JPH02223593A - ヒトカルパスタチン様ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体内で種々の生理活性を有するヒトカルパ
インの活性を阻害する新規なポリペプチドに関する。

〔従来の技術〕

カルパスタチンは、カルシウム依存性のシスティンプロ
テアーゼとして知られているカルパインを特異的に阻害
する細胞内蛋白質である。

カルパスタチンは高等動物の各種の組織に広く分布し、
細胞が刺激を受けることによって動員され、活性化され
たカルパインの作用を調節していると考えられている。

カルパインの生体における役割としては、プロティンキ
ナーゼＣ１ホスホリラーゼキナーゼＢなどのキナーゼ系
統酵素の限定分解による活性化、細胞骨格蛋白質の分解
、増殖因子やホルモンのレセプターの分解などが知られ
ている。

カルパスタチンは、これらのカルパインの作用を特異的
に阻害することにより、カルパインの過剰反応を調節し
ている。したがってカルパイン−カルパスタチン系のバ
ランスの維持は、病態と密接に関連している。

例えば、筋ジストロフイー疾患においては、カルパイン
のレベルが高まっており、筋原繊維やニューロフィラメ
ントの分解がカルパインによって促進されることが、発
症と密接に関わっていると推定されている。また、成人
型白血病ウィルスに感染した細胞では、カルパイン活性
及びインターロイキン２のレセプター活性が異常に高ま
っていることが知られている。これは、カルパインが細
胞骨格蛋白質に作用してレセプター活性を変化させ、そ
の結果、増殖因子などに対する細胞の異常な反応を生み
出し、病因となることを推定させる〔生化学、第５７巻
、第１２０２頁（１９８５））。更にカルパインは眼水
晶体蛋白質を切断することが知られており、その過剰反
応が白内障に関係していることが示唆される。

一方、情報伝達に必要なステロイド−レセプター複合体
の安定化物質が、カルパスタチンであるという報告〔ジ
ャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　）　、第２６０巻、第２６０１頁（１９８５
）：］や、高血圧ラットにおけるカルパスタチンレベル
の異常な減少も報告されている〔バイオケミカルアンド
　バイオフィジカル　リザーチ　コミュニケーションズ
（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｙｓｉｃ
ａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ
　）　、第１４５巻、第１２８７頁（１９８７）：］。

このようにカルパスタチンは、カルパインの作用を調節
する内在性の蛋白質インヒビターとして、カルパインの
過剰作用が原因と考えられる種々の疾患に対して有効な
治療剤となることが期待される。

〔発明が解決しようとする課題〕

カルパスタチンは高等動物の各種組織に広く分布し、ブ
タ赤血球や心筋、ウサギ骨格筋及びヒト赤血球などから
の精製が報告されている〔ザ　バイオケミカル　ジャー
ナル（Ｔｈｅ　Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ）　、第２３５巻、
第９７頁（１９８６）、ジャーナル　オブ　バイオケミ
ストリ＝　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　）　、第９５巻、第１６６１頁（１９８４）
、ジャーナル　オブ　バイオケミストリ、第９２巻、第
２０２１頁（１９８２））。更に、ブタ及びウサギのカ
ルパスタチンのｃＤＮＡクローニングにより、アミノ酸
の一次構造が解明された〔バイオケミストリー　（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　）第２７巻１第９６４頁（
１９８Ｂ）、プロシーディングズ　オブザ　ナショナル
　アカデミ−オブ　サイエンシーズ　オブ　ザ　Ｕ　Ｓ
　Ａ　　（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ
ｓ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　）、第８４巻、第３５９０頁（１９
８７）］。その結果、カルパスタチンの基本構造は共通
であり、約１４０アミノ酸残基からなる４つの繰り返し
機能単位（ドメイン１−４）とＮ末側の非相同性の配列
（ドメインＬ）よりなることがわかった〔フエブスレタ
ーズ（ＦＩＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　）、第２２３巻、
第１７４頁（１９８７））。

ヒトカルパスタチンの一次構造に関しては、まず本発明
者らがドメイン１−４の配列を明らかにし〔特願昭６３
−１０９１１１号〕、次いで全配列を解明した〔特願昭
６３−２０７２８３号〕。本発明の目的は、ヒトカルパ
スタチンの活性を有し、種々の応用に至便な鎖長の短い
ポリペプチドを提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明はヒトカルパスタチン様ポ
リペプチドに関する発明であって、下記式■で示される
ことを特徴とする。

