JPH02219600A - ヌクレオチドシークエンス決定方法およびシークエンス決定用キット - Google Patents
ヌクレオチドシークエンス決定方法およびシークエンス決定用キットInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヌクレオチドシークエンス決定方法およびシ
ークエンス決定用キットに関する。
ークエンス決定用キットに関する。
さらに詳しくは、本発明は定められたポリヌクレオチド
の領域におけるヌクレオチドシークエンス用の決定方法
および試薬の組合せならびに本方法を遺伝的変異の同定
に使用することに関する。
の領域におけるヌクレオチドシークエンス用の決定方法
および試薬の組合せならびに本方法を遺伝的変異の同定
に使用することに関する。
［従来の技術・発明が解決しようとする課題］生物（ｌ
ｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の遺伝情報はそのゲ
ノムのヌクレオチドシークエンスの中に保たれている。
ｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の遺伝情報はそのゲ
ノムのヌクレオチドシークエンスの中に保たれている。
遺伝子発現の過程でヌクレオチドシークエンスはアミノ
酸シークエンス、すなわちタンパク質に翻訳される。ヌ
クレオチドシークエンス中の小変化、ただ１つの塩基の
置換でさえもタンパク質生成物の変化を導きうる。与え
られたタンパク質の質または量が変わると生物または細
胞の表現型（すなわち、観察される特性）を変化させ、
それはたとえば病気の進行（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）
として観察されうる。もし生物のゲノム中のヌクレオチ
ドシークエンスにおける変化が正確に、かつ多量の試料
がスクリーニング可能であるような効率で決定できるな
らばこのことは有意義なことである。これは遺伝的素因
または疾患の診断、癌の体細胞突然変異の検出、および
植物または動物育種（ｂｒｅｅｄｉｎｇ）のための細胞
および株の選択の機会を与えるであろう。
酸シークエンス、すなわちタンパク質に翻訳される。ヌ
クレオチドシークエンス中の小変化、ただ１つの塩基の
置換でさえもタンパク質生成物の変化を導きうる。与え
られたタンパク質の質または量が変わると生物または細
胞の表現型（すなわち、観察される特性）を変化させ、
それはたとえば病気の進行（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）
として観察されうる。もし生物のゲノム中のヌクレオチ
ドシークエンスにおける変化が正確に、かつ多量の試料
がスクリーニング可能であるような効率で決定できるな
らばこのことは有意義なことである。これは遺伝的素因
または疾患の診断、癌の体細胞突然変異の検出、および
植物または動物育種（ｂｒｅｅｄｉｎｇ）のための細胞
および株の選択の機会を与えるであろう。
ヌクレオチドシークエンス中の変化の検出は種々の方法
により可能である。非常に都合のよい結果を与える方法
の１つは、興味ある遺伝子を含むゲノムの領域における
ヌクレオチドシークエンスを実際に決定することである
。核酸のハイブリダイゼーション法にくらべて、ヌクレ
オチドシークエンスの決定法は実際の突然変異を知る必
要がない。それは興味ある領域の位置を知ることと、試
料においてこの領域を「正常な」標準品の同じ領域と比
較することだけを必要とする。
により可能である。非常に都合のよい結果を与える方法
の１つは、興味ある遺伝子を含むゲノムの領域における
ヌクレオチドシークエンスを実際に決定することである
。核酸のハイブリダイゼーション法にくらべて、ヌクレ
オチドシークエンスの決定法は実際の突然変異を知る必
要がない。それは興味ある領域の位置を知ることと、試
料においてこの領域を「正常な」標準品の同じ領域と比
較することだけを必要とする。
ヌクレオチドシークエンスの決定に２つの基本的なアプ
ローチが用いられている。これらはマクサム−ギルバー
ト（Ｍａｘａｍ−Ｇ１１ｂｅｒｔ）の化学的方法と、サ
ンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のチェーンターミネーション法
（ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ
）である。両者とも現代の生化学の教科書によく記述さ
れている。この２法に共通なことは、サブマイクログラ
ム量の比較的純粋なターゲットポリヌクレオチドがシー
クエンシングされる必要があることである。多くのばあ
い、このターゲットポリヌクレオチドは、分析に充分な
量の核酸ポリマーをうるために、生物学的増幅（ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ ａｍｐＨｆ’１ｃａｔｉｏｎ）に適当
なベクターに遺伝子工学的方法によってクローン化され
る。また、クレッペ（Ｋｌｅｐｐｅ）らによる繰返し複
製反応（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｒｅｐＨｃａｔｌｏｎ ｒ
ｅａｃｔｉｏｎ）（ジャーナル・オブ・ザ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、）５８巻、
３４１〜３１１１頁、１９７１年参照）がイン・ビトロ
で、与えられたポリヌクレオチド領域を増幅する別の方
法を提供した。この方法はのちにムリス（Ｍｕｆｔｉｓ
）らによって適用された（欧州特許出願第２００３８２
号明細書参照）。この方法は、適切な量のＤＮＡを生産
するクローニング法としてスピードおよび効率の点で実
質的な利点を提供してはいるが、シークエンシングに直
接適した生成物を与えない。
ローチが用いられている。これらはマクサム−ギルバー
ト（Ｍａｘａｍ−Ｇ１１ｂｅｒｔ）の化学的方法と、サ
ンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のチェーンターミネーション法
（ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ
）である。両者とも現代の生化学の教科書によく記述さ
れている。この２法に共通なことは、サブマイクログラ
ム量の比較的純粋なターゲットポリヌクレオチドがシー
クエンシングされる必要があることである。多くのばあ
い、このターゲットポリヌクレオチドは、分析に充分な
量の核酸ポリマーをうるために、生物学的増幅（ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ ａｍｐＨｆ’１ｃａｔｉｏｎ）に適当
なベクターに遺伝子工学的方法によってクローン化され
る。また、クレッペ（Ｋｌｅｐｐｅ）らによる繰返し複
製反応（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｒｅｐＨｃａｔｌｏｎ ｒ
ｅａｃｔｉｏｎ）（ジャーナル・オブ・ザ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、）５８巻、
３４１〜３１１１頁、１９７１年参照）がイン・ビトロ
で、与えられたポリヌクレオチド領域を増幅する別の方
法を提供した。この方法はのちにムリス（Ｍｕｆｔｉｓ
）らによって適用された（欧州特許出願第２００３８２
号明細書参照）。この方法は、適切な量のＤＮＡを生産
するクローニング法としてスピードおよび効率の点で実
質的な利点を提供してはいるが、シークエンシングに直
接適した生成物を与えない。
それどころか、増幅された領域は、シークエンシング処
理中に存在すればシークエンシングに有害な増幅反応混
合物から、たとえば電気泳動や限外ろ過によって、注意
深く精製される必要がある。これらの精製操作は、ルー
チンの分析において、避けられるべきである時間の浪費
にいたる傾向がある。
理中に存在すればシークエンシングに有害な増幅反応混
合物から、たとえば電気泳動や限外ろ過によって、注意
深く精製される必要がある。これらの精製操作は、ルー
チンの分析において、避けられるべきである時間の浪費
にいたる傾向がある。
本発明者らは、ルーチンの診断手段（ｔｏｏｌ）として
使用するのに好適な、ヌクレオチドシークエンス中の変
化の改良された検出方法を開発し、本発明を完成するに
至った。
使用するのに好適な、ヌクレオチドシークエンス中の変
化の改良された検出方法を開発し、本発明を完成するに
至った。
〔課題を解決するための手段］
本発明は、（ωターゲット核酸ポリマーを含む試料を、
ヌクレオシド三リン酸類、核酸ポリメラーゼならびにタ
ーゲット核酸ポリマーの異なった鎖（ｓｔｒａｎｄ）と
相補的でかつハイブリダイゼーションする領域をもつオ
リゴヌクレオチドからなり、核酸ポリメラーゼによる核
酸合成重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）のプライ
マーとして有効な各増幅ブライ？ −（ａｍｐＨｆＩｃ
ａｔ１ｏｎ ｐｒｌｉｅｒ）であり、第１の増幅プライ
マーはさらにオリゴヌクレオチドに結合した第１の付着
部分（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｍｏｔｅｔｙ）を含んでい
るものである第１および第２の増幅プライマーの混合物
と増幅反応混合物を調製するために組み合せること、 （ｂ）増幅反応混合物を、ＤＮＡ合成重合が起こる第１
の条件と二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの変性（ｄｅ
ｎａｔｕｒａｔ １ｏｎ）が起こる第２の条件の間で、
付着部分に結合したターゲット核酸シークエンスのコピ
ーからなる増幅された試料を形成するために、ＤＮＡシ
ークエンシング処理に用いるのに適当な量のターゲット
核酸ポリマーのコピーを生成するのに充分な回数のサイ
クルを繰り返しサイクリングさせること、 （ｃ）それぞれ固体マトリックスおよび第１の付着部分
によってターゲット核酸ポリマーの１つの鎖を固定しう
る第１の付着部位からなる複数の第１の支持体（ｓｕｐ
ｐｏｒｔ）を増幅された試料に加えること、 （小筆１の付着部位を増幅された試料中のターゲット核
酸のコピーが第１の支持体に固定されるように第１の付
着部分と相互に作用せしめること、 （ｅ）固定された核酸を増幅反応混合物から分離するこ
と、 （「）増幅された核酸試料をそれが一本鎖核酸を形成す
るために変性すること、および （９）一本鎖核酸のシークエンスを決定すること、から
なるターゲット核酸ポリマーのシークエンス決定方法、
および （ａ）ターゲット核酸ポリマーの一部分と相補的でかつ
ハイブリダイゼーションし、酵素的核酸合成重合プライ
マーとして有効なオリゴヌクレオチドおよび第１の付着
部分からなる第１の増幅プライマー、ならびに （ｂ）それぞれ固体マトリックスおよび第１の付着部分
によって増幅プローブのオリゴヌクレオチドを固定しう
る少なくとも１つの付着部位からなる複数の第１の支持
体からなる組合せがパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎ
ｇ）されてなるターゲット核酸ポリマーのシークエンス
決定用キットに関する。
ヌクレオシド三リン酸類、核酸ポリメラーゼならびにタ
ーゲット核酸ポリマーの異なった鎖（ｓｔｒａｎｄ）と
相補的でかつハイブリダイゼーションする領域をもつオ
リゴヌクレオチドからなり、核酸ポリメラーゼによる核
酸合成重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）のプライ
マーとして有効な各増幅ブライ？ −（ａｍｐＨｆＩｃ
ａｔ１ｏｎ ｐｒｌｉｅｒ）であり、第１の増幅プライ
マーはさらにオリゴヌクレオチドに結合した第１の付着
部分（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｍｏｔｅｔｙ）を含んでい
るものである第１および第２の増幅プライマーの混合物
と増幅反応混合物を調製するために組み合せること、 （ｂ）増幅反応混合物を、ＤＮＡ合成重合が起こる第１
の条件と二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの変性（ｄｅ
ｎａｔｕｒａｔ １ｏｎ）が起こる第２の条件の間で、
付着部分に結合したターゲット核酸シークエンスのコピ
ーからなる増幅された試料を形成するために、ＤＮＡシ
ークエンシング処理に用いるのに適当な量のターゲット
核酸ポリマーのコピーを生成するのに充分な回数のサイ
クルを繰り返しサイクリングさせること、 （ｃ）それぞれ固体マトリックスおよび第１の付着部分
によってターゲット核酸ポリマーの１つの鎖を固定しう
る第１の付着部位からなる複数の第１の支持体（ｓｕｐ
ｐｏｒｔ）を増幅された試料に加えること、 （小筆１の付着部位を増幅された試料中のターゲット核
酸のコピーが第１の支持体に固定されるように第１の付
着部分と相互に作用せしめること、 （ｅ）固定された核酸を増幅反応混合物から分離するこ
と、 （「）増幅された核酸試料をそれが一本鎖核酸を形成す
るために変性すること、および （９）一本鎖核酸のシークエンスを決定すること、から
なるターゲット核酸ポリマーのシークエンス決定方法、
および （ａ）ターゲット核酸ポリマーの一部分と相補的でかつ
ハイブリダイゼーションし、酵素的核酸合成重合プライ
マーとして有効なオリゴヌクレオチドおよび第１の付着
