JPH02215381A - 新規セルラーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規なセルラーゼとその製造法及びセルラーゼ
生産性微生物に関する。

［従来の技術］ セルラーゼの開発は従来、バイオマス資源、特にセルロ
ース資源の有効利用を目的として進められてきたが、バ
イオマス用セルラーゼの工業的規模での利用は必ずしも
多くはない。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途のひとつとして、
洗剤用酵素としてセルラーゼが洗浄力の向上に有効であ
るといわれ注目を集めている。洗剤用セルラーゼは、通
常の洗濯条件では洗浄液のｐＨが高アルカリ性であるた
め、高アルカリ条件下で機能するアルカリセルラーゼで
なければならず、更にはまた。洗剤成分の一つである陰
イオン性界面活性剤に対しても安定に機能しなければな
らない。

微生物の生産するアルカリセルラーゼは、好アルカリ性
バチルス属細菌の培養によるセルラーゼＡを採取する方
法（特公昭５Ｏ−２８５１５）、セルロモナス属に属す
る好アルカリ性細菌を培養してアルカリセルラーゼ３０
１−Ａを生産する方法（特開昭５８−２２４６８６）、
好アルカリ性バチルス属細菌に５Ｍ−６３５を培養して
アルカリセルラーゼＫを生産する方法（特開昭６３−１
０９７７６）等が報告されている。

しかし、これら従来公知のセルラーゼは洗剤成分の一つ
である陰イオン性界面活性剤に対する安定性が必ずしも
十分ではない為、陰イオン性界面活性剤に対してより安
定な酵素の開発が望まれている。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、至適ｐＨが高アルカリ側にあり、また陰イオ
ン性界面活性剤に対しても安定な洗剤用酵素として適し
たセルラーゼを提供しようとするものである。

［課題を解決するための手段〕 本発明者等は上記のような性質を有するセルラーゼを得
るべく、多数の微生物を分離・培養して検索した結果、
東京部下の土壌中より分離したバチルス属に属するバク
テリアバチルスＳＤ４０１株が洗剤用酵素として優れた
性質を有する新規セルラーゼを生産することを見出し、
本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は１）カルボキシメチルセルロース（ＣＭ
Ｃ）を基質とした場合の至適ｐＨが９．５〜１０．０．
至適温度が約５５℃であり、２）安定ｐＨ領域が３０℃
、３０分処理したときｐＨ６〜１１であり、３）　３０
００　ｐｐ■の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウム存在下（ｐＨ９，０）で３０℃、２時間処理しても
９０％以上の残存活性を有する等、界面活性剤に対して
も極めて安定であり、４）分子量はＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動法により測定した場合、５２．０００
±２０００であり、そして５）等電点はポリアクリルア
ミド電気泳動法によって測定した場合、４．０以下であ
る新規なセルラーゼ；バチルス属の上記セルラーゼ生産
能を有する微生物を培地に培養し、培養物から目的のセ
ルラーゼを採取することを特徴とする上記セルラーゼの
製造法；及び上記セルラーゼ生産能を有するバチルス属
の新規な菌株を提供せんとするものである。

以下に本発明の新規セルラーゼとその製造法及びこれに
用いる新規な菌株について更に詳しく説明する。

生産１ 本発明の新規セルラーゼの製造のために使用する微生物
は、前記の性質を有するセルラーゼを生産することが出
来るバチルス属に属するバクテリアであり次のような性
質を有する。

（ａ）形態 ■細胞の形及び大きさ ■細胞の多形成 ■運動性 ■胞子 ■ダラム染色性 ■抗酸性 （ｂ）次の各培地での 生育状態 ■肉汁寒天平板培地 桿菌であり、その大き さは０．３〜０．５Ｘ　２．８〜 ５．２μｍである。

多形成を示さない。

周鞭毛を有する。

胞子を形成する。

その形は楕円形であり、 大きさは１．０〜１．５× １．８〜２．２μｍである。

陽性 陰性 集落は円形であり、表 面は偏平状で中心部が わずかに隆起している。

又、集落の色調は黄白 ■肉汁寒天斜面培地 ■肉汁液体培地 ■肉汁ゼラチン穿刺培養 ■リドマスミルク （ｃ）生理学的性質 の硝酸塩の還元 ■脱窒反応 ■ＭＲテスト ■ｖＰテスト ■インドールの生成 Ｏ硫化水素の生成 ■デンプンの加水分解 ■クエン酸の利ｍ ■無機窒素源の利用 ［相］色素の生成 ■ウレアーゼ ■オキシダーゼ 色の半透明である。