Ｘ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ八ｒへ−Ｇ］　ｕ−Ｖａ］−Ｔｈｒ−
Ｉ　Ｉｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＬｙｓＴｙｒ−八ｒｇ−Ｙ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・　　
（Ｉ）〔式中Ｘは下記式： Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−３ｅｒで表される配
列又はそのＮ末端からアミノ酸若しくはペプチドが欠失
した配列を示し、Ｙは下記式： ％式％ で表される配列又はそのＣ末端からアミノ酸若しくはペ
プチドが欠失した配列を示す〕本明者らはペプチド合成
法によりヒトカルパスタチンドメイン内の１８アミノ酸
よりなるポリペプチド〔前記式■に示されるＸ及びＹが
欠失した１８アミノ酸ポリペプチド二以下１８アミノ酸
ポリペプチドと略す〕、２１アミノ酸よりなるポリペプ
チド〔前記式■で表されるポリペプチドで、式中、Ｘが
欠失し、Ｙ　＝　Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕであるような
ポリペプチド：以下２１アミノ酸ポリペプチドと略す］
及び２６アミノ酸よりなるポリペプチド〔前記式■で表
されるポリペプチドで、式中、Ｘ−八ｓｐ−Ｐｒｏ−Ｍ
ｅｔ−８ｅｒ−３ｅｒかつＹ　＝　Ｇｌｕｌ、ｅ　ｕ　
−Ｌ　ｅ　ｕであるようなポリペプチド：以下２６アミ
ノ酸ポリペプチドと略す〕を合成しカルパイン阻害活性
を有することを見出し、この知見に基づいて本発明を完
成させた。以下本発明を具体的に説明する。

ヒトカルパスタチンはそのｃＤＮ八クリクローニングり
アミノ酸の一次構造が明らかにされ、約＼ １４０アミノ酸残基よりなる４つの繰り返し機能単位（
ドメイン１−４）とＮ末側に非相同性の配列（ドメイン
Ｌ）を有することが見出されている〔特願昭６：３−２
０７２８３号〕。ドメイン１−４は各ドメイン単独でカ
ルパスタチンの活性を有しているが、このうちドメイン
１が最も強い活性を有しているので、このドメインにつ
いて更に詳細な解析を行った。その結果、ドメイン１は
前記１８アミノ酸ポリペプチドまで短縮しても活性を示
すことを見出した。

そこでこの１８アミノ酸ポリペプチド、２１アミノ酸ポ
リペプチド、及び２６アミノ酸ポリペプチドを実際に化
学合成し、そのカルパイン阻害活性を調べた。ポリペプ
チドの化学合成はＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシ
カルボニルポリアミド）合成法に従って行った〔ザ　ジ
ャーナルオブ　オーガニック　ケミストリー（Ｔｈｅ　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）、第３７巻、第３４０４頁（１９７２）、ジャ
ーナル　オブ　ザ　ケミカルソサエティー、ケミカル　
コミュニケーションズ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　）　、第１３
巻、第５３７頁（１９７Ｂ）、インターナショナル　ジ
ャーナル　オブ　ペプチド　アンド　プロティン　リサ
ーチ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　、Ｉｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｐｒ。

ｔｅｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　、第１３巻、第３５
頁（１９７９））。

合成されたポリペプチドは確かにカルパインの阻害活性
を有しており、１８アミノ酸ポリペプチドだけでカルパ
スタチン様活性を示すことが明らかになった。また、２
１アミノ酸ポリペプチド及び２６アミノ酸ポリペプチド
でもカルパスタチン様活性を示すことが明らかになった
。以上述べてきたごとく、本発明により、ヒトカルパス
タチン様活性を示す新規な１８アミノ酸ポリペプチド、
２１アミノ酸ポリペプチド及び２６アミノ酸ポリペプチ
ドを提供することが可能となった。

〔実施例〕

次に本発明の実施例を示すが、これは本発明を限定する
ものではない。

実施例１１８アミノ酸ポリペプチド、２１アミノ酸ポリ
ペプチド及び２６アミノ酸ポリ ペプチドの合成 （原料）　　Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＰＰＰＰ
ｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＰＰＰ Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＰＰＰ Ｆｍｏｃ−３ｅｒ　（日ｕｔ）−ＤＩＩＢＴＰｍｏｃ−
Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−ＤＨＢＴＦｍｏｃ−Ｔｙｒ　（Ｂｕ
ｔ）　−ＰＰＰＦｍｏｃ−４１ｅ−ＰＰＰ Ｐｍｏ叶旧ｕ　（Ｂｕｔ）　−ＰＰＰ Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＰＰＰ Ｆｍｏｃ−Ｇ］ｙ−ＰＰＰ Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）−ＰＰＰＦｍｏｃ−Ａｒ
ｇ　（Ｍｔｒ）　−ＤｔｌＢＴＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＰＰ
Ｐ Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｏｆｆ Ｆ　ｍ　ｏ　ｃ　−Ｌ　ｅ　ｕ　−Ｄ　Ｈなおりｕｔは
ｔ−ブチルを、ＰＦＰはペンタフルオロフェニルを、Ｄ
ＨＢＴは１−オキソ−２−ヒドロキシジヒドロベンゾト
リアジンを、Ｍｔｒは４−メトキシ−２，３，６−）リ
メチルフェニルスルホニルを、Ｂｏｃはｔ−ブチルオキ
シカルボニルを示す。

