JPH02200692A - 新規高分子多糖ｓ―２およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はスエヒロタケ属（８ｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ
）に属する微生物によって生産され、抗植物ウィルス作
用を有する新規な高分子多糖８−２に関する。

〔従来技術〕

畑、水田あるいは各種施設で栽培されるタバコ　ピーマ
ン、トマト、キュウリ、スイカなどはタバコモザイクウ
ィルス（以下ＴＭＶという）、キュウリモザイクウィル
ス、キュウリ緑斑モザイクウィルス、ジャガイモＹウィ
ルス等にり病し、著しい被害を受けることが多い。これ
らの病原ウィルスは他作物、雑草、樹木、種苗、土壌中
などに存在し、作業時の接触、昆虫の吸汗等によって伝
染する。作物におけるこれらウィルス病の防除対策とし
て、従来はウィルスの発生源の除去または低減、土壌消
１１！あるいは殺虫剤によるウィルス媒介者の殺減等、
間接的防除技術が主として用いられてきた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、従来の市販の植物ウィルス病防除剤に見られ
ない浸透移行性の効果を示し、安全で有効な化学物質を
微生物を用いる発酵工業的手段によって安価に大量に提
供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の目的を達成するために、多種の微
生物の代謝産物についてスクリーニングを行った結果、
スエヒロタケ（５ｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕ　ｍ　）属に
属する菌が培養物中に生産する高分子多糖８−２が顕著
な抗ウィルス活性を示すことを発見した。

本発明に使用するスエヒロタケ属に属する菌株トシては
、天然のスエヒロタケよシ分離した菌株、あるいは公知
の保存菌株、例えばシゾフィラム・コミュ−ｙ　（８ｃ
ｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ）　ＩＦｏ　
４９２８、ＩＦ０６５０４、ＩＦＯ６５０５、ＩＦＯ３
０４９６、ＩＦＯ３０７４９（ＩＦＯは財団法人・発酵
研究所の略）等があるが、高分子多糖類の生産量が高い
シゾフィラム・コミューン（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｏ
ｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ　）　Ｊ　ＴＳ　３００１　（微工
研菌寄第９７６７号）が最も望ましい菌株である。なお
、ＪＴＳ　３００１菌株は、ＩＦｏ　４９２８菌株を親
株として継代培養し、選抜により得られた高生産株であ
る。

これら菌株の培養物の培養ろ液あるいは菌体の熱水抽出
物をそのまま、あるいはその有効成分である多糖Ｓ−２
を水に溶解し、タノ（コ、トマト、ピーマン等の茎葉に
散布あるいは地下部から吸収させることなどによって、
ＴＭＶ等の感染発病を効果的に防除することができる。

％にスエヒロタケ属に属する菌株の生産する抗ウイルス
活性物質は従来知られている多糖と異なシ、処理植物体
においてシステミノクに発現することがら著効を示す。

本発明において使用する菌株は一般の担子菌培養用培地
を用いて、静置または攪拌培養でき、その効果は有効成
分である高分子多糖Ｓ−２の量に依存する。

本発明者らはこれらのことを実験的にＶ＆認し本発明を
行った。

以下に、順を追って詳細に説明する。

高分子多糖Ｓ−２は、高分子多糖Ｓ−２生産菌を培養し
た後、培養物の液体区分（培養ｒ液）及び菌体区分から
分離採取することによって得ることができるが、特に、
培養ｒ液から多く得られる。

本発明においては、培養培地としては菌体がよく育つも
のであればいかなる組成の培地でもよいが、一般の糸状
菌用培地に酵母エキスなどを加えたものが好ましい。

培養条件としては、例えば２０〜３０′Ｏの静置培養で
十分でアリ、また高分子多糖Ｓ−２生産菌の生育が可能
で高分子多糖Ｓ−２を生産する条件でおればいかなる条
件でも良いが、振とう培養または通気攪拌培養が好まし
い。