部分からなる第１の増幅プライマー、ならびに （ｂ）それぞれ固体マトリックスおよび第１の付着部分
によって増幅プローブのオリゴヌクレオチドを固定しう
る少なくとも１つの付着部位からなる複数の第１の支持
体からなる組合せがパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎ
ｇ）されてなるターゲット核酸ポリマーのシークエンス
決定用キットに関する。
［実施例］
本発明の方法は先行技術の方法に比べていくつもの利点
を提供する。すなわち、本発明においてはターゲットポ
リヌクレオチドを特定のベクター中にクローン化する必
要はまったくない。
を提供する。すなわち、本発明においてはターゲットポ
リヌクレオチドを特定のベクター中にクローン化する必
要はまったくない。
酵素的に増幅されたターゲットポリヌクレオチドの単離
は簡単で、たとえば限外ろ過やゲル電気泳動などの精製
工程に浪費するような作業は不要である。さらにシーク
エンシング反応は固定された鋳型（ｌｓｍｏｂｌｌｌｚ
ｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ）上で行なわれ、工程の制御に
有利であり、オートメーション化およびターゲットポリ
ヌクレオチドの両方の鎖を同時にシークエンシングする
ことを可能にする。
は簡単で、たとえば限外ろ過やゲル電気泳動などの精製
工程に浪費するような作業は不要である。さらにシーク
エンシング反応は固定された鋳型（ｌｓｍｏｂｌｌｌｚ
ｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ）上で行なわれ、工程の制御に
有利であり、オートメーション化およびターゲットポリ
ヌクレオチドの両方の鎖を同時にシークエンシングする
ことを可能にする。
本発明のヌクレオチドシークエンス中の変化の検出方法
は、興味ある領域におけるヌクレオチドシークエンスの
決定に基礎を置いている。
は、興味ある領域におけるヌクレオチドシークエンスの
決定に基礎を置いている。
本発明によれば、本方法の第１工穆は、修飾された繰返
し複製反応によって、特定のターゲットポリヌクレオチ
ドの少なくとも１つの鎖に少なくとも１つの゛付着部分
が導入されている増幅されたＤＮＡ試料をつることを含
んでいる。これはターゲット核酸ポリマーを含む試料を
、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄ
ＧＴＰおよびｄＴＴＬ） 、ＤＮＡポリメラーゼならび
に第１および第２の増幅プライマーの混合物と組み合せ
て達成されうる。各増幅プライマーは、ターゲット核酸
ポリマーの異なった鎖（すなわち、２つの相補的な鎖の
一方か他方）と相補的で、かつハイブリダイゼーション
し、かつＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成重合プラ
イマーとして有効な領域をもつオリゴヌクレオチドから
なる。増幅プライマーの少なくとも１つはさらに該オリ
ゴヌクレオチドと結合した第１の（ｒｌｒｓｔ）付着部
分を含んでいる。調製された増幅反応混合物は、ＤＮＡ
の合成が起こる第１の条件と二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮ
Ａへの変性が起こる第２の条件の間で、付着部分に結合
したターゲット核酸シークエンスのコピーからなる増幅
された試料を形成するために、ＤＮＡシークエンシング
処理に用いるのに適当な量のターゲット核酸ポリマーの
コピーを調製するのに充分な回数のサイクルを繰り返し
サイクリングされる。一本鎖ＤＮＡないし二本鎖ＤＮＡ
のアニーリング、とくに一本鎖増幅プライマーの一本鎖
鋳型ＤＮＡへのアニーリングが起こる第３のインキュベ
ーション条件は各合成段階の前に組み込まれるのが有利
である。
し複製反応によって、特定のターゲットポリヌクレオチ
ドの少なくとも１つの鎖に少なくとも１つの゛付着部分
が導入されている増幅されたＤＮＡ試料をつることを含
んでいる。これはターゲット核酸ポリマーを含む試料を
、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄ
ＧＴＰおよびｄＴＴＬ） 、ＤＮＡポリメラーゼならび
に第１および第２の増幅プライマーの混合物と組み合せ
て達成されうる。各増幅プライマーは、ターゲット核酸
ポリマーの異なった鎖（すなわち、２つの相補的な鎖の
一方か他方）と相補的で、かつハイブリダイゼーション
し、かつＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成重合プラ
イマーとして有効な領域をもつオリゴヌクレオチドから
なる。増幅プライマーの少なくとも１つはさらに該オリ
ゴヌクレオチドと結合した第１の（ｒｌｒｓｔ）付着部
分を含んでいる。調製された増幅反応混合物は、ＤＮＡ
の合成が起こる第１の条件と二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮ
Ａへの変性が起こる第２の条件の間で、付着部分に結合
したターゲット核酸シークエンスのコピーからなる増幅
された試料を形成するために、ＤＮＡシークエンシング
処理に用いるのに適当な量のターゲット核酸ポリマーの
コピーを調製するのに充分な回数のサイクルを繰り返し
サイクリングされる。一本鎖ＤＮＡないし二本鎖ＤＮＡ
のアニーリング、とくに一本鎖増幅プライマーの一本鎖
鋳型ＤＮＡへのアニーリングが起こる第３のインキュベ
ーション条件は各合成段階の前に組み込まれるのが有利
である。
増幅後、付着部分をもつターゲット核酸ポリマーの鎖は
、付着部分またはその変型 （ａｏｄｌｆｌｃａｔｌｏｎ）が結合しうる付着部位（
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ５ｉｔｅ）でコーティングされ
た固体マトリックス（ｓｏｌｌｄ ｍａｔｒｉｘ）を用
いて捕捉される。この方法で、ターゲット核酸の鎖は固
体マトリックスに結合され、非結合反応物から固体マト
リックスとともに容易に分離されうる。
、付着部分またはその変型 （ａｏｄｌｆｌｃａｔｌｏｎ）が結合しうる付着部位（
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ５ｉｔｅ）でコーティングされ
た固体マトリックス（ｓｏｌｌｄ ｍａｔｒｉｘ）を用
いて捕捉される。この方法で、ターゲット核酸の鎖は固
体マトリックスに結合され、非結合反応物から固体マト
リックスとともに容易に分離されうる。
ターゲットポリヌクレオチドの精製されたコピーは固定
前か非結合反応物からの固体マトリックスの分離ののち
に変性され、増幅されたターゲットポリマーのシークエ
ンスが決定される。
前か非結合反応物からの固体マトリックスの分離ののち
に変性され、増幅されたターゲットポリマーのシークエ
ンスが決定される。
たとえばチェーンターミネーシジンシークエンシング（
ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ）反応は鋳型として作用するターゲットポリヌク
レオチドの変性したコピー上で開始することができる。
ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ）反応は鋳型として作用するターゲットポリヌク
レオチドの変性したコピー上で開始することができる。
新たに合成されたシークエンシング反応生成物は、つい
で鋳型から外され、サイズによっで分離検出される。
で鋳型から外され、サイズによっで分離検出される。
本発明はまた発明の方法を実施するための試薬の組合せ
またはキットを包含する。正確なパッケージングは付着
部分と選ばれた付着部位の組合せによるが、前述のキッ
トは一般に付着部分をもつ増幅プライマーおよび増幅プ
ライマーの固定に適した支持体を含むものである。
またはキットを包含する。正確なパッケージングは付着
部分と選ばれた付着部位の組合せによるが、前述のキッ
トは一般に付着部分をもつ増幅プライマーおよび増幅プ
ライマーの固定に適した支持体を含むものである。
本発明の方法は、ターゲット核酸における少なくとも１
つの潜在的なヌクレオチド変異を決定するのに有効であ
る。この変異とは、ヌクレオチドの置換、欠失または挿
入があげられる。
つの潜在的なヌクレオチド変異を決定するのに有効であ
る。この変異とは、ヌクレオチドの置換、欠失または挿
入があげられる。
したがって、本発明の方法は、法分析
（ｒｏｒｅｎｓｌｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）または遺伝的
素因または疾患の分析に適用しうる。
素因または疾患の分析に適用しうる。
これらの分析において、このヌクレオチド変異が体細胞
突然変異であるばあいがある。
突然変異であるばあいがある。
前記のとおり、本発明の方法は、植物または動物育種の
ための細胞、株または種の選択、または所望の遺伝子型
を示す（ｄｉｓｐｌａｙ）微生物の選択にもまた適用し
うる。
ための細胞、株または種の選択、または所望の遺伝子型
を示す（ｄｉｓｐｌａｙ）微生物の選択にもまた適用し
うる。
本発明は複雑な核酸混合物中の、先に定められた領域で
あるヌクレオチドシークエンスの決定方法を開示する。
あるヌクレオチドシークエンスの決定方法を開示する。
好ましい態様には、２つの既知の基本的方法が用いられ
る。すなわちサンガーのチェーンターミネーシ日ンシー
クエンシング方法と繰返し複製反応である。本発明はま
た、引用されてここに組込まれる米国特許出願第０２４
．８０４号明細書に記載された親和性に基礎をおくハイ
ブリッド収集処理（ｈｙｂｒＩｄｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）も利用する０本発明におけるこ
れらの方法の新規な組合せは、遺伝的欠陥の検出に非常
に適した、核酸をシークエンシングする容易かつ有効な
方法である。
る。すなわちサンガーのチェーンターミネーシ日ンシー
クエンシング方法と繰返し複製反応である。本発明はま
た、引用されてここに組込まれる米国特許出願第０２４
．８０４号明細書に記載された親和性に基礎をおくハイ
ブリッド収集処理（ｈｙｂｒＩｄｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）も利用する０本発明におけるこ
れらの方法の新規な組合せは、遺伝的欠陥の検出に非常
に適した、核酸をシークエンシングする容易かつ有効な
方法である。
本発明によれば、少ないターゲット核酸の試料がまず繰
返し複製反応を用いて増幅され、前記反応では増幅プラ
イマーの１つまたは両方が付着部分、たとえばアフィニ
ティーペア（ａｆＮｎｌｔｙ ｐａｌｒ）の一方を含む
ように修飾されて用いられる。興味あるターゲットシー
クエンスはこの修飾された繰返し複製反応で適当な回数
のサイクルを繰り返しサイクリングされて増幅される。
返し複製反応を用いて増幅され、前記反応では増幅プラ
イマーの１つまたは両方が付着部分、たとえばアフィニ
ティーペア（ａｆＮｎｌｔｙ ｐａｌｒ）の一方を含む
ように修飾されて用いられる。興味あるターゲットシー
クエンスはこの修飾された繰返し複製反応で適当な回数
のサイクルを繰り返しサイクリングされて増幅される。
ついで、試料は処理され二本鎖核酸を１本鎖にされても
よい。そののち、付与された付着部分で修飾されたすべ
ての分子は相補的な付着部位、たとえばアフィニティー
ペアの他の成分をコーティングされた固体マトリックス
に結合される。つぎに該マトリックスは洗浄され、すべ
ての非結合物質が除去される。増幅されたＤＮＡを変性
前にマトリックスに付着させることもまた可能である。
よい。そののち、付与された付着部分で修飾されたすべ
ての分子は相補的な付着部位、たとえばアフィニティー
ペアの他の成分をコーティングされた固体マトリックス
に結合される。つぎに該マトリックスは洗浄され、すべ
ての非結合物質が除去される。増幅されたＤＮＡを変性
前にマトリックスに付着させることもまた可能である。
そのばあい、二本鎖の吸着された（ ａｄｓｏｒｂｅｄ
）核酸分子の一本鎖形態への変性は固定（付着）後にな
される。このアプローチはまた本質的に純粋な相補鎖を
、それが付着部分で合成されたものでなくても、溶出可
能にする。
）核酸分子の一本鎖形態への変性は固定（付着）後にな
される。このアプローチはまた本質的に純粋な相補鎖を
、それが付着部分で合成されたものでなくても、溶出可
能にする。
変性工程が行なわれる段階とは関係なく、一本鎖核酸が
一方の末端からその上に結合している固体の支持体が生
ずる。この固体の支持体、好ましくはマイクロビーズ（
ｍ１ｃｒｏｂｅａｄｓ）は、ついでチェーンターミネー
ションシークエンス工程の、各ヌクレオチド、Ａ、Ｃ％
ＧまたはＴのための反応混合物の一つである反応混合物
中に導入される。重合工程はビーズ上で進行させられる
。ついでビーズは、所望により洗浄され、そののち合成
重合生成物はビーズから溶出され、多数のマニュアル、
セミマニュアル、またはオートマチイックなシークエン
シングブロトコールに記載されているようにゲル電気泳
動で分析される。この過程の変型において修飾された鎖
が結合したマトリックスから溶出された本質的に純粋な
相補鎖はシークエンシング鋳型として使用される。もし
両方の増幅プライマーが異なった付着部分で修飾され、
その結果生じた増幅されたＤＮＡが異なる物理的に分離
しうるマトリックスに「付着」されているなら、両方の
鎖は同じシークエンシング反応混合物に導入されうるし
、それに鎖が付着するマトリックスは最後の変性とゲル
