JPH02222677A

JPH02222677A - ブリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびその製造法

Info

Publication number: JPH02222677A
Application number: JP4020889A
Authority: JP
Inventors: Nobuaki Hori; 堀　伸明; Mutsumi Watanabe; 睦渡辺; Kenji Sunakawa; 砂川　憲二; Yoichi Mikami; 三上　洋一; Kyoko Uehara; 上原　京子
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1989-02-22
Filing date: 1989-02-22
Publication date: 1990-09-05
Anticipated expiration: 2011-10-30
Also published as: JP2548356B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は新規なプリンヌクレオシドホスホリラーゼおよ
びその製造法に関する。

（従来の技術）これまでに、プリンヌクレオシドポスホリラーゼに関す
る報告は次のようなものがある。

１、Ｊ、Ｄ、５ｔｏｅｃｋｌｅｒ、Ｃ，Ｃａｍｂｏｒ　
　ａｎｄ　　Ｒ，Ｅ、Ｐａｒｋｓ、Ｊｒ、、［３ｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ−，１９，１０２（１９２、Ｔ、Ｕ、
Ｕｔａｇａｗａ、Ｈ，Ｍａｒ　ｉ　ｓａｗａ、Ｓ、Ｙａ
ｍａｎａｋａ、Ａ、Ｙａｍａｚａｋｉ　　ａｎｄ　　１
Ｙ、Ｈｆｒｏｓｅ、、Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、５０．１２１　（１９８６）３
、Ｙ、Ｍａｃｈｉｄａ　　ａｎｄ　　Ｔ、Ｎａｋａｎｉ
ｓｈｉ、、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

、４５，１８０１．＜１９８１＞（発明が解決しようとする課題）前述のプリンヌクレオシドホスホリラーゼは耐熱性が低
いものであった。

本発明者らはこれまでに知られているプリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼより、耐熱性にすぐれ、反応速度が速
い新規な酵素を提供することを目的として、鋭意研究を
進めた。

（問題点を解決するための手段）本発明のプリンヌクレオシドボスホリラーゼは以下の性
質を有する。

■作用ニブリンヌクレオシド　＋　Ｐｉ４＼＝−ｍ− 塩基　士　リボース−１−リン酸 ■基質特異性：アデニン、アデノシン以外のプリン系ヌ
クレオシドと塩基に対して作用する。

■至適１）　Ｈおよび安定ｐＨ至適ｐＨはｐＨ７〜１１．５ｐＨ７〜１０において８０℃の処理を３０分しても失活
しない。

■至適温度および作用適温の範囲至適温度は８０℃ ｐＨ７，０において５０〜８０℃では６０分処理をして
も安定ｐＨ７，０，８０℃における半減期は１６時間（５）：ｐＨ、温度などによる失活の条件：ＰＨ７，０
，９０℃で処理しなとき２０分で失活する。

■阻害、活性化および安定化特別な活性化剤や安定化剤を必要としない。

塩化第二水銀、パラクロロメルクリベンゾエイトにより
阻害を受ける。

■分子量：　６８０００　（ＴＳＫゲルＧ−３０００Ｓ
Ｗによるゲルｒ過法） ■サブユニットの分子量３４０００　（ＳＤＳ電気泳動法）本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼは至適ｐＨ
および安定ｐＨ，至適温度および作用適温の範囲におい
て、これまでに知られているものと性質を異にしている
。

次に本発明の酵素の製造法について説明する。

本発明において用いられる該酵素生産菌の好ましい例と
して本発明者らによって土壌中より分離されたバチルス
・ステアロサーモフィルスＪＴＳ８５９がある。この菌
株は、通商産業省工業技術院微生物工業研究所に寄託さ
れており、その寄託番号は、微工研藷寄第９６６６号（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−９６６６）である。

