して４℃で透析させる。 次いでこのゲンタマイシン−HSAコンジユ
ゲートをカルボキシメチル化して粒子の非特異
的沈降を阻止する。前記で製造されたバツフア
ー化コンジユゲートを希釈して6Mグアニジン
塩酸塩および0.1Mトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン（PH8.2）を含有する溶液500mlを
生成させる。2.5mlのβ−メチルカプトエタノ
ールを撹拌しつつ徐々に加える。この混合物を
37℃に２時間保持し、次いで撹拌しつつ徐徐に
12.5ｇのヨード酢酸ナトリウム塩を加える。
1N水酸化ナトリウムの添加によつてそのPHを
8.2に再調整する。37℃に２時間置いた後、こ
の生成物を0.30M塩化ナトリウムおよび20ｍＭ
ホスフエートバツフアー（PH7.8）に対して透
析する。すべての沈殿した蛋白は12500rpmで
20分遠心することによつて除去できる。 ゲンタマイシン−HSAコンジユゲートを使
用するゲンタマイシン−HSA−粒子試薬の製
造は例７に記載の方法により実施される。 (b) ゲンタマイシンに対するアツセイ このアツセイは「aca」装置を使用して37℃
で実施される。ゲンタマイシン含有試料0.010
mlを2.5％(w/v)ポリエチレングリコール
（PEG）6000を含有する0.15Mホスフエートバ
ツフアー（PH7.8）4.99mlに加える。兎からの
抗血清すわち抗ゲンタマイシン−BSA（カレス
タツド・ラボラトリーズ社製品）0.015ml（1/2
５０〜1/500最終希釈）を加える。35分間37℃で
培養した後、前記(a)で製造された粒子懸濁液
（１％w/v、0.050ml）を加えて反応を開始させ
る。粒子添加後の29秒と46秒との吸光度の差に
よつて濁度上昇を340nｍで測定する。表６は
このアツセイに対する標準曲線用データを示
す。一方、標準ラジオイムノアツセイ法に対す
る比較は表７に与えられている（ゲンタマイシ
ンの標準は人正常血清中にゲンタマイシンサル
フエートを溶解させ、そして適当な希釈液をつ
くることによつて調製される）。

【表】

【表】 例 11 トブロマイシンの測定 トブロマイシン−HSA−粒子試薬の製造およ
びトブロマイシン（tobramycin）用アツセイは
ゲンタマイシンに対して与えられている方法（例
10）に従つて実施される。表８は血清トブロマイ
シンにより生ぜしめられた凝集（アグルチネーシ
ヨン）の阻害を示す。

【表】 例 12 テオフイリンの測定 (a) テオフイリン−HSAコンジユゲートの製造 蛋白質とのカツプリングに対して必要な８−
置換テオフイリン誘導体は例６(a)の方法により
合成される。 1.6mlのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の
25mgの８−（３−カルボキシプロピル）−１，３
−ジメチルキサンチン（例６で製造）の溶液に
０℃で11mgのＮ−ヒドロキシサクシンイミドお
よび21mgのＮ−エチル−N′−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を加え
る。次いでこの混合物を18時間４℃で撹拌しそ
して次いで０℃で0.05M重炭酸塩バツフアー
（６ml、PH9.0）中の人血清アルブミン（HSA、
120mg）の溶液に加える。得られた混合物を
0.5N NaOHの添加によつてPH9.0に保ちそして
この混合物を４℃に18時間保存する。得られた
コンジユゲートを脱イオン水に対して透析し、
次いで凍結乾燥させる。最終物質の分析は約
20：１のテオフイリンのHSAに対するモル比
を示す。 (b) テオフイリン−HSA−粒子試薬の製造 テオフイリン−HSAの溶液（300ml、２mg/
ml）を0.02M重炭酸塩バツフアー（PH9.7）中
で調製する。次いで例１で製造された重合体粒
子ラテツクス1.8ml（15％固体分）を徐々に撹
拌しつつ加える。この混合物を１時間70℃に加
熱し、次いで遠心（80分、40000×ｇ）にすべ
ての非結合コンジユゲートを除去する。粒子を
等容量の0.1％SDS中に再懸濁させそして再遠
心する。 この粒子試薬を２回遠心および再懸濁させる
ことによつて0.015Mホスフエートバツフアー
（PH7.8）で洗う。最終懸濁液は１mg/mlのHSA
を含有する0.015Mホスフエートバツフアー
（PH7.8）の形である。この容量を調整して１％
（ｗ／ｖ）固体分粒子濃度を生成させる。 (c) テオフイリンアツセイ このアツセイは37℃で「aca」装置上で実施
される。テオフイリン含有試料0.010mlを0.030
mlの0.15Mホスフエートバツフアー（PH7.8）
で希釈しそしてこれを2.0％(w/v)PEG6000をも
含有する4.96mlの同一ホスフエートバツフアー
に加える。0.1％HSAを含有する0.15Mホスフ
エートバツフアー（PH7.8）0.040mlで希釈した
0.010ml兎抗テオフイリン抗血清（カレスタツ
ド・ラボラトリーズ製品）を加えそして3.5分
の培養期間の後前記(b)製造の粒子試薬0.050ml
を使用して反応を開始させる。テオフイリン標
準の作製および濁度測定は例６の記載のように
して実施される。表９は薬物−コンジユゲート
−粒子試薬を使用する血清テオフイリン測定用
の標準曲線のためのデータを示す。

