JPH04500902A

JPH04500902A - Ｄｎａ配列決定法

Info

Publication number: JPH04500902A
Application number: JP1503793A
Authority: JP
Inventors: ユーレン、マチアス
Original assignee: セミュ・バイオテクニク・アーベー
Priority date: 1988-03-23
Filing date: 1989-03-22
Publication date: 1992-02-20
Anticipated expiration: 2015-07-24
Also published as: US5405746A; SE8801070D0; EP0406296A1; EP0406296B1; AU633252B2; DE68907407D1; JP3068144B2; AU3360289A; WO1989009282A1; DE68907407T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ配列決定法本発明は固相結合鋳型ＤＮＡを用いたＤＮＡの配列決定法に関する。

ヒトのゲノム全体の配列を決定しようとする提案（スミス　（ＳｍＮｂ）他（１９８７））のように、大規模な配列決定プロジェクトに対する関心が高まるに伴って、メガ（１００万）単位の塩基配列決定を可能とするような技術的改良が必要になってきた。配列決定は（ｉ）鋳型の調製、■配列決定反応、０電気泳動、０特定フラグメントの検出、及びωデータの蓄積と解析、の５つの操作に分けることができるが、大規模プロジェクトを可能とするためにはこれらの操作はすべて自動化しなくてはならない。データの蓄積と解析を除いて現状では配列決定の殆どは手動で行われており、そのため操作にかなりの時間が費やされる。

最近、多くの技術的改良が報告されているが、改良点の大部分はデータ評価、即ちコンピューターソフトウェアに関するものである。−重鎮ファージＤＮＡを調製するためのフィルター法が記載（クリストネッセン（Ｋｒ口＋ｎｅｓｅｎｌ他（１９８７１）されているが、この方法は自動化法にまで発展させ得るかも知れない。遠心力応用試薬取扱い装置による自動配列決定反応を開発する試み（マーチン（Ｍ！目ｉｎ）他（１９８５１）　、並びにラジオグラム上のバンド検出用画像処理プログラム（エルグ−（Ｅｌｄｅ＋）他（１９８５））も記載されている。しかし、最も一般的なアプローチはロボットを用いて技術を自動化することである。このような方策を用いて、高速配列決定用のシステム（ワダ他（１９８３））及びＤＮＡ鋳型調製法（ド・ボンビル　（Ｄｅ　Ｂｏｎｖｉｌｌｅ）他（１９１１７））が導入された。

ＤＮＡ断片の標識に同位体ではなく蛍光を活用することによって電気泳動工程を自動化する新規なアプローチが幾つかのグループ（スミス他（＋９８６１、アンツルシュ（Ａｎｓｏｒｇｅ）他（１９８７）、及びプローバー（？ｏｂｅｒ）他（１９８７））によって記載されている。このような系を用いることによって、オンライン検出が達成でき、これによって電気泳動、検出、及びデータ処理の３つの操作を一つの自動化ステーションに結合することが可能となる。従って、メガ単位の塩基配列決定を成し遂げる方策として、かかる系をその一部に含めることも有望である。

完全に自動化された配列決定のプロトコルを得るためには、上記操作のうちの最初の二つ（鋳型調製および配列決定反応）に関する適切な自動化法を開発することも欠かせない。配列決定反応操作に関しては、固相法を用いる方策を用いるとマイクロリットル量の液体の取り扱いについての自動化が容易となり、自動化プロトコルに適している。

本発明において、本発明者らは、目的とするＤＮＡの配列を決定する方法にして、該ＤＮＡを固体担体上に固定化した一重鎮形として供し、そして次に配列決定に付す方法を供する。

固相法は、分子生物学において非常に有用であることがペプチド合成、ペプチドの配列決定、及びＤＮＡ合成などの領域で実証されている。この技術を用いた多数の装置が市販されている。固相法に伴う利点は、反応溶液からの固相の分離が容易なため、通常、良好な収率、再現性のある反応、並びに容易な自動操作とを兼備えていることである。

しかし、現在までのところ、固相法を用いたクローン化ＤＮＡ配列の取扱い操作をＤＮＡ配列決定反応などに応用したという報告は殆どない。陰イオン交換担体上のオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列決定法が記載されているが（ローゼンタール　（Ｒｏｓｅ＋＋１ｈｘｌ）他（１９８５））　、ＤＮＡの配列決定を自動化しようとする試みの多くは実験用ロボットの使用に集中している（マーチン他（１９８５）、並びにワダ他（１９８７））。

本発明の一つの態様においては、二重鎖ＤＮＡを固体担体に固定化し、その後で鎖特異的な溶出を行う。このようにして、−重鎖ＤＮＡに関わる配列決定を自動化に適した方法で行うことができる。プリウス　（Ｈ，ＤｅｌｉυＳ）他にュークレイック・アシッズ・リサーチ（ＮυｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅｘ＋ｃｂＮ３巻１５号（＋９８５）５４５７頁）は、かかる鎖特異的な溶出について、ただしヘテロ二重鎖の電子顕微鏡分析との関連においてのみ記載している。

本発明の好ましい方法においては、所望のＤＮＡ配列を選択的に二重鎖プラスミド又はファージベクター中にに組込む。ある種の物質に対して親和性を持つ官能基をベクターＤＮＡの所望鎖に組込む。この物質は固相に結合しており、ベクターを固相に接触させた時に官能基とこの物質との間の相互作用によってベクターが固定化される。このベクターを次に融解させ、その後で結合していないＤＮＡ鎖を適当な条件下で溶出させる。

この二重鎖ＤＮＡは、目的ＤＮＡの組込みに適したクローニング部位と線状化に適したクローニング部位を提供できるものであれば、プラスミドやファージのような如何なるベクターであってもよい。本発明で用いるために特に設計し作製した２つのプラスミドベクターとしてプラスミドｐＲＩＴ２７とｐＲＩＴ２８があるが、これらについては実験に関する箇所で説明する。ただし、ラムダ（λ）又はコスミドベクターなどのファージベクターを使用することもできる。

所望のＤＮＡ配列の長さは、用途に応じて、数塩基対から少（とも３〜４万塩基対まで様々に変化させることができる。このＤＮＡ配列を、それ自体は公知の組換えＤＮＡ技術を用いてベクター中に選択的に導入する。