高分子多糖Ｓ−２生産菌の培養物から遠心分離またはｆ
過によシ液体区分（培養ｆ液）及び菌体区分（菌体）を
得、ついで、これらから抗ウィルス活性を有する高分子
多糖８−２を採取する。培養ｒ液から高分子多糖Ｓ−２
を採取するには常法によればよく、例として透析、限外
ｆ過、分別沈澱、塩析、溶媒分画、イオン交換クロマト
グラフィー　吸着クロマトグラフィーなどの操作を単独
あるいは適宜併用すればよい。

菌体から高分子多糖Ｓ−２を採取するには、例えば熱水
抽出を行い、固形分を除き、その後は液体区分からの採
取法に準ずればよい。

本発明において、−船釣には、グルコース、エビオス、
リン酸−カリウム、硫酸マグネシウム及び水道水からな
る培地で高分子多糖Ｓ−２生産菌を振とう培養し、培養
終了後、ｒ過によ＝５− 一 ９培養ｒ液を得る。

ついで、培養ｆ液と菌体熱水抽出液を合わせて、これへ
２倍容量のエタノールを加え、生じる沈澱を採取する。

この沈澱物を総て溶がし、再びエタノールを加えて沈澱
させる。この沈澱物を再び溶かし、多糖溶液を得る。

多糖溶液を各種クロマトグラフィーによシ分析し、糖と
して高分子多糖Ｓ−２のみを含む分取液を合わせてから
、透析、減圧濃縮、凍結乾燥によって高分子多糖Ｓ−２
を得る。

高分子多糖Ｓ−２は、次の理化学的性質を示す。

（１）　　元素分析 〔高分子多糖Ｓ−２〕 ０　：　４０．０％ Ｈ：６．７％ Ｎ：ｎｉｌ 灰分：　３％ （２）　　分子量 ゲルｆ過クロマトグラフィーを行った結果は第１図に示
すとおルである。

ゲルｒ適法による範囲＝５０００〜３００００ゲルｆ過
法による平均分子量：１７０００（３）　　紫外吸収ス
ペクトル ＨＩＴＡＯＨＩ　５５７　　Ｄｏｕｂｌｅ　Ｗａｖｅｌ
ｅｎｇｔｈＤｏｕｂｌｅ　Ｂｅａｍ　Ｓｐｅｃｔｒｏｐ
ｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて高分子多糖８−２　１ｍｇ
／ミり！Ｊットル溶液の紫外吸収スペクトルを測定した
結果は、第２図に示す通シである。

（４）赤外吸収スペクトル 日本分光Ａ−３型赤外分光光度計を用いて常法（例えば
、泉美治、小川雅弥、加藤俊二、塩用二朗、芝哲夫監修
二機器分析のてびき（１）、１ページ、化学同人、１９
８６年）によル高分子多糖Ｓ−２の赤外吸収スペクトル
を測定した結果は、第３図に示す通９である。

（５）　　溶媒に対する溶解性 水、ジメチルスルホキシドに可溶。メタノール、エタノ
ール、アセトン、エーテルに不溶。

（６）呈色反応 フェノール・硫酸反応　　陽性 ニンヒドリン反応　　　　陰性 ２ＮＴＦＡを加えて１２１″Ｏでｌｈｒ加水分解した高
分子多糖Ｓ−２溶液をアビセルプレートにチャージさせ
、０゜２％ニンヒドリン試薬（ｉｎｏ、５％エタノール
溶液）をスプレー後、１１０＠０にて乾燥したところ、
発色しなかった。

（力　塩基性、酸性、中性の別 高分子多糖Ｓ−２の０．１％水溶液のｐＨは中性である
。

（８）物質の色 高分子多糖Ｓ−２は白色である。

（９）構成糖とその組成 高分子多糖Ｓ−２を２　Ｎ　−）　ＩＪフルオロ酢酸中
、１２１°Ｃで１時間、加水分解後、アビセルプレート
を用いた薄層クロマトグラフィーによりガラクトースと
マンノースが検出された。

また、本多糖を加水分解後、常法（例えば、原田篤也、
小泉岳夫編：総合多糖科学上、６８ページ、講談社、昭
和４８年）により還元してアルジトールアセテートに導
き、ガスクロマトグラフィーにより分析した。これらの
結果から、その主な構成糖はガラクトースとマンノース
（２：１）であり、他に少量のグルコースとフコースが
含まれた。