【表】 例 13 サイロキシン（thyroxine）の測定 サイロキシン−カタラーゼコンジユゲートの製造 ５ｇのＬ−サイロキシンナトリウム塩（6.3ミ
リモル）を20mlの50％水性ジオキサンに懸濁させ
る。18.9ミリモル（2.64ml）のトリエチルアミン
を撹拌しつつこの懸濁液に加え、次いで1.71ｇ
（6.93ミリモル）のＮ−第３級ブトキシカルボニ
ル−２−フエニルアセトニトリルを加える。室温
で２時間撹拌した後、25mlのH₂Oおよび33mlの
酢酸エチルを加え、そして水性相および有機相を
分離する。33mlの酢酸エチルでこの水性相を抽出
する。固体状クエン酸ナトリウムをこの水性相に
加えて溶液のPHを4.0に低下させる。得られた沈
殿のＮ−（第３級ブトキシ）−Ｌ−サイロキシンを
集め、真空下に乾燥させそして−20℃に保存す
る。 1.23ｇ（1.4ミリモル）のＮ−第３級ブトキシ）
−Ｌ−サイロキシンおよび0.16ｇ（1.4ミリモル）
のＮ−ヒドロキシサクシンイミドを20mlのジメチ
ルホルムアミドに溶解させる。0.31ｇ（1.5ミリ
モル）のジシクロヘキシルカルボジイミドをこの
溶液に加え、次いでこれを室温で18時間撹拌す
る。反応の間に沈殿した尿素を過により除去し
そして活性エステルを含有する液を−20℃で保
存する。 15mlの0.15M重炭酸ナトリウム（PH8.1）中に
45mgのカタラーゼを溶解させる。0.30mlの活性エ
ステル溶液（150ｍＭ）を加え、そして得られる
懸濁液を４℃で１時間撹拌する。すべての未反応
エステルを15000rpmで30分遠心することにより
除去し、そして次いでその上澄を10ｍＭ燐酸カリ
ウムバツフアー（PH７）に対して透析させる。Ｎ
−（第３級ブトキシ）−Ｌ−サイロキシン−カタラ
ーゼコンジユゲートを凍結乾燥させ、そして次い
で−20℃で保存する。 (b) サイロキシン−カタラーゼ−粒子試薬の製造 反応をNaCl不存在下に40℃で実施する以外
は例７の方法に従つて30mgのＮ−（第３級ブト
キシ）−Ｌ−サイロキシン−カタラーゼコンジ
ユゲート〔10ｍＭの燐酸カリウムバツフアー
（PH７）中3.0mg/mlの溶液10ml〕を例１で製造
された0.069μｍ粒子サイズのラテツクス重合体
粒子に結合させる。 (c) サイロキシンアツセイ サイロキシンに対する濁度アツセイは
「aca」装置上で実施される。0.15Mホスフエー
トバツフアー（PH7.8）、2.5％(w/v)PEG6000、
0.01％１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン
酸（ANS）および0.2％サリチル酸ナトリウム
を含有するバツフアー4.8ml区分量に、0.10ml
の種々の濃度のサイロキシン試料〔0.2M
KOH中にＬ−サイロキシンナトリウム塩を溶
解させそして0.1％HSAを含有する0.15Mホス
フエートバツフアー（PH7.8）中で希釈させる
ことにより製造〕を加える。0.050mlの羊抗サ
イロキシン抗血清〔アボツト・ラボラトリーズ
社製品、0.1％HSA含有ホスフエートバツフア
ー（PH７）で1/5に希釈〕を各区分量に加え、
そして37℃での35分の培養期間の後、その
「aca」テストパツクに0.050mlの１％サイロキ
シン−カタラーゼ粒子試薬を加えることによつ
て、濁度計的反応を開始させる。340nｍにお
ける濁度の上昇速度を29秒および46秒後に測定
する。表10はこのアツセイに対する標準曲線用
のデータを示す。