拡布状に生育する。

混濁 液化 凝固もペプトン化もし ない 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陽性 陰性 硝ａ塩及びアンモニラ ム塩を利用する。

陰性 陰性 はっきりしない ０カタラーゼ ［株］生育の範囲（ｐ　Ｈ） （温度） ■酸素に対する態度 ＠Ｏ−Ｆテスト 陽性 ８．０で生育するが、７．１ で生育しない。

１０．８で生育するが。

１２．３で生育しない。

１５℃、４０℃で生育する が、５０℃で生育しない。

好気的 発酵（Ｆｅｒ＋ｍｅｎｔａｔｉｏｎ） ０ｗ類の酸化とガスの生成 酸化　ガス Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−マンノース Ｄ−フラクトース Ｄ−ガラクトース 麦芽糖 ショ糖 乳糖 （ｌＯ）トレハロース　　　　　　　十　　　−（１１
）　Ｄ−ソルビット （１２）叶マンニット　　　　　　− （１３）イノジット　　　　　　　− （１４）グリセリン　　　　　　　−−（１５）デンプ
ン　　　　　　　　十　　　−以上の菌学的性質につい
てバーシーズ・マニュアル・オブ・システマテインク・
バクテリオロジイー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏ（
ｙ）　、及びザ・ジーナス・バチルス（Ｔｈｅ　Ｇｅｎ
ｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を参照した結果、重両は有胞
子桿菌であるバチルス・アルカロフイラス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）に類縁の菌である
と認められた。しかし、前記バーシーズ・マニュアル・
オブ・システマテインク・バクテリオロジイーに記載の
バチルス・アルカロフイラスの標準株ＮＣＩＢ　１０４
３８と重両は、肉汁寒天培地及びリドマスミルクでの生
育状態、ガラクトースからの酸の生成などその菌学的性
質に於て異なる性質を有し、明かに新規な菌株であるこ
とが認められ、そこでバチルスＳＤ４０１と命名され、
微工研菌寄第１０５２７号として寄託された。

尚１本発明に用いる微生物は上記バチルスＳＤ４０１株
に限らず、本発明の後記する特性を有するセルラーゼの
生産性を有する限り如何なる菌株であっても良い、また
バチルスＳＤ４０１についても、その自然または人偽的
突然変異株や遺伝子工学的手法による改良株も包含され
る。

鹿１方羞 本発明のセルラーゼを製造するに当たって、上述の如き
微生物の培養方法については、特別な要件はなく慣用の
方法により適宜実施できる。

培地の栄養源としては通常培養に用いられているものが
広く利用できる。炭素源としては同化できる炭素化合物
またはこれを含有するものであればよく１例えばグルコ
ース、マルトース、デンプン、ＣＭＣなどが用いられる
。窒素源としても同化可能な窒素化合物、またはこれを
含有するものであればよく、例えばアンモニウム塩、ペ
プトン、大豆粉、脱脂大豆粉などが用いられる。また、
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩などの塩類
が使用される。その他、菌の生育及び酵素生産に必要な
各種の有機物や無機物またはこれを含有するもの、例え
ばビタミン類、酵母エキスを培地に添加することが出来
る。

培養は液体、または固体培養いずれでも良いが液体培養
の方が好ましい、液体培養における培養条件は培地組成
により多少異なるが、生産の目的物であるセルラーゼの
生産に最も有利な条件を選択する。培養温度は２５〜３
５℃の範囲であり、培養時間は１２時間から３日程度で
あり、セルラーゼ生産が最高に達したときに培養を終了
すれば良い。

培地のｐＨは８以上が良く、９〜１０がセルラーゼ生産
に好適である。このような培養により、目的とするセル
ラーゼが培養液中に得られる。

亀豊１裏羞 このようにして得られた培養液からのセルラーゼの採取
は、酵素を採取するための常法に従って。

分離、精製することができる。すなわち、濾過法。

遠心分離法などの公知の適当な方法により菌体や培地固
形物を分離して、上澄液または濾液を得ることができる
。これらの分離液を濃縮し、噴霧乾燥する方法や凍結乾
燥する方法、または濃縮することなく可溶性塩類を添加
し沈澱させる塩析法、親水性有機溶剤を添加して沈澱さ
せる沈澱法によりセルラーゼを得ることができる。さら
に酵素を精製するには、例えばイオン交換樹脂等を用い
た吸着脱離法、ゲル濾過法等の精製手段を単独または複
数組み合わせて、セルラーゼを精製することができる。