（１０）タンパク質の存在 高分子多糖Ｓ−２の２０■を１ミリリツトルの水にとか
し、その０．１ミリリツトル中のタンパク質をローリイ
法により定量した。発色は見られなかった。

（１１）ピルビン酸の存在 高分子多糖Ｓ−２の加水分解物をペーリンガー・マンハ
イム社製乳酸測定キットにより測定したが、ピルビン酸
は存在しなかった。

以下に実施例によυ本発明を更に具体的に説明する。

実施例１ 〔菌の培養〕 シゾフィラム舎コミューン（Ｓｃｂｉｚｏｐｈｙｌｌｕ
ｍｃｏｍｍｕｎｅ）ＪＴＳ　３００１菌株（微工研菌寄
第９７６７号）を、試験管内のバレイショ・ブドウ糖・
寒天培地（斜面、］　ＯミＩＪ　リットル）に接種し、
２８°Ｃで７日間培養し、保存菌株とした。

この保存菌株を、下記の培地、１ｏｏミリリツトルを入
れた５　００　ミ！Ｊ　ＩＪノトル容三角フラスコに接
種し、２８°０．２００　ｒｐｍで７日間、回転振とう
培養し種母とした。種母培養物１．００ミリリツトルを
ミキサーによりホモジナイズし、そ　の　６０　ミ　リ
　リ　ノ　ト　ル　を　、　　１．　　ＯＯＯミ　リ　
リ　フ　トルの培地をいれた３リツトル容三角フラスコ
に接種し、２８°Ｃ１２００ｒｐｍで７日間回転振とう
培養し、菌糸培養物を得た。

他の菌株、シゾフィラム・コミューン（Ｓｃｈｉｚｏｐ
ｈｙｌｌｕｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ　）　Ｉ　ＦＯ４９２８
、ＩＦ’０６５０４、　ＩＦＯ６５０５、ＩＦＯ３０４
９６、ＩＦ’０３０７４．９等も、同様に培養し、菌糸
培養物を得た。

培地ニゲルコース　　　　５０ｇ ペプトン　　　　　　２ｇ 酵母エキス　　　　　２ｇ 麦芽エキス　　　　１０ｇ ＫＨ，ｇＰ０４本　　　　　　　５ｇ Ｍｇ５Ｏｔ・７Ｈ＃０　　２．５ｇ 十　　　　　　ユ 水道水　　　　１０１００Ｏ 実施例２ 〔高分子多糖Ｓ−２の精製〕 実施例１において得られたシゾフィラム・コミ　ュ　−
　ン　（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ　　　ｃｏｍｍｕ
ｎｅ）　　　Ｊ　　Ｔ　　５３００１菌株の菌糸培養物
を、東洋１紙Ｎｏ５ｃを用いてｒ過し、菌体と培養ｒ液
を得た。

培養ｆ液１１リットルを４０°Ｃ減圧によって５分の１
まで濃縮した。それに２倍量のエタノールを加え、更に
１％（ｗ／ｖ）溶液となるようにＮａ１ｌを加えた。２
日間１０°０で静置し多糖を沈澱させ、沈澱を集めエタ
ノールで３回洗浄した後、減圧乾固した。これに蒸留水
を加え懸濁し、更にＥＤＴＡ溶液を加えて沈澱を溶がし
た。再び２倍量のエタノールを加えて多糖を沈澱させた
。沈澱を回収して減圧乾固し、Ｎａ０１−］ＩＧＥＬ−
ＧＳ　５］、０とＧ５３２ｏカラムを装着しり日本分析
工業（製）ＰＲＥＰＡＲ，Ａ、ＴＩＶＢ　　ＬＩＱＵＩ
Ｄ　　ＯＨＲＯＭＡＴＯＧＲ，ＡＰＨＭＯＤＥＬＬＯ２
０（溶出液：　０．１　Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６９
）　　流　速　　＝　　３　５　　ミ　　リ　　リ　　
フ　　ト　　／ｌ／　　７　　ｍ　ｉｎ　　　検　出　
　：　　Ｒ■）で分画すると図４に示すように二つのビ
ークに分かれた。この二つめのピークに相当する高分子
多糖のみを集め、透析、減圧濃縮、更に凍結乾燥によっ
て８−２を得た。