この菌株の菌学的性質をパージエイズ・マニュアル第２
巻に準じて検討した結果を以下に示す。

■、形態桿菌：５．４〜６．５μｍＸ０．７〜０．９μ　ｍ楕円形の胞子形成：　２．０〜２．３μｍＸ　１　。

１〜１．２μｍ、ｌ細胞に１個、位置は末端２、培養的性質ＮＢ培地：６２℃、２日間培養平板上：白色５かに黄色を含む、光沢あり、不透明、盛
り上がらない、コロニーの形は円形波状スラント上：白色僅かに黄色を含む、光沢あり、不透明
、盛り−Ｅがらない、生育は中程度３、生化学的性質１　グラム染色陽性２　嫌気的培養生育せず運動性オキシダーゼカタラーゼゼラチンの液化リドマスミルクＯＦテストｖ−Ｐテスｉ・グルコースからのガスの発生グルコースからの酸の産生アラビノースからの酸の産生マニトールからの酸の産生キシロースからの酸の産生サブロー培地での生育スラント液体あり、周毛陽性陽性液化能あり凝固させる醗酵タイプ陰性発生せず産生じた産生ぜず産生じた産生ぜず生育した生育した０１００１％リゾチーム下での生育　　　　　　生育せず０．０２％アザイド下での生育　　　　　　生育せず７％ＮａＣ１下での生育　　　　　　生育せず（２％まで生育した）カゼインの加水分解　　　分解能ありデンプンの加水分解　　　分解能ありジヒドロキシアセトンの生成　　　　　　　生成せずエラグヨーク試験　　　　生育せずクエン酸の利用　　　　　陰性インドールの産生　　　　陰性ウレアーゼ活性　　　　　陽性フェニルアラニンの脱アミノ化　　　　　陰性アルギニンデヒドロラーゼ活性　　　　　　陽性チロシンの分解　　　　　陰性２９　レバン産生　　　　　　　陰性３０　硝酸塩の還元　　　　　　陽性３１　　ｉｉ酸ナトリウムの脱窒能　　　　　　　　陰性３２　硫化水素の生成　　　　　陽性３３　無ａｌ窒素源の利用ＮＯｌを唯一の窒素源として　　　生育したＮＨ，を唯一の窒素源として　　　生育した３４　　ＧＣ含量　　　　　　　　４７．３％３５　生
育温度　　　　４０〜７１℃で生育最適　６０〜６８℃ ３６　　ＰＨ範囲　　　　ｐＨ５，７〜８．５最適ｐＨ
６，０・〜７．０以上の性質に基づき、本株菌はバチルス・ステアロサー
モフィルスと同定される。

上記株菌の培養に際しては、窒素源として、トリプトン
、ペプトンまたはカザミノ酸を、炭素源としてグルコー
スまたはシュークロースを含み、さらに酵母エキスと塩
化ナトリウムを含む培地を用いる。培養は６０〜６５℃
、１８０〜２２Ｏｒｐｍで振どう培養するか、通気攪拌
培養により行う。

本発明における使用菌としては、バチルス・ステアロサ
ーモフィルスＪＴＳ８５９だけでなく、バチルス属に属
する前記した機能を持つプリンヌクレオシドホスホリラ
ーゼを生産する微生物であればすべて用いることができ
る。

培養物よりプリンヌクレオシドホスホリラーゼの採取は
、次のようにして行う、集菌した菌体を破壊した後、熱
処理、アセトン処理、ｐＨ処理を順次はどこし、ついで
ＤＥＡＥ　（ジエチルアミノエチル）陽イオン樹脂カラ
ム、ＣＭ（カルボメトキシ）陰イオン樹脂カラム、ブチ
ル基疎水クロマトカラム、フェニル基疎水クロマトカラ
ム、ヒドロキシアパタイトカラムおよびゲル濾過を行っ
て単離する。

本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼを用い、プ
リン塩基とリン酸とからプリンヌクレオシトを効率よく
製造することができる。以下、本発明の実施例を示し、
さらに詳しく説明する。

（実施例）（実施例１）バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａ
ｃｉ　ｌ　Ｉｕｓ、５ｔｅ）ＪＴＳ８５９の培養、集菌ペプトン２０ｇ、イーストエキス１０ｇ、グリコース３
ｇおよび水１１よりなるｐ）１６．０の培地を用いた。

この培地２Ｉにバチルス・ステアロサーモフィルスＪＴ
Ｓ８５９胞子３゜２Ｘ１０’個を添加し、撹拌Ｘ（直径
６０鴎、上下部各６枚）を有するジャーファメンターを
用い、撹拌翼を６８０　ｒｐｍで回転させつつ、通気量
１．５ｖｖｍ、培養温度６５℃、ｐＨ５，９〜６．２で
８時間培養した。

