JPH02245190A - 酵素反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は酵素固定膜を用いた酵素反応方法に関する。

〈従来の技術〉 従来、工業的規模にて酵素反応によって有用物を生産す
る方法が医薬品や食品製造において広く行なわれている
。しかし、酵素自体が高価であることや、溶液状態にて
酵素を用いた場合、反応後の生成物と酵素との分離や回
収が容易でないところから、近年、所謂固定化酵素を用
いる酵素反応が実用化されるに至っている。

酵素を固定化する担体は、既に種々のものが知られてい
るが、なかでも表面に分画機能を有する緻密層を備え、
これ全一体に多孔質層が支持している異方性構造を有す
る限外濾過膜のように、分画機能を備えた膜体に酵素を
固定化してなる所謂酵素固定膜は、自体、酵素を固定化
し、担持していると共に、その分画性金適当に選択する
ことによって、反応生成物を酵素から直ちに分離し得る
のみならず、場合によっては基質からも分離し得るので
、高性能酵素膜リアクターとして注目を集めている。

このような膜リアクターとして、例えば、特開昭５９−
２５６８６号公報には、酵素を多孔質層に閉じ込めて被
覆を施してなる膜リアクターが記載されており、また、
特公昭５７−４１２３８号公報には、多孔質層に酵素を
ゲルと共に封入包括してなる膜リアクターが記載されて
いる。しかし、このような膜リアクターによれば、いず
れも酵素が安定に保持されず、膜リアクターの酵素活性
が経時的に著しく低下する。

そこで、従来の膜リアクターにおける上記した問題を解
決するために、例えば、特開昭６２−８３８８５号公報
には、異方性限外濾過膜の多孔質層に架橋高分子を保持
させ、この架橋高分子に共有結合にて酵素を固定化して
なる膜リアクターが提案されている。

このよ−うな膜リアクターによれば、酵素活性を比較的
高く維持しつつ、酵素反応を行なうことができるが、し
かし、酵素反応を長期間にわたって連続して行なう場合
は、酵素活性の鋤下を免れることができず、更に、膜面
への付着物によって、膜透過液の透過流束が経時的に低
下し、その結果として、目的とする生産物の生産性が低
下する。

更に、酵素反応によっては酵素反応阻害が起こったりす
る。上記膜リアクターの酵素活性の低下は、酵素反応の
条件を最適に設定したり、逆洗浄操作によって、ある程
度は回避できるが、経時的な膜の目詰まり全防止するこ
とは比較的困難である。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明は酵素固定膜を用いる酵素反応における上記課題
を解決するためになされたものであって、透過液の流束
回復のための逆洗浄操作を行なわずとも、高生産性にて
長期間にわたる酵素反応を行なえる方法を提供すること
を目的とする。

く課題？解決するだめの手段〉 本発明の酵素反応方法は、表面層としての緻密層と、こ
れを一体的に支持する多孔質層とを備えた異方性限外濾
過膜の多孔質層に酵素を固定化してなる酵素固定膜を用
いる酵素反応方法において、基質溶液を上記酵素固定膜
の多孔質層側に接触させて平均膜面線速１〜５ｍ／秒下
にて循環供給して酵素反応を行ない緻密層側へ反応生成
物を取り出すと共に、圧力損失によって透過液の自然逆
流洗浄を同時に行なうことを特徴とするものである。

本発明の方法においては、膜リアクターとして多数の微
孔を有する緻密な多孔質層からなり、分画機能を有する
所謂緻密層又は活性層と、これを一体的に支持する比較
的大きい孔径の微孔を多数有する多孔質層とからなる異
方性構造を有する限外濾過膜の多孔質層に酵素が固定化
されている膜リアクターが用いられる。酵素担体として
のかかる異方性構造？有する限外濾過膜は、既に知られ
ており、市販品として入手することができる。

本発明の方法においては、異方性構造を有する限外濾過
膜の多孔質層に酵素を固定化する方法は、特に限定され
るものではなく、例えば、一般に酵素固定化の技術分野
においてよく知られているように、酵素は物理吸着法、
共有結合法、架橋法等にて固定化されていてもよい。し
かし、酵素が安定であると共に、酵素がその担体である
限外濾過膜から容易には脱離しないように、共有結合法
にて固定化されていることが好ましい。

