JPH0488982A - 修飾プロテアーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、多糖類で化学修飾された修飾プロテアーゼの
製造方法に関する。

（従来の技術） 一般に、動物、植物、もしくは微生物などを起源とする
プロテアーゼが、洗剤、消化剤や抗炎症剤などの医薬品
、化粧品、肉の軟化剤、絹の精練またはビールの製造過
程など各種の産業分野に於いて広く有効に利用されてい
る。

しかしなから、プロテアーゼを洗剤、化粧品。

もしくは成る種の医薬品なとへ応用するに際しては、プ
ロテアーゼか人体にとって異種起源の蛋白であるため、
抗原性や皮膚感作性を示し、人によっては強い刺激を与
えることか指摘されている。

また、他の問題として、プロテアーゼの安定性が充分で
ないことも挙げられる。特に水分率の高い媒体や、水溶
液なとの剤形中では、変性の他に自己消化分解か起り、
室温で保存すると速やかに失活するので、安定な商品を
供給する事は難しいのが現状である。

酵素の抗原性なと安全性の問題解決に対しては、例えば
、治療用酵素の体内投与を目的として、抗原性を抑制し
、血中半減期を改善延長するため、ウリカーゼ、アスパ
ラギナーゼをポリエチレングリコールて修飾する方法（
特公昭６１−４２５５８号公報）、ストレプトキナーゼ
をポリエチレングリコールで修飾する方法（特開昭５７
−１１８７８９号公報）なとか提案されている。また、
安定性の問題解決に対しては、分子内架橋に寄与する修
飾か有効であることかキモトリプシンなとの酵素につい
て示されている。（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、５２２．　２７７〜２８３
（１９７８）。同、４８５．ｌ−１２（１９７７））。

更に、マンガン型スーパーオキシドジスムターゼに、多
糖類、ポリエチレングリコール、蛋白質などの水溶性高
分子を結合させたものは抗原性か抑制されると共に、熱
安定性か向上することが示されている（特開昭５８−１
６６８５号公報）。

しかしながら、プロテアーゼに対して、抗原性。

皮膚感作性なとの抑制と共に安定性を改良し、実用化を
計ったものは知られていない。なかでも、皮膚感作は鋭
敏な反応であるため、その抑制は極めて難しい。また、
プロテアーゼは基質か通常高分子量であるため、修飾の
方法やその程度によっては、プロテアーゼの活性か殆ん
と消失したり、熱安定性か低下したりしてしまう。

本発明者らは、プロテアーゼを洗剤、化粧品。

医薬品なとの分野で広く用いるため、高い活性を維持さ
せながら安全性と共に安定性を獲得するものとして、す
てにプロテアーゼと多糖類かトリアジン環を介して結合
している修飾プロテアーゼ、並びに、多糖類に塩化シア
ヌルを反応させてトリアジン環結合多糖類を合成し、次
に該トリアジン環結合多糖類とプロテアーゼとを反応さ
せる修飾プロテアーゼの製造法を提案している。（特願
平この方法で得られた修飾プロテアーゼの水溶液中での
安定性は元の酵素の場合に較へて顕著に優れているか、
配合する洗剤、化粧品、医薬品なとの剤形によっては、
十分な安定性を示さないことがある。この原因を究明し
た結果、得られる修飾プロテアーゼの安定性には調製条
件によって多少のバラツキかあり、酵素の経時的失活を
招き易い系の剤形中では、この差か増、幅して現れるこ
とが判明した。また、得られる修飾酵素の感作性抑制の
程度も若干不完全な場合があった。

更に、使用する塩化シアヌルが有効な活性基としてデキ
ストランに導入される効率もやや低く改善が望まれてい
た。

（発明か解決しようとする課題） 本発明者らは既存の修飾プロテアーゼの有する上記の問
題点に鑑み、鋭意研究した結果、本発明を完成したもの
であって、その目的とするところは、高度の安定性と安
全性を有し、広い種類の剤形に配合利用し得る水溶性修
飾プロテアーゼを、工業的に、再現性よく製造でき且つ
経済的にも優れた方法を提供するにある。