醒糞０ｎ厘 本発明のセルラーゼについて、その詳細な性質を記載す
る。

の　　−゛ ■カルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）をＭ／２０炭酸
ナトリウム−Ｍ／２０ホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，０）で溶解したものを基質として用い測定する。

具体的には、１％ＣＭＣ（ｐＨ９，０）１．０　ｄ１Ｍ
／２０炭酸ナトリウム−Ｍ／２０ホウ酸−塩化カリウム
緩衝液（ｐＨ９，０）　０．９　ｍｌからなる基質溶液
に酵素液０．１ｍｌを加え、３０℃、１５分間反応した
０反応後、４−ヒドロキシベンゾイックヒドラジド（４
−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ　ｈｙｄｒａｚｉｄｅ
）法（ｐＨＢＡＨ法）にて還元糖の定量を行った。すな
わち、反応液２．０　ｍｌにｐＨＢＡＨ試薬１．０　ｍ
ｌを加え、１０分間、１００℃で加熱発色させ、冷却後
、波長４１０　ｎ■で比色定量した。酵素力価は、上記
の条件下で１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する
還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

■アビセラーゼ活性 アビセル（メルク社）をｌ’ｌ／２０炭酸ナトリウム−
Ｍ／２０ホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９，０）に
懸濁したものを基質に用い測定した。具体的には、１０
ル／ｍｌアビセル（ｐＨ９，０）　ｔ、９ｍｌに酵素液
０．１ｍｌを加え、３０℃、３００分間反応せた０反応
後。

反応液２．０　ｍｌにｐＨＢＡＨ試薬１．０朧ｌを加え
。

１０分間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、波長４１
０　ｎｍで比色定量した。酵素力価は、上記の条件下で
１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を生
成する酵素量を１単位とした。

■β−グルコシダーゼ及びＰ−ニトロフェニルセロビオ
シド分解活性 合成基質であるＰ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラ
ノシド（ｐＮＰＧ）、　及びｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ
−セロビオシド（ｐＮＰＣ）を基質に用い測定した。具
体的には、Ｍ／２０炭酸ナトリウム−Ｍ／２０ホウ酸−
塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９，０）１．５ｍｌ、５０＋
ｍＭＰＮＰＯまたは、　５ｍＭｐＮＰＣＯ，１ｍｌから
なる基質溶液に酵素液０．１耐を加え、３０℃、３００
分間反応せ、遊離するＰ−ニトロフェノールを波長４０
０ｎ鳳で比色定量した。この条件下で１分間に１μｍｏ
ｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位
とした。

１巣曵ユ宜 （１）作用 本酵素は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）や結
晶性の高いアビセルに作用して。

βグルコシド結合を加水分解する。また、合成基質であ
るｐ−ニトロフェニルセロビオシドに作用して、ｐ−ニ
トロフェノールを遊離させる。

（２）基質特異性 本酵素は、ＣＭＣ、アビセル、ｐ−ニトロフェニルβ−
Ｄ−セロビオシド（ｐＮＰＣ）に作用し、ｐ−ニトロフ
ェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＰＧ）には作用
しない、ＣＭＣアーゼ活性を１００とすると、アビセラ
ーゼ活性は３、ｐＮＰＣ分解活性は０．　３の相対活性
を示す。

基質　　　　　　相対活性 ＣＭＣ１００ アビセル　　　　　　　　　３ ｐＮＰＧ　　　　　　　　　　０ ｐＮＰＣ０，３ （３）至適ｐＨ ブリトン・ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓ
ｏｎ）の広域＆ＩＷＩ液（ｐＨ６〜１１）を用い、ＣＭ
Ｃを基質として測定した場合、９．５〜１０．５である
。

反応ｐＨと相対活性との関係を第１図に示す。

（４）安定ｐＨ範囲 ｐＨの異なる緩衝液の下で、３０℃で３０分間放置し、
ＣＭＣ（ｐＨ９，０）を基質として測定した場合、安定
ｐＨは６〜１１である。熱処理ｐＨと残存活性を第２図
に示す。