特に好ましい方法は例えば、特開昭６２−８３８８５号
公報に記載されているように、分子内に少なくとも２個
の官能基金有する水溶性高分子の水溶液を帆１〜１＃／
ｄの加圧条件下に限外濾過膜の多孔質層から透過、含浸
させ、洗浄した後、上記水溶性高分子の架橋剤、即ち、
上記水溶性高分子の有する官能基と反応し得る官能基を
分子内に２個以上有する化合物の水溶液を前記加圧条件
内にて多孔質側から透過、含浸させて、上記水溶性高分
子を架橋させ、限外濾過膜の緻密層側からの逆洗浄によ
って、未架橋の水溶性高分子を膜から除去し、次いで、
酵素溶液を膜の多孔質側から前記加圧条件内で透過させ
て、前記架橋高分子の有する官能基を介して、共有結合
にて酵素を架橋高分子に結合させ、かくして酵素を固定
化した限外濾過膜を得る方法である。

上述した方法において用いる限外濾過膜は、分画分子量
が１０００〜１００００００の範囲である緻密層と、孔
径が数μｍ乃至１００μｍの微孔を有する多孔質層とか
らなるものが好ましいが、その形状は何ら制限されるも
のではなく、例えば、平板状、管状、中空糸状等、任意
である。有効膜面積が犬きく、且つ固定化された酵素と
基質との接触面積が大きい膜リアクター金得るためには
、限外濾過膜として中空糸状膜を用いることが好ましい
。

上記限外ｐ過膜を構成する重合体としては、例えば、ポ
リスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、ポリ
イミド、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル等が好
ましく用いられる。これら重合体は後述する水溶性高分
子と反応する官能基を特に有する必要はなく、異方性構
造を有する限外ｐ過膜に製膜し得るものであれば、特に
限定されるものではない。しかし、上記した重合体のな
かでも、食品や医薬品の製造に要求される厳格な分画分
子量を満足するものとして、ポリスルホン、ポリアミド
又はポリイミドを用いることが好ましく、特に、ポリス
ルホンが好適である。

上記したような異方性構造ヶ有する限外濾過膜は、既に
知られている方法によって製造するととができる。例え
ば、上記重合体音その溶解性に応じて水混和性の有機溶
剤、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムア
ミド、ジメチルアセトアミド、フェノール、クレゾール
、エチレンクロルヒドリン、エチレングリコール、プロ
ピレングリコール、セロソルブ、グリセリン、メタノー
ル、エタノール、グロパノール、ブタノール、アセトン
、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の１種又は２種以
上の混合物に溶解させて製膜溶液を調製し、次いで、と
の製膜溶液を主として水からなる凝固溶剤に接触させる
ことによって、接触界面に緻密層を有する種々の形状の
限外濾過膜を得ることができる。

前記水溶性高分子としては、例えば、ポリエチレンイミ
ン、ポリプロピレンイミン、ポリブチレンイミン等のポ
リアルキレンイミン、ポリエチレングリコール、ポリプ
ロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポ
リリジン、ポリアルギニン等のポリアミノ酸、アリアリ
ールアミン等を挙げることができる。これら水溶性高分
子は通常、その重量平均分子量が約１０００〜２０００
００の範囲にあり、官能基全分子内に数十乃至数百有す
るものが好ましい。特に、上記した水溶性高分子のなか
では、分子当りの官能基数の調節が容易であると共に、
官能基の反応性が高いポリエチレンイミンやポリアリー
ルアミンが好適に用いられる。

上記水溶性高分子の水溶液を異方性限外濾過膜の多孔質
層に含浸させるに際しては、その濃度は通常、１重量％
以下であり、特に、０．０５〜０．２５重量％の範囲が
好ましい。濃度が１重量％を越えるときは溶液粘度が高
く、含浸した溶液が限外濾過膜を閉塞して、膜透過液の
透過流束を低下させ、延いては酵素反応生成物の生産速
度を低下させるからである。

