JPH02215384A - 組織プラスミノーゲンアクチベーターミユーテイン、その製造方法および該ミユーテインを含有する凝血塊溶解剤 - Google Patents
組織プラスミノーゲンアクチベーターミユーテイン、その製造方法および該ミユーテインを含有する凝血塊溶解剤Info
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- JPH02215384A JPH02215384A JP1275117A JP27511789A JPH02215384A JP H02215384 A JPH02215384 A JP H02215384A JP 1275117 A JP1275117 A JP 1275117A JP 27511789 A JP27511789 A JP 27511789A JP H02215384 A JPH02215384 A JP H02215384A
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- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
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- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、新規の組織プラスミノーデンアクチペータ−
（ｔ−ＰＡ）ミューティン（Ｍｕｔ、ｅｌｎ：突然変異
タンパク質）、その製造方法２よび該ミューティンを含
有する凝血塊溶解剤に関する。
（ｔ−ＰＡ）ミューティン（Ｍｕｔ、ｅｌｎ：突然変異
タンパク質）、その製造方法２よび該ミューティンを含
有する凝血塊溶解剤に関する。
従来の技術
凝固血液は蛋白質マトリックスの主成分としてポリマー
フィブリンを含有している。このフィブリンはグラスミ
ノによって加水分解される。
フィブリンを含有している。このフィブリンはグラスミ
ノによって加水分解される。
グラスミノは、グラスミノ−ｒノから所Ｍｆラスミノー
ｒノアクチベーター 例えば組織プラスミノ−）ｆンア
クチペーター（ｔ、１８１ｕｅ−ｔｙｐｅｐｌａｌｉｍ
ｉｎｏｇｅｎ ａｃ ｂｉｖａｔ、ｏｒ ＝ ｂ −Ｐ
Ａ ）による活性化によって形成される。天然ｔ−Ｐ
Ａまたは珊乳動物の細胞から遺伝子工学的に得られたｔ
−ＰＡの酵素活性（プラスミノーゲンからプラスミンを
生成する触媒的活性化）は、フィブリンまたはフイデリ
７分解生成物（Ｆ８Ｐ ）の不在では極めて小さいが、
これらの賦活体の存在では著しく増大されうる（１０倍
を越える）。
ｒノアクチベーター 例えば組織プラスミノ−）ｆンア
クチペーター（ｔ、１８１ｕｅ−ｔｙｐｅｐｌａｌｉｍ
ｉｎｏｇｅｎ ａｃ ｂｉｖａｔ、ｏｒ ＝ ｂ −Ｐ
Ａ ）による活性化によって形成される。天然ｔ−Ｐ
Ａまたは珊乳動物の細胞から遺伝子工学的に得られたｔ
−ＰＡの酵素活性（プラスミノーゲンからプラスミンを
生成する触媒的活性化）は、フィブリンまたはフイデリ
７分解生成物（Ｆ８Ｐ ）の不在では極めて小さいが、
これらの賦活体の存在では著しく増大されうる（１０倍
を越える）。
生体内のｂ−ＰＡの作用機構は例えばＫＯｒｎｉｇｅｒ
＆ ｃｏｌｌｅｎ ： Ｔｈｒｏｍｂ、 Ｉ（ａｍｏｓ
ｂａｍｌｓ ４６ （１９８１）ｐ５６１〜５６５に記
載されている。フイブリノーゲンによるｔ−ＰＡＯ活性
の賦活は、他の公知の！ラスミノーデンアクチベーター
例えはウロキナーゼまたはストレプトキナーゼに比べ
ると決定的に有利である〔参照： Ｚ、Ｂ、Ｍ。
＆ ｃｏｌｌｅｎ ： Ｔｈｒｏｍｂ、 Ｉ（ａｍｏｓ
ｂａｍｌｓ ４６ （１９８１）ｐ５６１〜５６５に記
載されている。フイブリノーゲンによるｔ−ＰＡＯ活性
の賦活は、他の公知の！ラスミノーデンアクチベーター
例えはウロキナーゼまたはストレプトキナーゼに比べ
ると決定的に有利である〔参照： Ｚ、Ｂ、Ｍ。
ＨＯｙｌａＪ）ＪＪ等、Ｊ、Ｂｊｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
２５７ （ｉ ９８２）、ｐ２９１２〜２９１９ ；
Ｗ、Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ等、Ｂｌｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙ日、 ＡｃＬａ ７５５ （１９８５）
、ｐ５６１〜５６６〕。
２５７ （ｉ ９８２）、ｐ２９１２〜２９１９ ；
Ｗ、Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ等、Ｂｌｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙ日、 ＡｃＬａ ７５５ （１９８５）
、ｐ５６１〜５６６〕。
［１−ＰＡはすでに臨床において血栓の有効な治療剤で
あることが判明しておシ、それ故にｔ、−ＰＡをできる
だけ多量に製造することが試みられている。
あることが判明しておシ、それ故にｔ、−ＰＡをできる
だけ多量に製造することが試みられている。
なるほど臨床的実験によって、有効な血栓溶解をも九ら
すためには、肝臓に２けるｔ−ＰＡの分解速度が早いの
で、多量の？−ＰＡが必要でおることが判っている。し
かし高い治療用層は例えば出血のようなＭＩＪ作用を招
く。従って、この血栓溶解を改善しかつ全身的フィブリ
ン溶解のような副作用を低減するのが望ましい。また治
療用−の低減も達成されることが要求される。
すためには、肝臓に２けるｔ−ＰＡの分解速度が早いの
で、多量の？−ＰＡが必要でおることが判っている。し
かし高い治療用層は例えば出血のようなＭＩＪ作用を招
く。従って、この血栓溶解を改善しかつ全身的フィブリ
ン溶解のような副作用を低減するのが望ましい。また治
療用−の低減も達成されることが要求される。
詳細な研究の結果、？−ＰＡは第１図で示す領域から成
ることが判った。
ることが判った。
ヨーロッパ特許出願公開第０２４１２１０号明細書には
、数個のフィブリンフィンガー（Ｆｉｂｒｉｎｆｉｎｇ
ｅｒ）領域を有するｂ−ＰＡミューティンが記載されて
いる。フィブリンフィンガー領域のＤＮＡ配列は制限断
片として単一され、合成リンカ−を介して該タンパク質
の第１番目のアミノ酸の前に置かれた。しかし合成リン
カ−を用いるために天然Ｏフィブリンフィンガー領域と
は異なるアミノ酸配列を生じる。
、数個のフィブリンフィンガー（Ｆｉｂｒｉｎｆｉｎｇ
ｅｒ）領域を有するｂ−ＰＡミューティンが記載されて
いる。フィブリンフィンガー領域のＤＮＡ配列は制限断
片として単一され、合成リンカ−を介して該タンパク質
の第１番目のアミノ酸の前に置かれた。しかし合成リン
カ−を用いるために天然Ｏフィブリンフィンガー領域と
は異なるアミノ酸配列を生じる。
ヨーロッパ特許出願公開第０２５１６２４号には、合成
さｎた＊−ＰＡｆ伝子およびそれから製造され友ｔ−Ｐ
Ａ−ミューティンが記載されているが、このミューティ
ンは各領域を高々２回含む。こ（Ｄ ＤＮＡは、新しい
制限断片を配列に導入して個々の領域のクローニングを
容易にするように合成され友。これによってアミノ酸の
位置が特に領域の移行場所で著しく変更され九。つまシ
こ（ＤＬ−ＰＡ−ミューティンの場合にもアミノ酸配列
は天然の該タンパク質の配列とは異なる。
さｎた＊−ＰＡｆ伝子およびそれから製造され友ｔ−Ｐ
Ａ−ミューティンが記載されているが、このミューティ
ンは各領域を高々２回含む。こ（Ｄ ＤＮＡは、新しい
制限断片を配列に導入して個々の領域のクローニングを
容易にするように合成され友。これによってアミノ酸の
位置が特に領域の移行場所で著しく変更され九。つまシ
こ（ＤＬ−ＰＡ−ミューティンの場合にもアミノ酸配列