（樹脂）　ペプシンＫＡ［ミリゲン（Ｍ　ｉ　］　Ｉ　
１Ｇｅｎ）社製〕 １．１８アミノ酸ポリペプチドのＣ末端のアミノ酸であ
るＦ　ｍ　ｏ　ｃ　−Ｌ　ｅ　ｕ　−Ｄ　Ｈの樹脂及び
２１アミノ酸ポリペプチドと２６アミノ酸ポリペプチド
のＣ末端のアミノ酸であるＰｍｏｃ−Ｌｅｕ−叶の樹脂
への結合及びペプチド鎖の延長 （１）　　ＣＦｍｏｃ−Ａｒｇ　（Ｍｔｒ）　）　２０
無水物及び（ＦｍｏｃＬｅｕ）　２０無水物の合成 ７３０ｍｇのＰｍｏｃ−Ａｒｇ　（Ｍｔｒ）−叶を塩化
メチレン５ｍｌ！に溶解し、ジシクロへキシルカルボジ
イミド　１１０ｍｇを添加し、水浴中４０分間かくはん
後、ジシクロヘキシル尿素をろ過により除いてろ液を減
圧下で、蒸発乾固した。４２０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ
−ＯＨについても同様に処理した。

（２）　　〔Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ　（Ｍｔｒ）　：］　２
０及び（Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ）　２０と樹脂（ペプシンＫ
Ａ）の結合 ＣＦｍｏｃ−Ａｒｇ　（Ｍｔｒ）　）　２０無水物　７
２０ｍｇを樹脂が湿る程度のジメチルホルムアミド （ＤＭＰ）に溶かし、４−ジメチルアミノピリジン１１
ｍｇの存在下、樹脂１ｇと約２時間反応させた。反応終
了後ＤＭＦ１０ｄ、次いで塩化メチレン１０誦で洗浄し
乾燥させて、アミノ酸分析にて導入率を確認した。

（Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ）　２０無水物４１０ｍｇについて
も同様に処理した。

（３）　　ペプチド鎖の延長 次に生成したＰｍｏ叶Ａｒｇ　（Ｍｔｒ）−ペプシンＫ
Ａ樹脂をペプチドシンセサイザー用カラム（ミリゲン社
製）に充てんし、ペプチドシンセサイザー（ミリゲン社
製）を用いて１８アミノ酸ポリペプチドのＣ末端側から
順番にＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＰＰＰ　、　Ｆｍ
ｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＰＰＰ、以下１８番目のＦｍｏ
ｃ−Ｔｈｒ　（Ｂｕｔ）　−ＤＨＢＴまでを加えて結合
させ、１８アミノ酸ポリペプチドを合成した。また、Ｆ
ｍｏｃ−Ｌｅｕ−ペプシンＫＡ樹脂については、２１ア
ミノ酸ポリペプチド及び２６アミノ酸ポリペプチドのＣ
末端側から順番にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＰＢＰ、　Ｆｍｏ
ｃ−Ｇｌｕ（Ｂｕｔ）−ＰＰＰ　、以下２１番目のＦｍ
ｏｃ−Ｔｈｒ　（Ｂｕｔ）叶ＢＴまでを加えて結合させ
、２１アミノ酸ポリペプチドを、２６番目のＦｍｏｃ−
八ｓｐ　（ＯＢｕｔ）ＰＰＰまでを加えて結合させ、２
６アミノ酸ポリペプチドを合成した。合成終了後、ペプ
チドの結合した樹脂を塩化メチレン１０ｍ１（４回）、
ｔ−アミルアルコール１０社（２回）、酢酸１０ｍ１！
（２回）、ジエチルエーテル１０ｍ２（４回）で洗浄し
た。

２、　樹脂並びに保護基の除去 合成完了済みの樹脂に２０％ピペリジンＤＭＦを加え１
時間放置後、Ｄ　Ｍ　Ｆ　１０ｍ１２、次いで塩化メチ
レン１０ｍ１２で洗浄し乾燥した。それにトリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）：エタンジチオール：チオアニソール−
９０：５：５の混合液１０ｍ１を加え、３時間放置した
。次にＴＦＡ濃度が５％になるように水を加えてから、
ヘキサン１０艷、次いでエーテル１０−で洗浄した。