官能基は、デオキシヌクレオチド中に組込むことができ、かつ固体担体上に固定化可能な物質と強い相互作用を有するものであれば、如何なる化合物でもよい。

この２つの成分間の相互作用は処理の全工程を通して安定でなくてはならない。

かかる基の具体例としては、ビオチンーアビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、並びにシスティン−チオール基がある。

官能基ＡのベクターＤＮＡへの導入は、官能部位が影響を受けないように行わなくＣはならない。かかる結合用官能基の具体例としては＋１−ビオチン−ｄｌ、：Ｔｉ効＜ある。

ベクターは線状化しなくてはならないが、これは適切な制限酵素、例えばＢｓｔＥｎ、Ｂｇｌ　ＩＩ　（プラスミドｐ　Ｉｔ　Ｉ　７２　’ｌ　）又はＮｏ＋　 ’ｉ　（ｐＲＩ７２８）などで行うことができる。ラムダ又はコスミドベクターを用いると、ＣＯ１部位を認識し切断するノアージ特異的酵素でベクターを線状化することが可能となり、制限酵素を使用しなくてすむ。

線状化後の５′末端がはみ出していれば、官能基の組込みはフレノウ、Ｔ７又は逆転写酵素（ファルマシア（Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ）、スウェーデン）などのＤＮＡポリメラーゼで１幸成することができる。官能基に共に合成した適当なオリゴヌク１．・オチドで連結するごとによって官能基をベクター中に組込むことも可能である。

Ｋ、Ｊ定住−ｆロセスは従来通りの方法で行うことができ、適当な媒質中でスラリーとした前記物質結合担体を用いろ・くソチか式で行一つでも活性化担体カラム上で行ってもよい。従来の担体＋Ａ料（ビーズなど、例えばセファロース・ビーズ（ファルマシア））、フィルター、キャピラリー、又はプラスチック討量棒（例えばポリスチレン・ストリップ）と微量滴定用ウェルで今回の目的のために前３己物質が十分に結合し得るもの、を使用できる。官能基をかかる担体材料に結合又は固定化する方法は周知であり、本明細書中で詳細に説明するまでもないことである。被覆手段とし７て微量漉定用ウェル表面への前記物質の吸着を用いることも可能である。担体材料からの非結合ＤＮＡ鎖の解離又は融解は、０．１５Ｍ　Ｎａ１ｌ（又は温度上昇などの従来の方法で達成し得る。融解条件の選択は、当然のことながら、特定官能基−物質間の相互作用のみならず担体材料の選択とに鑑みて行わなくてはならない。

本発明の方法において重要な最初の段階は、従ってＤＮＡ配列決定に適した固定化・−重鎮組換えＤＮＡ断片を供することである。かかる手順についての例を第１図に図説的に概説した。

概略を述べると、目的ＤＮＡを配列決定用ベクターのマルチリンカ−領域中にクローン化する。プラスミドを制限酵素で線状化し、かつはみ出した部分を１種類又は複数種のデオキシヌクレオチドを用いて埋める、ただし上記デオキシヌクレオチドのうち少くとも１種類は官能基を含む誘導体としたものである。二つ目の制限酵素で切断した後、混合物を、上記官能基に対して親和性を有する物質を含んだ固体担体に接触させる。こうすることによって、上記官能基を含むＤＮＡ断片の特異的固定化が起こる。−重鎖ＤＮＡは、アルカリ処理又は温度処理のいずれかによって鎖を融解し、かつ同時に非官能鎖を溶出することによって得られる。得られた固定化−重鎖鋳型に普遍的配列決定用プライマー　（ｇｅｎｅｒａｌｔｅＨｅｎｃｉｎｇ　ｐａｉｎｅｄ）をアニールし、標準的条件下（サンガー（Ｓａｎｇｅ＋）他（１９７７））で配列決定反応を行う。この伸長オリゴヌクレオチドは様々な手段で、とりわけ同位体又は蛍光で、ラベルするこ乏ができ、これらの同位体又は蛍光は伸長反応の間にもしくは標識プライマーとし５て導入する。新たに合成した標識オリゴヌクレオチドは別の融解段階で溶出するが、鋳型はそのまま残って次の配列決定反応に利用できる。アニ・−リング及び伸長反応を繰返して４種のヌクレオチド全部について特異的な断片を得、この４つの試料を配列決定用ゲルに乗せる。

本発明の別の有用な要素は、かつ断片の一方の端にビオチンを持ちもう一方の端に配列決定用プラ・イマーに相補的なオリゴヌクレオチドを持つ様々な長さのＤＮＡ断片を得るためのビオチン化オリゴヌクレオチドと部分的制限酵素切断反応とを用いた、配列決定用の鋳型の提供である。かかる手順についての例を第２図に図説的に概説した。

概略を述べると、目的ＤＮＡを配列決定用ベクターのマルチリンカ−領域中にクローン化する。プラスミドをＳｌｉ　Ｔで線状化し、Ｓａｐ　ａＡで部分的に切断して様々な長さの断片を得る。このＤＮＡフラグメントに２種類の普遍的オリゴヌクレオチドＳｌｉ　Ｉ及びＳａｕ　３Ａを連結する。

Ｓｌｉ　Ｔによって認識される側の突出端に連結するオリゴヌクレオチドは官能基を有しており、またＳａｕ　３Ａ突出端に連結するオリゴヌクレオチドはプライマーとアニールする配列を含んでいる。混合物をアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、放射活性、蛍光又は他の方法を用いて上記Ｓｌｉ　！オリゴヌクレオチドを含む断片を視覚化する。視覚化されたバンドは、官能基を有するオリゴヌクレオチドを一端に、かつ特異的Ｓａｕ　３Ａ部位に組込まれたＳａｕ　３Ａオリゴヌクレオチドを別の一端に持つＤＮＡ断片を表している。これらの特異的バンドを別々にゲルから回収し、それ自体は公知の方法で溶出した後、上記官能基に親和性を有する物質を含む固体担体と接触させてＤＮＡを固定化する。配列決定は、固定化断片の３′末端に組込んだＳａｕ　３Ａオリゴヌクレオチドと相補的な普遍的配列決定用プライマー（ＧＳＰ　ｍ）を用いることを除いては、上記の方法（第１図）で行う。