電気泳動の直前にまでおくれてお互いを分離することが
できる。電気泳動の直前まで２者の分離を行なわなくて
もよいので、同時に両方の鎖をシークエンシングするこ
とが可能となり、２者をほとんど１つとして扱いうろこ
とによってシークエンシングにかかる労力は減少される
。
一方の末端からその上に結合している固体の支持体が生
ずる。この固体の支持体、好ましくはマイクロビーズ（
ｍ１ｃｒｏｂｅａｄｓ）は、ついでチェーンターミネー
ションシークエンス工程の、各ヌクレオチド、Ａ、Ｃ％
ＧまたはＴのための反応混合物の一つである反応混合物
中に導入される。重合工程はビーズ上で進行させられる
。ついでビーズは、所望により洗浄され、そののち合成
重合生成物はビーズから溶出され、多数のマニュアル、
セミマニュアル、またはオートマチイックなシークエン
シングブロトコールに記載されているようにゲル電気泳
動で分析される。この過程の変型において修飾された鎖
が結合したマトリックスから溶出された本質的に純粋な
相補鎖はシークエンシング鋳型として使用される。もし
両方の増幅プライマーが異なった付着部分で修飾され、
その結果生じた増幅されたＤＮＡが異なる物理的に分離
しうるマトリックスに「付着」されているなら、両方の
鎖は同じシークエンシング反応混合物に導入されうるし
、それに鎖が付着するマトリックスは最後の変性とゲル
電気泳動の直前にまでおくれてお互いを分離することが
できる。電気泳動の直前まで２者の分離を行なわなくて
もよいので、同時に両方の鎖をシークエンシングするこ
とが可能となり、２者をほとんど１つとして扱いうろこ
とによってシークエンシングにかかる労力は減少される
。
以下に本発明の種々の態様をさらに詳述する。
（ω 付着部分でのターゲット核酸断片の修飾本発明の
方法によって分析されるターゲット核酸（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）の起源はヒト細胞、動物細胞、植物細胞または
微生物のいずれでもよい。
方法によって分析されるターゲット核酸（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）の起源はヒト細胞、動物細胞、植物細胞または
微生物のいずれでもよい。
ターゲット核酸は生物学的試料から通常の核酸精製法に
よって単離されうるが、本発明にしたがえば未精製の生
物学的試料を直接使用することも可能である。
よって単離されうるが、本発明にしたがえば未精製の生
物学的試料を直接使用することも可能である。
本発明の方法において、付着部分は増幅されるべき領域
あたり２つのオリゴヌクレオチドプライマーの助けで修
飾された繰返し複製反応によってターゲットポリヌクレ
オチドの中に導入される。これらの「増幅」プライマー
のすくなくとも１つは付着部分で修飾されている。また
、本発明においてアフィニティ部分は、もう一方の成分
に対して親和性をもつ成分であって、このもう一方の成
分とは優先的かつ選択的にそれと結合することによって
アフィニティーペアを形成するものである。たとえば、
ビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン、ポリｄ
Ａ／ポリｄＴおよびポリｄＧ／ポリｄＣのようなホモポ
リヌクレオチドを含む相補的ポリヌクレオチド、ハブテ
ン／抗体および金属／錯体が、前記アフィニティーペア
としてあげられる。お互いに強い親和性をもついかなる
成分のペアもアフィニティーペアとして機能しうる。付
着部分とはアフィニティ一部分、またはアフィニティ一
部分の付着のための部位を与える部分である。
あたり２つのオリゴヌクレオチドプライマーの助けで修
飾された繰返し複製反応によってターゲットポリヌクレ
オチドの中に導入される。これらの「増幅」プライマー
のすくなくとも１つは付着部分で修飾されている。また
、本発明においてアフィニティ部分は、もう一方の成分
に対して親和性をもつ成分であって、このもう一方の成
分とは優先的かつ選択的にそれと結合することによって
アフィニティーペアを形成するものである。たとえば、
ビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン、ポリｄ
Ａ／ポリｄＴおよびポリｄＧ／ポリｄＣのようなホモポ
リヌクレオチドを含む相補的ポリヌクレオチド、ハブテ
ン／抗体および金属／錯体が、前記アフィニティーペア
としてあげられる。お互いに強い親和性をもついかなる
成分のペアもアフィニティーペアとして機能しうる。付
着部分とはアフィニティ一部分、またはアフィニティ一
部分の付着のための部位を与える部分である。
オリゴヌクレオチドプライマーは標準的な化学的方法で
合成してもよい。また組換えＤＮＡ技術をプライマーの
製造に用いてもよい。プライマーのサイズは、好ましく
は１４から４０塩基であるが、少なくとも８塩基または
４０塩基よりがなり大きい塩基を使用してもよい。プラ
イマーは化学的または酵素的または他のいかなる方法を
用いてでも付着部分で修飾される。付着部分はプライマ
ーの５°末端に付着しているのが好ましい。プライマー
の塩基対特性およびそのプライマーの機能が保持される
という条件で、他の部位への付着もまた可能である。
合成してもよい。また組換えＤＮＡ技術をプライマーの
製造に用いてもよい。プライマーのサイズは、好ましく
は１４から４０塩基であるが、少なくとも８塩基または
４０塩基よりがなり大きい塩基を使用してもよい。プラ
イマーは化学的または酵素的または他のいかなる方法を
用いてでも付着部分で修飾される。付着部分はプライマ
ーの５°末端に付着しているのが好ましい。プライマー
の塩基対特性およびそのプライマーの機能が保持される
という条件で、他の部位への付着もまた可能である。
本発明の方法の一態様において、２つの修飾されたプラ
イマーが使用される。このばあい、プライマーは異なる
付着部分で修飾されねばならない。
イマーが使用される。このばあい、プライマーは異なる
付着部分で修飾されねばならない。
本発明の方法において、１つまたは両方が修飾された増
幅プライマー ターゲット核酸、モノヌクレオシド三リ
ン酸およびＤＮＡポリメラーゼのような核酸合成酵素が
組み合せられる。ターゲットの変性、プライマーのター
ゲット鎖へのアニーリング、およびプライマーの酵素的
延長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）の繰返しサイクルは、用
いられるべきＤＮＡシークエンシング反応に用いるのに
充分な量の核酸をうるのに必要な回数のサイクルだけ、
いずれかの繰返し複製反応プロトコールにしたがって行
なわれる。チェーンターミネーションシークエンス反応
に用いるには、少なくとも１０１０のＤＮＡ分子かえら
れるのが好ましい。
幅プライマー ターゲット核酸、モノヌクレオシド三リ
ン酸およびＤＮＡポリメラーゼのような核酸合成酵素が
組み合せられる。ターゲットの変性、プライマーのター
ゲット鎖へのアニーリング、およびプライマーの酵素的
延長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）の繰返しサイクルは、用
いられるべきＤＮＡシークエンシング反応に用いるのに
充分な量の核酸をうるのに必要な回数のサイクルだけ、
いずれかの繰返し複製反応プロトコールにしたがって行
なわれる。チェーンターミネーションシークエンス反応
に用いるには、少なくとも１０１０のＤＮＡ分子かえら
れるのが好ましい。
本工程の結果として、原型のターゲットポリヌクレオチ
ドのコピーは、今や付着部分で修飾されており、該コピ
ーは修飾されたプライマーを新たに合成されたポリヌク
レオチド分子の中へ組み込むことによって調製されてい
る。１つのプライマーだけが修飾されるときは、付着部
分で修飾された１つの鎖のポリヌクレオチド分子が合成
される。２つの異なった修飾によるプライマーを使用す
ると、各々はターゲット核酸の異なる鎖とのハイブリダ
イゼーションに適用され、１つの付着部分で修飾された
１つの鎖およびそれとは別の付着部分で修飾された別の
１つの鎖をもつポリヌクレオチド分子が調製される。プ
ライマーの１つがポリヌクレオチドの付着部分で修飾さ
れているときには、１つの特例かえられる。このばあい
、たとえばポリヌクレオチドで修飾されたばあい、他の
鎖は第２の鎖の付着部分として作用しうる相補的シーク
エンスで繰り返し複製反応中に修飾される。調製された
修飾されたターゲットＤＮＡのサイズと量は繰返し復製
反応のキャパシティーによってのみ限定される。
ドのコピーは、今や付着部分で修飾されており、該コピ
ーは修飾されたプライマーを新たに合成されたポリヌク
レオチド分子の中へ組み込むことによって調製されてい
る。１つのプライマーだけが修飾されるときは、付着部
分で修飾された１つの鎖のポリヌクレオチド分子が合成
される。２つの異なった修飾によるプライマーを使用す
ると、各々はターゲット核酸の異なる鎖とのハイブリダ
イゼーションに適用され、１つの付着部分で修飾された
１つの鎖およびそれとは別の付着部分で修飾された別の
１つの鎖をもつポリヌクレオチド分子が調製される。プ
ライマーの１つがポリヌクレオチドの付着部分で修飾さ
れているときには、１つの特例かえられる。このばあい
、たとえばポリヌクレオチドで修飾されたばあい、他の
鎖は第２の鎖の付着部分として作用しうる相補的シーク
エンスで繰り返し複製反応中に修飾される。調製された
修飾されたターゲットＤＮＡのサイズと量は繰返し復製
反応のキャパシティーによってのみ限定される。
＜ｂ）１本鎖のターゲットポリヌクレオチドの単離
合成ののち、修飾されたターゲットポリヌクレオチドは
付着部位が付着している固体マトリックス上に捕捉され
る。本発明において付着部位は増幅プライマーに組み込
まれた付着部分として用いられた、またはのちにこれに
結合したアフィニティ一部分と優先的かつ選択的に結合
するように選ばれたアフィニティーペアの１成分である
。ターゲットポリヌクレオチドの１つの鎖が１つのアフ
ィニティ一部分で修飾されるときは、１つの固体マトリ
ックスが用いられ、両方の鎖が修飾されるときは、２つ
の異なった固体マトリックスが用いられる。好ましくは
２つのマトリックスはお互いに物理的に分けられるよう
に選択される。択一的に、２つの異なって修飾された鎖
の捕捉は２つの異なる固体マトリックス上で順次行なわ
れうる。
付着部位が付着している固体マトリックス上に捕捉され
る。本発明において付着部位は増幅プライマーに組み込
まれた付着部分として用いられた、またはのちにこれに
結合したアフィニティ一部分と優先的かつ選択的に結合
するように選ばれたアフィニティーペアの１成分である
。ターゲットポリヌクレオチドの１つの鎖が１つのアフ
ィニティ一部分で修飾されるときは、１つの固体マトリ
ックスが用いられ、両方の鎖が修飾されるときは、２つ
の異なった固体マトリックスが用いられる。好ましくは
２つのマトリックスはお互いに物理的に分けられるよう
に選択される。択一的に、２つの異なって修飾された鎖
の捕捉は２つの異なる固体マトリックス上で順次行なわ
れうる。
固体マトリックスはビーズ、微粒子
（＋＊１ｃｒｏｐａｒｔ１ｃｌｅ）−、マイクロタイト
レージジンウェル（ｓｌｃｒｏｔｌｔｒａｔｉｏｎ ｗ
ｅｌｌ）あるいは試験管の表面、ディプスティック（ｄ
ｌｐｓｔｌｃｋ）またはフィルターなど、どのような形
態であってよい。
レージジンウェル（ｓｌｃｒｏｔｌｔｒａｔｉｏｎ ｗ
ｅｌｌ）あるいは試験管の表面、ディプスティック（ｄ
ｌｐｓｔｌｃｋ）またはフィルターなど、どのような形
態であってよい。
マトリックスの材質は、たとえばポリスチレン、セルロ
ース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリ
アクリルアミド、デキストランまたはアガロースなどが
あげられる。マトリックスの材質に唯一必須なことは、
付着部位がそれに付着しうろことである。マトリックス
の結合能力（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｐａｃｌｔｙ）は修
飾されたターゲットポリヌクレオチドを、そこに存在す
る過剰の修飾されたプライマーを捕捉すると同様に、充
分な量捕捉することを可能にすべきである。
ース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリ
アクリルアミド、デキストランまたはアガロースなどが
あげられる。マトリックスの材質に唯一必須なことは、
付着部位がそれに付着しうろことである。マトリックス
の結合能力（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｐａｃｌｔｙ）は修
飾されたターゲットポリヌクレオチドを、そこに存在す
る過剰の修飾されたプライマーを捕捉すると同様に、充
分な量捕捉することを可能にすべきである。
しかしながら、部分に容易に分割されうるマトリックス
を用いることが望ましい。たとえば非常に大きい能力の
少量のマトリックス粒子に対してより小さい能力の非常
に数多くのマトリックス粒子を用いるなどである。
を用いることが望ましい。たとえば非常に大きい能力の
少量のマトリックス粒子に対してより小さい能力の非常
に数多くのマトリックス粒子を用いるなどである。
修飾されたターゲット核酸は、増幅が行なわれた反応混
合物中でアフィニティーマトリックス（ａＮ’１ｎｌｔ
ｙ ｍａｔｒｉｘ）と直接接触させられうる。
合物中でアフィニティーマトリックス（ａＮ’１ｎｌｔ
ｙ ｍａｔｒｉｘ）と直接接触させられうる。
混合物はまた希釈されてもよいしまたはその組成はアフ