また、前記水溶性高分子の溶液を限、外濾過膜の多孔質
層に含浸するに際しては、限外濾過膜の多孔質層側と緻
密層側との間の圧力差がｏ、ｉ〜１ｋＱ　／　ｄ　、好
ましくは０．１〜０．５ｋｑ／ｃｄとなるようにするの
が好ましい。余りに高い圧力にて水溶性高分子溶液を限
外濾過膜の多孔質層側から膜透過させるときは、多孔質
層内部、特に、緻密層側に水溶性高分子の圧密化が起こ
って、膜を閉塞することがあるからである。しかし、圧
力が余りに低いときは、水溶性高分子の多孔質層への含
浸に長時間を要したり、或いは多孔質層全体に均一に含
浸させ難く、表層部のみが含浸されたシして、酵素の固
定化量の低下を招くこととなる。

このようにして限外濾過膜の多孔質層に水溶性高分子を
含浸させた後、膜を適宜回数洗浄して、不純物質や極度
に低分子量の水溶性高分子を膜から除去する。この後、
前記水溶性高分子の限外濾過膜への含浸と同じ圧力範囲
内で、通常は同じ圧力にて、多孔質層側から架橋剤溶液
を通液して、前記水溶性高分子と接触させて、これを架
橋する。

このような架橋によって水溶性高分子は多孔質層内で三
次元化して不溶化し、分子の嵩張りや立体障害が大きく
なるので、限外濾過膜自体に化学的に結合されずとも、
多孔質層に保持されるので、後述するように架橋高分子
に酵素を固定化した後の膜の逆洗浄や、また、酵素反応
時の膜リアクターの逆洗浄によっても、限外濾過膜から
離脱したり溶出しないものとなる。

上記架橋剤としては、グリオキサール、グルタルアルデ
ヒド、アジピンアルデヒド、マロンジアルデヒド、ジア
ルデヒドデンプン等のようなジアルデヒド類、ヘキサメ
チレンジイソシアネート、トルエンジイソシアネート等
のようなジイソシアネート類、ヘキサメチレンジインチ
オシアネート等のようなジイソチオシアネート類ヲ挙げ
ることができる。水溶性高分子が官能基としてアミン基
を有するときは、水溶性カルボジイミド等のような縮合
試薬やジアルデヒドのような架橋試薬を用いることがで
きる。これらのうち、特に、ジアルデヒド類やジイソシ
アネート類は水溶液中で比較的安定であり、反応性も高
いために、本発明において架橋剤として好適に用いられ
る。

このような架橋剤は溶液として膜透過させて、水溶性高
分子を架橋させ、他方、この架橋後も、架橋高分子が分
子内に遊離の官能基金布するように、用いる水溶液の濃
度や膜透過量を適宜に選定することが好ましい。通常は
水溶性高分子中の官能基量と架橋剤中の官能基量とのモ
ル濃度比を２〜５０、好ましくは６〜２０とすることに
よって、水溶性高分子に酵素と結合するだめの官能基金
充分に残存させることができる。

このように限外濾過膜の多孔質層にて水溶性高分子を架
橋させた後、緻密層側から通常の洗浄処理である逆洗浄
ｒ行なって、多孔質層に残存する未架橋の水溶性高分子
を除去し、この後、所定の酵素を含む溶液を限外濾過膜
の多孔質層側から通液して、前記架橋高分子の有する官
能基を介して、酵素全架橋高分子に共有結合させる。

即ち、このような方法によれば、前記架橋高分子がその
分子末端や側鎖にアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキ
シル基等の官能基を有しているので、従来、固定化酵素
の技術分野において知られている方法によって、酵素の
有する官能基を直接に、又は前記架橋剤や縮合剤を用い
て間接的に、酵素を共有結合にて架橋高分子に結合させ
ることができる。固定化酵素の可動性全天きくし、酵素
の反応性を高めるために、所謂スペーサを介して、酵素
を架橋高分子に結合させることもできる。

本発明の方法において、酵素は特に限定されるものでは
ないが、上述したように分画機能を有する限外ｐ過膜を
担体とし、これに酵素を固定化してなる膜リアクターに
よる酵素反応において、その特性を充分に活かすために
は、多糖類やタンパク質の加水分解反応に用いることが
有利である。

このような酵素反応のための酵素として、例えば、α−
アミラーゼ、グリコアミラーゼ、ペクチナーゼ、セルラ
ーゼ、ムラミダーゼ等のような多糖類加水分解酵素、パ
パイン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、フロ
メライン、グロテアーゼ等のようなタンパク質加水分解
酵素等を挙げることができる。このような酵素は高分子
基質を加水分解して、低分子の反応生成物葡与える。