この方法の利点は、大きな挿入部分（２０００塩基対より大）を直接的に配列決定でき、より小さな断片をサブクローニングする必要のないことである。上記５ＩｉＩ／Ｓａｐ　３Ａ系を、Ｔａｑ　Ｉ、Ｍｓｐ　Ｉ、）ｌｐａ　ＩＩなどの他の酵素で補充することも当然可能である。

配列決定用の固定化−重鎮ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅ＋ａｓｅ　ｃｈａｉｎ　＋ｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲと略す）法で作製してもよく、この方法で比較的少量の配列決定すべきＤＮＡ　（例えばゲノムＤＮＡ）を酵素的に著しく増幅することができ、この場合もまた修飾することによって固体担体上に固定化できる。ＰＣＲ法においては、増幅すべきＤＮＡのコード鎖及び非コード鎖の５′末端もしくはその付近の配列それぞれとハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを選択し、アニールした後にプライマーを目的ＤＮＡにハイブリダイズさせ、次に適当なポリメラーゼを用いて重合を行ってプライマーを組込んだコード鎖と非コード鎖それぞれのコピーを作り、その後、例えば９０℃で従来の融解を行うなどして鎖の分離を行う。合成に必要な４種類のヌクレオチドばかりでなく過剰のプライマーオリゴヌクレオチドを媒質中に含ませた場合は、分離した新しい鎖を元の鎖と共にそれ以降のアニーリング・重合・鎖分離サイクルの鋳型として役立てることができる。この手順を同周期も継続すると、目的ＤＮＡは指数関数的に増幅されるが、存在する他のＤＮＡは殆ど影響を受けない。最近、好熱性ポリメラーゼであるＴａｑ　Ｉが入手できるようになってきたが、このＴａｑ　Ｉは鎖の分離に必要とされる融解温度に耐え得るので、ＰＣＲ法で元々使用されていたフレノウポリメラーゼを用いる時のようにサイクルを繰返す度に加える必要はなくなる。

オリゴヌクレオチドプライマーの一つが粒子などの固体担体に結合している場合、より好ましくはビオチンのような固体担体に結合することのできる手段を保有する場合は、固定化手段を用いて増幅されたＤＮＡが生じる。

このようにして、ＰＣＲ法は、そのまま配列決定できる固定化−重鎖ＤＮＡを直接作ることができ、しかも制限酵素切断及びプラスミド精製を必要としない容易に自動化できる方法で細菌コロニーから上記ＤＮＡを直接生産し得る。本発明に係る如何なる反応においても、固体担体を使用する格別の利点は反応媒質からの分離が容易なことである。従って、ＰＣＲ段階では、反応媒質は洗浄によって容易に除去することができ、配列決定段階を開始するため異なるポリメラーゼ、例えばＴ７のような従来の配列決定用ポリメラーゼを最適緩衝液中に導入できる。

さらに、ヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチド濃度を、ＰＣＲ工程で用いた濃度とは無関係に、サンガー法による配列決定に関して最適な濃度に維持することができる。固定化ＤＮＡを厳密に洗浄できる可能性は、配列決定段階においてより再現性の高い結果をもたらす。

さらに、いわゆる「ウオーキング・プライマー（ｗａｌｋｉＢｐｒｉｍｅｒ）Ｊ法がサンガー配列決定法において容易となり、それによってプライマーを長いＤＮＡ分子の最初の５００塩基対の配列決定に使用することができ、洗浄後、この不変固定化ＤＮＡを（第１段階で得られた情報を利用して）次の５００塩基対の配列決定を開始するプライマーにアニールし、この手順をＤＮＡ分子全体の配列が決定されるまで続ける。

添付図面を参照しながら、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。

第１図は、ビオチン−アビジン系を用いた固相配列決定法の基本概念を図説したものである。酵素Ａ及びＢの選択に応じて、二つの断片が共に固定化されたりされなかったりすることに注意しなければならない。

第２図は、Ｓ！υ３Ａのような制限酵素で部分的に切断した後に得られる断片の配列を決定するためにビオチン化オリゴヌクレオチドを使用することの基本概念を図説したものである。

第３図は、配列決定用ベクターであるｐＲＩ７２７を示したものである。マルチリンカ−領域中のヌクレオチド配列と推定されるアミノ酸配列、並びにその両側の領域に挿入された合成リンカ−の配列を示した。略語は以下の通り：　ｂｌｍはβ−ラクタマーゼ遺伝子；　ｏｒｉは複製起点；ｆｌはファージｆ１の複製起点；　１ａｃ２’　はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の一部である。

第４図は、３２Ｐで末端をラベルしたビオチン化二重鎖ｐＲＩＴ２７の固定化に関する結果を示したものである。室温で３０分間インキュベートした後、Ｉｇｊのアビジンアガロースに結合した標識量を示した。

第５図は、固相配列決定法で得られた試料についての配列決定用ゲルのオートラジオグラフを示したものである。Ａは、伸長反応時に”５−ＩＡＴＰを用いてラベルした場合。Ｂは、３２ｐで末端をラベルした配列決定用プライマーを用いてラベルした場合である。−緒に示しであるのは、予想された配列である。

第６図は、配列決定用ベクターであるｐＲＩＴ２８である。

両側の領域ａ　−ｅに挿入された合成リンカ−のヌクレオチド配列を示した。略語は第３図の通りである。

以下、本発明の特定の具体的態様について詳細に説明酵素はファルマシア（スウェーデン）から入手し、使用法は供給元の勧めるところに従った。ＤＮＡ操作法は標準的手法（マニアチス（Ｍｘｎｉａｊ口）、１９８２年）に従った。

１１−ビオ−ｄＵＴＰはベテズダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｌｈｅｓｄｘ　Ｒｃｓ、　Ｌ＠ｂｓ、米国）から入手し、アビジン・アガロースはシグマ− ケミカル　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）からプラスミドｐＲＩ７２７の作製プラスミドｐ７２１８　（ファルマシアＡＢ、スウェーデン）をＢｇｌ　Ｉで部分消化し、合成オリゴヌクレオチド：５’　−ＣＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＣＣＧＡＴＡＴＣＧＡＡ−３’（及びその相補的配列）を挿入した。この合成フラグメントはＢｓ１ＸＩ　、　ＢｓｔＥｎ及びＥｃｏＲＶ認識配列を含んでいた。