ィニティーペアの成分間の反応に有利な条件をうるため
に変えられてもよい。
ィニティーペアの成分間の反応に有利な条件をうるため
に変えられてもよい。
２つのアフィニティーペアが用いられるとき、ターゲッ
トポリヌクレオチドは、異なったアフィニティーマトリ
ックスに２つの鎖のコレクションを分離できるように、
親和性捕捉 （ａｌ’ｆ’１ｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ）反応の前に
変性されるのが好ましい。もしこれらの２つの異なるア
フィニティーマトリックスが、たとえばシークエンシン
グ反応段階後お互い物理的に分離されうるならば、その
２つのマトリックスは捕捉段階およびシークエンシング
反応段階にまとめて取扱うことができる。ターゲットの
１つの鎖だけが修飾されるならば、ターゲットを捕捉反
応前に変性するのは任意的なことである。
トポリヌクレオチドは、異なったアフィニティーマトリ
ックスに２つの鎖のコレクションを分離できるように、
親和性捕捉 （ａｌ’ｆ’１ｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ）反応の前に
変性されるのが好ましい。もしこれらの２つの異なるア
フィニティーマトリックスが、たとえばシークエンシン
グ反応段階後お互い物理的に分離されうるならば、その
２つのマトリックスは捕捉段階およびシークエンシング
反応段階にまとめて取扱うことができる。ターゲットの
１つの鎖だけが修飾されるならば、ターゲットを捕捉反
応前に変性するのは任意的なことである。
ターゲットポリヌクレオチドの付着部分は、固定された
相補的な付着部位と、増幅されたターゲット核酸が実質
的な割合で（５ｕｂｓｔａｎｔ１ａｌｐｏｒｔｉｏｎ）
回収されるのに充分な時間反応させられる。本反応時間
は結合反応の速度論 （ｋｌｎｅｔｉｃｓ）に極めて依存するものである。付
着部分が付着部位に直接結合できないばあいは、これは
さらに連結部分（１１ｎｋ１ｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を導
入する必要がある。連結部分は付着部分および付芒部位
に対して独立した結合部位をもつものであり、両者の間
にリンクを形成しうる。捕捉反応ののち、結合したター
ゲットポリヌクレオチドは、結合していない物質、たと
えば過剰のモノヌクレオシド三リン酸、修飾されていな
いプライマー、酵素、塩などから、マトリックスを適当
な条件下で洗浄することにより分離される。分離操作は
マトリックスの物理的形態に依存し、たとえば遠心分離
、磁気分離、カラム処理またはマトリックスの表面の洗
浄またはそれらの組合せがあげられる。
相補的な付着部位と、増幅されたターゲット核酸が実質
的な割合で（５ｕｂｓｔａｎｔ１ａｌｐｏｒｔｉｏｎ）
回収されるのに充分な時間反応させられる。本反応時間
は結合反応の速度論 （ｋｌｎｅｔｉｃｓ）に極めて依存するものである。付
着部分が付着部位に直接結合できないばあいは、これは
さらに連結部分（１１ｎｋ１ｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を導
入する必要がある。連結部分は付着部分および付芒部位
に対して独立した結合部位をもつものであり、両者の間
にリンクを形成しうる。捕捉反応ののち、結合したター
ゲットポリヌクレオチドは、結合していない物質、たと
えば過剰のモノヌクレオシド三リン酸、修飾されていな
いプライマー、酵素、塩などから、マトリックスを適当
な条件下で洗浄することにより分離される。分離操作は
マトリックスの物理的形態に依存し、たとえば遠心分離
、磁気分離、カラム処理またはマトリックスの表面の洗
浄またはそれらの組合せがあげられる。
洗浄工程ののちマトリックスは、結合したターゲットポ
リヌクレオチドを一本鎖にする条件下で処理される。二
本鎖ポリヌクレオチドを変性するがアフィニティーペア
の成分間の結合に影響をおよぼさない、たとえば熱、ア
ルカリまたは酵素のような条件であればいかなる条件で
も用いてよい。本工程はターゲットヌクレオチドが捕捉
反応前に変性されていないなら必須のものである。変性
が捕捉反応前になされているときは、本工程は任意であ
るが捕捉反応中に再アニーリングされるかもしれないタ
ーゲット分子の変性を確実にするために有利である。も
ちろん、例外は付着部分と付着部位が相補的核酸鎖のば
あいである。このばあい、変性は付着に先行せねばなら
ない。なぜなら、そうでなければ支持体への連結が失な
われるからである。
リヌクレオチドを一本鎖にする条件下で処理される。二
本鎖ポリヌクレオチドを変性するがアフィニティーペア
の成分間の結合に影響をおよぼさない、たとえば熱、ア
ルカリまたは酵素のような条件であればいかなる条件で
も用いてよい。本工程はターゲットヌクレオチドが捕捉
反応前に変性されていないなら必須のものである。変性
が捕捉反応前になされているときは、本工程は任意であ
るが捕捉反応中に再アニーリングされるかもしれないタ
ーゲット分子の変性を確実にするために有利である。も
ちろん、例外は付着部分と付着部位が相補的核酸鎖のば
あいである。このばあい、変性は付着に先行せねばなら
ない。なぜなら、そうでなければ支持体への連結が失な
われるからである。
さらに、本発明の別の変型では、この段階で行なわれる
変性工程は、繰返し複製反応によって合成されたターゲ
ットの１つの鎖の単離のための新しい便利な方法を与え
るものである。単離された鎖は過剰のモノヌクレオシド
三リン酸、プライマーおよび繰返し複製反応の他の成分
から分離されて、溶液中での通常のシークエンシングに
よってシークエンスされるか、または他の目的に用いら
れうる。
変性工程は、繰返し複製反応によって合成されたターゲ
ットの１つの鎖の単離のための新しい便利な方法を与え
るものである。単離された鎖は過剰のモノヌクレオシド
三リン酸、プライマーおよび繰返し複製反応の他の成分
から分離されて、溶液中での通常のシークエンシングに
よってシークエンスされるか、または他の目的に用いら
れうる。
（ｃ） シークエンシング反応
本発明によれば、単離された増幅されたポリヌクレオチ
ド断片のシークエンス決定がチェーンターミネーション
法を用いて行なわれうる。
ド断片のシークエンス決定がチェーンターミネーション
法を用いて行なわれうる。
本方法はポリヌクレオチド合成酵素によって、増殖して
いる（ ｇｒｏｗｉｎｇ）ポリヌクレオチド鎖にランダ
ムに組み込まれて特定のチェーンターミネーションを与
えるデオキシヌクレオチド類似体の使用に基づく。チェ
ーンターミネーションはまた極めて低い濃度のデオキシ
ヌクレオシド三リン酸の１種を用いて達成することがで
きる。
いる（ ｇｒｏｗｉｎｇ）ポリヌクレオチド鎖にランダ
ムに組み込まれて特定のチェーンターミネーションを与
えるデオキシヌクレオチド類似体の使用に基づく。チェ
ーンターミネーションはまた極めて低い濃度のデオキシ
ヌクレオシド三リン酸の１種を用いて達成することがで
きる。
チェーンターミネーションシークエンシング反応に必要
な成分はシークエンシングプライマー ポリヌクレオチ
ド合成酵素、チェーンターミネーションを与えるジデオ
キシヌクレオチド、デオキシヌクレオチドおよび検出可
能な標識である。本発明にしたがえば、シークエンシン
グ用の種々の標準的な実験室用プロトコールが固定され
たターゲットポリヌクレオチドのシークエンシングに適
用される。シークエンシング反応の成分の付加順序は、
用いるアフィニティーマトリックスと選ばれたプロトコ
ールに依存して変えてもよい。
な成分はシークエンシングプライマー ポリヌクレオチ
ド合成酵素、チェーンターミネーションを与えるジデオ
キシヌクレオチド、デオキシヌクレオチドおよび検出可
能な標識である。本発明にしたがえば、シークエンシン
グ用の種々の標準的な実験室用プロトコールが固定され
たターゲットポリヌクレオチドのシークエンシングに適
用される。シークエンシング反応の成分の付加順序は、
用いるアフィニティーマトリックスと選ばれたプロトコ
ールに依存して変えてもよい。
第２図に示されるように、シークエンシングプライマー
は繰返し複製反応−増幅反応に用いられるプライマーと
異なっていても同じでもよい。シークエンシングプライ
マーが増幅プライマーと異なるばあいは、シークエンシ
ングプライマーは囚ターゲット核酸ポリマー中の興味あ
る領域と増幅プライマーの３°末端の間に完全に位置し
ていてもよいし、または（Ｂ）そのプライマーの３゛末
端が、ターゲット核酸ポリマーの５゜末端の少なくとも
１つの、しかし好ましくは３個をこえるヌクレオチドを
アニーリングするような方法で増幅プライマーに部分的
にオーバーラツプしていてもよい。シークエンシングプ
ライマーはまた、（ｃ）完全に増幅プライマーの中に含
まれるか、■）増幅プライマーと全く同一であってもよ
い。
は繰返し複製反応−増幅反応に用いられるプライマーと
異なっていても同じでもよい。シークエンシングプライ
マーが増幅プライマーと異なるばあいは、シークエンシ
ングプライマーは囚ターゲット核酸ポリマー中の興味あ
る領域と増幅プライマーの３°末端の間に完全に位置し
ていてもよいし、または（Ｂ）そのプライマーの３゛末
端が、ターゲット核酸ポリマーの５゜末端の少なくとも
１つの、しかし好ましくは３個をこえるヌクレオチドを
アニーリングするような方法で増幅プライマーに部分的
にオーバーラツプしていてもよい。シークエンシングプ
ライマーはまた、（ｃ）完全に増幅プライマーの中に含
まれるか、■）増幅プライマーと全く同一であってもよ
い。
シークエンシングプライマーの選択は分析の目的に依存
する。繰返し複製反応プライマーと異なるプライマーは
シークエンシングの特異性を増加させるだろう。なぜな
ら、繰返し複製反応で生成される可能性のある不適当な
断片のシークエンスが避けられるからである。したがっ
て増幅プライマーと異なるシークエンシングプライマー
は好ましいものである。一方、増幅された断片のシーク
エンスのより多くの予備情報（Ｉｌｏｒｅ ｐｒｌｏｒ
ｉｎｆ’ｏｒｍａｔｌｏｎ）は、そのようなプライマ
ーの作成に必要とされる。
する。繰返し複製反応プライマーと異なるプライマーは
シークエンシングの特異性を増加させるだろう。なぜな
ら、繰返し複製反応で生成される可能性のある不適当な
断片のシークエンスが避けられるからである。したがっ
て増幅プライマーと異なるシークエンシングプライマー
は好ましいものである。一方、増幅された断片のシーク
エンスのより多くの予備情報（Ｉｌｏｒｅ ｐｒｌｏｒ
ｉｎｆ’ｏｒｍａｔｌｏｎ）は、そのようなプライマ
ーの作成に必要とされる。
シークエンシング反応で生成された断片の検出用の標識
は、標識されたシークエンシングプライマーを用いて組
み込ませることができる。
は、標識されたシークエンシングプライマーを用いて組
み込ませることができる。
標識は５°末端または内部に存在させればよい。
標識としては３２ｐのような同位元素、蛍光性の基、他
の検出可能な標識または検出可能な標識をのちに付着さ
れる部位をもつ基であればいかなるものでもよい。標識
はまた、３５Ｓや３２ｐのような同位元素または蛍光性
のまたは他の検出可能な標識で標識されたデオキシヌク
レオチド誘導体を用いて組み込むこともできる。たとえ
それがきわめて短かい断片であろうとも合成された核酸
の実質的にすべてに組み込まれる量だけ標識部分は組み
込まれる。
の検出可能な標識または検出可能な標識をのちに付着さ
れる部位をもつ基であればいかなるものでもよい。標識
はまた、３５Ｓや３２ｐのような同位元素または蛍光性
のまたは他の検出可能な標識で標識されたデオキシヌク
レオチド誘導体を用いて組み込むこともできる。たとえ
それがきわめて短かい断片であろうとも合成された核酸
の実質的にすべてに組み込まれる量だけ標識部分は組み
込まれる。
ポリヌクレオチド断片を担うマトリックスは、シークエ
ンシングプライマーを含有する適当な溶液中に懸濁され
る。プライマーはターゲットポリヌクレオチドと等しい
か、過剰のモル濃度で加えるのが好ましい。プライマー
は、適当な温度で、用いるプライマーのサイズおよび量
にしたがって充分な時間、ターゲットポリヌクレオチド
へのアニーリングに供される。ターゲットポリヌクレオ
チドの両方の鎖が修飾され、互いに物理的に分離可能で
、かつ今は１つとして扱われうる別々のアフィニティー
マトリックスと結合しているばあいは、２つの異なった
シークエンシングプライマーが用いられるということに
注意すべきである。
ンシングプライマーを含有する適当な溶液中に懸濁され
る。プライマーはターゲットポリヌクレオチドと等しい
か、過剰のモル濃度で加えるのが好ましい。プライマー
は、適当な温度で、用いるプライマーのサイズおよび量
にしたがって充分な時間、ターゲットポリヌクレオチド
へのアニーリングに供される。ターゲットポリヌクレオ
チドの両方の鎖が修飾され、互いに物理的に分離可能で
、かつ今は１つとして扱われうる別々のアフィニティー
マトリックスと結合しているばあいは、２つの異なった
シークエンシングプライマーが用いられるということに
注意すべきである。
ビーズのような分割可能なアフィニティーマトリックス
が用いられたばあいは、プライマーのアニーリングのの
ち、試料を別々のシークエンス反応用に４つに分割する
のが都合よい。分割できないマイクロタイトレージョン
ウェルのようなアフィニティーマトリックスが用いられ
るばあいは、親和性捕捉工程で４つの平行反応が行なわ
れる。つぎの反応を行なう前に各反応の生成物を溶出す
ることによって、４つの反応を順次同じ担体上で行なう
ことも可能である。
