JPH044888A - 発酵法によるアミノ酸の製造法 - Google Patents

発酵法によるアミノ酸の製造法

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JPH044888A
JPH044888A JP10451190A JP10451190A JPH044888A JP H044888 A JPH044888 A JP H044888A JP 10451190 A JP10451190 A JP 10451190A JP 10451190 A JP10451190 A JP 10451190A JP H044888 A JPH044888 A JP H044888A
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吉原 康彦
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孝三 永山
Koki Horikoshi
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野〕 本発明は発酵法によるアミノ酸の製造法に関するもので
ある。
[従来の技術] グルコース、シュークロース、廃糖蜜等を用いるアミノ
酸発酵においては培養液中にトレノ\ロスも生成される
ことが知られている(Biosci。
Rep、、 vol、5. No、6. pp 509
−515.1985)。しかし、このトレハロースに着
目して何らかの処理、あるいは活用することは知られて
いない。
〔発明が解決しようとする課題〕
トレハロースを発酵菌に資化させることができれば目的
アミノ酸の発酵収率を高められる可能性がある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは上記目的を達成するべく鋭意検討の結果、
トレハロースをD−グルコースに分解するトレハラーゼ
に着目するに至った。そして、トレハラーゼを著聞生産
する微生物の取得に成功し、このトレハラーゼをアミノ
酸発酵の培養液に加えることによって培養液中に生成蓄
積されたトレハロースを有効利用して目的アミノ酸の発
酵収率を高めうることを見出して本発明を完成するに至
った。
すなわち、本発明は、微生物を用いるアミノ酸製造方法
において、該微生物の培養液中にトレハラーゼを存在せ
しめることを特徴とするアミノ酸の製造法に関するもの
である。
トレハラーゼ(E、C,3,2,1,28)は2.2’
−1−レバロースを分解してD−グルコースを生成する
酵素であり、昆虫、動物、微生物などにその存在が知ら
れている。トレハラーゼは安価なものが好ましく、その
点で本発明者らが開発したコリネバクテリウム属細菌の
産生ずる1・1ツバラーゼ(特開昭62−275682
 ’3公報)は特に好ましい。
コリネバクテリウム属細菌を培養してl・レハラゼ4取
得する方法は公知の方法に従えばよい。
すなわち、トレハラーゼ産生能を有するコリネバクテリ
ウム属細菌をグルコース、シュークロース、可溶性デン
プン等炭素源、硫安、塩安、燐安等の無機物あるいは酵
母エキス、肉エキス、大豆粕加水分解物、ペプトン等の
有機物の窒素源、ビタミン等の微量有機栄養物、リン酸
カリ、硫酸マグネシラl、等の無機塩を含む液体培地に
培養する。培養条件もフリ不ハクテリウム属細菌を培養
する通常の条件でよいが、本発明者らが先に開発したコ
リネバクテリウム・エスピーに一512株(FERM 
P−8485)の場合には高温菌であるので40〜60
°C程度で培養するのがよい。培養は常法に従って通気
撹拌条件下で行ない、通常はトレハラーゼの蓄積が最高
に達するかあるいは経済的に最も好ましい蓄積量に達し
た時点で培養を終了する。培養終了後は培養液をそのま
ま、あるいは濃縮するだけで酵素源として使用してもよ
く、あるいは菌体分に1、限外濾過、ゲル濾過、イオン
交換クロマトグラフィ、硫安性を法等の公知の酵素精製
法によりさらに精製して使用することもできる。l・レ
バラーゼが菌体内酵素の場合には菌体を用い、あるいは
菌体を破壊して酵素抽出してこれを利用するごとはいう
までもない。本発明の方法で使用されるトレハラーゼは
微生物由来に限定されるものではなく、動植物由来のも
のであってもよい。また、遺伝子工学的手法等で調製さ
れたものであってもよい。
アミノ酸発酵の種類は特に限定されるものではなく、例
としてグルタミン酸発酵、リジン発酵、グルタミン発酵
、スI/オニン発酵、アミノ酸発酵、フェニルアラニン
発酵、バリン発酵、イソロイシン発酵等を例として挙げ
ることができる。発酵菌の種類もトレハ[l−スを生成
するものであれば特に限定されない。コリネバクテリウ
ム属細菌又はブレビバクテリウム属細菌等のいわゆるコ
リネ型細菌、例えばコリネバクテリウム・リリュウム、
コリネハクゾリウム・グルタミン酸、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム等に対して本発明の方法は特
に有効である。
アミノ酸発酵方法はトレハラーゼを添加するほかは公知
の方法に従って行なえばよく、これらの菌を培養する培