挿入に用いたＢｇｌ　Ｉ認識配列は同時に破壊された。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）　ＲＲｌ　１５株（マニアチス他（１９８２））　ＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａ　１選択法を用いた場合（マニアチス他（１９８２１）　、ｌＩｃ２′遺伝子の最後の部分で読取り枠がずれたが、コロニーの色は青いままであった。ｐｓｓＩと名付けたこの作製物を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｍで消化し、合成オリゴヌクレオチド＝５’　−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＧＧＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＣＡ−３″を挿入した。上記ＥｃｏＲＩ及びＩＩ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ部位は従って破壊さ第１、一連のＳｆｉ　１．　ＥＣＱＲＩ、　ｐＨ１，）ＩｉｎｄＩ［［、Ｓｌｉ　１部位が生じた。−の挿入によってＩａｃ　Ｘ’遺伝子にフレームシフトが起こりコＯニーの色が青から白に変わった。この新しいＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ）ＩＴ認識ν列を用いてｍｐ　８マルチリンカ−を挿入し、こうすることによってｌａｃ　２’遺伝了の読取り枠を元の正しいものに戻して青色のコロニーに戻し、た。こうし、た後、５’−ＣＡＧＡＴＣＴＧへ３′リンカ−（カビゲン　（Ｋａｂｉｇｅｎ）、ス白エーデン）の挿入により、ｌａｃ　１’遺伝−ＦノーＪ−、流（７：１ＰＶＩ１１１部位をＢｇｌ　ｎ部位に変換ｊ７た。得られたプラスミドをｐＲＩ７２７と名付けた（第３図）。

ビＡヂン化二重鎖ＤＮＡの固定化Ｍ１３　ｍｐ　１Ｂのマルチリンカ−領域から誘導した挿入部を含むプラスこト ’ｐＲＩＴ２７をＢｓ＋ＥＨＰｉびＥｃｏＲＶで消化した。

１１−ビオ−ｄυＴＰ及び適当なｄＮＴＰ類を使用して、５′突出部分をタレノウポリメラーゼ（マニアチス他（１９８２））で埋めた。この物質をＧ−５０カラムに通し次にエタノール沈殿ｌ−で精製した。ＴＥ　（ＩＯｍＭｈリスｐＨ７，５，１ｒｎＭ　ＥＩＴＴ人）に再溶解し７た後、プラスミドをＥｃｏｌｉ　ｉで消化した。このビオナン化二重鎖ＤＮＡを、１ＭＮａＣ７とＴＥで洗浄して調製したアビジン・アガロースゲルと混合した。アビジン・７ガロースゲルＪ、ｂｌ当り約１ｐｇのプラスミド（前述のように処理）を固定化に使用した。混合したものを室温で約１時間穏やかに振盪した。

アビジン・アガロースの結合容量は飽和実験で決定した。アビジン・アガロースと混合するビオチン化標識プラスミドＤＮＡの量を増加させていき、固定化された標識物質の量を決定した。結果（第４図）は、アビジンアガロース１μｌ当り数１のＤＮＡが結合できることを実証しており、マトリックスの容量が大規模な配列決定反応を行い得る程十分高いことを示唆している。

固定化鋳型ＤＮＡを用いる配列決定反応固定化ビオチ：、ｌ化二重鎖ＤＮＡを３７℃で１５分間０１５ＭＮａＯＨとインキュベートすることによって一貫鎖形に変換した。鋳型ＤＮＡが固定化されたアビジン−アガロースゲルを続いて０．１５Ｍ　ＮａＯＨ及び水で洗浄した。３５Ｓ標識（ＩＡＴＰ及び３２ｐ末端標識プライマーを用いて配列決定反応を行〕た。いずれの場合も、１ｐ！アビジン・アガロースゲル上に固定化したＩＢプラスミドを、ＩＯ＋ＩＩＭ）リス−ＨＣＩ（ｐ）ｌ　７．５１．１０ｍＭ　ＭｇＣｌ１．１００　ｐｇ／ｍ！ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びＩＨｍＭ　ＮａＣ１を含む全量１０ｐｌの緩衝液中の等モル量のプライマーと混合した。この混合物を６０℃で１時間インキュベートし、室温まで冷却した。上清を除去し、上記の緩衝液に１１のＢＳＡ　（１ｍｇ／ｍｌ）と共に１ｕｔのタレノウポリメラーゼ及び各々５９ｔのヌクレオチド混合物を添加した。ただし、３５Ｓプロトコルの場合は０．５ｐｌの”５−ｄＡＴＰ　（＋２．５βＣｉ／ａｌ）も添加した。いずれの場合も、全員で１０μｌの反応混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。

３５Ｓプロトコルに対しては、以下のヌクレオチド混合物を使用した。

Ａ混合物＝６２５μＭ　ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ。

２５１１Ｍ　ｄｄＡＴＰＣ混合物：８３ＭＭ　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ、　４ＢＭ　ｄｃＴＰ。

５ｈＭ　ｄｄｃＴＰＣ混合物・８３ＭＭ　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ、　４．Ｍ　ｄＧＴＰ。

１５０＋＋Ｍ　ｄｄＧＴＰ ■混合物：　８３．Ｍ　ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、　４μＭ　ｄＴＴＰ。

１２５ＩＩＭ　ｄｄＴＴＰ３２ｐ標識プライマーに対しては、以下のヌクレオチド混合物を使用した。

Ａ　〆昆合物　二　ｇ３ｐＭ　ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ；　４ＢＭ　ｄＡＴＰ、ＳｈＭ　ｄｄＡＴＰＣ混合物　８３ＭＭ　ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；　４ｘＭ　ｄｃＴＰ；５ｈＭ　ｄｄＣＴＰＣ混合物：　８３ｇＭ　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ；　４ａＭ　ｄＧＴＰ；５０ＭＭ　ｔｌｄＧＴＰ ■混合物・８３ＭＭ　ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、４ａＭ　ｄＴＴＰ：５０ＭＭ　ｄｄＨＰ反応終了後に上清を除去して、ゲルを水で徹底的に洗浄した。新たに合成したオリゴヌクレオチドを＋０４（の０．１５Ｍ　ＮａＯＨで溶出し、この溶出液を１．２５Ｍの酢酸で中和した。試料をエタノール沈殿して５μｌのＴＥで再び溶解した。２ａｌの画分を２ａｌのホルムアミド／色素混合液と混合して沸騰水中で３分間加熱し、６９６ポリアクリルアミド配列決定用ゲルに乗せた。鋳型ＤＮＡを固定化した上記アビジン・アガロースゲルは０．１５Ｍ　ＮａＯＨ及び水で徹底的に洗浄して再生した。