洗浄後、水をエバポレーターで除去しＩＮ酢酸１ｍｌに
溶かし、一部を高速液体クロマトグラフィー（カラム：
　ＹＭＣ−０ＤＳ５Ｃ，、、移動相：０．０５％Ｔ　Ｆ
　Ａ／Ｈ２０−０，０５％ＴＦＡ／ア七ト二トリル）を
行い、溶出された各ピークフラクションすべてについて
アミノ酸分析で調べた。アミノ酸組成が合うフラクショ
ンを分取し、保護基の遊離の確り忍のため高速原子衝撃
マススペクトルで分子量を調べた。その結果、１８アミ
ノ酸ポリペプチドが３２ｍｇ、　２１アミノ酸ポリペプ
チドが４０ｍｇ、　２６アミノ酸ポリペプチドが５０ｍ
ｇ得られた。

実施例２　合成したポリペプチドのカルパイン阻害活性
の検出 カルパインの阻害活性は、以下の方法に従って行ったし
ジャーナル　オブ　バイオケミストリー、第９５巻、第
１７５９頁（１９８４）］。

サンプル１０μβ、１　ｍｇ／−カルパイン溶液２．５
μＡ、２％カゼイン／イミダゾール溶液４０μｌ、６ｍ
ｇ／ｍシスティン溶液２０μｌと水とを混合し、全量で
１８０μｐとした。次に３０℃で５分間予熱した後、５
０ｍＭ塩化カルシウム溶液を２０μβ加えて、３０℃で
１５分間インキュベートした。その後５％トリクロロ酢
酸を２００μβ加えて反応を停止し、１２００Ｏｒｐｍ
で１０分間遠心し、上清を回収した。その上清の２８０
ｎｍの吸光度を測定して、これよりカルパイン阻害活性
を算出した。

その結果、表１に示したように実施例１で合成したポリ
ペプチドは確かに、カルパインの阻害活性を有しており
、１８アミノ酸ポリペプチド、２１アミノ酸ポリペプチ
ド及び２６アミノ酸ポリペプチドはカルパスタチン様活
性を示すことが明らかになった。

参考例１１８アミノ酸ポリペプヂドのＮ末端よりアミノ
酸若しくはペプチドが 欠失したポリペプチドのカルパイ ン阻害活性の検出 （１）Ｎ末端欠失ポリペプチドの合成 前記実施例１に示す手段でＰｍｏｃ−Ａｒｇ　（Ｍｔｒ
）ペプシンＫＡ樹脂に、１８アミノ酸ポリペプチドのＣ
末端側から順番にＦｍｏｃ−Ｔｙｒ　（Ｂｕｔ）ＰＰＰ
、　Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＰＰＰ以下、１１番
目のＰｍｏｃ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）−ＰＰＰまでを結合
させ、合成したポリペプチド、１２番目のＰｍｏｃ−Ｇ
ｌｙ−ＰＰＰまでを結合させ、合成したポリペプチド、
１３番目のＰｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＰＰＰまでを結合させ、
合成したポリペプチド、１４番目のＰｍｏｃ−Ｇｌｕ（
Ｂｕｔ）−ＰＰＰまでを結合させ、合成したポリペプチ
ド、１５番目のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｂｕｔ）−ＰＰＰま
でを結合させ、合成したポリペプチド、１６番目のＰｍ
ｏｃ−１１ｅ−ＰＰＰまでを結合させ、合成したポリペ
プチド、及び１７７番目ＦｍｏｃＴｙｒ　（Ｂｕｔ）−
ＰＰＰまでを結合させ、合成したポリペプチドを得た。

（２）　　カルパイン阻害活性の検出 これらの合成ポリペプチドを用いて、前記実施例２に示
す手段でカルパイン阻害活性を検出した。その結果、こ
れらＮ末端欠失ポリペプチドのカルパイン阻害活性は皆
無若しくは極めて微弱でその活性の強さが測定できない
程であることが明らかになった。

〔発明の効果〕

以上の結果から、本発明により新規なヒトカルパスタチ
ン様活性を示す１８アミノ酸ポリペプチド及びそのＮ末
端、Ｃ末端を延長したポリペプチドが提供された。この
新規１８アミノ酸ポリペプチド及びそのＮ末端、Ｃ末端
を延長したポリペプチドは、カルパインの過剰作用が原
因と考えられる種々の疾患に対しての効果がある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記式 I で表されることを特徴とするヒトカルパ
   スタチン様ポリペプチド。 【遺伝子配列があります】・・・（ I ） 〔式中Ｘは下記式： 【遺伝子配列があります】 で表される配列又はそのＮ末端からアミノ酸若しくはペ
   プチドが欠失した配列を示し、Ｙは下記式： 【遺伝子配列があります】 で表される配列又はそのＣ末端からアミノ酸若しくはペ
   プチドが欠失した配列を示す〕