が用いられたばあいは、プライマーのアニーリングのの
ち、試料を別々のシークエンス反応用に４つに分割する
のが都合よい。分割できないマイクロタイトレージョン
ウェルのようなアフィニティーマトリックスが用いられ
るばあいは、親和性捕捉工程で４つの平行反応が行なわ
れる。つぎの反応を行なう前に各反応の生成物を溶出す
ることによって、４つの反応を順次同じ担体上で行なう
ことも可能である。
あるばあいにはただ１つ、また２または３つの反応だけ
を用いて充分な情報かえられる。たとえば、もし遺伝的
欠陥が通常はＣである１つの特定部位における点突然変
異から起こると知られているならば、この点における非
Ｃ（ｎｏｎ−Ｃ＞核酸残基（ｒｅｓｌｄｕｅ）の現実の
同定は必要ではないからＣ反応を行なうだけで充分であ
る。重要な事実は残基が非Ｃだということである。
を用いて充分な情報かえられる。たとえば、もし遺伝的
欠陥が通常はＣである１つの特定部位における点突然変
異から起こると知られているならば、この点における非
Ｃ（ｎｏｎ−Ｃ＞核酸残基（ｒｅｓｌｄｕｅ）の現実の
同定は必要ではないからＣ反応を行なうだけで充分であ
る。重要な事実は残基が非Ｃだということである。
アニーリングののち、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＮＡポ
リメラーゼＩやＴ７ＤＮＡポリメラーゼのようなポリヌ
クレオチド合成酵素、およびチェーンターミネーション
を与えるジデオキシヌクレオチドおよびデオキシヌクレ
オチドを含み、およびもし標識されていないプライマー
が用いられたばあいには、使用される酵素やターゲット
のサイズにしたがって適当な割合の標識されたデオキシ
ヌクレオチドを含む混合物が加えられる。重合反応は、
酵素および用いられる条件にしたがって決定される温度
で、断片のサイズの実質的に完全な分布（ｄｌｓｔｒｉ
ｂｕｔｉｏｎ）を完了するのに充分な時間、進行させら
れる。最後に、まだターミネーションされていないポリ
ヌクレオチド鎖の合成を完全にするためにデオキシヌク
レオチドを用いたチェース（ｃｈａｓｅ）反応が行なわ
れる。反応はついで停止させられる。
リメラーゼＩやＴ７ＤＮＡポリメラーゼのようなポリヌ
クレオチド合成酵素、およびチェーンターミネーション
を与えるジデオキシヌクレオチドおよびデオキシヌクレ
オチドを含み、およびもし標識されていないプライマー
が用いられたばあいには、使用される酵素やターゲット
のサイズにしたがって適当な割合の標識されたデオキシ
ヌクレオチドを含む混合物が加えられる。重合反応は、
酵素および用いられる条件にしたがって決定される温度
で、断片のサイズの実質的に完全な分布（ｄｌｓｔｒｉ
ｂｕｔｉｏｎ）を完了するのに充分な時間、進行させら
れる。最後に、まだターミネーションされていないポリ
ヌクレオチド鎖の合成を完全にするためにデオキシヌク
レオチドを用いたチェース（ｃｈａｓｅ）反応が行なわ
れる。反応はついで停止させられる。
本発明の方法において、アフィニティーマトリックスは
この段階でシークエンシング反応の成分を除去するため
に洗浄されてもよい。混合物の組成は合成された断片の
分析にもっとも有利な条件かえられるように変えてもよ
い。もし両方の鎖が修飾され、２つの異なったアフィニ
ティーマトリックスに結合されているなら、マトリック
スはこの段階で、たとえば磁場などで物理的に分離され
る。ターゲットＤＮＡが一本鎖にされ、４つのシークエ
ンシング反応から合成された断片は電気泳動または他の
適当な方法により分離される。本発明の方法において、
アフィニティーマトリックスは電気泳動の前に除去され
うるし、またはアフィニティーマトリックスが微粒子の
ときは電気泳動工程でゲルのスロット（ｓｌｏｔ）の中
に試料とともに重層されうる。
この段階でシークエンシング反応の成分を除去するため
に洗浄されてもよい。混合物の組成は合成された断片の
分析にもっとも有利な条件かえられるように変えてもよ
い。もし両方の鎖が修飾され、２つの異なったアフィニ
ティーマトリックスに結合されているなら、マトリック
スはこの段階で、たとえば磁場などで物理的に分離され
る。ターゲットＤＮＡが一本鎖にされ、４つのシークエ
ンシング反応から合成された断片は電気泳動または他の
適当な方法により分離される。本発明の方法において、
アフィニティーマトリックスは電気泳動の前に除去され
うるし、またはアフィニティーマトリックスが微粒子の
ときは電気泳動工程でゲルのスロット（ｓｌｏｔ）の中
に試料とともに重層されうる。
これは、試料の取り扱いに有利である。電気泳動工程で
断片のサイズ分布は分析される。検出操作は用いられる
標識にしたがって変えて行なえばよい。同位元素を用い
たときは標準法にしたがってゲルは固定、乾燥により調
整され、Ｘ線フィルムに曝される。蛍光性の標識を用い
たときは、この目的のために開発された自動装置を用い
て検出される。シークエンシング反応によって生成した
ポリヌクレオチド断片のサイズ分布は、ターゲットポリ
ヌクレオチドのヌクレオチドシークエンスを与える「シ
ークエンシングラダー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ １ａｄ
ｄｅｒ）Ｊとよばれるパターンを示す。
断片のサイズ分布は分析される。検出操作は用いられる
標識にしたがって変えて行なえばよい。同位元素を用い
たときは標準法にしたがってゲルは固定、乾燥により調
整され、Ｘ線フィルムに曝される。蛍光性の標識を用い
たときは、この目的のために開発された自動装置を用い
て検出される。シークエンシング反応によって生成した
ポリヌクレオチド断片のサイズ分布は、ターゲットポリ
ヌクレオチドのヌクレオチドシークエンスを与える「シ
ークエンシングラダー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ １ａｄ
ｄｅｒ）Ｊとよばれるパターンを示す。
本発明の方法を実施するのに用いる試薬はキットの形態
にパッケージングされてもよい。たとえば、キットは付
着部分をもつ１つまたは２つの増幅プライマーおよび対
応する固体支持体のパッケージングされた組合せを含ん
で作成されてもよい。キットはまた、シークエンジング
プライマーまたは核酸ポリマーの決定されたシークエン
スを標準品のシークエンスと比較するための参照手段（
ｒｅｆ’ｅｒｅｎｃｅ ｌ１ｅａｎｓ）をさらに含んで
作成されてもよい。たとえば、参照手段としては、標準
品のシークエンシングからえられたシークエンシングラ
ダーを示す包装挿入物（ｐａｃｋａｇｅ Ｉｎ５ｅｒｔ
）または標準品そのものの試料があげられる。もし標準
品が備えられるならば、それがシークエンシングについ
てターゲットと同様な方法で取り扱えるように、付着部
分が付着しているのが有利である。
にパッケージングされてもよい。たとえば、キットは付
着部分をもつ１つまたは２つの増幅プライマーおよび対
応する固体支持体のパッケージングされた組合せを含ん
で作成されてもよい。キットはまた、シークエンジング
プライマーまたは核酸ポリマーの決定されたシークエン
スを標準品のシークエンスと比較するための参照手段（
ｒｅｆ’ｅｒｅｎｃｅ ｌ１ｅａｎｓ）をさらに含んで
作成されてもよい。たとえば、参照手段としては、標準
品のシークエンシングからえられたシークエンシングラ
ダーを示す包装挿入物（ｐａｃｋａｇｅ Ｉｎ５ｅｒｔ
）または標準品そのものの試料があげられる。もし標準
品が備えられるならば、それがシークエンシングについ
てターゲットと同様な方法で取り扱えるように、付着部
分が付着しているのが有利である。
キット容器中の試薬の配置（ａｒｒａｎｇｅｍｏｎｔ）
は、中に含まれる特定の試薬に依存するであろう。
は、中に含まれる特定の試薬に依存するであろう。
もちろん、それぞれの試薬は個々の容器中にパッケージ
ングされうるが、種々の組合せもまた可能である。たと
えば、もし用いられる付着部分および付着部位が繰返し
複製反応の条件下で互いに結合しないなら、両者は１つ
の容器で供給されうる。たとえば、連結部分が用いられ
たばあいは付着部分と付着部位を１つの容器で供給しう
る。
ングされうるが、種々の組合せもまた可能である。たと
えば、もし用いられる付着部分および付着部位が繰返し
複製反応の条件下で互いに結合しないなら、両者は１つ
の容器で供給されうる。たとえば、連結部分が用いられ
たばあいは付着部分と付着部位を１つの容器で供給しう
る。
本発明を以下に実施例を用いてさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
アビジン−微粒子に固定されたビオチニル化されたサイ
トメガロウィルスのＤＮＡ断片のヌクレオチドシークエ
ンスの決定 （プライマーの合成） プライマーを、メトキシホスホルアミダイト（ｓｅｔｈ
ｏｘｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｌｄｉｔｅ）法によりア
プライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｌｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザー（５
ｙｎｔｈｅｓ１ｚｅｒ）を用いて合成した。プライマー
（以下、２５Ａおよび２５Ｂという）は以下のヌクレオ
チドシークエンスをもつ２５量体である。
トメガロウィルスのＤＮＡ断片のヌクレオチドシークエ
ンスの決定 （プライマーの合成） プライマーを、メトキシホスホルアミダイト（ｓｅｔｈ
ｏｘｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｌｄｉｔｅ）法によりア
プライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｌｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザー（５
ｙｎｔｈｅｓ１ｚｅｒ）を用いて合成した。プライマー
（以下、２５Ａおよび２５Ｂという）は以下のヌクレオ
チドシークエンスをもつ２５量体である。
２５Ａ ： ５°−ＴＣＧ ＣＡＡ ＧＣＴ ＣＴＴ
ＴＣＣＣＯＯＣＣＴ ＧＧＣＴ２５Ｂ：５°−ＧＣＴ
ＣＴＧ ＣＧＣＧＡＡ ＣＡＴ ＧＴＡ ＧＴＣＧＧＣ
Ｃ合成における最後の工程として、アミノリンクＩＩ
（ａｍｉｎｏｌｉｎｋ■）試薬（アプライド・バイオシ
ステムズ社製、Ｐ ／ Ｎ ４００８０８）を用いてプ
ライマー２５Ａに５°末端のアミノ基を付加した。
ＴＣＣＣＯＯＣＣＴ ＧＧＣＴ２５Ｂ：５°−ＧＣＴ
ＣＴＧ ＣＧＣＧＡＡ ＣＡＴ ＧＴＡ ＧＴＣＧＧＣ
Ｃ合成における最後の工程として、アミノリンクＩＩ
（ａｍｉｎｏｌｉｎｋ■）試薬（アプライド・バイオシ
ステムズ社製、Ｐ ／ Ｎ ４００８０８）を用いてプ
ライマー２５Ａに５°末端のアミノ基を付加した。
アミノ基をスルホ−ＮＨ８−ビオチン（ピアス・ケミカ
ル社（Ｐｌｅｒｅｅ Ｃｈｅｓｌｅａｌ Ｃｏ、）製）
を用いてビオチニル化した。ビオチニル化されたオリゴ
ヌクレオチドを逆相Ｃ−１８カラムを用いたＨＰＬＣに
よって精製した。
ル社（Ｐｌｅｒｅｅ Ｃｈｅｓｌｅａｌ Ｃｏ、）製）
を用いてビオチニル化した。ビオチニル化されたオリゴ
ヌクレオチドを逆相Ｃ−１８カラムを用いたＨＰＬＣに
よって精製した。
（ターゲットＤＮＡ）
サイトメガロウィルス（以下、ＣＭｖという）ゲノムの
マツプポジション ０．３０〜０．３５における、すな
わちｐＡＴ１５３ベクター中でクローン化されりＡＤ１
６９ｃＭＶ ＤＮＡ（ＡＴＣＣＶＲ−５３８） （７）
１２．２ｋｂ１１１ｎｄｍＬ断片における長いユニー
クな領域の断片をターゲットＤＮＡとした。ターゲット
プラスミドを制限酵素Ｅｃｏ Ｒ１で線形化（１１ｎｅ
ａｒｉｚｅ） Ｌ、。
マツプポジション ０．３０〜０．３５における、すな
わちｐＡＴ１５３ベクター中でクローン化されりＡＤ１
６９ｃＭＶ ＤＮＡ（ＡＴＣＣＶＲ−５３８） （７）
１２．２ｋｂ１１１ｎｄｍＬ断片における長いユニー
クな領域の断片をターゲットＤＮＡとした。ターゲット
プラスミドを制限酵素Ｅｃｏ Ｒ１で線形化（１１ｎｅ
ａｒｉｚｅ） Ｌ、。
た。プライマーはＣＭＶ ＨｌｎｄＩ［［Ｌ断片中１１
５ｔＤ）領域をはさむ（ｆｌａｎｋ）。
５ｔＤ）領域をはさむ（ｆｌａｎｋ）。
（！！返し複製反応−増幅）
５°−ビオチニル化プライマー２５Ａおよび修飾されて
いないプライマー２５Ｂを用いた繰返し複製反応による
２５サイクルの増幅により、ＣＭｖＤＮＡの１０５塩基
対の断片の中にビオチンを導入した。増幅は、３ＸＩＯ
５分子の線形化されたＣＭＶ Ｈ１ｎｄｎＩＬ断片、各
１００ｐｔａｏｌ（Ｄプライマー各２００μＨの４つの
モノヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ％ｄ
ＧＴＰ、 ｄＴＴＰ）の、１０ＢＭトリス塩酸、ｐＨ８
，３５，５０ｍＭ ＫＣｆ％１．５ｓ＋Ｍ ＭｇＣｆｚ
および０．１−ｇ／ ｍｌゼラチンの溶液１００μＮを
用いて、０．５ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒ４）チューブ中で粘稠なパラフィン層下で行なった。
いないプライマー２５Ｂを用いた繰返し複製反応による
２５サイクルの増幅により、ＣＭｖＤＮＡの１０５塩基
対の断片の中にビオチンを導入した。増幅は、３ＸＩＯ
５分子の線形化されたＣＭＶ Ｈ１ｎｄｎＩＬ断片、各
１００ｐｔａｏｌ（Ｄプライマー各２００μＨの４つの
モノヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ％ｄ
