JPH02227095A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒトの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ。

ｔａＯｌｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｔ）に対
する抗体、より詳しくは医薬として有用な上記ヒトＴＮ
Ｆの免疫学的精製、測定等を可能とする該ヒトＴＮＦに
対する抗体に関する。

従来の技術 バチルス　カルメツティ　グエリン（Ｂｓｃｉｌｌｕｇ
ｄｅ　Ｃａｌｍｃｔｌｅ　Ｇｕｅｒｉｎ、　Ｂ　ＣＧ）
で感作したマウス、ウサギ、ラットにリポポリサッカラ
イド（Ｌ　Ｐ　Ｓ）を投与すると、血清中に腫瘍を出血
性壊死させる因子が誘起される。１９７５年にカースウ
ェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）らは、この因子をＴＮＦと名
付けた（Ｐｒｏｃ、Ｎａｌ、　　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、
ＵＳＡ、　　７２゜ｐ３６６６　（１９７５））。ＢＣ
Ｇで感作したマウスの牌臓では、マクロファージの増生
が見られ、ＬＰＳの投与によれば、その崩壊が起こるこ
とから、従来上記ＴＮＦはマクロファージにより産生さ
れると考えられていた。最近になって、単離したマクロ
ファージをｌ’ｌ　／ｉ／／ρでＬＰＳ処理すると、そ
の培養上清中にＴＮＦ活性が誘起されることが明らかに
され、マクロファージがＴＮＦの産生細胞であることが
確認された。また現在ＴＮＦを産生ずる白血病細胞が幾
つか報告されている。

しかして、ＴＮＦは各種がん細胞に致死あるいは増殖抑
制効果を示すが、正常細胞には之等の効果を示さないこ
とから、がんの治療への応用の期待が高まってきており
、実際にマウスあるいはウサギ由来の精製ＴＮＦを用い
た制がん実験の結果から、ＴＮＦの抗腫瘍効果が認めら
れている。

ＴＮＦの活性はこれに対して強い感受性を示すマウス由
来の繊維芽細胞株Ｌ９２９を用いて測定されてきており
、培養プレートに増殖させた上記し９２９細胞を５０％
崩壊致死させる濃度を１単位として、その力価を表すの
が一般的である。

各種動物の産生ずるＴＮＦの分子量は、ゲルが過分析で
、例えばマウスでは１５万と４万〜６万の２種類、ウサ
ギでは６７０００と３９０００の２種類、ヒトでは３４
０００〜１４００００と報告されている。５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥによる分子量分析では、ヒト及びウサギの精製ＴＮ
Ｆは、分子量１７０００と報告され、現在この分子量の
ＴＮＦがｒＴＮＦ−α」と呼ばれており、天然のＴＮＦ
は多量体として存在すると考えられている。

１９８４年に、ＴＮＦ産生細胞であるヒト前骨髄球系白
血病細胞株ｒＨＬ−６０Ｊを用いて、ＴＮＦのｃＤＮＡ
のクローニングが成功をおさめ該ＴＮＦの大腸菌での大
量生産が可能となった。

またこのｃＤＮＡクローニングの結果、ヒトのＴＮＦは
１５７個のアミノ酸より構成され、非常に長い７６個の
アミノ酸よりなるポリペプチドを前駆配列として持つこ
とが明らかにされた（Ｄ。

Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　ａｌ。Ｎａｔｕｔｅ、　　３１
２．　７２４〜７２９　（１９８４））。はぼ同時に、
染色体上の遺伝子のクローニングも報告され（Ｔ、５ｈ
ｉｒａｉ　ｅＩａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１３．８
０３　（１９８５）　）　、ヒトのＴＮＦ遺伝子は４つ
のエクソンより構成されていることが明らかにされた。

ＴＮＦのアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列は、Ｂ細胞
が産生ずる細胞障害性因子及びリンホトキシン（ＬＴ）
とそれぞれ２８％及び４６％の相同性がある。但しＴＮ
ＦはＮ−グリコジル型の糖鎖の結合部位がない点で上記
ＬＴとは本質的に異なる。また、ＴＮＦとＬＴとは免疫
学的交叉反応性を有しないが、非常に類似した細胞障害
性を示すことから、両者の相同部分が該細胞障害性に関
与すると推測されている。

ＴＮＦは、上述したようにその特有の生理活性より医薬
品としての応用が期待でき、種々研究が成されていると
共に、各種免疫欠損病や異常免疫応答の研究、之等の臨
床サンプルにおけるその測定等の面においても種々研究
が重ねられている。

しかるに、現在上記ＴＮＦ−αの測定技術としては、バ
イオアッセイ（生物学的検定法）が知られており、この
方法ではＴＮＦは被検サンプルの活性量として測定され
ているが、この方法は操作性や精度の面で劣っており、
また常に測定値を干渉する成分の存在を考慮する必要が
ある。従って、上記方法に代る新しいＴＮＦの測定技術
の開発が斯界で切望されている。