培養終了後、菌体を遠心分１Ｍ！（１００００ｇ。

４℃、１５分）により集菌した。

（実施例２）酵素の分離精製得られた湿菌１６０ｇを５００　ｍ　Ｍリン酸カリウム
（ｐＨ７，０，以下［Ｍ街液Ｊという）に懸濁し、ダイ
モミルで菌体を破壊した０Ｍ衡液を添加し、１４００　
ｍｌとした後、遠心分離（８３００ｇ、２０分）を行い
、上清１３００ｍｌを得た。沈澱物は５００　ｍｌの緩
衝液で懸濁し、ダイモミルで５分間処理した８Ｍ衡液を
添加し、１０１０３Ｏとした後、遠心分離（８３００ｇ
、２０分）を行い、上清９９０ｍ１を得た。この上清９
９０ｍ１を先の上清１３００ｍｌ’と合わせ、６３℃で
１時Ｉ７１！！やかに攪拌した。ついで、遠心分離（８
３００ｇ、４０分）を行い、上清２１３０ｍ１を得た。

熱処理をした上清２１３０ｍ１にアセトン２００ｍ１と
緩衝液２００ｍ１の一１０℃溶液を添加した。

さらに、−１０℃のアセトン１．８Ｎを加え、５〜１０
℃で１５分間攪拌した。つぎに、遠心分離（９０００ｇ
、５分）を行なった。得られた上清に一１０℃のアセト
ン２．５Ｊを添加し１５分間攪拌した後、遠心分離（９
０００ｇ、５分）を行ない沈澱物を得た。この沈澱物を
８００ｍ１の緩衝液に懸濁させアセトン処理済み酵素液
８５０ｍ１を得た。

アセトン処理済みＩ９素液８５０ｍ１に１Ｍリン酸を加
え、ｐ　Ｈを４．７５として１１１１ｔ間０℃に保った
。遠心分Ｍ（８９００ｇ、１時間）を行い、上清を得た
。この上清にＩＭの水酸化カリウムを加え、ｐＨを７．
０に調整し８４０ｍ１の酵素液を得た。

得られた酵素液８４０ｉをＤＥＡＥ　　Ｔｏｙ。

ｐｅａｒｌ　　６５０Ｍ（’東ソー製）２００ｍｌを充
填したカラム（Φ４５Ｘ　１２６ｍ）に添加した。

ついで２０ｍＭのリン酸カリウムＪＰＮ液（ｐ）１７゜
０）２Ｍで溶出を行い、ついで２０ｍＭリン酸カリウム
と０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０゜２Ｍ、０．
５Ｍの塩化ナトリウムよりなるｐＨ７゜０の溶液各５０
０ｍ１を順次用いて溶出を続けた。

次に２０ｍＭリン酸カリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム
溶液の溶出画分５００ｍ１を１Ｍ水酸化カリウムでＰＨ
８，０とした。この溶液＆　２　Ｏｎｔ　Ｍリン酸カリ
ウム、５０ｍＭ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ８，０）で
平衡化したＤＥＡＥ　　Ｔｏｙ。

ｐｅａｒ　＋　　　６５０Ｍ　　４００ａ＋ｌ　（Φ３
１Ｘ５３０ＩＩＩＩＩ）のカラムに添加した。ついで２
０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウムの溶液
（ｐＨ８，０）１１と、２０ｍＭリン酸カリウム、２０
０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８，０）ＩＪで塩化ナ
トリウム濃度が連続的に高くなるリニアーグラジェント
を作り、２０ｍ１づつ分取した。

プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の認められた第
５６〜６３分画（１６６ｍｌ）を分取し、２Ｍ乳酸でｐ
Ｈ４，０とした。

この溶液を２０ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ塩化ナ
トリウム溶液（ＰＨ４，０）で平衡化したＣＭ　　Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌ　　６５０Ｍ（東ソー製）２０ｍｌ（Φ
２６Ｘ３８膿）のカラムに添加した。ついで２０ｍＭリ
ン酸カリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液（Ｐ　Ｈ
４、０）　２０　＋ｎｌ、２０ｍＭリン酸カリウム、４
００ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ４，０）１００ａ＋
Ｉ、２０ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウ
ム溶液（ｐＨ４゜０＞１００＋ａｌで順次溶出を続けた
。

２０ｍＭリン酸カリウム、４００ｍＭ塩化ナトリウム溶
液から活性画分５０ｍ１と得た。この溶液を２ＭＫＯＨ
でｐＨ７，０に調整し、ついで硫安９．８ｇを添加し、
２ＭＫＯＨ’？″ｐ）Ｉ７．Ｏに調整した。この溶液を
２０ｍＭリン酸カリウム、１．５Ｍ［安溶液（ｐＨ７，
０）で平衡化しなりｕｔｙｌ　　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　
　６５０Ｍ（東ソー製）５０ｍｌ（Φｌ　６　Ｘ　２５
０　ｍ　）のカラムに添加した。