標識デオキシヌクｌノオチドを使用した固相配列決定伸長反応時に３５８で特異的フラグメントを標識するというプロトコルを用いて、配列決定反応を行った。

上記標準ヌクレオチドの他に３５８標識ｄＡ丁Ｐ及びジデオキシヌクレオチドのうちの１種類を含有するヌクレオチド混合物を使用した。この実験及び以下の実験では、Ｍ１３ｍｐ　Ｉｌｌのマルチリンカ−領域から誘導した挿入部を含むｐＲＩ７２７から成るプラスミドを使用した。

１ｐｌのアビジン拳アガロースを固定化するのにこのプラスミド約１１１ｇを使用し、続く鎖特異的溶出を前述の通りに行った。マルチリンカ−領域の直ぐ下流にある領域と相補的なＲＩＴプライマー（オルソン　（Ｏｌｓｏｎ）他（１９８６））を使用して伸長反応を開始させた。等モル量の固定化−重鎖ＤＮＡとＲＩＴプライマーとを混合して、６０℃で１時間インキュベートして室温に冷却した。上清を除去し、全量で１０４１の適当なヌクレオチド混合物を用いてプライマー伸長反応を開始し、続いてチェイス　（ｃｈａｓｅ）反応（サンガー他（＋９７７１）によってジデオキシヌクレオチドで停止しないようにフラグメントを伸長させた。

反応終了後に上清を除去して、ゲルを水で徹底的に洗浄した。新たに合成したオリゴヌクレオチドを０．１５ＭＭａｉｌ（を用いて溶出し、溶出液を酢酸で中和した。−重鎮の鋳型を含むアフィニティーゲルを使用して、もう−回、プライマーアニーリングとその後の新しいジデオキシヌクレオチド混合物を用いる伸長反応を含んだ配列決定反応を行った。

４種類のジデオキシヌクレオチドすべてについて上記プロトコルに従い、溶出試料をエタノール沈殿して、配列決定用ゲルに乗せるに先立って上記ホルムアミド／色素混合液中に再溶解した。電気泳動で分離したＤＮＡフラグメントのオートラジオグラムを第５図Ａに示すが、この図には使用プラスミドの予想された配列も示しである。明瞭に読み取ることのできる配列が得られたが、この配列は予想された配列と良く一致している。配列の一番上の強いバンドは、固定化された鋳型の５′端のＥＣＯＲＩ部位のランオフ　（「ｕｎ　ｏＨ）転写物を表す。

末端標識プライマーでの固相配列決定伸長ＤＮＡフラグメントをラベルするのに３２ｐ末端標識ＲＩＴプライマーを使用して、採用し得る別の方策についても試験した。同様のプロトコルを用いたが、ただしヌクレオチド混合物は適切に調整した（その詳細については材料及び方法の項を参照）。様々なモル比の固定化鋳型とプライマーについて試験した。等モル量の鋳型とプライマー（第５図Ｂ）は、明瞭にかつ容易に読み取ることのできるオートラジオグラムを与える。同様の結果が他のプライマー／鋳型の比についても得られたが（データはここには示していない）、このことはパターンに重大な影響を与えずにこの比を変化させることができることを示唆している。

第５図に示した結果は、ビオチン−アビジン系を用いた固相ＤＮＡ配列決定に第１図にその概略を示した方策が使用できることを実証している。

プラスミドｐｓｓｌ　（上記参照）をＰｖｕ　ＩＩで部分的に消化し、合成ヌクレオチドリンカー：５’　−ＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＣＡＧ＾丁ＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧ−３’（及びその相補的配列）を挿入した。このフラグメントはＳｌｉ　ＩＳＢｇｌ　ＩＩ、ＥｃｏＢ及びＮｏｔ　Ｉ認識配列を含んでいた。挿入に用いたＰｖｏ　ｎ認識部位は同時に破壊された。

得られたプラスミドをｐＲＩ７２８　（第６図）と名付けたが、このプラスミドは第２図に概略を示した方法を用いた固相配列決定法に適している。

線状化ｐＲＩ７２８への特異的オリゴヌクレオチドの連結第２図に概略を示した方法において重要な段階は、３′突出端（Ｓｌｉ　Ｉ　５ＢｓｊＮ１等）及び５ ′突出端（Ｓａｕ　３Ａ。

Ｔａｑ　Ｉ等）を与える酵素で線状化したプラスミドＤＮＡへの特異的オリゴヌクレオチドの連結である。連結効率を調べるため、２種類の合成オリゴヌクレオチドを合成してＳｌｉ　Ｉ又はＢａｍ旧で切断したｐＲＩ７２８に連結した。

合成Ｈｉ　Ｉオリゴヌクレオチド（５’−ＴＧＡＴＣＡＧＧＧ−３”）はＳｌｉ　Ｉで切断した後のｐＲＩ７２８の鎖の一つとその３′末端で相補的であり、一方合成りａｍ　Ｉｌｌオリゴヌクレオチド（５゛−ＧＡＴＣＡＧＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＡＴＴＡＧ−３’　）はＳａｎ　３＾、Ｂａｍ　Ｈｌ等で切断したＤＮＡの５′突出端とその５′末端で相補的である。

各オリゴヌクレオチドのｐＲＩ７２８への連結の効率を調べるため、連結前と連結後の連結混合物を１％アガロースゲル電気泳動で分析した。ＤＮＡベクターへのオリゴヌクレオチドの導入が成功するとプラスミド間でさらに連結が起こるかもしくはプラスミドの環状化が起こる。これは、連結混合物のアガロースゲルのパターンを比較することによって観察することができる。