発明が解決しようとする課題 本発明は、上記ヒトＴＮＦ−αの新しい免疫学的測定技
術、該技術に利用できるＴＮＦ−αに対する抗体を提供
することをその目的とする。

課題を解決するための手段 本発明によれば、ＴＮＦ−αに対して特異反応性を有す
るモノクローナル抗体が提供される。

本発明モノクローナル抗体の利用によれば、上記ヒトＴ
ＮＦ−αを高感度、高精度でしかも簡便に測定できる新
しい免疫検定法（イムノアッセイ法）が提供される。

また本発明抗体はＴＮＦ−αに特異的であるため、その
利用によれば例えばアフィニティークロマトグラフィー
等の手法によるそれらの特異的精製手段も提供できる。

以下、本発明抗体の製法につき詳述する。

本発明抗体は、ＴＮＦ−αを免疫抗原として利用して製
造することができる。より具体的には、例えば上記免疫
抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺乳
動物の形質細胞腫細胞との融合細胞（ハイブリドーマ、
ｈ７ｂｒｉｄｏｍａ　）を作成し、これより所望抗体を
産生ずるクローンを選択し、該クローンの培養により製
造、採取することができる。

上記方法において用いられる免疫抗原としてのＴＮＦ−
αとしては、特に限定はなく、既に公知のインビトロで
誘導されたヒトＴＮＦを含有する培養上清乃至そ゛の精
製標品（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｆｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　　８２．　６６３７　（１９８５
）　）　、遺伝子組換え技術に従い製造されたヒ）ＴＮ
Ｆ（Ｎａｔｕｒｅ、３１２，７２４〜７２９　（１９８
４））及びそれらの一部のアミノ酸配列を有する合成ペ
プチド等のいずれでもよい。

また、上記方法において免疫抗原で免疫される哺乳動物
としては、特に制限はないが、細胞融合に使用する形質
細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく
、一般にはマウス、ラット等が有利に用いられる。

免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳動
物に静脈内、皮肉、皮下、腹腔内注射等により投与する
ことにより実施できる。より具体的には、免疫抗原を、
所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に
３〜５日毎に数回投与し、総投与量が約１００〜５００
μｇ／マウス程度になるようにするのが好ましい。免疫
抗原としては、上記最終投与の約３日後に摘出した牌臓
細胞を使用するのが好ましい。

更に、上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての
哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々の
もの、例えばｐ３（ｐ３／ｘ６３−Ａｇ８）（Ｎａｔｕ
ｔｅ　、２５６，４９５＝４９７（１９７５）　）　、
Ｉ）　３−Ｕｌ　［Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓｉｎ
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ７　ａｎｄ　１ｍｍｕｎｏｌ
ｏｇ７．　８１．　１−７（１９７８）　）　、Ｎ５−
１　［Ｅｕｒ、Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

６．５１１−５１９　（１９７６））、ＭＰＣ−１１［
Ｃｅ１１．８．４０５−４１５　（１９７６））、５Ｐ
２１０　（Ｎａｔｕｒｅ　、２７６．２６９−２７０（
１９７８）　）　、ＦＯ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅ
ｌｈ、。

３５、　１−２１　　（１９８０））　　、Ｘ６３．　
６．　５゜３、　　［Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２
３．　１５４８−１５５０　　（１９７９））、５１９
４　　（Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、１４８．３１３−３２３．（１９７８）１等
や、ラットにおけるＲ　２１０　（Ｎａｔｕｒｅ、　２
７７゜１３１−１３３　（１９７９））等の骨髄腫細胞
等を使用できる。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、公知の
方法、例えばマイルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）ら
の方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　　’Ｅｎｔ７ｍｏｌｏｇ
７．Ｖｏ１．　７３゜ｐｐ３　（１９８１））等に準じ
て行なうことができる。より具体的には、上記融合反応
は、通常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等の存在下に
、通常の培地中で実施され、培地には更に融合効率を高
めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応
じて添加することもできる。

免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方法と
変りはなく、例えば形質細胞腫細胞に対して免疫細胞を
約１〜１０倍程度用いるのが普通である。融合反応時の
培地としては、形質細胞腫細胞の増殖に通常使用される
各種のもの、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培
地、その他のこの種細胞培養に一般に利用されるものを
例示でき、通常速等培地は牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ）等の
血清補液を抜いておくのがよい。融合は上記免疫細胞と
形質細胞腫細胞との所定量を、上記培地内でよく混合し
、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分
子量１０００〜６０００程度のものを、通常培地に約３
０〜６０ｖ／ｖ％の濃度で加えて混ぜ合せることにより
行なわれる。以後、適当な培地を逐次添加して遠心し、
上清を除去する操作を繰返すことにより所望のハイブリ
ドーマが形成される。