２０ｍＭリン酸カリウム、１．５Ｍ硫安溶液（ｐＨ７，
０）５０ｍｌで溶出した。ついで１．５ＭＫ安を含む２
０ｍＭリン酸カリウム１２５ｍ１と２０ｍＭリン酸カリ
ウム溶液（ｐＨ７，０）１２５ｍｌで硫安濃度が減少す
るリニアグラジェントを作り、溶出を行った。

プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の認められた画
分を、７５ｍＭリン酸カリウムに対し浸透した後、限外
ｆ過で５ｍｌに濃縮した。

ついで、ＴＳＫｇｅｌ　　ＤＥＡＥ　　５ＰＷ（東ソー
製）　（Φ７．５Ｘ７５ｍ）を用い、リン酸カリウム溶
液（ｐＨ６，０＞濃度を９０ｍＭより１５０ｍＭまで１
５分間でリニアーグラジェントで濃度を増加させ、さら
に１５０ｍＭで１３分間溶出を行い、活性区分１７．８
＋ａｌを得た。流速は１ｃｌ／分であった。

得られた溶液を限外ｒ過で４ｍ口こ濃ｍｔｋ、２０ｍＭ
リン酸カリウムに硫安を飽和させた溶液２ｍｌを添加し
た。ついで、ＴＳＫｇｅｌ　　ＤＥＡＥ５ｐｗ（Φ７．
５Ｘ７５−）を用い、２０ｍＭリン酸カリウム１．５Ｍ
［安から２０ｍＭリン酸カリウム７．５Ｍｉ安まで６０
分間でリニアーグラジェントで硫安濃度０．７５Ｍで１
５分間流出させ、活性区分２６ｍ１を得た。流速は１ｍ
ｌ／分であった。

つぎにこの活性区分２６ｍ１をＴＳＫｇｅｌ　　ＨＡｌ
ｏｏ（Φ７．５Ｘ７５鵬、東ソー製）を用い、リン酸カ
リウム溶液（ｐＨ６，８）の濃度を９０ｍＭより１００
ｍＭまで１０分間でリニアーグラジェントで増加させ、
さらに１００ｍＭｔ”１０分間溶出を行い、本発明のプ
リンヌクレオシドホスホリラーゼ１．７■を得た。流速
はｌａ＋ｌ／分であった。

（実施例３）理化学的性質０作用および基質特異性本発明のプリンヌクレオシドホスポリラーゼ０゜０２Ｍ
ｇを含む２０ｍＭヌクレオシド２ＱｍＭリン酸カリウム
溶液（ｐＨ７，０）２００ｕｊを６０℃で１０分間反応
させ、生成した塩基を定すした。結果を表１に示す。

また本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ０．０
２Ｍｇ、２０ｍＭ塩基、２０ｍＭリボース−１−ホスフ
ェート、２０ｍＭリン酸カリウムよりなる溶液（ｐ）１
７．０）２００μｍを６０℃で１０分間反応させ、生成
したヌクレオシドを定量した。結果を表２に示す。

（以下余白）ヌクレオシドイノシンアデノシングアノシンキサンチンシチジンウリジン５−・メチルウリジン２−−デオキシイノシン２−−デオキシアデノシン２゛−デオキシグアノシンチミジン２−−デオキシウリジン２゛−デオキシシチジン生成塩基量０．２２ｍＭ０．１８０．１００．４６０．３３表２塩基　　　　　　　　　生成ヌクレオシドヒボキサンチ
ン　　　　　Ｃ１６９ｍＭアデニン　　　　　　　　　
　Ｏキサンチン　　　　　　　０，５２シトシン　　　　　　　　　　０ウラシル　　　　　　　　　　０チミン　　　　　　　　　　０ ■至適ｐＨおよび安定ｐＨ本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ０゜６８μ
ｇを含む２０ｍＭイノシン、２０ｍＭリン酸カリウム溶
液（ｐＨ３，５〜１３）５ｍｌを６０℃で１５分間反応
させた。生成したヒボキサンチンを図１に示す、ｐＨ７
から１１．５の間において高い酵素活性が認められた。