合成Ｓｘｕ　３Ａオリゴヌクレオチド（５’　−ＧＡＴＴＡＣＴＴＴＧＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＡＧ−３’　）を、５０ｍＭ）リス　ｆｐＲ８）、５０ｍＭ　ＭｇＣ１，，１００ｍＭジチオトレイトール　（ＤＴＴ）及びｌ０ｍＭ　ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。５００ｎｇのｐＲＩＴ２８をＢａｍ旧で消化し、約１５０ｎｇのリン酸化オリゴヌクレオチドと混合した。この混合物を、４０ｍＭ　トリス　（ｐＨ７，４）、ｌ０ｍＭ　ＭｇＣＪ、、１．　ＯｍＭ　ＤＴＴ及び０、２ｍＭ　ＡＴＰを含む緩衝液及びリガーゼと共に１４℃で一晩インキユベートした。インキュベート後、この混合物を１％アガロースゲルに乗せた。

アガロースゲル電気泳動の結果を、線状化プラスミドとして分離したベクターの相対量を示［７た表１にまとめた。

表１Ｂａｍ旧又はＳｌｉ　Ｉで切断した後、Ｓｌａ　３＾オリゴヌクレオチド又はＨｉ　Ｉオリゴヌクレオチドで連結する前後で、１％アガロースゲル電気泳動で決定した線状化プラスミドｐＲＩ７２８の相対量酵素　連結　オリゴ　連結切断　前　ヌクレ　Ｓｌｉ　Ｉオリゴ　Ｓａｕ　３Ａオリゴオチド無　ヌクレオチド　ヌクレオチドＢａｍ旧　＋００　５　５　９５ＳｆｉＩＩ００　５　９５　５上記の結果は、５ＩｉＩオリゴヌクレオチド及びＳａｕ　３ＡオリゴヌクレオチドがそれぞれＳｌｉ　Ｉ及びＢａｍ旧で切断したｐＲＩ７２８と効率的に連結することを示している。このことは、Ｓｌｉ　Ｔ及びＢｒｍ　Ｈｌによって生じた部位に上記オリゴヌクレオチドが効率的かつ特異的に導入されることを実証したものである。

ビオチンによるアビジンへの固定化の前に目的とする配列をＰＣＲ法で増幅したことを除いては、第１図にその概略を示した概念を用いて固相配列決定を行った。合成ヒトプロインシュリン遺伝子断片を含むプラスミドｐｔｔ＋ｒ２７をＥ、ｃｏｌｉ　ＲＲＩ　Ｍ１５株中に形質転換し、寒天培地中に植えた。滅菌したパスツールピペットで単一コロニーを採取し、５７ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨＩＯ，ＯＱＬ　１６．６ｍＭ　（ＮＨ，）ｔｓＯｔ。

６．７ｍＭ　ＩＡｇｃＪ＋、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール及び１７０　ｐｇ／ｍ１ＢｓＡから成るＰＣＲ緩衝液１０ｐｌ中に懸濁した。試料を９５℃に５分間加熱し、室温に冷却した後、１０倍のＰＣＲ緩衝液（ｐＨ７，０）　ｌａｌを添加して中和した。

マルチリンカ−領域の上流及び下流の領域とそれぞれ相補的な２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、（ビオチン−ＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡ人ＴＴＴＡＡＴＡＣ−３’　）及び（５’　−ＴＴＣＧＡＴＡＴＣＧＧＴＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＣＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧ−３’　）を用いてＰＣＲを行った。上流プライマーは製造業者（ファルマシア、スウェーデン）の説明にある通り５′末端がビオチン化されている。

反応混合物（＋００　ＤＩ’）は上記ＰＣＲ緩衝液（ｐＨ８，８）　。

各々１ａＭのプライマー、各々２０ｈＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ及び上記１０μｌの溶菌試料から成っていた。２ユニツトのＴａｑ　Ｉ−ポリメラーゼ（アマ−ジャム（人ｍ！＋ｔｂａｍ）、英国）を添加し、テクネ（Ｔｅｃｈｎｔ）プログラム可能Ｄ＋１−ＢｌＯｃｋＰＨＣ−１（テクネ、英国）を使用して温度周回反応を行った。各サイクルは、９２℃で１分間の熱変性段階、続いて５０℃で２分間のＤＮＡへのプライマーのアニーリング、及び７２℃で１分間の丁ａｑＩ−ポリメラーゼによるＤ　Ｎ　Ａ鎖伸長反応を含んでいた。反応混合物をパラフィン油滴で覆った。２０サイクル後に、混合物に２ｈｌのアビジンアガロース（例１に記載のもの）を添加した。上清を除去ｌ１、固定化した二重鎖ＤＮＡを０．１５ｋｔ　Ｎａ０１１と共に３７℃で１５分間インキュベートすることによって一重鎖形に変換した。鋳型ＤＮＡを固定化したアビジンアガロースを次に０．１５Ｍ　Ｎａ０）１及びＴＥ緩衝液で洗浄した。

配列決定反応は、マルチリンカ−領域の直ぐ下流の領域と相補的で蛍光で末端を標識した配列決定用プライマー（５’　−ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’　）を用いて行った。

２ピコモルの配列決定用プライマーを、ｌＯｍＭ）リス−ＨＣ１ｃｐｏ　７．５）　、ｌ０ｍＭ　ＭｇＣＪ＋、１００　ｊｇ／ｍｌ　ＢＳＡ及び１００　ｍＭＮａＣＩ　を含む全量１ｈＪの緩衝液中の鋳型ＤＮＡ固定化アビジンアガロースと混合した。このアニーリング混合物を６５℃に加熱して室温に冷却した。１ｕＪのＤＴＴ／ＮａＣｊ混合物（０，８Ｍ　ＮａＣｌ／（１，ＩＭ　ＤＴＴ）及び４ユニツトのＴ７−ポリメラーゼ（ファルマシア、スウェーデン）を添加して容積を１５１１Ｊに調整した。この混合物の３．５ｕＪ等量を２．５１１の各ヌクレオチド混合物と混合して３７℃で１０分間インキュベートした。以下のヌクレオチド混合物を使用した：各々８ｒＤＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ、各々の混合物に付き６ＪｇＭずつの　ｄｄＮＴＰ、５０ｍＭのＮａＣｌ及び４０ＩＩＩＭトリスーＨＣＪ（ｐＨ７，５）。伸長反応終了時に各々の反応の上清を除去して、アビジンアガロースを水で洗浄した。新たに合成したオリゴヌクレオチドを、ｌ０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐ）１７．５）を含む脱イオン化ホルムアミドから成るホルムアミド／色素混合液３ｐＩを用いて溶出した。３７℃ で１５分間インキュベートした後、上清を除去しａｐｌの水で稀釈した。この約２ｐｉを、電気泳動の間に蛍光を検出するように組み立てた自動配列決定装置（アンツルシュ他）に乗せた。２０ａｎの分離長で７％ポリアクリルアミドゲルを用いて配列決定操作を行ったところ明瞭な結果が得られた。この例は、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼと蛍光プライマーとを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡの配列決定に関して、固相配列決定法を使用できることを説明したものである。