は天然の該タンパク質の配列とは異なる。
発明が解決しよりとするＳ題
従って本発明は、天然のｔ−ＰＡよシも増大されたフィ
ブリン結合力および賦活性を有しかつ依然として生物学
的ｔ、−Ｆ’Ａのすべての特性を有するｂ−ＰＡ−ミュ
ーティンを製造するという課題を基礎にしている。
ブリン結合力および賦活性を有しかつ依然として生物学
的ｔ、−Ｆ’Ａのすべての特性を有するｂ−ＰＡ−ミュ
ーティンを製造するという課題を基礎にしている。
課題を解決する丸めの手段
前記課題は、本発明にょシ、ブイゾリンフィンガーおよ
びクリングル（Ｋｒｉｎｇｅｌ） ｆｆ領域の少なくと
も一つの天然アミノ酸配列を数倍化ちれた杉で有する組
域ノラスミノーデンアクチペーター（ｔ−ＦＡ）ミュー
ティンによって解決される。
びクリングル（Ｋｒｉｎｇｅｌ） ｆｆ領域の少なくと
も一つの天然アミノ酸配列を数倍化ちれた杉で有する組
域ノラスミノーデンアクチペーター（ｔ−ＦＡ）ミュー
ティンによって解決される。
天然アミノ酸配列とは、本発明の範囲では、ｐｅｎｎｉ
ｃａ等、Ｎａｔｕｒｅ ５０１．２１４頁（１９８３）
から公知の、個々の領域のアミノ酸配列の意である。数
倍化は天然１．−ＰＡＯＤＮＡ配列Ｏエクンンーイント
ロン範囲に従って行なわれる。従って両領域の少なくと
も一つを数倍化された形で含むが、その配列中に付加的
な他のアミノ酸を有することはなく、またアミノ酸の欠
失していないタンパク質が得られる。数倍化された配列
は好゛ましくは２倍であるが、しばしば６倍または４倍
以上であってもよい・ さらに本発明の好ましい実施態様の場合には、ｂ−ｐＡ
−ミューティンにおいてＥＧＦ’ （上皮成長因子）ｔ
たは／ひよびクリングル（Ｋｒｌｎｇｅｌ） ［領域の
アミノ酸配列が欠失されている。ＥＧＦ領域Ｏ欠失によ
って半減期が天然Ｌ−ＰＡに比べて著しく延長される。
ｃａ等、Ｎａｔｕｒｅ ５０１．２１４頁（１９８３）
から公知の、個々の領域のアミノ酸配列の意である。数
倍化は天然１．−ＰＡＯＤＮＡ配列Ｏエクンンーイント
ロン範囲に従って行なわれる。従って両領域の少なくと
も一つを数倍化された形で含むが、その配列中に付加的
な他のアミノ酸を有することはなく、またアミノ酸の欠
失していないタンパク質が得られる。数倍化された配列
は好゛ましくは２倍であるが、しばしば６倍または４倍
以上であってもよい・ さらに本発明の好ましい実施態様の場合には、ｂ−ｐＡ
−ミューティンにおいてＥＧＦ’ （上皮成長因子）ｔ
たは／ひよびクリングル（Ｋｒｌｎｇｅｌ） ［領域の
アミノ酸配列が欠失されている。ＥＧＦ領域Ｏ欠失によ
って半減期が天然Ｌ−ＰＡに比べて著しく延長される。
それというのもこの領域は肝臓における該タンパク質の
迅速な分解にとって不可欠だからである。クリンｒル■
領域は活性の損失なしに欠失されうる、この場合にはア
ミノ酸配列が倍化によって過度に延長されないという利
点が得られる。
迅速な分解にとって不可欠だからである。クリンｒル■
領域は活性の損失なしに欠失されうる、この場合にはア
ミノ酸配列が倍化によって過度に延長されないという利
点が得られる。
本発明の好ましい実施態様においては、ｂ−ＰＡ−ミュ
ーティンのフィブリンフィンガー領域、つまジアミノ酸
４〜４９が倍化されている。
ーティンのフィブリンフィンガー領域、つまジアミノ酸
４〜４９が倍化されている。
また極めて好ましい実施態様の場合には、ＥＧＦ領域の
アミノ酸、りまジアミノ酸５０〜８７が欠失されておシ
、クリングル１領域のアミノ酸９８〜１７５が欠失され
てりる。
アミノ酸、りまジアミノ酸５０〜８７が欠失されておシ
、クリングル１領域のアミノ酸９８〜１７５が欠失され
てりる。
他の好ましい本発明の実＃ｉ悲様の場合には、クリンｒ
ル■領域のアミノ酸、つまりアミノ酸１７６〜２６１が
倍化されている。さらに極めて好ましい実施態様の場合
、ＥＧＦ領域およびクリンデルＩ領域のアミノ酸が欠失
されている。
ル■領域のアミノ酸、つまりアミノ酸１７６〜２６１が
倍化されている。さらに極めて好ましい実施態様の場合
、ＥＧＦ領域およびクリンデルＩ領域のアミノ酸が欠失
されている。
第３蕾目の好ましい実施態様の場合には、ＥＧＦおよび
クリ／デル１領域が欠失されておシかクワイプリンフィ
ンガーンよびクリンデルＵ領域が倍化されている。
クリ／デル１領域が欠失されておシかクワイプリンフィ
ンガーンよびクリンデルＵ領域が倍化されている。
本発明によるｔ、−ＰＡ−ミューティンが原核生物か真
核生物で発現されるかどうかに応じて、該ミューティン
はグ替コシル化または非グリコジル化されている。本発
明の好ましい実施態様の場合には、ｔ、−ＰＡ−ミュー
ティンはグリコジル化されてｓｒ Ｄ 、従って天然０
ｈ−ＰＡに極めて類似している。
核生物で発現されるかどうかに応じて、該ミューティン
はグ替コシル化または非グリコジル化されている。本発
明の好ましい実施態様の場合には、ｔ、−ＰＡ−ミュー
ティンはグリコジル化されてｓｒ Ｄ 、従って天然０
ｈ−ＰＡに極めて類似している。
本発明の他の対象は、本発明によるｅ−ＰＡ−ミューテ
ィンの製造方法であり、このｐ数個の光全ｔ−ＰＡ遺伝
子を縦列配置で適当なベクターに挿入し、オリゴヌクレ
オチド部位の突然変異誘発によって、生成物に２いて数
倍化されていてはならないタンパク質領域のアミノ酸を
コードしているＤＮＡ配列を除去し、このようにして得
られた突然変異ベクターを適当な細胞に導入しかつ増幅
し、その中で欠失の起つ九ベクターｔ−取得し、同ベク
ターを適当な宿主細胞で発現させる。前記のオリゴヌク
レオチド部位の突然変異−発は自体公知の方法により実
施する（例えばＭＯｒｉｎａｇａ等、（１９８４） Ｂ
ｌｏＬｅｃｈ−ｎＯＩＯｇＹ ２＊ ６３４ ）。
ィンの製造方法であり、このｐ数個の光全ｔ−ＰＡ遺伝
子を縦列配置で適当なベクターに挿入し、オリゴヌクレ
オチド部位の突然変異誘発によって、生成物に２いて数
倍化されていてはならないタンパク質領域のアミノ酸を
コードしているＤＮＡ配列を除去し、このようにして得
られた突然変異ベクターを適当な細胞に導入しかつ増幅
し、その中で欠失の起つ九ベクターｔ−取得し、同ベク
ターを適当な宿主細胞で発現させる。前記のオリゴヌク
レオチド部位の突然変異−発は自体公知の方法により実
施する（例えばＭＯｒｉｎａｇａ等、（１９８４） Ｂ
ｌｏＬｅｃｈ−ｎＯＩＯｇＹ ２＊ ６３４ ）。
本発明の好ましい実施１１１１様においては、２個のＵ
−ＰＡ遺伝子金ベクターに挿入する前に、これらの遺伝
子から同様にオリゴヌクレオチド部位の突然変５ｒｔｓ
発によってＥＧＦ領域および／またはクリングルＩ領域
を除去する。
−ＰＡ遺伝子金ベクターに挿入する前に、これらの遺伝
子から同様にオリゴヌクレオチド部位の突然変５ｒｔｓ
発によってＥＧＦ領域および／またはクリングルＩ領域
を除去する。
オリゴヌクレオチド部位の突然変異誘発のためには、結
合すべきＤＮＡ配列（Ｄ ５’−および５′−配列のヌ
クレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを使用する。
合すべきＤＮＡ配列（Ｄ ５’−および５′−配列のヌ
クレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを使用する。
好ましくは１８〜２６個のヌクレオチド長さを有するオ
リゴヌクレオチドを使用する。
リゴヌクレオチドを使用する。
他の好ましい実施態様においては、先づｇＧＦおよびク
リソデル１領域を除去し、次にフィブリンフィンガー（
Ｆ）、クリングルＩ （Ｋ２）および軽い鎖（プロテア
ーゼ’） ＝ （Ｌ）の領域を２回連続的にベクターに
導入し、これによって配列Ｆ’に２ＬＦＫ２Ｌが得られ
かりＣの配列からオリゴヌクレオチド部位の突然変異誘
発によって、２個のＦ領域ｏ＠３の配列、すなわちに２
およびり。
リソデル１領域を除去し、次にフィブリンフィンガー（