本発明の方法においては、用いる基質も特に限定される
ものではないが、好ましくは前記酵素に対応する基質が
用いられる。従って、例えば、多糖類加水分解酵素に対
しては、液化デンプン、可溶性デンプン、デキストリン
のような多糖類が用いられる。液化デンプンの製造には
、α−アミラーゼにてデンプン全比較的高分子量のもの
に分解したもののほか、サイクロデキストｌ）ン生成酵
素、更には、酸、アルカリや物理的方法にて可溶化した
ものも用いられる。

本発明の方法においては、基質溶液を循環させる操作圧
力（入口圧力と出口圧力との平均圧力）は前記水溶性高
分子や架橋剤ケ含有する水溶液を膜透過させたときと同
じく、０．１〜１１ｇ　／　Ｃｄの範囲であって、且つ
、前記水溶性高分子の限外濾過への含浸時の圧力以下の
圧力にて、膜を透過させることか望ましい。即ち、基質
溶液を前記水溶性高分子の限外ｐ過膜への含浸時の圧力
よりも高くした場合は、限外ｐ過膜の多孔質層に保持さ
れている酵素の担体としての前記架橋高分子が圧密化す
るために、基質溶液を膜透過させて酵素反応を行なう場
合に、基質の透過が困難となって、酵素反応が阻害され
るからである。

本発明の方法においては、基質溶液を上記酵素固定膜の
多孔質層側に接触させて下記式にて定義される平均膜面
線速 を１〜５ｍ／秒の条件下にて循環供給して酵素反応ケ行
なう。平均膜面線速？この範囲に設定することによって
、基質循環入口側と出口側との圧力損失による透過液の
自然逆流、即ち、酵素固定膜の緻密層側から多孔質層側
へ膜透過液が逆流し、逆流洗浄操作が別設必要となくな
る。平均膜面線速か大きすぎると、基質循環入口の圧力
が上昇するので膜内体が破損する恐れがあり、また小さ
すぎると自然逆流が起こりに〈〈なシ、膜面洗浄ができ
ず、生産性の低下勿招くこととなる。

また、上記のような自然逆流洗浄は膜面の付着物を除去
できるものではあるが、透過液の流束が低下して酵素反
応性が徐々に低下し□はじめた場合、透過流束の低下量
が基質溶液の循環供給開始直後の３０％以上となる毎に
基質溶液の循環供給開始直後にすることが、透過流束の
回復性の点から好ましいものである。

〈発明の効果〉 以上のように本発明の方法によれば、平均膜面線速ｔ１
〜５ｍ／秒と比較的大きく設定して基質溶液を循環供給
しているので、圧力損失による自然逆流が生じ、膜面付
着物を除去しながら酵素反応？連続的に行なうことがで
きる。従って、従来のように頻繁に逆洗浄操作を行なう
必要がなく、逆洗性時の酵素反応中断による生産性低下
を極力抑制することができ、高生産性にて長期間にわた
る酵素反応が実現できるものである。

〈実施例〉 以下に実施例を挙げて、本発明？さらに具体的に説明す
る。

実施例１ （限外濾過膜への酵素の固定化） ポリスルホンからなる酵素固定化用中空糸状限外許過膜
（日東電工■製ＮＴＥ−３７０、分画分子量２００００
）を備えた膜モジュール（中空糸状膜径３．５絹、長さ
３２１、充填数１１５本、膜面積０．１ｍ”）を用いた
。

まず、限外ｐ過膜の多孔質層側から室温にて０．１重量
％のポリエチレンイミン水溶液を０．３ｋｑ　／　ｄの
加圧下に３０分間透過させ、ポリエチレンイミンを多孔
質層に吸着保持させた。次いで、０．１重量％濃度のグ
ルタルアルデヒド水溶液金膜の多孔質層側から温度４０
°Ｃで帆３ｋｑ／ｃｄの加圧下に４時間強制通液し、ポ
リエチレンイミンを架橋させた。この後、室温にて膜の
緻密層側から水を透過液し、膜の多孔質層に残留する未
架橋のポリエチレンイミンを洗浄除去した後、再び多孔
質層側から２．５重量％濃度のグルタルアルデヒド水溶
液を温度４０°Ｃで０．３ｋＱ／ｃｄの加圧下に４時間
通液シて、ポリエチレンイミンのアミノ基を活性化させ
た。この後、室温にて水を多孔質側から強制通液して、
膜を洗浄した。