スタフィロコッカス・オーレウス５ＡＩ１３株（Ｓｌａｐｈｙ−１ｏｃｏｃｃｏｓ　ａｏ＋ｅｕｓ　５ＡＩ１３）株をＴＢＡＢプレート上で単一コロニー七して生育させた。滅菌したパスツールピペットで単一コロニーを採取し、６７ｍＭ）リス−〇ＣＩ　（ｐＨ１０，００）。

１６．６ｍＭ　（ＮＨｌ）＋ＳＯｉ、６．７ｍＭ　ＭｇＣｌ＋、ｌｏｍＭβ−メルカプトエタノール及び１７０μｓ／ｍｌ　ＢＳＡから成るＰＣＲ緩衝液１０μ ！中に懸濁した。試料を９５℃に５分間加熱して溶菌させ、室温に冷却した後で１０倍のＰＣＲ緩衝液（ｐＨ７，０）　１．　ｐｉを添加して中和した。

スタフィロコッカスのプロティンＡ遺伝子と相補的な２種類のオリゴヌクレオチドブライマーを用いてＰＣＲを行、った。片方のプライマーは５゛末端がビオチン化されており（ビオチン−＾＾ＴＡＧＣＧＴＧＡＴＴＴＴＧＣＧＧＴ−３’　）　、二番目のプライマーはＤＮＡ鋳型と相補的でない特異的ハンドル配列（ｂａｎｄｌｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）を５′末端に含んでおり、このハンドル配列はプライマーアニーリング配列を生ずる。

反応混合物（１００μｌ）は、上記ＰＣＲ緩衝液（ｐＨ８，８）、各々１ｊＭのプライマー、各々　２０ｈＭのｄＡＴＰ、（ＩｃＴＰ、ｄＧＴＰ及び［ＴＰ、及び上記１０μＩの溶菌試料から成っていた。２ユニツトのＴａｑ　Ｉ−ポリメラーゼ（アマ−ジャム、英国）を添加し、テクネ・プログラム可能Ｄ＋１−Ｂｌｏｃｋ　ＰＨＣ−１（テクネ、英国）を使用して温度周回反応を行った。各サイクルは、９２℃で１分間の熱変性段階、続いて５０℃で２分間のＤＮＡへのプライマーのアニーリング、及び７２℃で１分間のＴａｑ　Ｉ−ポリメラーゼによるＤＮＡ鎖伸長反応を含んでいた。反応混合物をパラフィン油滴で覆った。

アセトン中で２分間紫外線照射することによって、ポリスチレン微量滴定用プレート（コスタ−（Ｃｏ１ｔａ「）、米国）を０．２Ｍグリシジルメタクリレート及び２Ｍベンゾフェノンで表面グラフトした（オールマー（Ｋ、　ＡＩ＋＋ｅ＋）他、ポリマー・ケミストリー　（Ｐｏｌｙ＋ｎｅ＋　ＣｈｅｍｉｓｔＢ）第２６巻。

１９８８、　２０９９−２＋１０頁）。全量で１０μＩのＴＥ緩衝液中の２５ｊ！のストレプトアビジン（アマ−ジャム、英国）を各ウェルに入れて、微量滴定用プレートを４２℃で一晩インキユベートした。上清を除去した後、ウェルを全量でｌｏｗ（のＴＥ緩衝液中］　００　ｍｇ　／　ｍｌのＢＳＡと共に４２℃で一晩インキユベートした。上清を除去し、次にウェルを１倍のＴＥで洗浄した。

２０サイクルの温度反応を行った後、１０μｌの上記混合物を、上述の通り予備処理した４つの微量滴定ウェルのそれぞれに加えた。１５分後に上清を除去してウェルをＨ，。

で洗浄した。固定化二重！ｌＤＮＡを１５ｊｌ）０．１５Ｍ　Ｎａ０１（ト共に３７℃でインキュベートすることによって一重鎖形に変換した。鋳型ＤＮＡの固定化されたウェルを続いて０．１５Ｍ　ＮＩＯ＋（及びＴＥ緩衝液で洗浄した。

配列決定反応は、マルチリンカ−領域の直ぐ下流の領域と相補的で３２ｐで末端を標識した配列決定用プライマー（５’−ＧＴＡ＾＾＾ＣＧＧＣＣＡＧＴ−３” ）を用いて行った。２ピコモルの配列決定用プライマーを、１０ｍＭ）リス−＋１ｃＪ　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　Ｍｇｃｌ＋、　２Ｈａｇ／ｍｌ　ＢＳＡ及び１００　ｍＭ　ＮａＣｊを含む全量１０ｕｌの緩衝液中の鋳型ＤＮＡ固定化アビジンアガロースと混合した。このアニーリング混合物を６５℃に加熱して室温に冷却した。

上清を除去して、４．２μＩのヌクレオチド混合物（下記参照）を２ｐｌのＤＴＴ／ＮａＣＪ混合物（０，０３Ｍ　ＤＴＴｌｏ、　２５＋ｎＭＮＩＣｌ　）並びに、ｌ０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、ｌＯｍＭＭｇＣ’Ｉｎ　２００　Ｎ／　ｍｌ　ＢＳＡ及び１００　ｍＭ　ＮｌＣｌ　から成る緩衝液中の１ユニツトのＴ７−ポリメラーゼ（ファルマシア、スウェーデン）と共に添加した。溶液をｌＯμＩに調整してこの微量滴定用プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。