地には炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその
他の有機微量栄養素を含有する通常の培地が用いられる
炭素源の例としては、グルコース、シュークロース、フ
ラクト−ス、ケーンモラセス、ビートモラセス、澱粉加
水分解物などの炭水化物を挙げることができる。窒素源
としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム
塩、尿素等が好適である。培養は、好気的条件で行ない
、通常、培養のコントロールp)Iを4から9の間に温
度を25°Cから39°Cの間に調節する。しかしなが
ら、培養時間の短縮、雑菌防止等の点で40〜60°C
程度の高温発酵を行なうことは好ましく、その場合には
コリネバクテリウム・エスピーに一512株等の産生ず
る至適温度が40〜60°Cにあるような耐熱性トレハ
ラーゼは特に好ましい。
1−レバラーゼの添加量は各発酵の種類と方法、トレハ
ラーゼの種類等を考慮して設定されるが通常0.5〜1
00ユニット/−程度である。添加時期は培養に先立っ
て予め培地に加えておいてもよく、あるいは培養中に1
回あるいは数回に分けて添加してもよい。トレハラーゼ
は固定化して使用することもできる。この固定化酵素は
アミノ酸発酵菌を固定化して使用する場合にそれに混合
してもよく、発酵槽に投入して使用することもできる。
かくして1ないし7日間も培養すれば培地中に著量のア
ミノ酸が生成される。培養液よりアミノ酸を採取する方
法は通常の方法で行なう。
[作用] トレハロースはD−グルコースが1.1 結合した形の
非還元性の二炭糖であり、−船釣にはコリネ型細菌はト
レハロースを資化する力が弱く、この生成はとりもなお
さずグルコース等炭素源のアミノ酸への変換率を低めて
いる。アミノ酸発酵の培養液中に生成するトレハロース
をトレハラーゼで処理することにより、効率的にグルコ
ースに変換し、アミノ酸の収率を高めることが出来る。
〔実施例〕
実施例1 トレハラーゼはコリネバクテリウl、・エスピーに一5
12株から得られたものを使用した。その調製法は以下
の通りである。
まずに−512株(FERM P−8485)を1%可
溶性澱粉、1%グルコース、1%ポリペプトン、0.5
%酵母エキス、0.1%に211P04および0.02
%Mg5O,・71120を含有する液体培地に植菌し
、55°Cにて72時間好気的に培養した。得られた培
養液を11000Orp、0°Cにて10分間遠心分離
して菌体を除き、上澄液を得た。ついで、該上澄液を平
均分子量10000の限外濾過膜を用いて約10倍に濃
縮し、10mM燐酸緩衝液(pl+7)で−夜透析した
。この透析後に生じる沈澱を遠心分離で除き、得られた
上澄液を10mM燐酸緩衝液(pH7)で平衡化したD
EAE−トヨパール650Mカラムに吸着させ、0〜0
.7MのNaC1を含む上記と同様な緩衝液の濃度勾配
法によって酵素を溶出させた。溶出した活性画分を集め
分画分子量10000の限外濾過膜を用いて濃縮し、さ
らに10mM燐酸緩衝液(pH7)で−夜透析した。得
られた活性画分を10mM燐酸緩衝液(pH7)で平衡
化したDEAEトヨパールバック6508カラムに吸着
させO〜0.5M NaC1を含有する上記と同様な緩
衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。活性画分
を分画分子量10000の限外濾過膜で濃縮し、あらか
しめ0、IM NaClを含む上記緩衝液で平衡化した
アサヒバツクG5−520 Pカラムを用い、0.IM
 NaC1を含む上記緩衝液で溶出した。得られた活性
画分を分画分子量10000の限外濾過膜で400ユニ
ツト/戚になるよう濃縮し、酵素溶液とした。
グルコース5g/面、尿素0.4g/d1、KH2P0
.0.1g/df!、、MgSO4・711200.0
4g/d1、FeSO4・711z01mg/社、Mn
SO4・nHzo 1mg/d1、サイアミン・)IC
120μg/社、ビオチン30μg/dll、大豆蛋白
酸加水分解液90mg#J!(全窒素として)を含む種
母培地をpH7,0に調節し、その50rdを500d
容肩付フラスコに入れて加熱殺菌した。これにコリネバ
クテリウム・グルタミクムAJ 11441(FERM
 P−5138)を接種し、31.5°Cに保ちつつ1
5時間振盪培養した。
一方、シュークロース20g/a(総糖量として)KI
I2PO,0,1g/d1、Mg5040.04g/d
1、FeSO4・711201mg/dl、 MnSO
4・4Hz01■/d1、サイアミン・lIc120μ
g/a、ビオチン30μg/a、界面活性剤0.2g/
み、消泡剤0.005d/d1.大豆蛋白酸加水分解液
90■/面(全窒素として)、pt+ 7.0に調整し
た培地285m!を1!容ファーメンタ−に入れ殺菌し
た。冷却後、前述のトレハラーゼを0又は6.7ユニy
ト/mlとなるように添加した。この場合の1ユニツト
は反応温度55°Cで1分間にトレハロースから1μm
olのグルコースを生成する酵素活性である。
これに上記種母培養液を15d接種した。培養は31.