Ｆ）、クリングルＩ （Ｋ２）および軽い鎖（プロテア
ーゼ’） ＝ （Ｌ）の領域を２回連続的にベクターに
導入し、これによって配列Ｆ’に２ＬＦＫ２Ｌが得られ
かりＣの配列からオリゴヌクレオチド部位の突然変異誘
発によって、２個のＦ領域ｏ＠３の配列、すなわちに２
およびり。
ま几は２個のに２領域の間の配列、つまりＬおよびＦを
除去する。これからＦＦＫ２ＬまたはＰＩ３に２Ｌ領域
を有するミニ−ティンのためｃＤＮＡ配列を含むベクタ
ーが得られる。
除去する。これからＦＦＫ２ＬまたはＰＩ３に２Ｌ領域
を有するミニ−ティンのためｃＤＮＡ配列を含むベクタ
ーが得られる。
本発明の好ましい実施態様においては、ｂ−ＰＡ−ＤＮ
ＡとしてＬ−ＦＡ−ｃＤＮＡを使用する。得られたベク
ターは好ましくは原核細胞で増幅され、この際ｎａｅｌ
ｑｆラスミドを含むＬｃｏｌｉ株を使用する。好筐しい
実施態様にかいては、その中で欠失の起ったベクターの
選択後に、該ベクターを真核生物で発現させる。この発
現は確かに原核生物でも可能であるが、原核生物からは
非グリコジル化生成物が得られる。しかしグリ ｌ；シル化生成物が天然のｔ、−ＰＡに類似しているの
で、真核生物での発現が有利である。極めて好ましい実
施態様においては、ＣＨＯ細胞で発現を行なう。好まし
くは真核生物での発現のためには、ベクターとしてジヒ
ドロ葉酸レダクターゼまたはウシのパピローマウィルス
ｋｉｎとする増鴇可能なベクターを使用する。
ＡとしてＬ−ＦＡ−ｃＤＮＡを使用する。得られたベク
ターは好ましくは原核細胞で増幅され、この際ｎａｅｌ
ｑｆラスミドを含むＬｃｏｌｉ株を使用する。好筐しい
実施態様にかいては、その中で欠失の起ったベクターの
選択後に、該ベクターを真核生物で発現させる。この発
現は確かに原核生物でも可能であるが、原核生物からは
非グリコジル化生成物が得られる。しかしグリ ｌ；シル化生成物が天然のｔ、−ＰＡに類似しているの
で、真核生物での発現が有利である。極めて好ましい実
施態様においては、ＣＨＯ細胞で発現を行なう。好まし
くは真核生物での発現のためには、ベクターとしてジヒ
ドロ葉酸レダクターゼまたはウシのパピローマウィルス
ｋｉｎとする増鴇可能なベクターを使用する。
極めて好ましい実施態様においては、シラスミドｐＡｔ
８／ｉ 、ｐｋ１９／１ ’ＣＥ、ｃｏｌｉで発現させ
る本発明の他の対象は、領域ＦＦＫ２ＬまたはＦＫ２に
２Ｌの念めＯミューティンＤＮＡ ’ｉ含むプラスミド
ｐＡ１８／１．１）Ａｉ９／１ 、同一領域のＤＮＡ配
列を有するが、さらに真核シグナル配列も含むグラスミ
ドｐＡ２４およびｐＡ２５、およびＦＦＫ２ＬおよびＦ
Ｋ２に２Ｌのための増＋１ｇ可能な真核発現ベクターで
あるプラスミドｐＳＶ−ＦＦＫ２Ｌ−ｄｈｆｒおよびｐ
ｓＶ −ＦＫ ２に２Ｌ −ｄｈｆｒである。
８／ｉ 、ｐｋ１９／１ ’ＣＥ、ｃｏｌｉで発現させ
る本発明の他の対象は、領域ＦＦＫ２ＬまたはＦＫ２に
２Ｌの念めＯミューティンＤＮＡ ’ｉ含むプラスミド
ｐＡ１８／１．１）Ａｉ９／１ 、同一領域のＤＮＡ配
列を有するが、さらに真核シグナル配列も含むグラスミ
ドｐＡ２４およびｐＡ２５、およびＦＦＫ２ＬおよびＦ
Ｋ２に２Ｌのための増＋１ｇ可能な真核発現ベクターで
あるプラスミドｐＳＶ−ＦＦＫ２Ｌ−ｄｈｆｒおよびｐ
ｓＶ −ＦＫ ２に２Ｌ −ｄｈｆｒである。
本発明の他の対象は、少なくともフィデ替ンフィンガー
および／またはクリンデル■領域の数倍化されている、
本発明による？−ＰＡミューティンを含有する凝血塊溶
解剤である。該溶解剤は、極めて好ましくは、さらにＥ
ＧＦおよびクリンｒル］領域が欠失されでいるｔ−ＰＡ
誘導体を含有している。該溶解剤は極めて好ましい実施
態様の場合には、ＦＦ’に２ＬまたはＦＫ２に２Ｌ領域
を有するミューティンを含有している。
および／またはクリンデル■領域の数倍化されている、
本発明による？−ＰＡミューティンを含有する凝血塊溶
解剤である。該溶解剤は、極めて好ましくは、さらにＥ
ＧＦおよびクリンｒル］領域が欠失されでいるｔ−ＰＡ
誘導体を含有している。該溶解剤は極めて好ましい実施
態様の場合には、ＦＦ’に２ＬまたはＦＫ２に２Ｌ領域
を有するミューティンを含有している。
本発明は、増大されたフィブリン結合力およびフィブリ
ン賦活性を有し、好ましくは明らかする。さらに該ｆｌ
−ＰＡミューティンの場合には真核生物に２ける生成速
度が増大される。
ン賦活性を有し、好ましくは明らかする。さらに該ｆｌ
−ＰＡミューティンの場合には真核生物に２ける生成速
度が増大される。
従って、ｂ−ＰＡの含分が著しく少ないにも拘らず明ら
かに増大された効能を示す凝血塊溶解剤を製造するＯと
ができる。
かに増大された効能を示す凝血塊溶解剤を製造するＯと
ができる。
次に図面との関連において実施例により本発明を詳述す
る。
る。
例１
ＦＦＫ ２ Ｌの製造
ａ）前槽ＥＦ’に２Ｌ／ＦＫ２１゜
出発プラスミドｐＲＥＭ ７６８５ （ａ −ｃｘツバ
特特許出願公開第０２４２８３芳 は次の構成！！素を含む： ｔａｃ−プロモーターＡＴ
Ｇ開始コドンｔ−有する１ａｃ−オペレーター領域、ミ
ューティンＦＫ２Ｌのコード領域、ｐＫＫの ２２３−３から転写ターミネータ−１β−ラクタマーゼ
遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子およびプラスミドｐＡ
ｃＹｃ １ ７ ７の複製開始点。ミューティンＦＫ２
Ｌの配列は、ヌクレオチド１ ９Ｏ−３３６ＣＦ領域）
、７１ ５−１ ８０９（Ｋ２領域、グロテアーゼ、比
較的小さい部分３’ＵＴ（非翻訳６′−領域））および
ＡＴＧ開始コドンから＊ｇされている。ヌクレオチドの
位ｆｔ ｕ Ｐｅｎｎ１ｃａ等（ Ｎａｔｕｒｅ ３
０ Ｉ、２１４（１９８３））によって記載された配列
によシ費示される。
特特許出願公開第０２４２８３芳 は次の構成！！素を含む： ｔａｃ−プロモーターＡＴ
Ｇ開始コドンｔ−有する１ａｃ−オペレーター領域、ミ
ューティンＦＫ２Ｌのコード領域、ｐＫＫの ２２３−３から転写ターミネータ−１β−ラクタマーゼ
遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子およびプラスミドｐＡ
ｃＹｃ １ ７ ７の複製開始点。ミューティンＦＫ２
Ｌの配列は、ヌクレオチド１ ９Ｏ−３３６ＣＦ領域）
、７１ ５−１ ８０９（Ｋ２領域、グロテアーゼ、比
較的小さい部分３’ＵＴ（非翻訳６′−領域））および
ＡＴＧ開始コドンから＊ｇされている。ヌクレオチドの
位ｆｔ ｕ Ｐｅｎｎ１ｃａ等（ Ｎａｔｕｒｅ ３
０ Ｉ、２１４（１９８３））によって記載された配列
によシ費示される。
プラスミドｐＲｇＭ ７６８５を、ブロモ−ター／オペ
レーター領域および転写シグナルを含むミューティンコ
ード領域から成るｔ−ＰＡミューティンの発現カセット
の重複の之めに、制限酵素Ｘｈｏ Ｉ Ｉによりて切断
し九〇この制限バッチを寒天ゲルで電気泳動法により分
離し、約１４８０ｂｐの大きさの断片を率離し九。
レーター領域および転写シグナルを含むミューティンコ
ード領域から成るｔ−ＰＡミューティンの発現カセット
の重複の之めに、制限酵素Ｘｈｏ Ｉ Ｉによりて切断
し九〇この制限バッチを寒天ゲルで電気泳動法により分
離し、約１４８０ｂｐの大きさの断片を率離し九。
第２のバッチではプラスミドｐＲｇＭ７ ６ ８ ５勿
酵累ＢａｍＨＩで線状化し、次にコウシ腸産生アルカリ
性ホスファターゼで処理しｔ０ 得られた２つのＤＮＡ断片の結合後に結合体をＬａｃＩ
ｑ−プラスミドを含０Ｌｃｏｌｉ細胞（ Ｄ８Ｍ３６８
９）で形質転換させた。プラスミド’ｔ−Ｗする形質転
換細胞會、培地にカナマイシン２５〜／ｍｊｉ加えて選
択する。
酵累ＢａｍＨＩで線状化し、次にコウシ腸産生アルカリ
性ホスファターゼで処理しｔ０ 得られた２つのＤＮＡ断片の結合後に結合体をＬａｃＩ