実施例３ 〔元素分析〕 実施例２において、シゾフィラム・コミュー７　（Ｓｃ
ｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ　）　Ｊ　Ｔ
　Ｓ　３００１菌株培養物から得られた高分子多糖Ｓ−
２１＝３ｍｇを柳本製作所（ｊＩＩＮ−ｆｆ−ダーＭ　
Ｔ　−３型（燃焼条件：試料分解炉９３０°Ｃ酸化炉８
５００Ｃ還元炉５５０°Ｏヘリュウム流量］−８０ミリ
　リ　ソ　ト　ル／　ｍ　ｉ　ｎ　　　　酸素流１ｔ　
２０　ミ　リ　リ　ッ　ト　ル／ｍ１ｎ）を用いての有
機元素分析結果は、０：４０％、　ｉ＞、　Ｈ：　６．
７％、Ｎ：ｎｉｌ、灰分：３％を示した。

実施例４ 〔分子量の測定〕 日本分析工業■製ＪＡ−ＩＧＥＩ、−ＧＳ５１０と０８
３２０カラムを装着した日本分析工業（製）　　ＰＲＥ
ＰＡＲＡＴＩＶＥ　　ＬＩＱＵＩＩ）ＯＨＲＯＭＡＴＯ
ＧＲＡ　Ｐ　ＨＭ　ＯＤ　Ｅ　Ｌ　　Ｌ　Ｏ−２０を用
いて、１％プルラン（昭和電工膜、Ｐｕ１ｌｕｌａｎ　
５ｈｏｄｅｘ　　Ｓ　Ｔ　ＡＮ　Ｄ　Ａ、　Ｒ１）　　
Ｐ　−８２）　／　０］、　Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ
，６，９）を分子量標準物質とし、シゾフィラム・コミ
ューンＪ　ＴＳ　３００１菌株培養物から得た高分子多
糖８−２の分子量を測定した。１％高分子多糖Ｓ　−２
／　Ｏ，］、　Ｍ酢酸アンモニウムを流速３５ミリリッ
トル／ｍｉｎ、ゲルｆ過クロマトグラフィーにより測定
し、システム・インスッルメンツ■製Ｏｈｒｏｍａｔｏ
ｃｏｒｄｅｒ　　１２ＧＰＣカートリツジを用いて求め
た重量平均分子量は】７０００であり、その結果を、第
１図に示す。

他の菌株の培養物から得た高分子多糖８−２も、分子量
の分布範囲は５０００〜３００００であった。

実施例５ 実施例Ｉにおいて得られたシゾフィラム・コミー−ンＪ
ＴＳ３００１菌株の菌糸培養物をｆ過し培養ｒ液と菌体
な得た。この培養Ｆ液の抗ウィルス活性をＴＭＶについ
て検定した。

同時に、実施例２において得られた各種高分子多糖類と
高分子多糖Ｓ−２を検定した。検定にはウィルスを接種
することによって局部病斑を生ずるタバコ品種（キザン
チ・エヌシー）を用いた。検定用のタバコ植物は直径１
２ｃｍの鉢で育成し、１試料につき２鉢、３葉ずつ計６
葉を用いた。展開した葉の表または裏側の主脈を境とす
る生葉に被験液を絵筆で塗布し、片側の生葉には対置と
して水を塗布した。試料処理１目抜１葉の表側全面にカ
ーボランダムを振りかけ　、　　純　化　ＴＭＶ（０，
０５μｇ　／　　ミ　　リ　　リ　　ッ　　ト　　ル　
　）　　を塗抹接種した。ウィルス接種３〜４日後、接
種葉に現れた斑点の数を数え、次式によって防除率を算
出し、表１の結果を得た。