5°Cでアンモニアガスにてpl+ 7.5に保持しつ
つ、通気撹拌下で糖を加えながら行った。培養48時間
後、それぞれの培養液中のL−グルタミン酸とトレハロ
ース量はそれぞれ第1表に示す通りであった。
第1表 実施例2 トレハラーゼはコリネバクテリウム・エスピーL512
株(FERM P−8485)を下記のGS培地にて5
5°C・72時間培養し、イオン交換樹脂およびゲル濾
過カラムクロマトグラフィーで精製したものを用いた。
GS培地 1%   グルコース 1%   可溶性澱粉 1%   ポリペプトン 0.5%  酵母エキス 0.1%  KzllPo。
0.02%  Mg5O,・711□0実施例1の菌株
、培地組成及び培養方法を用い、トレハラーゼ無添加の
発酵終了液1ml1に前記のトト・ハラーゼを最終濃度
O及び6,7ユニツト/雌となるように添加し、31 
、5 ”Cで7時間反応した。反応後の培養液中の1.
−グルタミン酸とトレハロース量を第2表に示す。
第2表 実施例3 トレハラーゼはコリネバクテリウム・エスピー)[−5
12株(FERM p、−8485)を培養して得られ
た培養液(特開昭62−275682号公報)を無菌濾
過して使用した。
ペプトンIg/d1、酵母エギスIg#f、 NaCl
 O,5g/み、グルコース0.5(H/み、寒天2g
7dl、pH7,0のUl 成の固体プレーl−にブ1
ノビバクテリウム・ラフ1−ファーメンタムへJ 34
24(FERM P−1711)を植えつけ、温度31
.5°Cで24時間培養し、種母用菌体を得た。
一方、グルコース10g/di、硫安5.5g/d1、
トeSo、−711z0 1mg/d、Mn5Os ・
4H201mg/di!、1(Il、PO40,1g/
d、MgSO40,1g/み、サイアミン・lIc12
0μg/d1、ビオチン50μg/d1、ニコチン酸ア
ミド0.5mg/Li1、大豆蛋白酸加水分解105■
/ミ(全窒素として)を加えpl+ 8.0に調整した
培地20dを500mp、容肩付フラスコに入れて加熱
殺菌1−だ。これに別殺菌したCaC0:+ Igを加
えて、リジン生産用培地とした。このリジン生産用培地
に種母用菌体1白金芽を植えつけた後、ミリポアフィル
タ−で除菌した前述のトレハラーゼを最終濃度O及び6
ユユツ)/dとなるように培養開始時及び24時間目に
添加し、31.5°Cで48時間振盪培養した。それぞ
れの培養液中の1.−リジン量及びトレハロース量を第
3表に示す。
第3表 〔発明の効果〕 本発明によりアミノ酸の発酵収率を高めることができる

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1.  微生物を用いるアミノ酸製造方法において、該微生物
    の培養液中にトレハラーゼを存在せしめることを特徴と
    するアミノ酸の製造法
JP10451190A 1990-04-20 1990-04-20 発酵法によるアミノ酸の製造法 Expired - Lifetime JP2952604B2 (ja)

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