ｑ−プラスミドを含０Ｌｃｏｌｉ細胞（ Ｄ８Ｍ３６８
９）で形質転換させた。プラスミド’ｔ−Ｗする形質転
換細胞會、培地にカナマイシン２５〜／ｍｊｉ加えて選
択する。
制限酵素解析によって、形質転換細胞の中からプラスミ
ドｐＡ１ｓｔ−含むクローンを選択することができる。
ドｐＡ１ｓｔ−含むクローンを選択することができる。
このプラスミドに、就中ＸｈｏＩＩ断片の組込みおよび
所望の定位を保証する約ｔ４ｓｏｂｐの大きさの付加的
８ｍａ ［断片の出現によって、出発プラスミドｐＲＥ
Ｍ ７ ６ ８ ５から区別される。従ってｐＡ１ｓｈ
前記発現カセットを縦列配置で２倍有する。
所望の定位を保証する約ｔ４ｓｏｂｐの大きさの付加的
８ｍａ ［断片の出現によって、出発プラスミドｐＲＥ
Ｍ ７ ６ ８ ５から区別される。従ってｐＡ１ｓｈ
前記発現カセットを縦列配置で２倍有する。
ｂ）突然変異誘発
ミューティン遺伝子Ｆ’Ｆ’に２Ｌの構成の九めの出発
プラスミドとしてｔｚｐＡ１５？用いる。
プラスミドとしてｔｚｐＡ１５？用いる。
ｐＡ１５から所望の領域を欠失させるために、Ｍｏｒｉ
ｎａｇａ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２．６６４
（１９８４）の方法を用い九。ヘテロ二重鎖の形成の九
めにｐＡ １５から２個の断片を分離しｆｔｏ断片Ａ：
ｐＡ１５に２ｍの制限酵素ＥａｍＨＩおよび８ａｌｉ
（ポリリンカー領域）で切断し友。
ｎａｇａ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２．６６４
（１９８４）の方法を用い九。ヘテロ二重鎖の形成の九
めにｐＡ １５から２個の断片を分離しｆｔｏ断片Ａ：
ｐＡ１５に２ｍの制限酵素ＥａｍＨＩおよび８ａｌｉ
（ポリリンカー領域）で切断し友。
切断生底物？デル′亀気泳動法により分離し、ゲルから
大きなりａｍＨＩ ／ Ｂａ１ｌ断片を溶離した。
大きなりａｍＨＩ ／ Ｂａ１ｌ断片を溶離した。
断片Ｂ：ｐＡ１５″Ｉｔ制限酵素Ｘｈｏ Ｉで線状化し
次。
次。
線状化プラスミドを同様にしてデル電気泳動法により精
製し九。突然変異誘発の友めに次のオリイヌクレオチド
： ５’ ＧＣＣＴＧＴＣＡＡＡＧＴＧＡＴＣＴＣ）ＣＡ
５’全合成する。
製し九。突然変異誘発の友めに次のオリイヌクレオチド
： ５’ ＧＣＣＴＧＴＣＡＡＡＧＴＧＡＴＣＴＣ）ＣＡ
５’全合成する。
ヘテロ二重鎖の形成の穴めに、断片Ａ１断片Ｂ（それぞ
れ４５ Ｑ ｆｍｏｌ ）およびオリイヌクレオチド（
７５１）Ｍｏｌ ） ｋ混合し、先づＮａＣｔ５ Ｑ
ｍＭ、トリスＨＣｔ１０ ｍＭ （ｐ［（７，５）およ
びＭｇ８０４１０ｍＭｋ１００℃で３分恒温保持し、直
ちに氷上に移す。ＤＮＡの再結合’ｔ−６０℃で６０分
間行なう友。修復合成の几めに反応バッチ金調整しｔ：
デスオキシヌクレオチド三リン酸（０，２５ｍＭ）、Ａ
ＴＰ （ｍＭ ）、ＮａＣｔ（Ｉ ＤＯｍＭ ）、トリ
ス塩［ｐＨ７，５（６，５ｍＭ ）、ＭｇＣ’ｔ２（８
ｍＭ ）、β−メルカプトエタノール（１ｍＭ ）、Ｅ
、 ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメツーゼ（０，１２５０
／μｌバツチ）のフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ ） 断片お
よびＴ４りが一ゼ（０，ＩＵ／μｊバッチ）。次にこの
バッチｆ １ａｃＩｑプラスミド（ＤＡＭ ３６８９
） ｋ含Ｕ Ｅ、 ｃｏｌｉ ａ’Ｍで形質転換させ、
形質転換細胞を培地にカナマイシン２５μｙ／彪を加え
て選択し友。
れ４５ Ｑ ｆｍｏｌ ）およびオリイヌクレオチド（
７５１）Ｍｏｌ ） ｋ混合し、先づＮａＣｔ５ Ｑ
ｍＭ、トリスＨＣｔ１０ ｍＭ （ｐ［（７，５）およ
びＭｇ８０４１０ｍＭｋ１００℃で３分恒温保持し、直
ちに氷上に移す。ＤＮＡの再結合’ｔ−６０℃で６０分
間行なう友。修復合成の几めに反応バッチ金調整しｔ：
デスオキシヌクレオチド三リン酸（０，２５ｍＭ）、Ａ
ＴＰ （ｍＭ ）、ＮａＣｔ（Ｉ ＤＯｍＭ ）、トリ
ス塩［ｐＨ７，５（６，５ｍＭ ）、ＭｇＣ’ｔ２（８
ｍＭ ）、β−メルカプトエタノール（１ｍＭ ）、Ｅ
、 ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメツーゼ（０，１２５０
／μｌバツチ）のフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ ） 断片お
よびＴ４りが一ゼ（０，ＩＵ／μｊバッチ）。次にこの
バッチｆ １ａｃＩｑプラスミド（ＤＡＭ ３６８９
） ｋ含Ｕ Ｅ、 ｃｏｌｉ ａ’Ｍで形質転換させ、
形質転換細胞を培地にカナマイシン２５μｙ／彪を加え
て選択し友。
グローブとして前記の突然変異誘発オリゴヌクレオチド
七使用してコロニーハイブリッド法により、プラスミド
ルＡ１８／ｉｋ含むクローン七選択することができｔｏ
このグラスミドに、就中、差当ってミューティン発現カ
セットの重複によって導入された８ｍａ ｌ断片の欠落
によって出発プラスミドとは相違する。第２因ｅＸｐＡ
１８／１の製造過糧を略示しである。
七使用してコロニーハイブリッド法により、プラスミド
ルＡ１８／ｉｋ含むクローン七選択することができｔｏ
このグラスミドに、就中、差当ってミューティン発現カ
セットの重複によって導入された８ｍａ ｌ断片の欠落
によって出発プラスミドとは相違する。第２因ｅＸｐＡ
１８／１の製造過糧を略示しである。
ｃ） Ｅ、 ｃｏｌｉにおけるＦＦＫ２Ｌの発現プラ
スミドｐＡ１８／１ｅ、１ａｃｅ”プラスミド金倉ひＥ
、 ｃｏ：ｔｉ細胞（ＤＢＭ ３６８９ンで形質転換さ
せ几。プラスミドｔＷする細胞を培地で６７゛Ｃで通気
下に０Ｄａ５ｏ ” ０．４ ｖで培養し、０．２１ラ
クトースまたｆｉ５ｍＭのＪＰ’ｌ’Ｇ （インプロビ
ル−１−チオ−β−り一がラクトピラノシド）を加えて
３時間酵−ｘｍ導を行なう。所謂封入体を西独国特許出
願公開第５５５７７０８号に記載され友プｏ）コル（Ｐ
ｒｏｔｏｋｏｌＬ ）により細胞タンパク質から分離し
、突然変異されたｔ−ＦＡタンパク質か再生さｎ、７？
：ｅｃ、のようにして得られ九タンパク質に約４９ ｋ
Ｄの分子量を有し、ヒトのｔ−ＰＡに対するポリクロナ
ール抗体（ヤギで製造）に結合する。核再生ミューティ
ン（ヨーロッパ特許出幀公開第 ０２１９８７４号に記載されているように再生）は、プ
ラスミノーゲン分解試験においてアミド分解活性および
フィブリン賦活性を示す。
スミドｐＡ１８／１ｅ、１ａｃｅ”プラスミド金倉ひＥ
、 ｃｏ：ｔｉ細胞（ＤＢＭ ３６８９ンで形質転換さ
せ几。プラスミドｔＷする細胞を培地で６７゛Ｃで通気
下に０Ｄａ５ｏ ” ０．４ ｖで培養し、０．２１ラ
クトースまたｆｉ５ｍＭのＪＰ’ｌ’Ｇ （インプロビ
ル−１−チオ−β−り一がラクトピラノシド）を加えて
３時間酵−ｘｍ導を行なう。所謂封入体を西独国特許出
願公開第５５５７７０８号に記載され友プｏ）コル（Ｐ
ｒｏｔｏｋｏｌＬ ）により細胞タンパク質から分離し
、突然変異されたｔ−ＦＡタンパク質か再生さｎ、７？
：ｅｃ、のようにして得られ九タンパク質に約４９ ｋ
Ｄの分子量を有し、ヒトのｔ−ＰＡに対するポリクロナ
ール抗体（ヤギで製造）に結合する。核再生ミューティ
ン（ヨーロッパ特許出幀公開第 ０２１９８７４号に記載されているように再生）は、プ
ラスミノーゲン分解試験においてアミド分解活性および
フィブリン賦活性を示す。
ｄ）真核シグナル配列を有するＦＦＫ２Ｉ、の構成ミュ
ーティン遺伝子にリーダー配列および３’ＵＴ（３’非
翻訳領域）（厚相補的ＤＮＡ配列に相応する）を結合す
るために次の断片全分離した； １）ＵＣｌ３のポリリンカー中に、ｔ−Ｆ’Ａの５’Ｕ
Ｔ（５’非翻訳領域）、リーダー配列およびヌクレオチ