安定ｐ　Ｈを調べるために本発明のプリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ０．１７μｇを５０μｍの２０ｍＭクエ
ン［１衡液（２０ｍＭリン酸カリウムを含む）＝２０ｍ
ＭグリシンＭｆｆｒ液（２０ｍＭリン酸カリウムを含む
）、２０ｍＭ）リス・塩酸緩衝液（２０ｍＭリン酸カリ
ウムを含む）、２０ｍＭリン酸カリウムＭ衡液中各々８
０℃で３００分間反応せ、残存酵素活性を定量した。結
果を図２に示す。

酵素活性はｐＨ７〜１０においても失活しなかった。

■至適温度および作用適温の範囲本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ０．０８５
ｕｇを含む２０ｍＭイノシン、２０ｍＭリン酸カリウム
溶液（ｐＨ７，０）１ｍｌを４０〜９０℃で反応させ、
生成したヒボキサンチンを定量した。結果を図３に示す
。

８０℃以下では温度が高いほど生成速度が速く２９０℃
では２０分以内に酵素が失活した。

また、２０ｍＭリン酸カリウムとＺｍＭイノシン溶液（
ｐＨ７，０）中での酵素の半減期は、図４に示ように１
６時間であった。

■阻害、活性化および安定化本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ０゜０９μ
ｇを含む２０ｍＭイノシン、２０ｍＭリン酸カリウム溶
液と各種金属イオン溶液（ｐＨ７゜０）１ｍｌを６０℃
で２０分反応させ、生成したヒボキサンチンを定量した
。

Ｍｇ５Ｏａ　−７Ｈ２０、ＭｎＣｊｌ　ｘ　’　４Ｈ，
０１ＣｕＳＯａ　’　５Ｈｘ　０１ＺｎＳＯａ　・７Ｈ
ｚ　０１ＣＨ＊　Ｉ　Ｃ０ＯＨ，ＥＤＴＡ、では阻害は
認められなかったが、Ｈｇ　Ｃｊ　ｘ　、パラクロロメ
ルクリベンゾエイトでは強い阻害が認められた。

■分子量ＴＳＫゲルＧ−３０００ＳＷ（束ンー製）によるゲルｒ
過法では６８０００であった。

ＳＤＳ電気泳動法によるサブユニットの分子量は３４０
００であ・ンな。

■アミノ酸組成アミノ酸アナライザー（日立ＩＪ８８３５）により分析
した。結果を表３に示す。

表３構成アミノ酸アスパラギン酸スレオニンセリングルタミン酸グリシンアラニンバリンメチオニンイソロイシンロイシンチロシンフェニルアラニンリジンヒスチジンアルギニンプロリンＭｏｌ　％８、０４４、３０３、０８１２．６４１０．０７１０．８０８、５９３、６８８、５５７、２６３、２６２、３２４　、０７５、９６５、４９

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼの
ｐＨ依存性を示す図面である。第２図は本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼの
ｐＨ安定性を示す図面である。第３図は作用適温の範囲を示す図面である。第４図は酵素活性の半減期を示す図面である。第図度忘・時間　（分）

Claims

【特許請求の範囲】１、次の理化学的性質を有するプリンヌクレオシドホス
ホリラーゼ（１）作用：プリンヌクレオシド＋Ｐｉ■ 塩基＋リボース−１−リン酸（２）基質特異性：アデニン、アデノシン以外のプリン
系ヌクレオシドと塩基に対して作用する。（３）至適ｐＨおよび安定ｐＨ至適ｐＨはｐＨ７〜１１．５ｐＨ７〜１０において８０℃の処理を３０分しても失活しない。（４）至適温度および作用適温の範囲至適温度は８０℃、ｐＨ７．０において５０〜８０℃では６０分処理をしても安定（５）：ｐＨ、温度などによる失活の条件：ｐＨ７．０
、９０℃で処理したとき２０分で失活する。（６）阻害、活性化および安定化特別な活性化剤や安定化剤を必要としない。塩化第二水銀、パラクロロメルクリベンゾエイトにより
阻害を受ける。（７）分子量：６８０００（ＴＳＫゲルＧ−３０００Ｓ
Ｗによるゲル濾過法）（８）サブユニットの分子量３４０００（ＳＤＳ電気泳動法）２、請求項１項に記載の酵素を生産する能力を有するバ
チルス属に属する微生物を培養し、培養物より該酵素を
採取することを特徴とするプリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼの製造法。