（課題を解決するための手段） 上述の目的は、多糖類と塩化シアヌルとを反応させて得
られたトリアジン環結合多糖類と、プロテアーゼとを反
応せしめ修飾プロテアーゼを製造するに際し、前記トリ
アジン環結合多糖類として、反応性塩素含有量か０．４
〜１．２ミリモル／ｇのものを使用し、且つプロテアー
ゼの反応性アミノ基に対してモル比で２倍以上のトリア
ジン環多糖類結合多糖類とプロテアーゼとの反応に際し
、該トリアジン環結合多糖類をプロテアーゼに対し重量
比にして３倍以上用いるものである。

特許請求の範囲第１項記載の製造方法により達成される
。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に使用されるプロテアーゼとしては、例えば、ト
リプシン、キモトリプシンなどの動物由来のプロテアー
ゼ、微生物由来のプロテアーゼ等か挙げられる。本発明
の修飾プロテアーゼはいずれも抗原性や皮膚感作性か抑
制されており、また安定性も大きく向上する。しかし、
プロテアーゼの違いにより相対的に安定性は異なる。安
定性の点からは、動物由来のプロテアーゼと比較すると
微生物由来のプロテアーゼに優れているものか多い。し
たかって、好ましくは微生物由来のプロテアーゼ、特に
好ましくはバチルス属由来のプロテアーゼを用いると好
結果か得られる。

本発明に用いる多糖類の一例としては、アガロース、グ
アーガム、イヌリン、デンプン、デキストラン２　プル
ラン、ザンタンガム、カラギーナン。

ペクチン、アルギン酸なとの天然多糖類及びその誘導体
や、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース
、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなど
が挙げられる。なかでもデキストラン、プルランは、か
なりの高分子量のものを用いても溶液粘度か低く、反応
操作か容易であり、また得られる修飾プロテアーゼの性
能も均一安定である点で優れている。

多糖類の分子量は、特に著しく小さいものてなければ、
修飾プロテアーゼの安定性は良好な結果を与えるが、抗
原性、皮膚感作性の抑制なとか完全てなくなる場合もあ
るため、その平均分子量は１０．０００以上のものを用
いることか好ましく、また、特に好ましくは４０，００
０以上である。

修飾プロテアーゼに於ける、元のプロテアーゼの抗原性
や皮膚感作性の抑制効果の大きさ、安定化の程度は、用
いた多糖類の種類１分子量、結合量及びその状態なとに
よって変化する。一般に結合量を大きくすると、安全性
と安定性は良好となるかプロテアーゼか失活する傾向に
あり、目的を達する迄の修飾を施して得られる修飾プロ
テアーゼの活性は著しく低い場合が多い。しかし、本発
明の修飾プロテアーゼは、かなり修飾率を高めても非常
に高い活性を有する。また、逆に修飾率か低い場合でも
十分高い安定性、安全性を有することも本発明の修飾プ
ロテアーゼの特長であるか、やはりその程度と修飾率に
は相関かある。これらの点より、プロテアーゼの表面ア
ミノ基の修飾率はＴＮＢＳ法で測定して３０％以上であ
ることが好ましく、更に好ましくは５０％以上である。

本発明の修飾プロテアーゼは、多糖類に塩化シアヌルを
反応させてトリアジン環結合多糖類を合成し、次にこれ
をプロテアーゼと反応させることによって得られる。

特に、高度の安定性と安全性を有する修飾プロテアーゼ
を再現性よく製造するためには、トリアジン環結合多糖
類が成る程度以上の活性基密度を有することか重要であ
る。

しかし、活性基密度か過度に高い場合、多糖類か自己架
橋により不溶化したり、部分的にゲル化が起る。まｈ極
端な場合、このため却って酵素の修飾率か低下し、十分
な感作性の抑制効果が得られない現象も見られる。

活性基密度とは、この場合、活性化多糖類中のトリアジ
ン環に結合した反応性塩素量であるか、この量は後述す
る硝酸銀滴定法により定量できる。

上述した理由からこのトリアジン環結合多糖類の反応性
塩素含有量は、０．４〜１．２ミリモル／ｇの範囲にあ
ることが必要であり、好ましくは０．５〜１．０ミリモ
ル／ｇである。