【表】 例 14 ジゴキシンの測定 (a) ジゴキシン−HSAコンジユゲートの製造 2.40ｇのジゴキシンを144mlの無水アルコー
ルに溶解させる。144mlの0.1M過沃素酸ナトリ
ウムを撹拌しつつ滴加し、そして反応を30℃で
25分継続させる。この時点で3.264mlの0.1Mグ
リセロールを加えて反応を停止させる。５分
後、この反応混合物を144mlの脱イオン水中3.6
ｇのHSA〔５％(w/v)炭酸カリウムでPHを9.2に
調整〕に滴加する。反応の経過の間（30分、25
℃）５％(w/v)炭酸カリウムを使用してそのPH
を9.0〜9.5に保持する。1.272ｇの硼水素化ナト
リウムを加えそして３時間後にそのPHを3.65M
HClで6.5に調整する。この溶液を次いで脱イ
オン水に対して透析する。透析の後、溶液を
PM10フイルターを使用したアミコン
（Amicon）濃縮装置で130mlまで濃縮する。次
いでこの溶液を凍結乾燥させてジゴキシン−
HSAコンジユゲートを生成させる。硫酸炭化
法によるジゴキシン含量分析および280nｍの
吸光度による蛋白含量の分析は蛋白分子当り
13.5のジゴキシン分子の比を示す。 (b) ジゴキシン−HSA粒子試薬の製造 ジゴキシン−HSAコンジユゲートを例７に
与えられている方法によつて0.069μｍおよび
0.109μｍ（例１の方法により製造された）の２
種の異つたサイズのラテツクス重合体粒子に結
合させる。 (c) ジゴキシンのアツセイ このアツセイは37℃で「aca」装置上で実施
される。標準（人血清中、および0.1Mグリシ
ン、１％NaCl、0.01％ナトリウムアジドを含
有するバツフアー（PH7.5）すなわちGBSバツ
フアー中の両方）を、DMSO中に１mg/mlジゴ
キシン区分量を加えそして適当な希釈を行うこ
とにより製造する。100μｍ標準試料を、0.02M
ホスフエート、0.3M NaCl、0.1％SDS、0.01
％ナトリウムアジドを含有するPH7.5のバツフ
アー4.9mlに加え、次いで50μの抗血清（カペ
ル・ラボラトリーズ社の兎抗ジゴキシン、１
mg／mlのHSAを含有するGBSバツフアー中に1/
５０に希釈、1/5000最終希釈）を加える。37℃で
3.5分の培養期間の後、２種の異つたジゴキシ
ン−HSA粒子試薬の各々0.050mlを加えて反応
を開始させる。速度（開始後29秒および46秒後
の吸光度差）として、または開始後種種の時間
での終点として340nｍで濁りを測定する。表
11は0.109μｍの粒子を使用して340nｍで得られ
たミリ吸光度単位での終点値を示す。一方、表
12は0.069μｍの粒子を使用した速度データを示
す。データ比較は０〜50nｇ濃度範囲に対して
与えられたｍＡを達成するために必要な時間は
より小さい出発粒子の使用の場合には15分から
10分に短縮されることを示す。表13は粒子試薬
（0.06μｍの重合体粒子ベース）で開始させた後
29秒と46秒との間の吸光度変化速度を測定した
標準曲線のためのデータを示す。 比較において、表14はより低い抗体濃度におい
てさえも、より大なる0.109μｍ重合体粒子をベー
スとした粒子試薬に対しては感度の若干の損失が
あることを示す。0.069μｍ粒子をベースとしたよ
り小さい粒子試薬の場合には、1/1250抗体希釈に
おいて、500nｇ/試料は42％の阻害を招来する
が、一方より大なる粒子試薬は1/1667抗体希釈に
おいて初速度の22％阻害を招来する。この例はよ
り小さい粒子を使用した場合のジゴキシンに対す
るアツセイ感度の改善を例示する。