このように処理した限外濾過膜にその多孔質層側から２
．０〜／　ｔｅｌ濃度のα−アミラーゼ溶液（三共■製
コクラーゼ、酢酸緩衝液ｐＨ６，０）を温度２　”Ｃで
０．２ｋＱ／ｄの加圧下に１５時間通液して、共有結合
にてα−アミラーゼを限外許過膜の多孔質層の保持する
架橋ポリエチレンイミンに固定化した。

このようにして得られた膜リアクターにおけるα−アミ
ラーゼの固定化量は、膜面積１１当りに０．４ダであっ
た。

（膜リアクターによるグルコースの製造）上記膜リアク
ターに１重量％濃度の可溶性デンプン溶液（酢酸緩衝液
ｐＨ６，０）を平均膜面線速２．０　ｍ／秒・及び平均
圧力０．５＃／ｄの加圧条件下にて４０°Ｃの温度で循
環供給し、圧力損失を利用した自然逆流洗浄を行ないな
がら酵素反応を行なつた。

なお、膜透過液の透過流束の低下量が基質溶液の循環供
給時と比べて３０％となったとき毎に、基質溶液の循環
供給方向全逆方向にして酵素反応を続て、透過流束及び
膜透過液中の還元糖量を測定した。その結果を第１図に
示す。

比較例１ 実施例１において、平均膜面線速に０．５ｍ／秒とした
以外は実施例１と同様にして酵素反応２行ない、透過流
束及び膜透過液中の還元糖量を測定した。その結果を第
２図に示す。

実施例１及び比較例１の結果から明らかなように、本発
明の方法によれば透過流束の低下が少なく、生産性が高
いことが判る。また、膜透過液の特性は還元糖量によっ
て変化していないことが判る。

実施例２ 実施例１において、酵素溶液として０．０２重量％グル
コアミラーゼ（酢酸緩衝液、ｐＨ６，０）　？用いた以
外は、同様にして膜リアクター？得た。

この膜リアクターに基質溶液として５重量％のデンプン
液化液（ｐＨ６，０）を平均膜面線速３．５ｍ／秒、平
均圧力０．５ｋｑ／ｄの加圧下に温度４０°Ｃで供給し
、圧力損失を利用した自然逆流洗浄を行ないながら酵素
反応ｒ行なった。

なお、実施例１と同様に膜透過液の透過流束の低下量が
２５％となったとき毎に基質溶液の循環方向を逆にして
酵素反応を行なった。

透過流束および膜透過液中のグルコース量の変化を第３
図に示す。

第１図及び第３図から明らかなように平均膜面線速を大
きくすることによって生産性が向上することが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図から第３図は、本発明の方法及び比較例としての
方法において、反応時間と透過流束及び反応時間と膜透
過液中の還元糖量又は生成グルコース量との関係を示す
グラフである。 （，１４’−ｖ／ｙ）　！’１ｉｆＶ！（ｔｗ−ｙ／；
ｒ）　Ｊ’Ｍｎ 冶　　　　斃　　　　（ （ｌ私り鍮１０小箪ｎ ０〃旬１柚ＴＯ本！７Ｖ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）表面層としての緻密層と、これを一体的に支持す
   る多孔質層とを備えた異方性限外濾過膜の多孔質層に酵
   素を固定化してなる酵素固定膜を用いる酵素反応方法に
   おいて、基質溶液を上記酵素固定膜の多孔質層側に接触
   させて平均膜面線速１〜５ｍ／秒下にて循環供給して酵
   素反応を行ない緻密層側へ反応生成物を取り出すと共に
   、圧力損失によって透過液の自然逆流洗浄を同時に行な
   うことを特徴とする酵素反応方法。
2. （２）請求項（１）記載の酵素反応において、透過液の
   流束低下量が、基質溶液の循環供給開始直後の流束の３
   ０％以上となる毎に、基質溶液の循環供給方向を逆にし
   て酵素反応することを特徴とする酵素反応方法。
3. （３）酵素固定膜が限外濾過膜の多孔質層に架橋された
   高分子重合体を保持し、この重合体に酵素が共有結合に
   て固定化されていることを特徴とする請求項（１）また
   は（２）記載の酵素反応方法。