JPH02219575A - 酵素固定用膜の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業との利用分野〉 本発明は酵素固定用膜及び酵素固定膜の製造方法に関す
る。

〈従来の技術〉 近年、酵素反応を利用し几工業的規模での実施は医薬晶
子食品工業の分野で盛んに行なわｎているが、酵素目体
の価格が高価なことｆ１ｍ液状態にＣＶ用した場合に反
応後における生ｒＪｙ、物と酵素の分離で回収が困難で
あることなどの問題点から。

担持体ＶＣ＃素を固定する。所謂固定化酵素の手法が檀
々検討されている。

反応生成蜀と酵素の分離を酵素反応と同時に処理できる
方法として限外濾過膜の如ｔＡ膜を利用した方法が研死
さＩしており、＃！密分離精製の前処理として分子分画
による粗分離処理が憔めて容易になるものとして注目さ
几てＳ？す、とりわけ、高分子基質から低分子生成物を
得る友めの酵Ａ反応への適用が期待されている。これら
の一つとして。

＃木を膜に固定したメンブレンリアクターが提案さル、
酵累を異方性限外濾過膜の多孔質部に閉じ込めて披榎を
施こす方法（特開昭５９−２５６８６号公報）−？、多
多孔郡部酵素をゲルと共に封入包括する方法（特公昭５
７−４１２３８号公報）などが開示されているが、いず
れの方法も酵素を長期間にわ几って安定に保持できるも
のではない。

また、酵素を安定に保持する友めに、官能基を有する膜
に直接共有結合によって酵素を固定する方法も提案され
ているが、この方法では酵素活性が低下したり、酵素が
失活した際の再生が困難であるなどの問題を有するもの
であり、工業的規模での実用化に充分に耐えうるもので
はない。

Ｊ：記問題点の解決のために、外直に緻密Ｉ−を有する
非対称限外濾過膜からなる中空糸状膜を用いた酵素固定
膜（特開昭６２−８３３８５号公報）−？、多孔質構造
のみからなる中空糸状膜に特定の処理を施こしてなる酵
素固定膜（特願昭６３−２６２４４３号）が開発されて
いる。

しかし、こｎらの方法では加圧Ｆにて膜の多孔質１−に
水だ在高分子を含浸させるため、酵素固定用膜の透水性
能が低ドするという問題があった、〈発明が解決しよう
とする課題〉 従って６本発明の第１の目的は、膜の透水性能の大幅な
低下がなく、且つ＃素を長期間にわ几って高活性に保持
することができる酵素固定用膜の製造方法を提供するこ
とにある。

本発明の第２の目的は上記酵素固定用膜に酵素を共有結
合にて固定化してなる＃累固定膜の製造方法を提供する
ことにある。

〈課題を解決するための十段〉 上記目的を達成すべく、検討を重ねた結果、多孔質構造
を有するｆ過膜に、少なくとも２個の官能基を有する水
溶性高分子を浸漬により含浸させ。

該水浴性高分子を架橋剤溶液に浸漬して架橋せしめた膜
が高い透水性能を有し、優れた自由度を維持しながら＃
素を固定できることを見い出し１本発明を完成するに至
り几、 即ち本発明は、多孔質構造を有するＰＡＢ１８Ｔを。

少なくとも２個の官能基を有する水溶性高分子の溶液に
浸漬し、さらに架橋剤溶液に浸漬して、＃。

水溶性高分子を架橋する酵素固定用膜の製造方法及びか
かる方法で得られた酵素固定用膜に、水浴性高分子の官
能基を介して酵素を共有結合＜て固定する酵素固定膜の
製造方法を提供する。

本発明において用いられるＰａ１ｍは１分画−分子量が
１，０００〜ｓ、ｏ　ｕ　ｏ、　ｏ　ｏ　ｏであるが０
．０５〜２μ鴨の細孔をもつ多孔質構造を有しているも
のが好ましく、多孔′Ｊｔ１−と同時に緻［−を有・ｒ
る異万注濾過膜でも艮い。その形状は平板状、管状、中
空糸状など任意に選択することができる。好ましくは有
効膜面積を大きくシ、固定化さｔＬ之酵素と基質との接
触面積を大きくするために中空糸状膜とすることが望ま
しい。

上記ｆＪＭ膜を製造するに際して用いる材料としては０
例えばポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアミ
ド、ポリイミド、酢酸セルロースポリアクリルニトリル
などが挙げられる。こ１らの材料は後述する水浴性高分
子ｆ＃素と反応するような官能基を特にＭ−ｒる必要ｔ
よないが、耐熱性や機械的強度の面でポリスルホンが好
適に使用できる。