こうした活性化多糖類の調製工程を制御し、再現性よく
合成するためには、塩化シアヌル溶液の溶媒を、水混合
性であると共に塩化シアヌルとの反応性を有しない非水
溶媒とし、又、多糖類水溶液に塩化シアヌル溶液を添加
１反応させる際のｐＨを好ましくは７．５〜９．５、更
に好ましくは８．０〜９．０に制御して反応を進める。

塩化シアヌル溶液の好適な溶媒としては、具体的にはア
セトン、テトロヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルス
ルホキシド等か挙げられるか、使用性及び溶媒除去の容
易なことから、アセトンが特に好ましい。

この様に条件を設定することにより、多糖類に活性な反
応性塩素基を優れた再現性を以て導入できるうえ、多糖
類と塩化シアヌルとの反応率も高く、使用する塩化シア
ヌル量を低減できる。反応は常温付近で行うのが好まし
い。また反応の進行につれて多糖類に導入された活性な
反応性塩素基が分解するので３０分以内に反応を完了さ
せるのが好適である。反応停止は、ｐＨ３程度の酸性条
件下とすることにより行う。また必要に応じ、酸性条件
下でアセトン等の貧溶媒を加えて分離、精製してもよい
。また、トリアジン環結合多糖類とプロテアーセとの結
合反応に際しては、トリアジン環結合多糖類をプロテア
ーゼに対し重量比にして３倍以上用いるとともに、トリ
アジン環結合多糖類の反応性塩素量かプロテアーゼの反
応性アミン基に対してモル比にして２倍以上あることが
好適であり、なかでも反応性アミン基に対する反応性塩
素量を５倍以上にすることか特に好適である。すなわち
、この値か大きいほど酵素の修飾率か大きくなり、特に
５倍以上とした場合に非常に安定な修飾プロテアーゼが
得られる。また、上述の活性化多糖類とプロテアーゼの
重量比、モル比条件が満たされなくても、かなり安定な
修飾プロテアーゼが得られることはあるか、抗原性や皮
膚感作性の抑制かいま一つ不十分となる。修飾率が大き
くなるに伴い、安定性は増大する傾向にあるか、反面活
性収率は若干低下する。したかつて酵素の安定化に寄与
する様な剤形へ配合し、利用する場合は、若干低い修飾
率を選択することもてきる。

なお、使用するプロテアーゼは精製度によっては、他の
蛋白成分や低分子量のアミノ基含有物質を含有する場合
かある。これらに由来するアミノ基も活性化多糖類と反
応し、プロテアーゼの修飾率に影響を与えるため、本発
明に於けるプロテアーゼの反応性アミノ基としては、プ
ロテアーゼ自体の表面アミノ基と、混在物質に由来する
アミノ基との総和を意味する。

次いて、残存する活性基を処理するためアミノ基を有す
る低分子化合物の水溶液中に於いて、好ましくは５０〜
７５°Ｃで後処理を行なう。本発明に用いるアミノ基を
有する低分子化合物は、特に限定されないか、グリシン
、アラニン、リジン。

セリン、グルタミン酸等のアミノ酸類やモノエタノール
アミン等の、安全性の点から感作源となりにくく、修飾
プロテアーゼの構造に悪影響を与えない物質か好ましい
。

修飾酵素中に残存しているトリアジン環結合のハロゲン
原子の数は処理時間と共に減少するか、この速度は温度
か高くなる程、又ｐＨ値が高い程大きくなる傾向かある
。水溶液のｐＨ値は通常５〜１０の範囲で行なうが、酵
素の変性失活を避けると共に、高い処理効率を得るため
の条件として６．５〜９．５とすることか好ましい。

必要な処理時間は、処理温度やｐＨ条件により異なる。

結合ハロゲン原子の含有量が５００ｐｐｍより大きい場
合、室温下でも粉末を長時間保存すると部分的にゲル化
か起り、水に対する溶解性か低下すると共に活性も低下
するか、結合ハロゲン原子の含有量を５００ｐｐｍ以下
とすることにより、こうした問題を抑制できる。又、本
発明の温度条件を選ぶことにより、処理中の酵素の失活
を殆んど避けることかできる。この後処理を施すことに
より、粉末状態でも安定した品質の目的物が得られる。