ド位置２０８１でのＮ末端配列ｋＷするプラスミドｐ７
．１ Ｃ０８Ｍ４７１９ ）から、約２．７ ｋｂの大
ささのＰｓｔｉ ／ Ｅ（ｉｎｄｌｌｌ断片を得た。
ーティン遺伝子にリーダー配列および３’ＵＴ（３’非
翻訳領域）（厚相補的ＤＮＡ配列に相応する）を結合す
るために次の断片全分離した； １）ＵＣｌ３のポリリンカー中に、ｔ−Ｆ’Ａの５’Ｕ
Ｔ（５’非翻訳領域）、リーダー配列およびヌクレオチ
ド位置２０８１でのＮ末端配列ｋＷするプラスミドｐ７
．１ Ｃ０８Ｍ４７１９ ）から、約２．７ ｋｂの大
ささのＰｓｔｉ ／ Ｅ（ｉｎｄｌｌｌ断片を得た。
プラスミドｐｅＰＡ９８．１ （ヨーロッパ特許出願公
開第０２４２８３５号参照）からは、約１２００ｂｐｋ
包含しかつグロテアーゼのコード部位および３’Ｕ’ｒ
’ｔＷするＨｌｎｄｌｌ ／ Ｓｃａ［断片を分離しｆ
ｃｏ ｐＡ、 １８ ／ １からｌずＢａｍＨＩ ／８
ｃａｌ ｈ片を精製し、このものからＰｓｔ［で部動的
に制限することによって約４７０ ｂｐ ｔ−包含する
ｐｓｔｌ ／ ８ｃａｌ断片會得九。この断片は重複さ
れた領域Ｆおよびに２領域のコード部位？有する。これ
らの断片會連結反応さゼ、１、ａｅＩｑプラスミド（Ｄ
ＢＭ ５６８９ ） ’に含むＢ、 ｃｏｌｉで形質転
換さゼた。カナマイシン耐性形質転換体全上記突然変異
誘発プライマーで遮蔽した。長さ２７００１）ｐ（１）
Ｕ（’ １２ベクター）； ７９０ｂｐ、７３０ｂｐ、
１４０ｂｐおよび７０ｂｐ（ｔ−ＰＡ＠片）のＰａｔ■
断片で制限すると正しいプラスミド（ｐＡ ２５ ）が
得られる。
開第０２４２８３５号参照）からは、約１２００ｂｐｋ
包含しかつグロテアーゼのコード部位および３’Ｕ’ｒ
’ｔＷするＨｌｎｄｌｌ ／ Ｓｃａ［断片を分離しｆ
ｃｏ ｐＡ、 １８ ／ １からｌずＢａｍＨＩ ／８
ｃａｌ ｈ片を精製し、このものからＰｓｔ［で部動的
に制限することによって約４７０ ｂｐ ｔ−包含する
ｐｓｔｌ ／ ８ｃａｌ断片會得九。この断片は重複さ
れた領域Ｆおよびに２領域のコード部位？有する。これ
らの断片會連結反応さゼ、１、ａｅＩｑプラスミド（Ｄ
ＢＭ ５６８９ ） ’に含むＢ、 ｃｏｌｉで形質転
換さゼた。カナマイシン耐性形質転換体全上記突然変異
誘発プライマーで遮蔽した。長さ２７００１）ｐ（１）
Ｕ（’ １２ベクター）； ７９０ｂｐ、７３０ｂｐ、
１４０ｂｐおよび７０ｂｐ（ｔ−ＰＡ＠片）のＰａｔ■
断片で制限すると正しいプラスミド（ｐＡ ２５ ）が
得られる。
例２
ＰＸ２に２Ｌの製造
ａ） Ｅ、 ｃｏｌｉにおける突然変異誘発および発
現ＦＫ２Ｌ二［１伝子−グラスミド１）Ａ１５から例１
によ、！７２Ｆ！／７１の断片ＡおよびＢｉ分離し九。
現ＦＫ２Ｌ二［１伝子−グラスミド１）Ａ１５から例１
によ、！７２Ｆ！／７１の断片ＡおよびＢｉ分離し九。
しかしこの場合にはへテロ二重ａ’ｒ形収するｔめに次
のオリー／スクレオチド： ５’ ＧＣＣＣＴＣＣＴ（）ＣＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧ
５’全使用し九〇 すべての実験段階金側１で記載し友ように行った。上記
突然変異誘発オリデヌクレオテドを用いるコロニーハイ
ブリッド法によって求めるプラスミドｐＡ１９／１ （
５，２ｋｂ）？含むクローン會見出した。このプラスミ
ドの特性上制限解析によって確認し、８ｍａｉ切断位置
の欠失を調べた〇 第２図は特にｐＡ１９／１の製造プロセスを略示する。
のオリー／スクレオチド： ５’ ＧＣＣＣＴＣＣＴ（）ＣＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧ
５’全使用し九〇 すべての実験段階金側１で記載し友ように行った。上記
突然変異誘発オリデヌクレオテドを用いるコロニーハイ
ブリッド法によって求めるプラスミドｐＡ１９／１ （
５，２ｋｂ）？含むクローン會見出した。このプラスミ
ドの特性上制限解析によって確認し、８ｍａｉ切断位置
の欠失を調べた〇 第２図は特にｐＡ１９／１の製造プロセスを略示する。
ｐＡ １９ ／ １ ｋ Ｅ、 ｃｏｌｉ （ＤＡＭ
３６８９）中に移入し、ミューティンＦＫ２に２Ｌ ｋ
ｍ友。
３６８９）中に移入し、ミューティンＦＫ２に２Ｌ ｋ
ｍ友。
このタンパク質は約５２０００ダルトンの大きさ営頁す
る。同ミューティンはヒトのｔ−ＰＡに対する七ノクロ
ナール抗体（ヤギで製造）に結合し、グラスミノーデン
分解試験においてアミド分解活性およびフィブリン賦活
性を示す。
る。同ミューティンはヒトのｔ−ＰＡに対する七ノクロ
ナール抗体（ヤギで製造）に結合し、グラスミノーデン
分解試験においてアミド分解活性およびフィブリン賦活
性を示す。
ｂ）真核シグナル配列ケ有′するＰＸ２に２Ｌ、の再構
成 ミューティン遺伝子ＦＫ２に２Ｉ、に原す−ダー配列會
結合するために久下の断片１分離し、結合し几： ｐ７．１（Ｄ８Ｍ４７１９）から分離され九２．７ｋｂ
の大きさのＢａｍＨＩ ／ Ｈｌｎｄ［［断片、ｐＡ
２０ （ｐ ７．１のＰａ’Ｔａｌ切断位置にｔ−ＦＡ
コード配列からの４５０ ｂｐ Ｐｓｔ［断片を挿入し
た）からの約０．２ ｋｂの大きさのＢａｍＨＩ ／
８ｓｐｉ断片、 ｐＡ１９からの約１．３ｋｂの大きさの８ａｐｌ／＋ｉ
ｎａ ［［断片。
成 ミューティン遺伝子ＦＫ２に２Ｉ、に原す−ダー配列會
結合するために久下の断片１分離し、結合し几： ｐ７．１（Ｄ８Ｍ４７１９）から分離され九２．７ｋｂ
の大きさのＢａｍＨＩ ／ Ｈｌｎｄ［［断片、ｐＡ
２０ （ｐ ７．１のＰａ’Ｔａｌ切断位置にｔ−ＦＡ
コード配列からの４５０ ｂｐ Ｐｓｔ［断片を挿入し
た）からの約０．２ ｋｂの大きさのＢａｍＨＩ ／
８ｓｐｉ断片、 ｐＡ１９からの約１．３ｋｂの大きさの８ａｐｌ／＋ｉ
ｎａ ［［断片。
結合棒金Ｅ、 ｃｏｌｉ細胞（ＤＢＭ ３６８９ンで形
質転換し、グラスミド金倉む形質転換体を培地にアンビ
アす７５０μ＆／ｌ１ｔｋ加えることによって選択し九
。詳細な制限酵素解析によって所噴のグラスミドｐＡ
２４の特性を確認し友。
質転換し、グラスミド金倉む形質転換体を培地にアンビ
アす７５０μ＆／ｌ１ｔｋ加えることによって選択し九
。詳細な制限酵素解析によって所噴のグラスミドｐＡ
２４の特性を確認し友。
例３
Ｆ’ＦＫ２ＬおよびＰＸ３に２Ｌの増幅可能な真核発現
ベクターの槽底 ｐＡ２５およびｐＡ ２４からＦ’Ｆ’に２１．および
ＰＸ２に２Ｌ ｃＤＮＡ ｋ、 Ｘｂａ −Ｈ１ｎｄｌ
断片として分離し、ＦＦＫ２ＬおよびＰＸ２に、２Ｉ、
、 ＤＮＡおよび真核発現ベクターｐＫＣＲ（σＨａｒ
ｅ等、Ｐｒ０Ｃ。
ベクターの槽底 ｐＡ２５およびｐＡ ２４からＦ’Ｆ’に２１．および
ＰＸ２に２Ｌ ｃＤＮＡ ｋ、 Ｘｂａ −Ｈ１ｎｄｌ
断片として分離し、ＦＦＫ２ＬおよびＰＸ２に、２Ｉ、
、 ＤＮＡおよび真核発現ベクターｐＫＣＲ（σＨａｒ
ｅ等、Ｐｒ０Ｃ。
Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７８ （１９
８１）１５２７〜１５３１）の断端ｔ５ｃクレアーゼ８
１で平滑にした後、前記ｃＤＮＡ ｔ−同ベクターのＢ
ａｍＨＩの位置に挿入し友。結合体ｆ Ｅ、 ｃｏｌｉ
（ＨＢｌ （Ｎ （ＤＥＩＭ１６０７））中に移入し、
アンぎシリン５０！４／Ｎｌｋ含可する培地でプラスミ
ド金倉むコロニー金分離し、５Ｖ４Ｑの初期プロモータ
ーに関してＦＦＫ２ＬおよびＰＸ３に２Ｌの正しい定位
【有するプラスミドを制限酵素切断地図によって特定し
た。発現ベクターはｐＫＣＲ−ＦＦＫ２ＬおよびｐＫｃ
’Ｒ−ＰＸ２に２Ｌと称する。これらのグラスミドから
それぞれの発現カセットｋ Ａｈｚ ＩＩ −８ａｌ
ｌ断片として分離した。この九めにｐＫＣＲ−ＦＦＫ２
ＬおよびｐＫｃＲ−ＰＸ２に２Ｌ ？！−８ａｌ ｌで
部分的に切断し、次にＡａｔ ３１で切断し、断−ｔヌ
クレアーゼＳ１で平滑にし、相応の断片を低融点の寒天