ＧＴＰ、 ｄＴＴＰ）の、１０ＢＭトリス塩酸、ｐＨ８
，３５，５０ｍＭ ＫＣｆ％１．５ｓ＋Ｍ ＭｇＣｆｚ
および０．１−ｇ／ ｍｌゼラチンの溶液１００μＮを
用いて、０．５ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒ４）チューブ中で粘稠なパラフィン層下で行なった。
ターゲットＤＮＡを一本鎖にするために反応混合物中で
５分間煮沸し、そののちテルムス・アクアティカス（Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｌｃｕｓ ） ＤＮＡポリメ
ラーゼ（二ニー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ
εｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）製）２単位を加えた
。ついで、チューブを以下のように２５サイクル処理し
た。
５分間煮沸し、そののちテルムス・アクアティカス（Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｌｃｕｓ ） ＤＮＡポリメ
ラーゼ（二ニー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ
εｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）製）２単位を加えた
。ついで、チューブを以下のように２５サイクル処理し
た。
５５℃で１分間のプライマーアニーリング、７２℃で３
分間のプライマーの伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、９５
℃で１分１５秒間の鋳型の変性。
分間のプライマーの伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、９５
℃で１分１５秒間の鋳型の変性。
（アビジンをコーティングされたポリスチレン粒子での
ビオチニル化された増幅されたＤＮＡの捕捉） 二本鎖でかつ１つの鎖中に５°−ビオチンを含む増幅さ
れたＤＮＡ断片を、約１６１０分子、すなわち０．０２
μｍｏｌを含む２５μｇの試料を、アビジンをコーティ
ングされたポリスチレン粒子（０，８−、パンデックス
・ラボラトリーズ（ＰａｎｄｅｘＬａｂｏｒａｔｏｒｌ
ｅｓ）製）の５％溶液５ｕｆｌと室温で１時間インキエ
ベーションすることにより反応混合物から収集した。ビ
ーズをエッペンドルフの遠心分離機で３分間遠心分離し
て収集し、０．１９６のトライトン−Ｘ−１００（ｔｒ
ｌｔｏｎ−Ｘ−１００）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｊｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅｓ以下
、ＰＢＳという） 、ｐＨ７，５，１ｍｌで３回撹拌（
ｖｏｒｔｅｘｌｎｇ）洗浄した。そののち前記と同様に
遠心分離をした。結合したＤＮＡを０．１５Ｍ Ｎａ０
１１２００ ｕｆｌで３７℃で１５分間処理することに
より変性し、粒子を収集し、０．１％トライトン−Ｘ−
１００１ｍｌで２回、そして最後に１回０．０１％トラ
イトン−Ｘ−１００１ｍｌで洗浄した。
ビオチニル化された増幅されたＤＮＡの捕捉） 二本鎖でかつ１つの鎖中に５°−ビオチンを含む増幅さ
れたＤＮＡ断片を、約１６１０分子、すなわち０．０２
μｍｏｌを含む２５μｇの試料を、アビジンをコーティ
ングされたポリスチレン粒子（０，８−、パンデックス
・ラボラトリーズ（ＰａｎｄｅｘＬａｂｏｒａｔｏｒｌ
ｅｓ）製）の５％溶液５ｕｆｌと室温で１時間インキエ
ベーションすることにより反応混合物から収集した。ビ
ーズをエッペンドルフの遠心分離機で３分間遠心分離し
て収集し、０．１９６のトライトン−Ｘ−１００（ｔｒ
ｌｔｏｎ−Ｘ−１００）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｊｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅｓ以下
、ＰＢＳという） 、ｐＨ７，５，１ｍｌで３回撹拌（
ｖｏｒｔｅｘｌｎｇ）洗浄した。そののち前記と同様に
遠心分離をした。結合したＤＮＡを０．１５Ｍ Ｎａ０
１１２００ ｕｆｌで３７℃で１５分間処理することに
より変性し、粒子を収集し、０．１％トライトン−Ｘ−
１００１ｍｌで２回、そして最後に１回０．０１％トラ
イトン−Ｘ−１００１ｍｌで洗浄した。
（固定されたＤＮＡ断片のシークエンシング）ＤＮＡ断
片を担っている微粒子を、０．０６〜０．０８ｐｓｏｌ
のブライ７−２５Ｂを含む、４０１Ｍ トリス塩酸、ｐ
Ｈ７，５、２０置Ｍ ＭｇＣｆ２ 、５０ＢＭ
ＮａＣ、ｌｏＯμ ｇ／ ｍｌのウシ血清アルブミン
１０μｇ中に懸濁させた。プライマーを５５℃で１０分
間、ついで３７℃で３０分間のアニーリングに供した。
片を担っている微粒子を、０．０６〜０．０８ｐｓｏｌ
のブライ７−２５Ｂを含む、４０１Ｍ トリス塩酸、ｐ
Ｈ７，５、２０置Ｍ ＭｇＣｆ２ 、５０ＢＭ
ＮａＣ、ｌｏＯμ ｇ／ ｍｌのウシ血清アルブミン
１０μｇ中に懸濁させた。プライマーを５５℃で１０分
間、ついで３７℃で３０分間のアニーリングに供した。
ついで、 Ｓで標識されたｄＣＴＰ （Ｂｏｏ Ｃ１／
５ｉｏｌ、アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製＞
２ｕｌおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ（Ｋ
ｌｅｎｏｖ）断片、ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅ
ｈｒｌｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｌｍ）社製）１μｆＩ
（５単位）を加えた。個々のシークエンシング反応を行
なうため懸濁液をそれぞれ２．５μｇずつ４つの試験管
に分け、以下の最終濃度にするためデオキシ−およびジ
デオキシヌクレオチドの混合物２μｇを加えた。
５ｉｏｌ、アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製＞
２ｕｌおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ（Ｋ
ｌｅｎｏｖ）断片、ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅ
ｈｒｌｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｌｍ）社製）１μｆＩ
（５単位）を加えた。個々のシークエンシング反応を行
なうため懸濁液をそれぞれ２．５μｇずつ４つの試験管
に分け、以下の最終濃度にするためデオキシ−およびジ
デオキシヌクレオチドの混合物２μｇを加えた。
Ａ−反応：１２５ａＭ ｄＧＴＰ、 １２５ａＭ ｄ
ＴＴＰ。
ＴＴＰ。
１６μＭ ｄＡＴＰ、 ２５０ａＭ ｄｄＡＴＰＣ−
反応：１２５ａＭ ｄＧＴＰＳ１２５μＭ ｄＴＴＰ。
反応：１２５ａＭ ｄＧＴＰＳ１２５μＭ ｄＴＴＰ。
１２５ａＭ ｄＡＴＰ、 ２０ｐＭ ｄｄＣＴＰＧ−反
応：１２５ａＭ ｄＴＴＰ、 １２５ａＭ ｄＡＴＰ
。
応：１２５ａＭ ｄＴＴＰ、 １２５ａＭ ｄＡＴＰ
。
１６ｐＭ ｄＧＴＰ、 ２００ａＭ ｄｄＧＴＰＴ−
反応：１２５ａＭ ｄＧＴＰ、 １２５ａＭ ｄＡＴ
Ｐ。
反応：１２５ａＭ ｄＧＴＰ、 １２５ａＭ ｄＡＴ
Ｐ。
■６μＭ ｄＴＴＰ、 ５００ａ Ｍ ｄｄＴＴＰ室
温で２０分間反応を進行させた。ついで４種類のｄＮＴ
Ｐの２ｔｘＭ溶液２μｇを加え、室温で２０分間チェー
ス反応を進行させた。９５％ホルムアミド、２０ｍＭ
ＥＤＴＡ 、、０．０５％ブロモフェノールブルー、０
．０５％キシレンシアツール４μｇを加えて反応を停止
させた。試料を９８℃で３分間加熱した。チューブを遠
心分離し、上滑３μｇを８％ポリアクリルアミドシーク
エンシングゲルに重層した。試料を電気泳動に供し、ゲ
ルを移動させて、固定したのち標準法にしたがってＸ線
フィルムに曝した。現像の結果、明瞭なシークエンシン
グラダーが観察された。
温で２０分間反応を進行させた。ついで４種類のｄＮＴ
Ｐの２ｔｘＭ溶液２μｇを加え、室温で２０分間チェー
ス反応を進行させた。９５％ホルムアミド、２０ｍＭ
ＥＤＴＡ 、、０．０５％ブロモフェノールブルー、０
．０５％キシレンシアツール４μｇを加えて反応を停止
させた。試料を９８℃で３分間加熱した。チューブを遠
心分離し、上滑３μｇを８％ポリアクリルアミドシーク
エンシングゲルに重層した。試料を電気泳動に供し、ゲ
ルを移動させて、固定したのち標準法にしたがってＸ線
フィルムに曝した。現像の結果、明瞭なシークエンシン
グラダーが観察された。
実施例２
微粒子を事前に除去せずに、シークエンシング反応から
の試料をゲルに直接重層したほかは実施例１と全く同様
の処置を行なった。実施例１のシークエンシングラダー
と同一のシークエンシングラダーが観察された。
の試料をゲルに直接重層したほかは実施例１と全く同様
の処置を行なった。実施例１のシークエンシングラダー
と同一のシークエンシングラダーが観察された。
実施例３
本実施例においては、３２ｐで標識されたプライマーを
シークエンシング反応に用いた。以下の点を除いて、実
施例１と同様に処理を行なった。
シークエンシング反応に用いた。以下の点を除いて、実
施例１と同様に処理を行なった。
γ−３２Ｐ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを
用い、標準法にしたがうてシークエンシングブライマ−
２５Ｂを標識した。オリゴヌクレオチドプライマー２ｐ
■Ｏ１とγ−３２Ｐ−ＡＴＰ（＞ ５０００Ｃ１７１１
０１％アメルシャム社製） １４ｐ■Ｏ１を標識化反応
に用いた。１０’ ｃｐ■／ｐｓ＋ｏｌめ比活性（ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｌｅｓ）をもつプライマ
ーをえた。
用い、標準法にしたがうてシークエンシングブライマ−
２５Ｂを標識した。オリゴヌクレオチドプライマー２ｐ
■Ｏ１とγ−３２Ｐ−ＡＴＰ（＞ ５０００Ｃ１７１１
０１％アメルシャム社製） １４ｐ■Ｏ１を標識化反応
に用いた。１０’ ｃｐ■／ｐｓ＋ｏｌめ比活性（ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｌｅｓ）をもつプライマ
ーをえた。
シークエンシング反応について、約０．０２ｐｓｏｌの
増幅されたＤＮＡ断片を担った微粒子を０６１ｐｓｏｌ
の標識されたプライマー２５Ｂを含むシークエンシング
緩衝液（実施例１参照）に懸濁した。
増幅されたＤＮＡ断片を担った微粒子を０６１ｐｓｏｌ
の標識されたプライマー２５Ｂを含むシークエンシング
緩衝液（実施例１参照）に懸濁した。
プライマーのアニーリング反応は実施例１と同様に行な
った。ついで１μＮ （５単位）のＤＮＡポリメラー
ゼを加え、懸濁液をそれぞれ２．５μｇの４部分に分け
た。デオキシ−およびジデオキシヌクレオチドの混合物
２μｇを以下の最終濃度にするために加えた。
った。ついで１μＮ （５単位）のＤＮＡポリメラー
ゼを加え、懸濁液をそれぞれ２．５μｇの４部分に分け
た。デオキシ−およびジデオキシヌクレオチドの混合物
２μｇを以下の最終濃度にするために加えた。
Ａ−反応＝１２５μＭ ｄＣＴＰ、 １２５ａＭ ｄ
ＧＴＰ。
ＧＴＰ。
１２５ａＭ ｄＴＴＰ、 １６ｐＭ ｄＡＴＰおよび２
５０ａＭ ｄｄＡＴＰ Ｃ−反応：１２５ａＭ ｄＡＴＰ、 １２５ａＭ ｄ
ＧＴＰ。
５０ａＭ ｄｄＡＴＰ Ｃ−反応：１２５ａＭ ｄＡＴＰ、 １２５ａＭ ｄ
ＧＴＰ。
１２５ａＭ ｄＴＴＰ、 １６ｐＭ ｄＣＴＰおよび８
０ｐＭ ｄｄＣＴＰ Ｇ−反応：１２５ａＭ ｄＡＴＰ、 １２５ａＭ ｄ
ＣＴＰ。
０ｐＭ ｄｄＣＴＰ Ｇ−反応：１２５ａＭ ｄＡＴＰ、 １２５ａＭ ｄ
ＣＴＰ。
１２５ａＭ ｄＴＴＰ、 １８ｐＭ ｄＧＴＰおよび２
００ａＭ ｄｄＧＴＰ Ｔ−反応＝１２５μＭ ｄＡＴＰＳ１２５μＭ ｄＣＴ
Ｐ。
００ａＭ ｄｄＧＴＰ Ｔ−反応＝１２５μＭ ｄＡＴＰＳ１２５μＭ ｄＣＴ
Ｐ。
１２５ａＭ ｄＧＴＰ、 １８ｐＭ ｄＴＴＰおよび５
００ａＭ ｄｄＴＴＰ チェーンターミネーションおよびチェース反応は生成し
た断片の分析と同様、実施例１と同様に行なった。明瞭
なシークエンシングラダーがこの実施例においても観察
された。
００ａＭ ｄｄＴＴＰ チェーンターミネーションおよびチェース反応は生成し
た断片の分析と同様、実施例１と同様に行なった。明瞭
なシークエンシングラダーがこの実施例においても観察
された。
実施例４
本実施例においては、用いた増幅プライマーとシークエ
ンジングプライマーは同一ではなかった。シークエンシ
ングプライマーは増幅プライマーから増幅された断片の
ビオチニル化され。
ンジングプライマーは同一ではなかった。シークエンシ
ングプライマーは増幅プライマーから増幅された断片の
ビオチニル化され。
た５°末端の方へ７８塩基の距離に位置した。
繰返し複製反応−増幅はビオチニル化プライマー２５Ａ
および以下に示すシークエンスをもつ２５量体のプライ
マー（以下、２５Ｃという）を用いて行なった。
および以下に示すシークエンスをもつ２５量体のプライ
マー（以下、２５Ｃという）を用いて行なった。
５°−ＣＡＧ ＧＯＴ ＣＡＣＴＧＡ ＣＡＡ ＣＡＧ
ＣＣＧ ＣＣＣＴプライマー２５Ａおよび２５Ｃは
ＣＭＶ−ゲノム中の２０９ｂｐシークエンスをはさむ。