得られた修飾プロテアーゼは限外ｔハ過や、ゲル濾過ク
ロマト法などにより精製することができるか、更にこれ
を粉末化する方法としては、減圧溶媒除去、凍結乾燥、
エタノール等による貧溶媒添加による析出等を用いるこ
とかできる。

（発明の効果） 本発明の方法により抗原性、皮膚感作性が殆んと、もし
くは完全に抑制され、かつ熱安定性も著しく高い修飾プ
ロテアーゼを確実に再現性よく製造することか可能であ
る。また、修飾に伴う活性低下も小さく、非常に高い活
性を有する。界面活性剤を高濃度に含む系中においても
安定なうえ、自己分解失活が抑制されているため、水系
の各種剤型への配合に適する。

更に、粉末なとの固体状においても、保存時の不溶化や
活性低下が起らず、又、１０５°Ｃての加熱滅菌にも耐
えるため、広い範囲の剤型への適用か可能であり、洗剤
、化粧品、医薬品等に有効に用いることができる。

尚本発明に於いて、熱安定性、皮膚感作性、プロテアー
ゼの表面アミノ基及びハロゲン原子含有量の測定、評価
は吹下に記す方法で行った。

（１）　　熱安定性の測定（水系） ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，８’）に修飾プロテ
アーゼを溶解し、０．５　ｍ　ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ／　
ｍ　Ａ’としたものを検液として用いた。検液を６０°
Ｃて６時間又は４０°Ｃて３ケ月間インキュベーション
を行った後、検液中の酵素活性を測定し、処理前の活性
と比較して残存率を求めた。モデル剤形中ての安定性評
価も、同様に行い、６０°Ｃて６時間処理後の活性残存
率を評価した。

（２）　　皮膚感作性の評価 マキシミゼーション（Ｍａｘｉｍｉｚａｔ　１ｏｎ）法
ＣＢｅｒ−ｔｉｌ、Ｍ　ａｎｄ　Ａｌｂｅｒｔ、Ｍ、に
、、Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍ、、　　５２（３）、
２６Ｂ　（１９６９））に基つき、皮膚感作性試験行っ
た。

誘導及び惹起濃度は、プロテアーゼ、修飾プロテアーゼ
共、蛋白量として０．０５重量％になるように設定した
。皮膚感作性の程度を以下に示す方法で求めた平均評価
点により評価した。

（３）　　プロテアーゼの表面アミノ基修飾率の測定プ
ロテアーゼの反応性アミノ基の測定はハインズ（Ｈａｙ
ｎｅｓ）らの方法ＣＨａｙｎｅｓ、　Ｒ，ｅｔａｌ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ−ｉｓｔｒｙ、６．　５４１　　（１９
６７）　）によりトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮ
ＢＳ）の反応量として求め、修飾プロテアーゼの修飾率
は酵素表面の未反応のアミン基量を測定し、未修飾体の
表面アミノ基量との比から表面アミノ基の修飾率を算出
した。

又プロテアーゼ量は２８０ｎｍの吸光度より決定した。

（４）　　活性化多糖類中の反応性塩素含有量の測定試
料１００ｍｇを水４ｍＡに溶解し、０．５　Ｍ　−Ｎａ
ＨＣＯ，を１ｍｆ加えて１００℃、３０分間加熱処理を
行なう。７％クロム酸水溶液０．５　ｍ　１を加え、更
に水希釈した後、０．ＩＮ硝酸銀水溶液で滴定する。（
ｖ＋　ｍＡ） 対照としてアルカリ分解処理を行わない場合についても
滴定を行う（ｖ、ｍｆ）。

（ｖ＋　　Ｖｏ　）の値から相当する塩素量を算出し、
反応性塩素含有量として求めた。

以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明する。

実施例１ デキストラン（平均分子量４Ｘ１０’）１２５ｇを２．
５１の水に溶解した。これに、アセトン６００ｍＡに溶
解した各積置の１．３．５−）リクロロトリアジン（塩
化シアヌル）を滴下混合し、各４表１に示した条件下で
反応させた。但し、ｐＨの調整はＩＮ　　ＮａＯＨを用
いて行ない、温度は１８〜２２℃とした。