【表】

【表】

【表】

【表】 例 15 ジゴキシンの測定 (a) 重合体粒子への抗体の結合 ジゴキシン−BSAコンジユゲートに対する
特異的兎抗血清の免疫グロブリンＧ分画
（IgG）（カペル・ラボラトリーズ社製品）を
0.3M NaCl、0.020M燐酸ナトリウムおよび1.0
mg／mlのHSAを含有する25mlバツフアー中に
1.0mg/mlの最終IgG濃度に溶解させる。1N
NaOHを使用して溶液のPHを9.7に調整した後、
例１と同様の方法で製造された0.069μｍ直径の
14％(w/v)重合体粒子懸濁液0.150ml区分量を
徐々に加える。得られた懸濁液を50℃に加熱し
そして「ブランソン（Branson） 」型式Ｂ−
22−４水浴ソニケーターを使用して１時間しず
かに超音波処理する。超音波処理の後、懸濁液
を２時間遠心させ、その後で得られたペレツト
を0.1％(w/v)ドデシル硫酸ナトリウムに再懸濁
させ、そして再び40分間遠心させる。第２の遠
心からのペレツトをグリシンバツフアーされた
食塩水（GBS、0.1Mグリシン、0.15M NaCl、
PH7.6）に再懸濁させ、そして更に40分遠心さ
せる。第３の遠心段階はIgG−重合体粒子試薬
（凝集剤）のペレツトを生成させる。これを1.0
mg／mlHSAおよび0.1％(w/v)ナトリウムアジド
を含有するGBS5ml中に再懸濁させる。使用前
に粒子を分散させるためにはこの最終懸濁液を
20分間ヒートシステムズ・ウルトラソニクス
型式Ｗ−185−Ｆソニケーターで超音波処理す
る。すべての遠心段階はデユポンソーバル型式
RC−5B遠心装置を使用してSM−24ローター
を19000rpmで使用して実施される。 (b) ジゴキシン−HSAの重合体粒子への結合 ジゴキシン−HSAコンジユゲートは10ｍＭ
ジゴキシンを30℃で30分間50％エタノール中で
50ｍＭ過沃素酸ナトリウムと反応させることに
より製造される。70ｍＭグリセロールを加えて
反応を停止させた後、２容量のこの溶液を炭酸
カリウムでPH10.1に調整した１容量の21.3mg/
mlHSAに加える。このジゴキシン−HSAコン
ジユゲート溶液を室温で１時間培養させ、その
後で50ｍＭ水準まで硼水素化ナトリウムを加え
る。更に２時間後そのPHを3N HClで6.5に調
整する。得られたコンジユゲート溶液をPH7.8
の５ｍＭ燐酸ナトリウムに対して透析する。 このジゴキシン−HSAコンジユゲート溶液
を20ｍＭ燐酸ナトリウム、0.3M NaClバツフ
アー（PH9.7）で希釈して２mg/mlの最終蛋白濃
度とする。例１と同様の方法で製造された直径
0.069μｍの14％(w/v)懸濁液の重合体粒子ラテ
ツクス0.540ｍＭ区分量を90mlのコンジユゲー
ト溶液に加え、そして50℃で１時間超音波処理
する。超音波処理および以後の遠心の条件は前
記(a)に与えられているものと同一でありそして
これはジゴキシン−HSA−粒子試薬を生成さ
せる。 (c) ジゴキシンのアツセイ このアツセイは2.0mlのバツフアー〔4.5％
（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール6000を含有する
PH7.8の0.150M燐酸ナトリウムバツフアー〕を
含有する3.0mlの石英キユベツトを使用して37
℃でキヤリー 219分光光度計中で実施される。
（抗ジゴキシン）IgG−粒子試薬区分量をこの
バツフアーおよび1.0mg/mlHSAを含有する
GBS中の遊離ジゴキシン含有試料40μと共に
５分間培養する。培養後、ジゴキシン−HSA
粒子試薬の区分量を加えそして340nｍにおい
て初期吸光度変化速度をモニターする。表15は
吸光度変化速度の濃度依存性を示し、そして表
16はジゴキシン（40μの粒子試薬および50μ
の凝集剤）によるこれら速度の阻害を示す。