ＣＣＧ ＣＣＣＴプライマー２５Ａおよび２５Ｃは
ＣＭＶ−ゲノム中の２０９ｂｐシークエンスをはさむ。
増幅処理および捕捉処理は実施例１と同様に行なった。
プライマー２５Ｂを３２ｐで標識し、実施例３に記載さ
れた条件でシークエンシングプライマーとして用いた。
れた条件でシークエンシングプライマーとして用いた。
実施例３でえられたシークエンスと同様のシークエンス
かえられた。
かえられた。
実施例５
すべての操作は親和性捕捉工程を除いて実施例１と同様
にして行なわれた。本実施例においてはアフィニティー
マトリックスとして磁気ビーズを用いた。ビーズは直径
２１ｍで常磁性の核とストレプトアビジンでコーティン
グされた球状のポリスチレンの外殻をもつ。このビーズ
（ダイナビード２８０−ストレプトアビジン（Ｄｙｎａ
ｂｅａｄ ２８０−８ｔｒｅｐｔａｖｌｄｌｎ ）はダ
イナル（Ｄｙｎａｌ）社、ノルウＱ −（Ｎｏｒｗａｙ
）から入手した。使用前にビーズをリン酸緩衝食塩水（
ＰＢＳ）で１回洗浄した。
にして行なわれた。本実施例においてはアフィニティー
マトリックスとして磁気ビーズを用いた。ビーズは直径
２１ｍで常磁性の核とストレプトアビジンでコーティン
グされた球状のポリスチレンの外殻をもつ。このビーズ
（ダイナビード２８０−ストレプトアビジン（Ｄｙｎａ
ｂｅａｄ ２８０−８ｔｒｅｐｔａｖｌｄｌｎ ）はダ
イナル（Ｄｙｎａｌ）社、ノルウＱ −（Ｎｏｒｗａｙ
）から入手した。使用前にビーズをリン酸緩衝食塩水（
ＰＢＳ）で１回洗浄した。
実施例１と同様に、増幅されたＤＮＡ断片を含有する試
料２５μｇを分析した。ＰＢＳ中４％磁気ビーズ懸濁液
５μｇを加え、捕捉反応を回転ミキサーの中で、エッペ
ンドルフ・チューブ中、３７℃、３０分間行なった。標
準的な実験用磁石を用い、１分間かけてビーズを溶液か
ら分離し、溶液を廃棄した。ビーズをＰＢ８１ｍｌで３
回撹拌洗浄し、ついで前記と同様の磁気的な分離を行な
った。結合したＤＮＡを２００μｊ！の０．１５Ｍ Ｎ
ａＯＨで１５分間３７℃で処理することにより変性させ
た。
料２５μｇを分析した。ＰＢＳ中４％磁気ビーズ懸濁液
５μｇを加え、捕捉反応を回転ミキサーの中で、エッペ
ンドルフ・チューブ中、３７℃、３０分間行なった。標
準的な実験用磁石を用い、１分間かけてビーズを溶液か
ら分離し、溶液を廃棄した。ビーズをＰＢ８１ｍｌで３
回撹拌洗浄し、ついで前記と同様の磁気的な分離を行な
った。結合したＤＮＡを２００μｊ！の０．１５Ｍ Ｎ
ａＯＨで１５分間３７℃で処理することにより変性させ
た。
ビーズを収集し、ＰＢＳで２回、４０１Ｍトリス塩酸、
ｐ＋＋７．ｓ、２０ｍＷＩ ＨｇＣ１２，５０１Ｍ Ｎ
ａＣｆで１回洗浄した。固定されたＤＮＡ断片のシーク
エンシングは実施例１と同様であった。
ｐ＋＋７．ｓ、２０ｍＷＩ ＨｇＣ１２，５０１Ｍ Ｎ
ａＣｆで１回洗浄した。固定されたＤＮＡ断片のシーク
エンシングは実施例１と同様であった。
実施例６
繰返し複製反応−増幅および捕捉処理は実施例１と同様
にして行なった。本実施例においては、変性工程でえら
れた増幅されたＤＮＡ断片の第２の鎖をシークエンシン
グした。
にして行なった。本実施例においては、変性工程でえら
れた増幅されたＤＮＡ断片の第２の鎖をシークエンシン
グした。
アフィニティーマトリックスから溶出されたＤＮＡ鎖を
含むＯ，１５Ｍ Ｎａ０１１の上清２００ｍ１に１．５
Ｍ酢酸２０μｇおよび３Ｍ酢酸ナトリウム（ａｌ１７）
１２Ｍｇを加えて中和した。ＤＮＡをエタノールを用い
て沈澱させ、シークエンシングプライマーを含むｌＯμ
ｇのシークエンシング緩衝液（実施例１参照）に溶解さ
せた。シークエンシング処理は実施例１で特定された条
件で行なった。明瞭なシークエンシングラダーがまたえ
られた。
含むＯ，１５Ｍ Ｎａ０１１の上清２００ｍ１に１．５
Ｍ酢酸２０μｇおよび３Ｍ酢酸ナトリウム（ａｌ１７）
１２Ｍｇを加えて中和した。ＤＮＡをエタノールを用い
て沈澱させ、シークエンシングプライマーを含むｌＯμ
ｇのシークエンシング緩衝液（実施例１参照）に溶解さ
せた。シークエンシング処理は実施例１で特定された条
件で行なった。明瞭なシークエンシングラダーがまたえ
られた。
実施例７
固定されたビオチニル化されたアポリポタンパクＥ
ＤＮＡ断片のシークエンシングによるアポリポタンパク
Ｅの遺伝的串型の同定 本実施例は、本発明の方法が遺伝的疾患の診断に便利で
あることを説明するものである。本発明はアポリポタン
パクＥ（以下、アポＥという）の遺伝的変異の分析に適
用される。このタンパクは、リポタンパク代謝において
重要な役割を果たす。３つの異なる対立遺伝子（ｃ２、
Ｃ３およびＣ４）によりエンコード（ｅｎｃｏｄｅ）さ
れるアポＥの３つの共通のアイソフオーム（ｃｏａｖｏ
ｎ １ｓｏｆｏｒｍ）が個体群に存在する。３つの対立
遺伝子の遺伝的変異は、アミノ酸部位１１２および１５
８における１つの塩基のｉ換によるものである。このア
ポＥの遺伝的串型は固体群における血清コレステロール
レベルの１０％はどの変化を説明し、したがって大いに
臨床的意義をもつ。
ＤＮＡ断片のシークエンシングによるアポリポタンパク
Ｅの遺伝的串型の同定 本実施例は、本発明の方法が遺伝的疾患の診断に便利で
あることを説明するものである。本発明はアポリポタン
パクＥ（以下、アポＥという）の遺伝的変異の分析に適
用される。このタンパクは、リポタンパク代謝において
重要な役割を果たす。３つの異なる対立遺伝子（ｃ２、
Ｃ３およびＣ４）によりエンコード（ｅｎｃｏｄｅ）さ
れるアポＥの３つの共通のアイソフオーム（ｃｏａｖｏ
ｎ １ｓｏｆｏｒｍ）が個体群に存在する。３つの対立
遺伝子の遺伝的変異は、アミノ酸部位１１２および１５
８における１つの塩基のｉ換によるものである。このア
ポＥの遺伝的串型は固体群における血清コレステロール
レベルの１０％はどの変化を説明し、したがって大いに
臨床的意義をもつ。
（プライマーの合成）
４つのプライマーＰ１〜４をアプライド・バイオシステ
ムズ３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成した
。プライマーのヌクレオチドシークエンスおよびアポリ
ポタンパクＥ遺伝子上のその位置（ヌクレオチド番号と
して示す）は以下のとおりである。
ムズ３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成した
。プライマーのヌクレオチドシークエンスおよびアポリ
ポタンパクＥ遺伝子上のその位置（ヌクレオチド番号と
して示す）は以下のとおりである。
Ｐｌ：５°−ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＧＣＣ
ＴＡＣＡＡＡ Ｔ （３８１８〜３６３７） Ｐ２ ： ５’−ＴＣＧ ＣＧＧ ＧＣＣＣＣＧ ＧＣ
ＣＴＧＧ ＴＡＣＡ （３８９３〜３９１４） Ｐ３：５°−ＧＡＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＡＧＣＣＣＧ
ＧＴＩＩ； ＧＣＧ Ｃ（３８４９〜３６７０） Ｐ４：５°−ＧＧＡ ＴＧＧ ＣＧＣＴＧＡ ＧＧＣＣ
ＧＣＧＣＴ Ｃ（３９２２〜３９４３） アミノリンク■試薬（アプライド・バイオシステムズ社
製）を用いて、５°−アミノ基をプライマーＰ２に付加
した。アミノ基をスルホ−ＮＨ８−ビオチン（ピアス・
ケミカル社製）を用いてビオチニル化し、逆相１１ Ｐ
ＬＣで精製した。シークエンジングブライマ−Ｐ３を
、（γ−″Ｐ）ｄＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて４×１０’ ｃｐｓ／ｐａの比活性を示
すように標識した。
ＴＡＣＡＡＡ Ｔ （３８１８〜３６３７） Ｐ２ ： ５’−ＴＣＧ ＣＧＧ ＧＣＣＣＣＧ ＧＣ
ＣＴＧＧ ＴＡＣＡ （３８９３〜３９１４） Ｐ３：５°−ＧＡＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＡＧＣＣＣＧ
ＧＴＩＩ； ＧＣＧ Ｃ（３８４９〜３６７０） Ｐ４：５°−ＧＧＡ ＴＧＧ ＣＧＣＴＧＡ ＧＧＣＣ
ＧＣＧＣＴ Ｃ（３９２２〜３９４３） アミノリンク■試薬（アプライド・バイオシステムズ社
製）を用いて、５°−アミノ基をプライマーＰ２に付加
した。アミノ基をスルホ−ＮＨ８−ビオチン（ピアス・
ケミカル社製）を用いてビオチニル化し、逆相１１ Ｐ
ＬＣで精製した。シークエンジングブライマ−Ｐ３を
、（γ−″Ｐ）ｄＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて４×１０’ ｃｐｓ／ｐａの比活性を示
すように標識した。
（ＤＮＡ試料）
ユニバージティー９セントラル拳ホスビタル・オブ・ヘ
ルシンキ（Ｕｎｌｖｅｒｓｌｔｙ Ｃｅｎｔｒａｌｌｌ
ｏｓｐＩｔａｌ ｏｒ ＩＩｏｌｓｌｎｋｌ）のリピッ
ド・アウトペイシャントφクリニック（Ｌｉｐｉｄ ０
ｕｔｐａｔ１ｅｎｔＣ１ｉｎＩｃ）に来院している既知
のアポＥ表現型の患者から静脈血の試料を採取した。白
血球ＤＮＡを標準法にしたがって抽出した。
ルシンキ（Ｕｎｌｖｅｒｓｌｔｙ Ｃｅｎｔｒａｌｌｌ
ｏｓｐＩｔａｌ ｏｒ ＩＩｏｌｓｌｎｋｌ）のリピッ
ド・アウトペイシャントφクリニック（Ｌｉｐｉｄ ０
ｕｔｐａｔ１ｅｎｔＣ１ｉｎＩｃ）に来院している既知
のアポＥ表現型の患者から静脈血の試料を採取した。白
血球ＤＮＡを標準法にしたがって抽出した。
（増幅）
ＤＮＡサーマルサイクラ−（ｔｈｅｒａａｌ ｅｙｃｌ
ｅｒ）（パーキン−エルマー／シーラス（Ｐｅｒｋｌｎ
−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）製）において各０．２ｍＭ
のｄＡＴＰ。
ｅｒ）（パーキン−エルマー／シーラス（Ｐｅｒｋｌｎ
−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）製）において各０．２ｍＭ
のｄＡＴＰ。
ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＴＴＰ、 ２０ｍＭ トリ
ス塩酸、ｐＨ８，８，１５１Ｍ （Ｎ１１４）２ ＳＯ
ｓ 、１．５ｍＭ Ｍｇ（Ｊｚ 、０．１ ％゛ツイー
ン２０Ｏ，１ｍｇ／ｍｌゼラチンおよび２．５単位のテ
ルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｓｕｓａｑｕａｔｌ
ｅｕｓ ） ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｓ
＋ｏｇａ）社製）の溶液１００μＮ中プライマーＰＩお
よびＰ４ （最終濃度１μ約を用いてＤＮＡ（試料あた
り１０１００ｎを９６℃で１分間および６５℃で２分間
を２５回サイクリングして増幅した。この第１の増幅反
応混合物の少量の部分標本（１１００希釈液３μｇ）を
第２の増幅に移した。この第２の増幅は上記条件で行な
われ、一方がビオチニル化されたネステッド（ｎｅｓｔ
ｅｄ）プライマーの対によって果された（ビオチニル化
されたＰ２およびＰ３）。
ス塩酸、ｐＨ８，８，１５１Ｍ （Ｎ１１４）２ ＳＯ
ｓ 、１．５ｍＭ Ｍｇ（Ｊｚ 、０．１ ％゛ツイー
ン２０Ｏ，１ｍｇ／ｍｌゼラチンおよび２．５単位のテ
ルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｓｕｓａｑｕａｔｌ
ｅｕｓ ） ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｓ
＋ｏｇａ）社製）の溶液１００μＮ中プライマーＰＩお
よびＰ４ （最終濃度１μ約を用いてＤＮＡ（試料あた
り１０１００ｎを９６℃で１分間および６５℃で２分間
を２５回サイクリングして増幅した。この第１の増幅反
応混合物の少量の部分標本（１１００希釈液３μｇ）を
第２の増幅に移した。この第２の増幅は上記条件で行な
われ、一方がビオチニル化されたネステッド（ｎｅｓｔ
ｅｄ）プライマーの対によって果された（ビオチニル化
されたＰ２およびＰ３）。
（アビジンでコーティングされたポリスチレン粒子での
ビオチニル化された増幅されたアポＥＤＮＡの親和性捕
捉） 第２の増幅反応混合物の部分標本２５μｇを０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、 ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢ
Ｓ） 、ｐＨ７，５で５０Ｍｇに希釈し、そののちアビ
ジンでコーティングされたポリスチレン粒子（０，８ａ
＋、バクスター争へルスケア社（ＢａｘｔｅｒＨｅａｌ
ｔｈｃａｒｃ Ｃｏｒｐ、）製）の５％（ｗハ）懸濁液
５μｇを加えた。試料を１時間２０℃に保温した。
ビオチニル化された増幅されたアポＥＤＮＡの親和性捕
捉） 第２の増幅反応混合物の部分標本２５μｇを０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、 ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢ
Ｓ） 、ｐＨ７，５で５０Ｍｇに希釈し、そののちアビ
ジンでコーティングされたポリスチレン粒子（０，８ａ
＋、バクスター争へルスケア社（ＢａｘｔｅｒＨｅａｌ
ｔｈｃａｒｃ Ｃｏｒｐ、）製）の５％（ｗハ）懸濁液
５μｇを加えた。試料を１時間２０℃に保温した。
エッペンドルフ遠心分離機での２分間の遠心分離により
粒子を収集し、１５ａ＋Ｍ ＮａＣｌと１．５膳Ｍクエ
ン酸ナトリウムの溶液１ｍｌで２回、ついでＰＢＳ中０
．１％ツイーン２０１°ｍｌで２回撹拌洗浄した。粒子
を０．１５Ｍ Ｎａ０ＩＩで３７℃で１５分間２回処理