滴下終了後、０．１ＮＨＣｆを加え、ｐＨを３に調整し
た。これをアセトン２０Ｉ！中に加え、析出した結晶を
浜過し、アセトン洗浄して活性化デキストランを得た。

次に、こうして得られた活性化デキストラン１０ｇを水
１００ｍｆに溶解し、これにバチルス・リケニホルミス
菌由来のプロテアーゼ（ノボ社製の酵素、商品名エスペ
ラーゼを精製したもの）を水１０ｍｌ！に溶かして加え
、更に０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，２）１００ｍｌ
を加えて、２５°Ｃて２０時間反応させた。但し、プロ
テアーゼは反応性アミノ基量０．６ｍ　　ｍｏｌ！ｅ／
ｇのものを用い、反応性塩素量／反応性アミノ基量がモ
ル比に於いて１０となるように設定した。

修飾反応後、反応系にグリシンｌ、３ｇを加え溶解させ
た後、６０°Ｃて３０時間加熱処理を行ない、続いて各
々を限外堀過操作により４回低分子物質を除去洗浄後、
濃縮し凍結乾燥により淡褐色の粉末を得た。これらの修
飾プロテアーゼ粉末について活性、蛋白表面アミノ基修
飾率、皮膚感作性及び水系安定性を評価した。結果を第
１表に示す。

第１表より、活性化多糖類の反応性塩素量を０，４〜１
．２ミリモル／ｇとすると水系条件下での安定性及び皮
膚感作性共に優れた修飾プロテアーゼを調製できること
が解る。又、活性化多糖類の反応性塩素量か１．２　ミ
リモル／ｇを超えるような場合、比較例２のようにゲル
化か起る場合か多く、好ましくない。

実施例２ 実施例１の実験例２と同一の条件で調製した活性化デキ
ストラン１０ｇを水１００ｍｆに溶解し、これに実施例
１と同様の方法で精製エスペラーゼを加え、反応させた
。

但し、精製エスペラーゼは反応性アミノ基量０．７２ｍ
　　ｍｏｆｅ／ｇのものを用い、反応性塩素量／反応性
アミノ基量を第２表に示すように設定した。

得られた修飾プロテアーゼの評価結果を第２表第２表よ
り、反応性塩素量／反応性アミノ基量かモル比にして２
以上であることか安定性、安全性の両面に優れた修飾プ
ロテアーゼを調製するために必要であり、この値か５以
上であると更に好ましい結果か得られることか明瞭であ
る。

実施例３ 実施例１の方法に準じて修飾プロテアーゼの調製を行な
った。但し、活性化デキストラン調製に用いた塩化シア
ヌル量２反応ｐＨ２反応時間を第３表に示す。又プロテ
アーゼとしては、反応性アミノ基量０．５５ｍ　　ｍｏ
Ａｅ／ｇの精製エスペラーゼを使用し、修飾反応に於い
ては重量比にして酵素の８倍量の活性化デキストランを
反応に供した。

得られた修飾プロテアーゼの評価結果を第３表第３表よ
り明らかなように、本発明の条件下に於いて調製された
修飾プロテアーゼは優れた安定性及び安全性を示す。

実施例４ 実施例３の実験例８て得られた修飾プロテアーゼを第４
表に示した各種の基本的な剤形に０．２％配合し、６０
″Ｃて６時間の加熱処理を行なった後の活性を測定し、
安定性を元の酵素と比較評価し第４表の結果から明らか
な如く、こうしたモデル剤形中でも修飾プロテアーゼは
優れた安定性を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）多糖類と塩化シアヌルとを反応させて得られたト
   リアジン環結合多糖類と、プロテアーゼとを反応せしめ
   修飾プロテアーゼを製造するに際し、前記トリアジン環
   結合多糖類として、反応性塩素含有量が０．４〜１．２
   ミリモル／ｇのものを使用し、且つプロテアーゼの反応
   性アミノ基に対してモル比で２倍以上のトリアジン環多
   糖類の反応性塩素の存在下で反応せしめることを特徴と
   する修飾プロテアーゼの製造方法。
2. （２）トリアジン環結合多糖類とプロテアーゼとの反応
   に際し、該トリアジン環結合多糖類をプロテアーゼに対
   し重量比にして３倍以上用いるものである。 特許請求の範囲第１項記載の製造方法。