ｒルで分離するＣとにより分離した。これらの断片ｔ１
増幅可能のベクターｐＡｄＤ ２６ Ｓ Ｖ （Ａ ）
（Ｋａｕｆｍａｎ Ｍよぴ””ｐｔ １９８２ ＊
Ｊ−Ｍｏｌ。
８１）１５２７〜１５３１）の断端ｔ５ｃクレアーゼ８
１で平滑にした後、前記ｃＤＮＡ ｔ−同ベクターのＢ
ａｍＨＩの位置に挿入し友。結合体ｆ Ｅ、 ｃｏｌｉ
（ＨＢｌ （Ｎ （ＤＥＩＭ１６０７））中に移入し、
アンぎシリン５０！４／Ｎｌｋ含可する培地でプラスミ
ド金倉むコロニー金分離し、５Ｖ４Ｑの初期プロモータ
ーに関してＦＦＫ２ＬおよびＰＸ３に２Ｌの正しい定位
【有するプラスミドを制限酵素切断地図によって特定し
た。発現ベクターはｐＫＣＲ−ＦＦＫ２ＬおよびｐＫｃ
’Ｒ−ＰＸ２に２Ｌと称する。これらのグラスミドから
それぞれの発現カセットｋ Ａｈｚ ＩＩ −８ａｌ
ｌ断片として分離した。この九めにｐＫＣＲ−ＦＦＫ２
ＬおよびｐＫｃＲ−ＰＸ２に２Ｌ ？！−８ａｌ ｌで
部分的に切断し、次にＡａｔ ３１で切断し、断−ｔヌ
クレアーゼＳ１で平滑にし、相応の断片を低融点の寒天
ｒルで分離するＣとにより分離した。これらの断片ｔ１
増幅可能のベクターｐＡｄＤ ２６ Ｓ Ｖ （Ａ ）
（Ｋａｕｆｍａｎ Ｍよぴ””ｐｔ １９８２ ＊
Ｊ−Ｍｏｌ。
阻ｏ１．１５９，６０１−＜５２１ 〕の、クレノウで
充填され九ＢｃｏＲＩの位置に挿入し友。この結合され
た反応複合体上ｇ、 ｃｏｌｉ ＨＢ １０１に移入し
、テトラサイクリンを含有する培地（１０μＩ／成）で
コロニー七分離し次。制限解析によって相応の組換え体
上見出し九〇同解析にまたｔ−ＰＡ誘導体の発現カセッ
トの定位上発現ベクターに対して相対的に決めた。分離
した発現ベクターｆｘ ｐｓＶ −ＦＦＫ２Ｌ −ｄｈ
ｆｒおよびｐｓＶ −ＦＫ２に２Ｌ −ｄｈｆｒと称す
る（第６図）。
充填され九ＢｃｏＲＩの位置に挿入し友。この結合され
た反応複合体上ｇ、 ｃｏｌｉ ＨＢ １０１に移入し
、テトラサイクリンを含有する培地（１０μＩ／成）で
コロニー七分離し次。制限解析によって相応の組換え体
上見出し九〇同解析にまたｔ−ＰＡ誘導体の発現カセッ
トの定位上発現ベクターに対して相対的に決めた。分離
した発現ベクターｆｘ ｐｓＶ −ＦＦＫ２Ｌ −ｄｈ
ｆｒおよびｐｓＶ −ＦＫ２に２Ｌ −ｄｈｆｒと称す
る（第６図）。
ｐｓＶ −ＦＦＫ２Ｌ −ｄｈｆｒ Ｂ、８ａｌ Ｉ’
ｆ用いて制限すると長さ２４７０ ｂｐおよび７１００
ｂｐの２個の断片が得られることを特徴とする。
ｆ用いて制限すると長さ２４７０ ｂｐおよび７１００
ｂｐの２個の断片が得られることを特徴とする。
ｐｓＶ −ＦＫ２に２Ｌ −ｄｈｆｒ ｈ、Ｓａｌ ｌ
で制限すると長さ２４７０ ｂｐおよび６８６０ｂｐの
２個の断片が得られること全特性とする。
で制限すると長さ２４７０ ｂｐおよび６８６０ｂｐの
２個の断片が得られること全特性とする。
例４
ｍ成ＦＦＫ２ＬおよびＦ’に２に２Ｌを分泌するＣＨＯ
細胞の樹立 ＣＨＯｄｈｆｒ″″ 細胞 （ＤＵＫＸ 、 Ｄ
Ｅ（！ＰＲ’″ ン 、 ｇｃＡｃｅ８８０７２１０
３ｋ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎによって記載さ
れているように増殖させた（ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、σ８Ａ ７７ （１９８０）
、４２１６−４２２０）。該細胞ｔ１アデノシン、デオ
キシアデノシン、チミジンおよびペニシリンとストレプ
トマイシン上官む１０チクシ胎児血清の追加されている
α−培地で増重さゼる。
細胞の樹立 ＣＨＯｄｈｆｒ″″ 細胞 （ＤＵＫＸ 、 Ｄ
Ｅ（！ＰＲ’″ ン 、 ｇｃＡｃｅ８８０７２１０
３ｋ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎによって記載さ
れているように増殖させた（ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、σ８Ａ ７７ （１９８０）
、４２１６−４２２０）。該細胞ｔ１アデノシン、デオ
キシアデノシン、チミジンおよびペニシリンとストレプ
トマイシン上官む１０チクシ胎児血清の追加されている
α−培地で増重さゼる。
永続的発現のために、燐酸カルシウムと最終容積４ ａ
ｔ中の適当な発現祷、収体（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ
ｄｅｒＥｂ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２ （１９７３
Ｌ４５６〜４６７）２０μμとの沈殿物全製造し友。こ
の沈殿物ｌ ｌ［ｌ會９儂培養皿中の１（３ｍｌ培地中
の３１０’〜Ｉ Ｘ １０’細胞に加えた。同細胞を沈
殿物と共に６〜１８時間恒温保持し、培地？除去し、Ｔ
ＢＳ （トリスＨＣｔ（出７．４）２５ｍｍｏｌ／／、
ＮａＣ６１５７ｍｍｏｌ／／、ＫＣｌ５ ｍｍｏｌ
／ ｌ ％Ｎａ２ｆ（ＰＯ４（ｐｋｉ ７−４ ） ０
．６ｍｍｏｌ ／Ｊ）１０＋ｊで洗浄し、トリス緩衝塩
Ｍ溶液（ＴＢＳ ）中の２０＋１グリセリン’ｌ ｔｕ
ｔと一緒に３〜５．５分恒温保持し、ＴＢＳで洗浄し、
次に適当な培地で恒温保持し九。ＣａＯ細胞を移入後４
８時間で１：１０形質転換させ、選択培地（Ｋａｕｆｍ
ａｎおよび８ｈａｒｐ 、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ
、 １５９（’Ｉ ９８２）６０１〜６２１〕で増殖さ
せた。
ｔ中の適当な発現祷、収体（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ
ｄｅｒＥｂ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２ （１９７３
Ｌ４５６〜４６７）２０μμとの沈殿物全製造し友。こ
の沈殿物ｌ ｌ［ｌ會９儂培養皿中の１（３ｍｌ培地中
の３１０’〜Ｉ Ｘ １０’細胞に加えた。同細胞を沈
殿物と共に６〜１８時間恒温保持し、培地？除去し、Ｔ
ＢＳ （トリスＨＣｔ（出７．４）２５ｍｍｏｌ／／、
ＮａＣ６１５７ｍｍｏｌ／／、ＫＣｌ５ ｍｍｏｌ
／ ｌ ％Ｎａ２ｆ（ＰＯ４（ｐｋｉ ７−４ ） ０
．６ｍｍｏｌ ／Ｊ）１０＋ｊで洗浄し、トリス緩衝塩
Ｍ溶液（ＴＢＳ ）中の２０＋１グリセリン’ｌ ｔｕ
ｔと一緒に３〜５．５分恒温保持し、ＴＢＳで洗浄し、
次に適当な培地で恒温保持し九。ＣａＯ細胞を移入後４
８時間で１：１０形質転換させ、選択培地（Ｋａｕｆｍ
ａｎおよび８ｈａｒｐ 、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ
、 １５９（’Ｉ ９８２）６０１〜６２１〕で増殖さ
せた。
この選択培地は透析された１０幅ウつ胎児血清會含むα
−培地であシ、従りてアデノシン、デオキシアデノシン
およびチミジンを含有しない。
−培地であシ、従りてアデノシン、デオキシアデノシン
およびチミジンを含有しない。
移入後２〜３′８後にトリプシン処理によりクローンを
分離し、天童培養の几めに利用し、上澄みの？、−ＰＡ
免疫活性をＫｌ、Ｉｓ人によって検ぺ九。次に場性りロ
ーンｔプールし、それぞれｌＸ１０６ｍ胞を有する４個
の平板を、メトトレキセート２０ ｎｍｏｌ ／ ７３
紮含む培地に入れ九〇２週間後にメトトレキセート耐性
クローンが出現した。これらのクローンを増殖集密さゼ
、メトトレキセート１００ ｎｍｏｌ ／ ／ ｋ 富
有する培地に暴露しｔ０耐性細胞に、メトトレキセート
濃度の段階的増大（３Ｑ Ｑ ｎｍｏｌ ／ ｌ、 ５
００ｎｍｏｌ ／ ｌ ％ １ μｍｏｌ ／ ７３
および５ μｍｏｌ ／ ｌ ）を受けさせた。最後に
核クローンを限定的な希釈によって分離し、上澄みのｔ