以下のヌクレオチド混合物を使用した：各々８０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ、各々の混合物に付き６．３ＪＭずつのｄｄＮＴＰ、　５０ｍＭのＮａＣＪ及び４０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）。

伸長反応終了後、上清を除去して微量滴定用ウェルをＨ，Ｏで洗浄した。新たに合成したオリゴヌクレオチドを、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）、　０．３％（Ｗ／Ｗ）キシランシアツールＦＦ（！７１ｉｎ　ｃＨｎｏｌ　ＦＦ）及び０．３％ｆｔ／ｗ）ブロムフェノールブルーを含む脱イオン化ホルムアミドから成るホルムアミド／配列決定用色素混合液３ｐｌを用いて溶離した。３７℃で１５分間インキュベートした後、上清を除去し３μＩのＨ，０で稀釈した。

この約’２ｒｌを配列決定用ゲルに乗せたところ、得られたオートラジオグラムはスタフィロコッカス遺伝子断片の明瞭な配列を示した。この例は、ＰＣＲ法を用いるゲノムＤＮＡの直接的配列決定に固相配列決定法を使用できることを説明したものである。この例はまた、ストレプトアビジンを共有結合したプラスチック微量滴定用ウェルを固体担体として使用できることを説明したものである。

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ロバートソン　ｆＲｏｂｅｒ口ｏＩｌ、Ｃ，Ｗ、　）、ザグルスキイ（２ａｇｕｒｓｋ７．　Ｒ，Ｊ、）、コクッザ　（Ｃｏｅｕｒｒａ、＾、１．）、ジャンセン（Ｉｅｎｓｅｎ、　Ｍ、Ａ、）及びバウマイスタ−（Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ。

Ｋ）、（１９８７）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２３８巻３３６−３４１頁ローゼンタール　（Ｒｏｓｅｎ＋ｂｘｌ）他、（１９８５）ニュークレイツク・アシッズ・リサーチ第１３巻＋１７３−１１８４頁サンガー（Ｓｘｎｇｅ＋、　Ｆ、　）、　＋＋−ｔケルン　（Ｎｉｃｋｌｅｎ、　Ｓ、）及びクールソン（ＣＯＩＩＩＳＯＩＩ、　Ａ、Ｒ，）、（１９７７）プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンスＵ　Ｓ　Ａ　（Ｐ＋ｏｃ、　Ｎｔｔｌ、＾ｃｉｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）第７４巻５４６３−５４６７頁スミス　（Ｓｍ目り、Ｌ、）及びフッド（Ｈｏｏｄ、Ｌ、　）、（１９８７）バイオテクノロジー第５巻９３３−９３９頁スミス　（Ｓｍｉｔｂ、　１．、Ｍ、）、サンダース　（Ｓｉｎｄｅ＋５　」２．）、カイザー（にａｉｓｅ＋、Ｒ目）、ヒ、ｖ、　−（Ｉｌｕｇｈｓ、Ｐ、　）、トッド（Ｄｏｄｄ、Ｃ，）、コネル（Ｃｏｎｎｅｌ、Ｃ，Ｒ，）、バイナー（Ｈｅｉｎｅ＋。

Ｃ）、ケニ／ト（Ｋ＋ｎｌ、Ｓ、［１，ｌｌ、）及びフ・ソド（Ｈｏｏｄ、Ｌ、）。

（１９８６）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第３２１を６７４−６７９頁＋７ダ（Ｗａｄａ、八）ヤ＜モト（Ｙａ＋ｎａｍｏｌｏ、Ｍ）ソｘダ（Ｓｏｅｄａ、Ｅ、　１．　（１９８３）Ｒｅｖ、Ｓｋｉ、Ｉｎ＋ｔ＋ｏ　第５４巻　１５６クー１５７２葭１キ入５ｆＯ−７’Ｉ−）”　↓　ｆｋｎｈ乙うづ１用Ａ＜ｖ−ｔｃｓｐ　：：ｌ１ｌｌｑ７’；−＋１７２”補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成２年　９月２１日

Claims

【特許請求の範囲】１　目的とするＤＮＡの配列を決定する方法にして、該ＤＮＡを固体担体上に固定化した一重鎖形で供し、次いで配列決定に付す方法。２　請求項１記載の方法において、前記二重鎖形の目的ＤＮＡをその２本の鎖のうちの片方を通して固体担体に固定化し、次いで鎖分離に付して未結合鎖を除去する方法。３　請求項１又は請求項２記載の方法において、鎖分離を融解によって実施する方法。４　請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法において、官能基を前記二重鎖形の目的ＤＮＡの片方の鎖の一方の端にのみ導入する方法。５　請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法において、前記二重鎖形の目的ＤＮＡを含むプラスミドを該目的ＤＮＡ配列以外の１つの制限部位で切断し、少くとも一方の端に官能基を導入して片方の鎖にのみ結合させ、この官能化ＤＮＡもまた該目的ＤＮＡ配列以外の別の制限部位で切断し、かつ所望の官能化目的ＤＮＡを該官能基に対して親和性を有する物質を保有する固体担体と接触させる方法。６　請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法において、前記二重鎖形の目的ＤＮＡを含むプラスミドを該目的ＤＮＡ配列以外の１つの制限部位並びに該配列内の１又はそれ以上の制限部位で切断し、少くとも配列決定すべき目的ＤＮＡ鎖の両端に複数のオリゴヌクレオチドを連結し、該オリゴヌクレオチドの１つが固体担体に結合し得る官能基を保有しかつ他方のオリゴヌクレオチドが普遍配列決定用プライマーにハイプリダイズし得るものである方法。７　請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法において、固体担体に結合した又は固体担体に結合する手段を保有する少くとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって固定化一重鎖ＤＮＡを作る方法。８　請求項７記載の方法において、ポリメラーゼ連鎖反応によるゲノムＤＮＡの増幅により固定化一重鎖ＤＮＡを作る方法。９　請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法において、前記配列決定をマクサムーギルバート法で実施する方法。１０　請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法において、前記配列決定をサンガー法で実施する方法。１１　請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法において、前記官能基がビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、又はチオール基であり、かつ前記固体担体がこれらの官能基に結合する基を保有する方法。１２　請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法において、前記固体担体が粒子状又は微量滴定用ウェルである方法。