と記ｆ過編は通常行なわれている既知の方法により製膜
できるが、多孔質構造を有するｆ過膜であればいかなる
方法、形状のものであっても本発明の技術に適用するこ
とができる。

本発明の＃累固定用膜は、上記−過膜を少なくとも２個
の官能基を有する水溶性高分子物質の溶液１通常水浴液
に浸漬し１次いで架橋剤によって架橋せしめる。このよ
うな水溶性高分子としては。

例えばポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン。ポ
リブチレンイミンの如きポリアルキレンイミン、ポリエ
チレングリコール　ポリプロピレングリコールの如きポ
リアルキレングリコール　ポリリジン、ポリアルギニン
の如きポリアミノ酸。

ポリアリールアミンなどｆｉ；挙げられ１通常、直量平
均分子量が約１０００〜２０００００　、官能基数が数
十〜故百のものが好ましく、Ｉｊ２！用する酵素の種類
−？ｍ材料のｌａｍ、膜の形状に応じて適宜選択するこ
とが出来る。これらの水溶性高分子のうち、ポリエチレ
ンイミンｆポリアリールアミンは官能基数の調節が容易
で１反応性も高いので特に好適に用いることができる。

上記水−往窩分子の溶液に、多孔質構造を有するＰ２１
！ｇを浸漬−ｒるにあたり、溶液の溶＊嬢度は２重量％
以下、好ましくは０．１〜１．０　ｉ濾％の範囲に設定
する。

一質ａ度が２重量％以上であると過膜に水溶性高分子が
含浸及び架橋されることになり、ｆｆｌの加圧洗浄によ
っても除くことができずかえって透水性能を下げる場合
がある。水′ａ性高分子俗液の液量は、ＢＭモジュール
の形状及びサイズにより制約を受けるが、およそ０．０
５〜２ｄ／６４膜、好ましくは０．１−１　ｄ／−膜の
範囲に設定するのが望°ましい。

ま几、浸漬に要する時間は、多孔質層全体へ均一に水感
性高分子を含浸できれば特に限定されず。

水溶性高分子の種類１分子通、温度及びＦ４膜の分画１
分子量によって適当に設定−ｒることかできる。

上記の如く含浸を行なり几水溶性高分子はｆ過膜の多孔
質層に保持されるが、数回の膜洗浄操作によって不純物
１−ｙ極度に低分子量の水浴性高分子が除去さｎる。

しかるのち、架橋剤ｍ液に２請し、前記水溶性高分子を
架橋せしめる。このような架橋手段を施こすことＶζよ
って水溶性高分子は三次元化して不溶化し０分子のがさ
ばＤ′？立体障害が大きくなるので、膜自体に結合せず
とも多孔質層の孔内に保持することができ、後の膜洗浄
によっても流出しないものとなる。

このような架橋剤としては、グリオキサールグルタルア
ルデヒド、アジピンアルデヒド、マロンジアルデヒド、
ジアルデヒドＭ粉の如きジアルデヒド類、ヘキサメチレ
ンジイソシア＄−ト、）ルエンンイソシアネートの如き
ジインシアネート類、ヘキサメチレンジインチオシアネ
ートの如きジイソチオンアネート類などが挙げられ、水
溶性高分子にポリアミノ酸を使用し次場合には水浴性カ
ルボジイミドなどの縮合試薬を用いることもできる。こ
れらのうち、特にジアルデヒド類ヤシインシアネート類
は水浴液中で比較的安定で反応性も高いために好適に用
いることができる。

上ｄｄ架橋剤は溶液状態１通常水浴液状態で開用するが
、水浴性高分子中の官能基量と該架橋剤中の官能基量と
のモル濃度比を２〜５０．好ましくは６〜２０とするこ
とによって、のちに酵素と結合する官能基量を充分に残
存させることができる。

上記のようにして酵素固定用膜を得ることができるが、
酵素を固定化するに際して、上記のように架橋し７１′
？、膜に６通常の洗浄処理である加圧洗浄によって多孔
質Ｊ−に残存する水架橋の水溶性高分子ｆ未反応の架橋
剤を除去することが望ましい。