−ＰＡ免疫活性を検べることによってｔ−ＰＡミューテ
ィンの最良の生成物を見出し九。
分離し、天童培養の几めに利用し、上澄みの？、−ＰＡ
免疫活性をＫｌ、Ｉｓ人によって検ぺ九。次に場性りロ
ーンｔプールし、それぞれｌＸ１０６ｍ胞を有する４個
の平板を、メトトレキセート２０ ｎｍｏｌ ／ ７３
紮含む培地に入れ九〇２週間後にメトトレキセート耐性
クローンが出現した。これらのクローンを増殖集密さゼ
、メトトレキセート１００ ｎｍｏｌ ／ ／ ｋ 富
有する培地に暴露しｔ０耐性細胞に、メトトレキセート
濃度の段階的増大（３Ｑ Ｑ ｎｍｏｌ ／ ｌ、 ５
００ｎｍｏｌ ／ ｌ ％ １ μｍｏｌ ／ ７３
および５ μｍｏｌ ／ ｌ ）を受けさせた。最後に
核クローンを限定的な希釈によって分離し、上澄みのｔ
−ＰＡ免疫活性を検べることによってｔ−ＰＡミューテ
ィンの最良の生成物を見出し九。
例５
ＥＬＩ８Ａ （ｅｎｚｙｍｅ １ｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕ
ｎｏｓｏｒｂｅｉ＊ｔ ａｓｓａｙ）によるｔ−ＰＡ％
Ｆ’Ｆ’に２ＬおよびＦ’に２に２Ｌの測定 ９６個の穴を有するｆｆｍ１滴定板（ＮｕｎＣ社）に、
燐酸カリウム緩衝液（ｐ）１７−５ ） ５０ ｍｍｏ
ｌ ／ｌ中の抗−ｃ−ｐＡ−ｘｇＧｃ８ｔＭｌ／ｍｅ）
ｋｍ布し、ＰＨ１（ＮａＣｔＯ，１５ｍｏｌ ／ ｌ
、燐酸ナトリフＡ ＣｐＨ７−５） １０ ｍｍｏｌ
／ｌ ：ｌ、０．５１ Ｒ８Ａ（ウシ血清アルブミ／）
で３回洗浄した。前記穴上組織培養上澄み２００μｊと
共に４゛０で１２時間恒温保持した。上澄みｔ注意栗く
除去し、収入をＰＨ１（燐酸塩緩衛塩類溶液）で３回洗
浄し友。次に該穴ｔペルオキシダーゼー複合ヒツジ抗ｔ
−ＰＡＩｇＧ 、過酸化水素およびＡＢＴ８［Ｆ］（
２、２’−アジノージ（６−ニチルベンデチアデリンー
スルホネート（６）〕と−緒に恒温保持し７ｔｏ４０５
ｎｍで吸収量全測定し、吸収量と校正曲線との比較によ
って評ｇｆＪを行った。
ｎｏｓｏｒｂｅｉ＊ｔ ａｓｓａｙ）によるｔ−ＰＡ％
Ｆ’Ｆ’に２ＬおよびＦ’に２に２Ｌの測定 ９６個の穴を有するｆｆｍ１滴定板（ＮｕｎＣ社）に、
燐酸カリウム緩衝液（ｐ）１７−５ ） ５０ ｍｍｏ
ｌ ／ｌ中の抗−ｃ−ｐＡ−ｘｇＧｃ８ｔＭｌ／ｍｅ）
ｋｍ布し、ＰＨ１（ＮａＣｔＯ，１５ｍｏｌ ／ ｌ
、燐酸ナトリフＡ ＣｐＨ７−５） １０ ｍｍｏｌ
／ｌ ：ｌ、０．５１ Ｒ８Ａ（ウシ血清アルブミ／）
で３回洗浄した。前記穴上組織培養上澄み２００μｊと
共に４゛０で１２時間恒温保持した。上澄みｔ注意栗く
除去し、収入をＰＨ１（燐酸塩緩衛塩類溶液）で３回洗
浄し友。次に該穴ｔペルオキシダーゼー複合ヒツジ抗ｔ
−ＰＡＩｇＧ 、過酸化水素およびＡＢＴ８［Ｆ］（
２、２’−アジノージ（６−ニチルベンデチアデリンー
スルホネート（６）〕と−緒に恒温保持し７ｔｏ４０５
ｎｍで吸収量全測定し、吸収量と校正曲線との比較によ
って評ｇｆＪを行った。
例６
ｔ−ＰＡ％Ｆ’Ｆ’に２ＬおよびＦＫ２に２Ｌのフィブ
リノ−デフ賦活プラスミノーゲン分解活性の測定 プラスミノーデ／アクチベーター活性金、間接的な分光
光度試験（Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ等、 Ｔｈｒｏｍｂ。
リノ−デフ賦活プラスミノーゲン分解活性の測定 プラスミノーデ／アクチベーター活性金、間接的な分光
光度試験（Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ等、 Ｔｈｒｏｍｂ。
Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ４８ （１９８２Ｌ ２６６
〜２６９）によって測定し九。ｔ−ＰＡはプラスミノー
デン鷺活性セリンプロテアーゼであるプラスミンに変へ
、同プ２スミ／は発色性基質のペプチド結合を加水分解
し、この基質の吸収ｔ４０５ｎｍで最高３時間１での時
間間隔で追跡し次。発色性基質としてはトシル−グリフ
ループロリル−リシン−４−ニトラニリドーアセテート
（ＣｈｒｏｍｏｚｙｍｏＰ Ｌ ） １ｉ使用しｔ６該
試験は２５℃でトリｘ ａｃｚ ｃ ｐｈ八へ） ０−
１ ｍｏｌ ／ ／ 。
〜２６９）によって測定し九。ｔ−ＰＡはプラスミノー
デン鷺活性セリンプロテアーゼであるプラスミンに変へ
、同プ２スミ／は発色性基質のペプチド結合を加水分解
し、この基質の吸収ｔ４０５ｎｍで最高３時間１での時
間間隔で追跡し次。発色性基質としてはトシル−グリフ
ループロリル−リシン−４−ニトラニリドーアセテート
（ＣｈｒｏｍｏｚｙｍｏＰ Ｌ ） １ｉ使用しｔ６該
試験は２５℃でトリｘ ａｃｚ ｃ ｐｈ八へ） ０−
１ ｍｏｌ ／ ／ 。
トウイーン８０〔プラスミノーゲン０．１６μｍｏｌ／
ｌ、ＣＮＢｒ消化フィブリノーゲン（１２０μｇ／ｌ）
およびＣｈｒｏｍｏｚｙｍ’ Ｐ Ｌ ：Ｉ Ｑ、ｌ
５ ｍｏｌ ／ノ中で行なった。
ｌ、ＣＮＢｒ消化フィブリノーゲン（１２０μｇ／ｌ）
およびＣｈｒｏｍｏｚｙｍ’ Ｐ Ｌ ：Ｉ Ｑ、ｌ
５ ｍｏｌ ／ノ中で行なった。
例７
構Ｋ ｔ、 −Ｐ Ａ１７’ｃｆｉＦ’に２に２Ｌ ｔ
−分泌丁ｂＣＨＯ細胞の培養上管みを、フィブリノーゲ
ン賦活タンパク質分解活性について、例６で記載し九よ
うにして試駿し、同時に上澄み液中のｔ−Ｐ Ａ ’！
７’ｊｒＸ、Ｆ’に２に２Ｌ Ｉ）量ｉ ＥＬＩＳＡ
によって測定し之。この際ＰＫ２に２Ｉ、のタンパク質
分解活性がフィブリノーゲンのＣＮＢｒ Ｆｒ片により
テｔ−ＰＡのタンパク質分解活性とほぼ同じ強さ（約２
０〜６０倍）で賦活されることが判っ友。意外にも、Ｆ
Ｋ２に２ＬはＺ−ＰＡと比べると３倍増大された比活性
を有することが判っ九。構成ＰＫ２に２Ｌ ｔ−分泌す
る０ｆ（Ｏ細胞は、第１の増幅段階ｖｋＫすでにベトリ
シャーレから溶去され九。
−分泌丁ｂＣＨＯ細胞の培養上管みを、フィブリノーゲ
ン賦活タンパク質分解活性について、例６で記載し九よ
うにして試駿し、同時に上澄み液中のｔ−Ｐ Ａ ’！
７’ｊｒＸ、Ｆ’に２に２Ｌ Ｉ）量ｉ ＥＬＩＳＡ
によって測定し之。この際ＰＫ２に２Ｉ、のタンパク質
分解活性がフィブリノーゲンのＣＮＢｒ Ｆｒ片により
テｔ−ＰＡのタンパク質分解活性とほぼ同じ強さ（約２
０〜６０倍）で賦活されることが判っ友。意外にも、Ｆ
Ｋ２に２ＬはＺ−ＰＡと比べると３倍増大された比活性
を有することが判っ九。構成ＰＫ２に２Ｌ ｔ−分泌す
る０ｆ（Ｏ細胞は、第１の増幅段階ｖｋＫすでにベトリ
シャーレから溶去され九。
Ｏの原因は、血清中に存在するプラスミノーゲンから活
性セリンプロテアーゼするプラスミン音生じる、Ｆ’に
２に２Ｌによる活性化に帰せられる。免疫吸清され几培
養上溌みのｒルミ気泳動法による分離およびヒトのｔ−
ＰＡに対するペルオキシダーゼ標識抗体を用いる前記上
澄みの視覚化によシ、上澄み中にプロテアーゼ阻害物質
友るアプロテイニンの存在する場合には主として一本鎖
のＦ’に２に２Ｌが検出され、同物質の存在しない場合
にに二本鎖のＦＫ２に２Ｌが検出され友。
性セリンプロテアーゼするプラスミン音生じる、Ｆ’に
２に２Ｌによる活性化に帰せられる。免疫吸清され几培
養上溌みのｒルミ気泳動法による分離およびヒトのｔ−
ＰＡに対するペルオキシダーゼ標識抗体を用いる前記上
澄みの視覚化によシ、上澄み中にプロテアーゼ阻害物質
友るアプロテイニンの存在する場合には主として一本鎖
のＦ’に２に２Ｌが検出され、同物質の存在しない場合
にに二本鎖のＦＫ２に２Ｌが検出され友。
増幅可能な発埃ベクターであるｐｓＶ−ＦＦＫ２Ｌ−ｄ
ｈｆｒの移入され九ＣＨＯ細胞の上澄みハ、フィブリノ
ーゲンのＣＮＢ ｒ断片の存在する場合に１−）ｔ−Ｐ
Ａのタンパク質分解活性を高め念。この誘導体は％ｔ−
ＦＡとはぼ同じ比活性ヶ有している。
ｈｆｒの移入され九ＣＨＯ細胞の上澄みハ、フィブリノ