（５）至適温度 ＣＭＣを基質として測定した場合、至適温度は約５５℃
である。Ｊｉ応湯温度相対活性の関係を第３図に示す。

（６）熱安定性 阿／２０炭酸ナトリウムーＭ／２０ホウ酸−塩化カリウ
ム緩衝液（ｐＨ９，０）の下で、各温度（５〜６５℃）
で３０分間熱処理し、ＣＭＣを基質として測定した場合
、４０℃付近まで全く失活せず、５５℃で約５０％、６
５℃で約３０％の残存活性を有する。

熱処理温度と残存活性の関係を第４図に示す。

（７）酵素阻害剤、金属イオン及びキレート剤の影響 Ｃｕ”（５ｍＭ）、バラマーキュリ安息香ＩＩ（５ｍ　
Ｍ　）によって阻害を受け、Ｃａ”　（５ｍＭ）によっ
て活性化される。　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（５ｍ　Ｍ　）
による影響は受けない。

（８）界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム３０００　
ｐｐｍの存在下（Ｊ）Ｈ９，Ｏ）で３０℃、２時間処理
してもほとんど失活しない、処理時間と残存活性の関係
を第５図に示す。

（９）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により得ら
れた分子量は、５２０００±２０００である。

（１０）等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定
した結果、４．０以下である。

本酵・素は、バチルス属に属する菌株バチルスＳＤ４０
１株によって生産され、高アルカリｐＨ領域に最適ｐＨ
を有するものであり、特公昭５０−２８５１５号及び、
特開昭８３−１０９７７８号に記載されているアルカリ
セルラーゼと比較した場合は、本酵素の分子量が５２０
００±２０００であるのに対し、上記アルカリセルラー
ゼの分子量は１５０００．３００００及び１ｓｏｏｏｏ
であること並びに他の物理化学的性質が異なる点におい
て明かに別異の酵素である。

［発明の効果］ 本発明のセルラーゼは、至適ｐＨが９．５〜１０．５と
高く、ｐＨ１１においても最適ｐＨの約７０％の相対活
性を有しいると共に＋　　ｐＨ６においても約６０％の
相対活性を有し、広いｐＨ領域で活性を保持している。

また低温側においても充分活性を有する。更に洗剤成分
である陰イオン性界面活性剤に対する安定性が高いため
、洗剤用酵素として使用でき、洗浄力の増強を図ること
が出来る。

次に本発明について代表的な実施例を挙げて更に具体的
に説明する。

実ｌ（医」− ペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸二カリ
ウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％。

酵母エキス０．５％、セロビオース０．５％、ＣＭＣ０
，５％、炭酸ナトリウム０．５％からなる液体培地を試
験管に分注し、常法により滅菌した。これにＳＤ−４０
１株を接種し、３５℃で２５時間振盪培養した。培養液
を遠心分離し、その上澄のセルラーゼ活性を測定したと
ころ０．２０／ｍｌであった。

爽厳透２ 大豆粉２％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸二カリウ
ム０．１％、硫酸マグネシウム０．０２％、酵母エキス
０．５％、マルトース０．５％、ＣＭＧ　Ｏ，１％、炭
酸ナトリウム０．３％からなる液体培地を５Ｌ培養槽に
入れ、蒸気滅菌した。これにあらかじめ培養しておいた
ＳＤ−４０１株を接種し、３５℃で３５時間通気攪拌培
養を行った。この培養液を遠心分離し、上澄を得た。こ
の上澄のセルラーゼ活性は１．Ｉ　Ｕ／ｍｌであった。