このようにして得られた酵素固定用膜は、前記水溶性高
分子の官能基を介して共有結合で酵素を固定することに
より酵素固定膜とすることができる、前記水溶性高分子
はその分子末端や側鎖にアミン基、カルボキシル基、ヒ
ドロキシル基などの官能基を有しているので、既知の手
法を用いて酵素が有する官能基と直接、または前記架−
橋剤ｆカツフＩＪング剤によって間接的に共有結合させ
る。さらに、固定化された酵素の可動性を大きくシ、酵
巣反応を高める次めにスペーサーを介在させることもで
きる。

このような酵素としては特に限定さｎるものではないが
１本発明により得られ几酵素固定膜を用いて濾過膜とし
ての特性を充分に発揮するためには、多！ａ類ｆ蛋白質
の加水分解＃素が有用で６９゜例えばα−アミラーゼ、
グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ムラミ
ダーゼの如き多糖類加水分解酵素、パパイン、ペプシン
　トリプシン、キモトリプシン　プロメライン　プロテ
アーゼの如き蛋白質加水分解酵素などが挙げらｎる。

上記酵素を含む溶液を透過させるに際しての加圧条件は
１通常０．１〜ｌ　Ｋｇ／ｃ４の範囲に設定するのが望
ましい。刀口圧度合が大きすぎると、既に保持されてい
る水浴性高分子が圧密化されたノーを形成して、基質溶
液を透過させて酵素反応をさせる場合に、基質の透過移
動の障害となり、固定化した酵素を反応に有効活用する
ことができなくなることがある。

〈発明の効果〉 以とのように本発明の方法は、多孔質構造をＭするＰ２
Ｍ膜を、水浴性高分子の浴液に浸漬し、さらに架橋剤ｍ
液に浸漬して、水溶性高分子を架橋する比め水溶性高分
子の圧密化が起こりに〈＜。

且つ多孔質層全体に略均−に水浴性高分子が架橋状態で
保持さｎていると考えられ、透水性能に優れ且つ活性の
高い固定化酵素を得ることができる。

従って、この膜を酵素固定膜として開用すると酵素固定
用膜が高い透水性能を有しているため必然的に酵素を固
定した酵素固定膜も透水性能が優れ。

また、酵素の自由度を確保するように高活性を維持しな
がら確実に固定化できるので、　＆ＡＩＪにわたる酵素
反応にも酵素の離脱がなく開用することが可能となる。

〈実施例〉 以下に本発明の実施例を示し、さらに詳細に説明するが
１本発明の技術的思想を逸脱しない範囲で檀々の応用が
可能である。

実施例１ 内表面に０．１〜１．５μｍ、外表面に０．１５〜０．
２μ胤の細孔が存在し１分画−分子量的１ＯＬ）万の多
孔質摘造を有するポリスルホン製中空糸状ｇ（内径１１
ＪＩＩＩ外径１．８龍）を組み込んだ小型モジニール（
有効長９ｃｒＩＬ、有効膜面積５Ｌ）　７　）を作製し
、これを０．０４〜１．０　＠量％誠度のポリエチレン
イミン（ＰＥＩ）水ｍ液（重量平均分子量的７０，０１
３Ｇ、１分子当たりのアミノ基数的４００）２０ｄに室
温で約１６時間浸漬した。

次いで水で洗浄後、０．０２〜１．０重量％ＩＩＩ度の
グルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液に約１６時間室温で
浸漬し、多孔′Ｒ層に保持さｔしているポリエチレンイ
ミンを架橋し比。

次いで、水で加圧（０，５即／−）洗浄し、未架橋のポ
リエチレンイミンｆ未反応のグルタルアルデヒドを除去
し酵素固定用膜を得た。

上記のようにして得た酵素固定用膜に４０℃にテ１．Ｏ
ｉ！ｌｉｔ％譲度のグルタルアルデヒド水溶液に２時間
浸漬してポリエチレンイミンのアミン基を活性化した後
洗浄した。次に０．２１ｎｇ／ＩＩＩの丈イクロデキス
トリングルカノトランスフェ２−ゼ（コンテザイム、天
野製薬製）溶液を０．３Ｋｇ／ｄの加圧下にて透過し、
共有結合によって酵素を固定した。

比較例１ Ｏ，０４，６るいは０．４重量％娘度のポリエチレンイ
ミン２００　ｄ　ｅよび１．０重量％濃度のグルタルア
ルデヒド水浴液を０．３　ｋＣ９／−の加圧下にて水層
性高分子の含浸および架橋を行なつ比以外は実施例１と
同様の操作を行ない、酵素固定用膜を得た。さらに実施
例１と同様に酵素を固定し比。