ーゲンのＣＮＢ ｒ断片の存在する場合に１−）ｔ−Ｐ
Ａのタンパク質分解活性を高め念。この誘導体は％ｔ−
ＦＡとはぼ同じ比活性ヶ有している。
第１図にｔ−ＰＡの構造を示す模式図であり、第２図は
本発明によるプラスミドｐＡ１８／１およびｐＡ１９／
１ の製造過程を示す模式図であシ、第６図に本発明に
よるプラスミドｐ８Ｖ −ＦＦＫ２Ｌ−ｄｈｆｒおよび
ｐ８Ｖ −ＦＫ２に２Ｌ −ｄｈｆｒの製造過程を示す
模式図である。 Ｆｉｇ 、 １ ガー 上皮生長因子に対する相同性を有する 領域
本発明によるプラスミドｐＡ１８／１およびｐＡ１９／
１ の製造過程を示す模式図であシ、第６図に本発明に
よるプラスミドｐ８Ｖ −ＦＦＫ２Ｌ−ｄｈｆｒおよび
ｐ８Ｖ −ＦＫ２に２Ｌ −ｄｈｆｒの製造過程を示す
模式図である。 Ｆｉｇ 、 １ ガー 上皮生長因子に対する相同性を有する 領域
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、フイブリンフインガーおよびクリンゲルII領域の少
なくとも一つの天然アミノ酸配列を数倍化された形で有
することを特徴とする組織プラスミノーゲンアクチベー
ターミユーテイン。 ２、数個の完全なｔ−ＰＡ遺伝子を適当なベクター中に
直接次々と挿入し、オリゴヌクレオチド部位の突然変異
誘発によつて生成物中で数倍化されていてはならないア
ミノ酸をコ ードしている配列を除去し、このようにして得られた突
然変異ベクターを適当な細胞に導入しかつ増幅し、その
中で欠失が起ったベクターを取得し、該ベクターを適当
な宿主細胞で発現させることを特徴とする請求項１記載
の組織プラスミノーゲンアクチベーターミユーテインの
製造方法。 ３、請求項１記載の組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーミユーテインを含有することを特徴とする凝血塊溶解
剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3836200.7 | 1988-10-24 | ||
| DE3836200A DE3836200A1 (de) | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Domaenenduplikations-muteine des gewebsplasminogen-aktivators (t-pa) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02215384A true JPH02215384A (ja) | 1990-08-28 |
Family
ID=6365810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1275117A Pending JPH02215384A (ja) | 1988-10-24 | 1989-10-24 | 組織プラスミノーゲンアクチベーターミユーテイン、その製造方法および該ミユーテインを含有する凝血塊溶解剤 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0366091A3 (ja) |
| JP (1) | JPH02215384A (ja) |
| AU (1) | AU609337B2 (ja) |
| DE (1) | DE3836200A1 (ja) |
| DK (1) | DK528989A (ja) |
| IL (1) | IL92015A0 (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62289181A (ja) * | 1986-04-02 | 1987-12-16 | ビ−チヤム・グル−プ・ピ−エルシ− | 新規化合物、その製法およびそれを含む医薬組成物 |
| JPS63501841A (ja) * | 1985-12-20 | 1988-07-28 | ジ・アップジョン・カンパニ− | 組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−（ｔｐａ）同族体 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU600463B2 (en) * | 1985-12-20 | 1990-08-16 | Pharmacia & Upjohn Company | Tissue plasminogen activator (tpa) analogs |
| DE3682891D1 (de) * | 1986-02-17 | 1992-01-23 | Stichting Centraal Lab | Gewebeplasminogen-aktivator-mutant, dafuer kodierende rekombinante genetische information und verfahren zur herstellung dieser mutanten, deren verwendung und pharmazeutische zusammensetzungen. |
| ATE110772T1 (de) * | 1987-06-04 | 1994-09-15 | Zymogenetics Inc | Mutierter t-pa mit kringle-ersatz. |
-
1988
- 1988-10-24 DE DE3836200A patent/DE3836200A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-10-17 IL IL92015A patent/IL92015A0/xx unknown
- 1989-10-23 AU AU43657/89A patent/AU609337B2/en not_active Ceased
- 1989-10-24 EP EP19890119757 patent/EP0366091A3/de not_active Withdrawn
- 1989-10-24 JP JP1275117A patent/JPH02215384A/ja active Pending
- 1989-10-24 DK DK528989A patent/DK528989A/da not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63501841A (ja) * | 1985-12-20 | 1988-07-28 | ジ・アップジョン・カンパニ− | 組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−（ｔｐａ）同族体 |
| JPS62289181A (ja) * | 1986-04-02 | 1987-12-16 | ビ−チヤム・グル−プ・ピ−エルシ− | 新規化合物、その製法およびそれを含む医薬組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU4365789A (en) | 1990-04-26 |
| DE3836200A1 (de) | 1990-04-26 |
| IL92015A0 (en) | 1990-07-12 |
| AU609337B2 (en) | 1991-04-26 |
| EP0366091A3 (de) | 1990-09-05 |
| DK528989D0 (da) | 1989-10-24 |
| EP0366091A2 (de) | 1990-05-02 |
| DK528989A (da) | 1990-04-25 |
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