【表】

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 本質的に (A) 内側コアと外側シエルとを有し、その際内側
   コアがナトリウムＤ線の波長で測定して1.54以
   下でない屈折率を有しそして外側シエルが (1) エポキシ、カルボキシ、アミノ、ヒドロキ
   シおよびアルデヒドより成る群から選ばれた
   生物学的に関心ある化合物と反応しうる官能
   基を有するエチレン性不飽和単量体、 (2) 随意にその他のエチレン性不飽和単量体、
   および (3) 外側シエルの10重量部を越えない内側コア
   の単量体 の重合体であり且つこの外部シエルは前記内側
   コアの存在下での重合によつて製造されるもの
   である0.03〜0.1μｍの大約の直径範囲を有する
   重合体粒子と、 (B) 前記重合体粒子が共有的に結合せしめられて
   いる生物学的に関心のある化合物またはそれに
   対する抗体 とからなる、高屈折率を有する粒子試薬。 ２ 前記外側シエルが前記重合体粒子の５重量部
   を越えない量である前記特許請求の範囲第１項記
   載の粒子試薬。 ３ 本質的に (A) 内側コアと外側シエルとを有し、その際内側
   コアがナトリウムＤ線の波長で測定して1.54以
   下でない屈折率を有しそして外側シエルが (1) エポキシ、カルボキシ、アミノ、ヒドロキ
   シおよびアルデヒドより成る群から選ばれた
   生物学的に関心ある化合物と反応しうる官能
   基を有するエチレン性不飽和単量体、 (2) 随意にその他のエチレン性不飽和単量体、
   および (3) 外側シエルの10重量部を越えない内側コア
   の単量体 の重合体であり且つこの外部シエルは前記内側
   コアの存在下での重合によつて製造されるもの
   である0.03〜0.1μｍの大約の直径範囲を有する
   重合体粒子と、 (B) 前記重合体粒子が蛋白性物質を介して共有的
   に結合せしめられている生物学的に関心のある
   化合物 とからなる、高屈折率を有する粒子試薬。 ４ 生物学的に関心ある化合物を測定するにあた
   り、下記すなわち (A)(1) 本質的に (a) 内側コアと外側シエルとを有し、その際
   内側コアがナトリウムＤ線の波長で測定し
   て1.54以下でない屈折率を有しそして外側
   シエルが (i) エポキシ、カルボキシ、アミノ、ヒド
   ロキシおよびアルデヒドより成る群から
   選ばれた生物学的に関心ある化合物と反
   応しうる官能基を有するエチレン性不飽
   和単量体、 (ii) 随意にその他のエチレン性不飽和単量
   体、および (iii) 外側シエルの10重量部を越えない内側
   コアの単量体 の重合体であり且つこの外部シエルは前記
   内側コアの存在下での重合によつて製造さ
   れるものである0.03〜0.1μｍの大約の直径
   範囲を有する重合体粒子と、 (b) 前記重合体粒子が共有的に結合せしめら
   れている生物学的に関心のある化合物また
   はそれに対する抗体 とからなる高屈折率を有する粒子試薬、 (2) 生物学的に関心のある化合物を含有してい
   ると推定される液体、および (3) 凝集剤 を培養すること、そして (B) 凝集から生じた増大した粒子サイズを分光分
   析的に測定すること の各段階を包含する、方法。 ５ 重合体粒子が生物学的に関心のある化合物に
   共有結合的に結合されている。前記特許請求の範
   囲第４項記載の方法。 ６ 凝集剤が (A) 生物学的に関心のある化合物に対する抗体、 (B) 本質的に (1) 内側コアと外側シエルとを有し、その際内
   側コアがナトリウムＤ線の波長で測定して
   1.54以下でない屈折率を有しそして外側シエ
   ルが (a) エポキシ、カルボキシ、アミノ、ヒドロ
   キシおよびアルデヒドより成る群から選ば
   れた生物学的に関心ある化合物と反応しう