し、ついで５０ｍＭ ＮａＣｌ 、 ４０ｍにトリス塩
酸、ｐＨ７，５中０．１９６ツイーン２０で２回洗浄し
、最後に５０ｍＭ ＮａＣｌ、 ４０＋ｅＭ）リス塩酸
、ｐＨ７，５中０ 、０１９６ツイーン２０で洗浄した
。
粒子を収集し、１５ａ＋Ｍ ＮａＣｌと１．５膳Ｍクエ
ン酸ナトリウムの溶液１ｍｌで２回、ついでＰＢＳ中０
．１％ツイーン２０１°ｍｌで２回撹拌洗浄した。粒子
を０．１５Ｍ Ｎａ０ＩＩで３７℃で１５分間２回処理
し、ついで５０ｍＭ ＮａＣｌ 、 ４０ｍにトリス塩
酸、ｐＨ７，５中０．１９６ツイーン２０で２回洗浄し
、最後に５０ｍＭ ＮａＣｌ、 ４０＋ｅＭ）リス塩酸
、ｐＨ７，５中０ 、０１９６ツイーン２０で洗浄した
。
（固定されたＤＮＡ断片のヌクレオチドシークエンシン
グ） ＤＮＡ鋳型を担う粒子を０．５〜１ ｐｉｏｌのシーク
エンジングプライマーＰ３を含む、５０ｍＭＮａＣ１ｔ
。
グ） ＤＮＡ鋳型を担う粒子を０．５〜１ ｐｉｏｌのシーク
エンジングプライマーＰ３を含む、５０ｍＭＮａＣ１ｔ
。
２０ｍ１４ ＭｇＣ＃ｚ 、４０ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ
７，５１０Ｍｇ中に懸濁させた。チューブを２分間６５
℃に加熱したのち、室温に徐々に冷却した。０．１８ジ
チオスレイト一ル１μｇ１水２．５μｇおよび２μｇ（
３，２５単位）の７７ ＤＮＡポリメラーゼ（５ｅｑｕ
ｅｎａｓｅ”、ユナイｔツド・ステイツ・バイオケミカ
ル社（ｔｌｎｌｔｅｄ ５ｔａｔｅｓ Ｂｌｏｅｈｃｍ
ｌｃａｌＣｏｒｐ、）製）を加え、チューブを３分間２
２℃に保温した。反応混合物の部分標本（３，５μｇ）
を、２．５μｇの各チェーンターミネーション混′合物
（Ａ反応および１反応用：８０ＭＭ ｄＮＴＰ、 ８μ
ＨｄｄＮＴＰ ； Ｃ反応オヨび６反応用： ３２Ｑ
μＭ ｄＮＴＰ。
７，５１０Ｍｇ中に懸濁させた。チューブを２分間６５
℃に加熱したのち、室温に徐々に冷却した。０．１８ジ
チオスレイト一ル１μｇ１水２．５μｇおよび２μｇ（
３，２５単位）の７７ ＤＮＡポリメラーゼ（５ｅｑｕ
ｅｎａｓｅ”、ユナイｔツド・ステイツ・バイオケミカ
ル社（ｔｌｎｌｔｅｄ ５ｔａｔｅｓ Ｂｌｏｅｈｃｍ
ｌｃａｌＣｏｒｐ、）製）を加え、チューブを３分間２
２℃に保温した。反応混合物の部分標本（３，５μｇ）
を、２．５μｇの各チェーンターミネーション混′合物
（Ａ反応および１反応用：８０ＭＭ ｄＮＴＰ、 ８μ
ＨｄｄＮＴＰ ； Ｃ反応オヨび６反応用： ３２Ｑ
μＭ ｄＮＴＰ。
８μＭ ｄｄＮＴＰ）を含む４つのチューブに移した。
チューブを４２℃で６分間インキュベーションし、９５
％ホルムアミド、２０ｔｔｒＭ ＥＤＴＡ 、 ０．０
５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレン
シアツールを含む溶液４μｇを加えて反応を停止した。
％ホルムアミド、２０ｔｔｒＭ ＥＤＴＡ 、 ０．０
５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレン
シアツールを含む溶液４μｇを加えて反応を停止した。
試料を８０℃で２分′間加熱し、粒子を２分間遠沈（ｓ
ｐｌｎ ｄｏｗｎ）させた。チェーンターミネーション
反応の生成物を６％シークエンシングゲルに流した。電
気泳動を行ない、ゲルを標準法にしたがって処理した。
ｐｌｎ ｄｏｗｎ）させた。チェーンターミネーション
反応の生成物を６％シークエンシングゲルに流した。電
気泳動を行ない、ゲルを標準法にしたがって処理した。
正確な対立遺伝子はえられたシークエンシングラダーか
ら確認された。ヘテロ接合体の試料においては、両方の
対立遺伝子は、ヌクレオチド変異の位置で重複した（ｓ
ｕｐｅｒｌａ＋ｐｏｓｅｄ ）シークエンシングラダー
として確認された。
ら確認された。ヘテロ接合体の試料においては、両方の
対立遺伝子は、ヌクレオチド変異の位置で重複した（ｓ
ｕｐｅｒｌａ＋ｐｏｓｅｄ ）シークエンシングラダー
として確認された。
第１図は、本発明の一実施態様において用いられた一連
の工程を示す概略図、および第２図はターゲット核酸と
シークエンシングプライマー間の相補性領域を示す概略
図である。 饗 七 第２図
の工程を示す概略図、および第２図はターゲット核酸と
シークエンシングプライマー間の相補性領域を示す概略
図である。 饗 七 第２図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １（ａ）ターゲット核酸ポリマーを含む試料を、ヌクレ
オシド三リン酸類、核酸ポリメラーゼならびにターゲッ
ト核酸ポリマーの異なった鎖と相補的でかつハイブリダ
イゼーションする領域をもつオリゴヌクレオチドからな
り、核酸ポリメラーゼによる核酸合成重合のプライマー
として有効な各増幅プライマーであり第１の増幅プライ
マーはさらにオリゴヌクレオチドに結合した第１の付着
部分を含んでいるものである第１および第２の増幅プラ
イマーの混合物と増幅反応混合物を調製するために組み
合せること、 （ｂ）増幅反応混合物を、ＤＮＡ合成重合が起こる第１
の条件と二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの変性が起こ
る第２の条件の間で、付着部分に結合したターゲット核
酸シークエンスのコピーからなる増幅された試料を形成
するために、ＤＮＡシークエンシング処理に用いるのに
適当な量のターゲット核酸ポリマーのコピーを生成する
のに充分な回数のサイクルを繰り返しサイクリングさせ
ること、 （ｃ）それぞれ固体マトリックスおよび第１の付着部分
によってターゲット核酸ポリマーの１つの鎖を固定しう
る第１の付着部位からなる複数の第１の支持体を増幅さ
れた試料に加えること、 （ｄ）第１の付着部位を増幅された試料中のターゲット
核酸のコピーが第１の支持体に固定されるように第１の
付着部分と相互に作用せしめること、 （ｅ）固定された核酸を増幅反応混合物から分離するこ
と、 （ｆ）増幅された核酸試料をそれが一本鎖核酸を形成す
るために変性すること、および （９）一本鎖核酸のシークエンスを決定すること、 からなるターゲット核酸ポリマーのシークエンス決定方
法。 ２ 支持体にターゲット核酸のコピーを固定するのに先
立って、増幅された試料を変性する工程が行なわれる請
求項１記載の方法。 ３ 一本鎖の固定された核酸のシークエンスがチェーン
ターミネーション法を用いて決定される請求項１記載の
方法。 ４ 前記第１の付着部分および前記第１の付着部位がア
フィニティーペアの成分である請求項１記載の方法。 ５ アフィニティーペアがビオチン／アビジン、ビオチ
ン／ストレプトアビジン、ポリｄＡ／ポリｄＴ、ポリｄ
Ｇ／ポリｄＣ、ハプテン／抗体および金属／キレートか
らなる群より選ばれたものである請求項４記載の方法。 ６ 前記第２の増幅プライマーが前記第１の付着部分と
異なる第２の付着部分を含むものである請求項１記載の
方法。 ７ 支持体マトリックスおよび第２の付着部分によって
ターゲット核酸ポリマーの１つの鎖を固定しうる第２の
付着部位からなる複数の第２の支持体を増幅された試料
に加える工程をさらに含んでなる請求項６記載の方法。 ８ 前記第２の付着部分および前記第２の付着部位がア
フィニティーペアの成分である請求項７記載の方法。 ９ アフィニティーペアがビオチン／アビジン、ビオチ
ン／ストレプトアビジン、ポリｄＡ／ポリｄＴ、ポリｄ
Ｇ／ポリｄＣ、ハプテン／抗体および金属／キレートか
らなる群より選ばれたものである請求項８記載の方法。 １０ 前記第１および第２の支持体が、増幅された試料
中にともに存在し、かつお互いが物理的に分離されるよ
うに選ばれたものである請求項７記載の方法。 １１ 前記第１および第２の支持体の１つが磁気性をも
つものである請求項１０記載の方法。 １２ 前記第１および第２の支持体の１つまたは両方が
、ディプスティックである請求項１０記載の方法。 １３ シークエンス決定工程が、 一本鎖の固定された核酸を、シークエンシ ングプライマーならびにヌクレオシド三リン酸類、１つ
のチェーンターミネーションを与えるヌクレオチド、ポ
リヌクレオチド合成酵素および核酸合成中に組み込まれ
る標識部分からなるシークエンシング混合物と組み合せ
る工程、 シークエンスの決定を可能にするのに充分 なチェーンターミネーション現象を起こす充分な時間、
部分的に重合された試料を形成するために重合せしめる
工程、 ヌクレオシド三リン酸類の混合物を含む完 成試薬を部分的に重合された試料に加える工程、 実質的にＤＮＡ合成が完了するのに充分な時間、完成試
薬中で重合せしめる工程、 完全に重合された試料を完成試薬から分離 する工程、 重合された核酸を支持体から放出する工程、重合された
核酸を、一本鎖にするために変 性する工程、および ターゲット核酸ポリマーのシークエンスを 決定すベく一本鎖核酸ポリマーのサイズを分析する工程 を含むものである請求項３記載の方法。 １４ シークエンシングプライマーが、増幅プライマー
の少なくとも一部分と相補的なオリゴヌクレオチドおよ
び増幅プライマーの３′末端とターゲット核酸ポリマー
中の興味ある領域との間に位置するターゲット核酸ポリ
マーの一部分と相補的なオリゴヌクレオチドの中から選
ばれたオリゴヌクレオチドである請求項１３記載の方法
。 １５ それぞれの重合工程前に、核酸のアニーリングを
促進するために選ばれた温度で増幅反応混合物をインキ
ュベーションする工程をさらに含んでなる請求項１記載
の方法。 １６ （ａ）ターゲット核酸ポリマーの一部分と相補的
でかつハイブリダイゼーションし、酵素的核酸合成重合
プライマーとして有効なオリゴヌクレオチドおよび第１
の付着部分からなる第１の増幅プライマー、ならびに （ｂ）それぞれ固体マトリックスおよび第１の付着部分
によって増幅プローブのオリゴヌクレオチドを固定しう
る少なくとも１つの付着部位からなる複数の第１の支持
体からなる組合せがパッケージングされてなるターゲッ
ト核酸ポリマーのシークエンス決定用キット。 １７ 付着部分および付着部位がアフィニティーペアの
成分である請求項１６記載のキット。 １８ アフィニティーペアがビオチン／アビジン、ビオ
チン／ストレプトアビジン、ポリｄＡ／ポリｄＴ、ポリ
ｄＧ／ポリｄＣ、ハプテン／抗体および金属／キレート
からなる群より選ばれたものである請求項１７記載のキ
ット。 １９ 付着部分が付着部位と直接に結合を形成せず、付
着部分と付着部位との間に結合を形成するように選ばれ
た連結部分をさらに含んでなる請求項１８記載のキット
。 ２０ 増幅プライマーの少なくとも一部分と相補的なオ
リゴヌクレオチドおよび増幅プライマーの３′末端とタ
ーゲット核酸ポリマー中の興味ある領域との間に位置す
るターゲット核酸ポリマーの一部分と相補的なオリゴヌ
クレオチドの中から選ばれたオリゴヌクレオチドである
シークエンシングプライマーをさらに含んでなる請求項
１６記載のキット。 ２１ シークエンシングプライマーが、さらに検出可能
な標識を含むものである請求項２０記載のキット。 ２２ ターゲット核酸ポリマーの決定されたシークエン
スを標準品のシークエンスと比較するための参照手段を
さらに含んでなる請求項１６記載のキット。 ２３ 参照手段が標準品のシークエンシングによりえら
れたシークエンシングラダーを示す包装挿入物である請
求項２２記載のキット。 ２４ 参照手段が標準品の試料である請求項２２記載の
キット。 ２５ 増幅プライマーのオリゴヌクレオチドがターゲッ
トの生物由来のターゲット核酸ポリマーの一部分と相補
的でかつハイブリダイゼーションするものである請求項
１６記載のキット。 ２６ ターゲット核酸ポリマーの第２の鎖の一部分と相
補的でかつハイブリダイゼーションし、酵素的核酸合成
重合にプライマーとして有効なオリゴヌクレオチドおよ
び第１の付着部分と異なる第２の付着部分からなる第２
の増幅プライマーならびにそれぞれ固体マトリックスお
よび第２の付着部分によって増幅プローブのオリゴヌク
レオチドを固定しうる少なくとも１つの付着部位からな
る複数の第２の支持体をさらに含んでなる請求項１６記
載のキット。 ２７ 付着部分および付着部位がアフィニティーペアの
成分である請求項２６記載のキット。 ２８ アフィニティーペアがビオチン／アビジン、ビオ
チン／ストレプトアビジン、ポリｄＡ／ポリｄＴ、ポリ
ｄＧ／ポリｄＣ、ハプテン／抗体および金属／キレート
からなる群より選ばれたものである請求項２７記載のキ
ット。 ２９ ターゲット核酸ポリマーの決定されたシークエン
スを標準品のシークエンスと比較するための参照手段を
さらに含んでなる請求項２６記載のキット。 ３０ ターゲット核酸ポリマーにおける少なくとも１つ
の潜在的な核酸変異の決定に用いられる請求項１、２、
３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４または１５記載の方法。 ３１ 法分析または遺伝的素因もしくは疾患の分析に用
いられる請求項３０記載の方法。 ３２ ヌクレオチド変異が体細胞突然変異である請求項
３０または３１記載の方法。 ３３ 植物および動物の育種のための細胞および株もし
くは種の選択または所望の遺伝子型を示す微生物の選択
に用いられる請求項３０または３１記載の方法。 ３４ 請求項３０、３１、３２または３３記載の方法に
用いられる請求項１６、１７、１８、１９、２０、２１
、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２
９記載のキット。
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