防除率（％）　＝　［］、　−（処処理案の病斑数／対
照生葉の病斑数）　）　Ｘ　１．　ＯＯ各種画分の植物
ウィルス防除効果を示した表１にみられるように、葉表
処理した場合には全ての試料が１００％近い防除率を示
した。

表１　各種画分の植物ウィルス防除効果式　料　　　　
　濃度　　試料塗布面　接種面（％）防除率培養ｆ液 高分子多糖Ｓ−２ 蒸留水（対照） ９ｍｇ／ｍ１　　葉表生葉 葉裏生葉 ０、４　ｍｇ　７ｍ１　　薬麦生葉 葉裏生葉 葉裏生葉 葉表全葉　　１．００ 葉表全葉　　８７ 葉表全葉　　１００ 葉表全葉　　９５ 葉表全葉　　　７ 一方、高分子多糖Ｓ−２の植物ウィルス防除効果を示し
た表２にみられるように、葉裏処理でも効果が防除率に
現れるのみならず、主脈を境にして処理し女かった生葉
側にもその効果が及ぶことが認められた。即ち、葉に全
く試料を塗布せずにウィルスを接種した場合に比べて、
試料を塗布した対照生葉の病班の絶対数が減少する効果
が認められた。この結果は、本発明における活性物質が
システミノクに効くことを示している。

表２　高分子多糖Ｓ−２の植物ウィルス防除効果４００
μｇ／ｍ１ １００μｇ／ｍ１ １０μｇ／ｍｌ 蒸留水（対照） 葉裏生葉 葉裏生葉 葉裏生葉 葉裏生葉 葉表全葉 葉表全葉 葉表全葉 葉表全葉 〔発明の効果〕 実施例によって示されたように、高分子多糖Ｓ−２は、
高い植物ウィルス防除効果を示し、その効果はシステミ
ソクであることが明らかとなった。

また、いわゆる高分子多糖Ｓ−２はシゾフィラム・コミ
ー−ンを培養することにより発酵工業的に容易に生産で
きることが示された。本発明によシ従来罠ない、新しい
抗植物ウィルス剤の供給が可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は高分子多糖Ｓ−２のゲルｆ過クロマトグラムで
ある。点線は高分子多糖Ｓ−２を示し、実線は分子量標
準物質プルランを示す。 第２図は高分子多糖Ｓ−２の紫外吸収スペクトルを示す
。 第３図は高分子多糖Ｓ−２の赤外吸収スペクトルを示す
。 第４図は日本分析工業■製ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ５１０と
Ｇ５３２０カラムを装着した日本分析工業（＃）　ＰＲ
ＥＰＡＲＡＴＩＶＥ　　ＬＩＱＵＩＤ　ＯＨＲＯＭＡＴ
ＯＧＲＡＰＨＭＯＤＥＬＬＯ−２０（溶出液：　０．　
Ｉ　Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，９）　流速　：　　
３．５　　ミ　　リ　　リ　　フ　　ト　Ａ７　７　　
ｍ　ｉｎ　　　　　検　出　　：ＲＩ）　　　にて８−
２を分画した時の二つのピークである。 溶出液量 （ｍ　１　） 第 図 ＋０００ （ｃｌ’）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　次の理化学的性質を有する高分子多糖Ｓ−２ （１）元素分析 〔高分子多糖Ｓ−２〕 Ｃ：４０．０％ Ｈ：６．７％ Ｎ：ｎｉｌ 灰分：３％ （２）分子量 ゲル濾過法による範囲：５０００〜３００００（３）塩
   基性、酸性、中性の別 高分子多糖Ｓ−２の０．１％水溶液のｐＨ は中性である。 （４）構成糖とその組成 ガラクトース、マンノース、グルコース、 フコースより構成される。ガラクトース： マンノース＝２：１、アミノ糖の存在は認 められない。 ２　シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）に
   属する高分子多糖Ｓ−２生産菌を培養し、培養物より高
   分子多糖Ｓ−２を採取することを特徴とする高分子多糖
   Ｓ−２の製造法。