   る官能基を有するエチレン性不飽和単量
   体、 (b) 随意にその他のエチレン性不飽和単量
   体、および (c) 外側シエルの10重量部を越えない内側コ
   アの単量体 の重合体であり且つこの外部シエルは前記内
   側コアの存在下での重合によつて製造される
   ものである0.03〜0.1μｍの大約の直径範囲を
   有する重合体粒子と、 (2) 前記重合体粒子が共有的に結合せしめられ
   ている生物学的に関心のある化合物に対する
   抗体 とからなる、高屈折率を有する粒子試薬 より成る群から選ばれる前記特許請求の範囲第５
   項記載の方法。 ７ 単量体粒子が生物学的に関心ある化合物に対
   する抗体に共有結合的に結合されている前記特許
   請求の範囲第４項記載の方法。 ８ 凝集剤が生物学的に関心ある化合物と蛋白と
   の多価コンジユゲートである前記特許請求の範囲
   第７項記載の方法。 ９ 培養段階(a)の間に凝集促進剤をも存在せしめ
   る前記特許請求の範囲第４項記載の方法。 １０ 凝集促進剤がポリエチレングリコールおよ
   びドデシル硫酸ナトリウムより成る群から選ばれ
   る前記特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１ 重合体粒子を蛋白物質を介して生物学的に
   関心のある化合物に共有結合的に結合させる前記
   特許請求の範囲第５項記載の方法。 １２ 本質的に (A) 内側コアと外側シエルとを有し、その際内側
   コアがナトリウムＤ線の波長で測定して1.54以
   下でない屈折率を有しそして外側シエルが (1) エポキシ、カルボキシ、ヒドロキシおよび
   アルデヒドより成る群から選ばれた生物学的
   に関心ある化合物と反応しうる官能基を有す
   るエチレン性不飽和単量体、 (2) 随意にその他のエチレン性不飽和単量体、
   および (3) 外側シエルの10重重部を越えない内側コア
   の単量体 の重合体であり且つこの外部シエルは前記内側
   コアの存在下での重合によつて製造されるもので
   ある0.03〜0.1μｍの大約の直径範囲を有する重合
   体粒子と、 (B) 前記重合体粒子が共有的に結合せしめられて
   いる生物学的に関心のある化合物の抗原 とからなる高屈折率を有する粒子試薬。 １３ 前記外側シエルが前記重合体粒子の５重量
   部を越えない量である前記特許請求の範囲第１２
   項記載の粒子試薬。 １４ 生物学的関心ある化合物の抗原が蛋白物質
   を介して前記重合体に結合されている前記特許請
   求の範囲第１２項記載の粒子試薬。 １５ 蛋白質を測定するにあたり、下記すなわち (A)(1) 本質的に (a) 内側コアと外側シエルとを有し、その際
   内側コアがナトリウムＤ線の波長で測定し
   て1.54以下でない屈折率を有しそして外側
   シエルが (i) エポキシ、カルボキシ、アミノ、ヒド
   ロキシおよびアルデヒドより成る群から
   選ばれた生物学的に関心ある化合物と反
   応しうる官能基を有するエチレン性不飽
   和単量体、 (ii) 随意にその他のエチレン性不飽和単量
   体、および (iii) 外側シエルの10重量部を越えない内側
   コアの単量体 の重合体であり且つこの外部シエルは前記
   内側コアの存在下での重合によつて製造さ
   れるものである0.03〜0.1μｍの大約の直径
   範囲を有する重合体粒子と、 (b) 前記重合体粒子が共有的に結合せしめら
   れている蛋白質に対する抗体 とからなる高屈折率を有する粒子試薬、 (2) 生物学的に関心のある化合物を含有してい
   ると推定される液体 を培養すること、そして (B) 凝集から生じた増大した粒子サイズを分光分
   析的に測定すること の各段階を包含する、方法。 １６ 前記蛋白質が抗体でありそして前記重合体
   粒子が該抗体または該抗体の抗原に結合されてい
   る、前記特許請求の範囲第１５項記載の方法。