この上澄液１．３Ｌを限外濾過膜で濃縮し、凍結乾燥し
てセルラーゼ比活性１００　ｕｌｚの粗酵素を得た。

実差勇ｌ 実施例２で得られた粗酵素から本発明のセルラーゼを精
製した。

粗酵素４ｇを２００　ｍ　ｌの１０ｍＭ　　炭酸ナトリ
ウム−１０ｍＭホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９）
に溶かし、硫酸アンモニウム沈澱法にて２０−７０％画
分の沈澱を得た。この沈澱を上記緩衝液に溶かし、限外
濾過膜により脱塩後、１０ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で平衡化したＣＭ（カルボキシメチル）陽イ
オン交換樹脂カラム（２５ｍｍφ、３０ｃｍ）で精製し
、得られた活性画分を更に、同ＣＭ陽イオン交換樹脂カ
ラムで精製を行った。同操作で溶出した活性両分を限外
濾過膜で濃縮脱塩後、１０ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で平衡化したＤＥＡＥ　（ジエチルアミノエ
チル）陰イオン交換樹脂カラム（２５ｍｍφ、３６ｃｍ
）に吸着させ、塩化ナトリウムの濃度勾配（０〜ＬＭ）
で溶出させた。粗酵素中にＣＭＣアーゼは少なくとも３
成分存在した。ＤＥＡＥ陰イオン交換樹脂での分画と活
性の関係を図６に示した。この主成分であるＣＭＣアー
ゼ（分画番号１２２〜１４１）を限外濾過膜で濃縮説塩
後、更に同ＤＥＡＥ陰イオン交換樹脂にて精製を行った
。同操作で溶出した活性両分を限外濾過膜にて脱塩を行
い、凍結乾燥後、１０ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐＨ７
，０）に溶かし、１０ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐＨ７
，０）で平衡化したフェニルセファロース　ＣＬ４Ｂカ
ラムに吸着させ、硫酸アンモニウムの濃度勾配（１〜Ｏ
Ｍ）で溶出させた。同操作で溶出した活性画分を限外濾
過膜にて脱塩を行い、凍結乾燥した。この過程で２．２
ｍｇの凍結乾燥標品を得た。

この凍結乾燥標品は白色であり、ボリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により試験したところ単一であることが確
認された。

この凍結乾燥標品を用いて、至適ｐＨ，ｐＨ安定性、至
適温度、熱安定性、界面活性剤に対する安定性を調べた
結果は第１図〜第５図に示した通りである。

裏ム舅Ａ 本発明セルラーゼの洗浄試験を実施した。

（ａ）汚染布の作成 約２００ｍ１の活性炭を乳バチへ入れ、純水で練りなが
ら水溶液にする。パレット中で綿布に均一に塗布し、自
然乾燥させ、２０回づつスポンジでこすり余分な活性炭
を除＜、５ｃｍＸ５ｃｍに裁・断し、洗浄試験に供した
。

（ｂ）洗浄試験 洗浄はターボトメ−ター（Ｔｅｒｇ−０−Ｔｏ＋ａｅｔ
ｅｒ）にて行った。洗浄条件は回転数１２Ｏｒｐｍにて
３０’Ｃ。

１０分間、洗剤（Ｊ　Ｉ　Ｓ無リン）濃度１３３０　ｐ
ｐｍとした。実施例２で得られた粗酵素をＬｏＩＩｇル
の濃度で添加すると無添加に比べ　白炭で５％、洗濯効
率で８％の向上がみられた。

【図面の簡単な説明】

第１図は反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフであ
る。 第２図は熱処理ｐＨと残存活性を示すグラフである。 ３１３図は反応温度と相対活性の関係を示すグラフであ
る。 第３図 第４図 第４図は熱処理温度と残存活性の関係を示すグラフであ
る。 第５図は直鎖アルカリベンゼンスルホン酸ナトリウム３
０００ｐｐ＋ａの存在下での安定性を示すグラフである
。 第６図は一回目のＤＥＡＥ陰イオン交換樹脂での分画と
活性を示すグラフである。 第１図 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の性質を有する新規セルラーゼ （１）至適ｐＨ、至適温度 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質とした場
   合の至適ｐＨが９．５〜１０．５、至適温度が約５５℃
   である。 （２）安定ｐＨ ３０℃で３０分処理したときｐＨ６〜１１まで安定であ
   る。 （３）界面活性剤の影響 ３０００ｐｐｍの直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナト
   リウム存在下（ｐＨ９．０）で３０℃、２時間処理して
   も９０％以上の残存活性を有する。 （４）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により測定した分
   子量が５２０００±２０００である。 （５）等電点 等電点電気泳動によって測定した等電点が ４．０以下である。 ２、バチルス属に属し請求項１に記載のセルラーゼ生産
   能を有する微生物を培地に培養し、培養物から目的とす
   るセルラーゼを採取することを特徴とする請求項１に記
   載のセルラーゼの製造方法。 ３、請求項１記載のセルラーゼ生産能を有する微生物。 ４、菌株がバチルスＳＤ４０１株（微工研菌寄第１０５
   ２７号）である請求項３記載の微生物。