実施例１および比較例１で得た酵素固定用膜の透水性能
２よび酵素固定膜の透水性能と固定化酵素の活性を表１
に示す。透水性能は表１の（ｅ）の条件で得７？１．膜
の純水透過流束の値を１００として相対値で表わす相対
純水透過流束で示し、酵素活性はβ−ナイクロデキスト
リン分解速度で示し几。

β−プイクロデキストリノ分解速度はｐｆ（６，０，５
０℃、１．２５道量％のグルコース存在゛ドでの０．５
重量％β−サイクロデ中ストリンの分解速変である。

表１で明らかなように、実施例１の浸漬法で得友酵素固
定用膜の透水性能が優れ、また固定化酵素の活性も向上
し友。酵素活性の向上は水浴性高分子の圧密化が＠減さ
れたことにより、水溶性高分子の官能基の利用率が高く
なった。あるいは。

水ｍ性高分子が略均−に多孔質層に含浸され、酵素も略
均−に多孔質層に固定化さｎた几め反応効率が増大し几
ためと考えられる。

また、５０℃、ｐｆ（６，０の酢酸緩衝液を１週間透過
後の残存酵素活性は実施例１および比較例１ともおよそ
９０％であり７′？、。

実施例２ シート状ポリスルホンａａ外ｆ過膜（日東電工■製ｒ４
ＴＵ−３ｔｓｏ）を直径４３１１１の円型に打抜き。

０．４１℃％濃度のポリアリールアミン水溶液（直音平
均分子量ｔｏ、０００．１分子当比りのアミノ基数的１
７５０　）　ｌＯｄに室温で約１６時間浸漬後、洗浄し
友。そして０．２電量％−度のへキサメチレンジインシ
アネート水浴液に室温で約１６時間浸漬し、多孔’ｌｌ
ｌ−に含浸されているポリアリールアミンを架橋した。

次に膜を透過用セルに固定して、スキン層側より水で加
圧（０，５Ｋｇ／ｍ　）洗浄し、未架橋のポリアリール
アミンｆ未反応のジイソシアネートを除去し、酵素固定
用膜を得た。

上記のようにして得几＃素固定用換ｒ（ｌ扉ｙ／ｄのプ
ロテアーゼ（三共製コクラーゼ５Ｓ）ｌ’ｌｌ’［を実
施例１と同様に固定し１本発明の＃＃Ａ固定膜を得た。

比較例２ 実施例２におけるポリアリ−ルアばンおよびヘキナメチ
レンジイソシアネート水溶液を０．３　Ｋｇ／ｃｄの圧
力下にて透過させ次以外は実施例２と同様の操作を行な
い、酵素固定用膜を作製し、さらに同様にプロテアーゼ
を固定し、酵素固定膜を得た。

実施例２および比較例２で得友酵素固定用膜の純水透過
流束は実施例１の膜が約３５％高かつ友。

次に１両プロナアーゼ固定膜に１［盪％濃度のカゼイン
Ｍ液を０．３ｋｐ／−の加圧下にて連続的に供給して酵
素反応を行ない、透過液中の蛋白質分解物をケルダール
法、トリクロロ酢酸沈澱により測定した。いずｎの透過
液もトリクロロ酵酸で沈澱が生じず、蛋白質が低分子ペ
プチドに分解されて−た。低分子ペプチドの生成速度は
２７％ま九はグロテアーゼ固定換の純水透過流束ｒ１２
２％比較例２エリ実施例２で得られた酵素固定膜が高か
つ友。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）多孔質構造を有するろ過膜を、少なくとも２個の
   官能基を有する水溶性高分子の溶液に浸漬し、さらに架
   橋剤溶液に浸漬して、該水溶性高分子を架橋する酵素固
   定用膜の製造方法。
2. （２）多孔質構造を有するろ過模がポリスルホン膜であ
   る請求項（１）記載の酵素固定用膜の製造方法。
3. （３）水溶性高分子がポリエチレンイミンまたはポリア
   リールアミンである請求項（１）記載の酵素固定用膜の
   製造方法。
4. （４）架橋剤がジアルデヒドまたはジイソシアネートで
   ある請求項（１）記載の酵素固定用膜の製造方法。
5. （５）請求項（１）ないし（４）記載の方法で得られた
   酵素固定用績に、水溶性高分子の官能基を介して酵素を
   共有結合にて固定化することを特徴とする酵素固定膜の
   製造方法。