得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用
培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行
なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブ
リドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充
分な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得
られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的
とする抗体の検索及び単一クローン化に供される。

目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬ　Ｉ　ＳＡ法（Ｅ
ｎｇｖａｌｌ、　　Ｅ、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｘ７ｍｏ
１．、７０．　４１９−４３９　（１９８０））　、プ
ラーク法、スポット法、凝集反応法、オクテｏニー　（
Ｏｕｃｈｔｅｔｌｏｎ７）法、ラジオイムノアッセイ（
ＲＩ　Ａ）法等の一般に抗体の検出に用いられている種
々の方法〔「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」
、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０−５３頁、昭
和５７年３月５日〕に従い実施することができ、この検
索には前記免疫抗原が利用できる。

かくして得られるヒトＴＮＦ−αを認識する所望のモノ
クローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、通常の培
地で継代培養することができ、また液体窒素中で長期間
保存することができる。

上記ハイブリドーマからの所望抗体の採取は、該ハイブ
リドーマを、常法に従って培養してその培養上清として
得る方法やハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動
物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が採
用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適し
ており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

また上記のごとくして得られる抗体は、更に塩析、ゲル
濾過法、アフイニテイクロマトグラフイー等の通常の手
段により精製することができる。

か（して得られる本発明のモノクローナル抗体は、ＴＮ
Ｆ−αに特異反応性を有する。

また本発明抗体中には、ヒトＴＮＦ−αの生物活性に対
して中和活性を有するタイプの抗体が包含され、かかる
抗体は生物活性のあるＴＮＦ−αの特異的測定に好適で
ある。更に本発明抗体中にはＴＮＦ−α分子の異なる部
位を認識し、抗体相互の立体障害がなく、同時にＴＮＦ
−α分子に結合できるタイプの抗体も包含され、かかる
抗体は例えばサンドイツチ法等による免疫検体に有効で
ある。更に加えて、本発明抗体中には液相系又は固相系
での反応性が特に優れたタイプの抗体が包含され、それ
らは液相系及び固相系免疫検定法に適用するのに適して
いる。

発明の効果 本発明によれば、ヒトＴＮＦ−αに特異的なモノクロー
ナル抗体が提供され、この本発明抗体の利用によれば、
測定感度が極めて高く、特異性に優れ、従って、例えば
臨床サンプル等の極めて低濃度のヒトＴＮＦ−αを含有
する検体中の、該ＴＮＦ−αを、正確に測定可能な免疫
検定法による測定手法が提供される。

以下、本発明をより詳しく説明するため実施例を挙げる
が、本発明は之等に限定されない。

実施例　１ 本発明抗体の製造 遺伝子組換え技術に従い製造したヒトＴＮＦ−ａ　（（
Ｎａｔｕｒｅ、　　３１２．　７２４〜７２９（１９８
４））の１０〜２０μｇを、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、完
全フロインドアジュバントと共に腹腔内投与した。３〜
４週問おきに、同量を不完全アジュバントと共に２回追
加投与して免疫した。

最終免疫の３〜４日後に、常法に準じて、細胞融合を行
なった（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｘ７ｍｏｌｏｇＬ　
　７３ｅ　ｐ９３　（１９８１）等参照〕。即ち、該細
胞融合は、上記免疫された肺細胞と骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ
１、Ｃｕｒｒｅｎｔ　　Ｔｏｐｉｃｓ　　ｉｎ　　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇ２　　ａｎｄ１ｍｍｕｎｏｌｏｇ７
．８１．　１−７　（１９７８）　）とを１０＝１の割
合で用い、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−４０００
）を用いて行なった。

ハイブリドーマを、ＨＡＴ培地で選別後、その上清を上
記ヒトＴＮＦ−αをコートした９６穴マイクロプレート
及びパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスグロブリン抗体
〔イー、ライ。ラブ（Ｅ。

Ｙ、Ｌａｂ、）社製〕を用いた酵素免疫測定法により試
験して、目的のヒトＴＮＦ−αに対する抗体産生株を検
出した。

限界希釈法によりクローニングを繰返して、所望の抗体
産生クローン７株を得た。之等をそれぞれｒＫＯｃＯ７
０１Ｊ〜ｒＫＯｃＯ７０７Ｊと命名し、之等から得られ
る本発明抗体をそれぞれｒＡＮＯｃ７０１Ｊ　〜ｒＡＮ
Ｏｃ７０７Ｊと命名する。

本出願人はそのうちの一株（本発明抗体産生ハイブリド
ーマＫＯＣＯ７０５）を、通産省工業技術院微生物工業
技術研究所（微工研）に、ｒｘｏｃ。

７０５」なる表示で、微工研条寄第２５６９号（ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−２５６９）として寄託した。

上記各クローンから得られた本発明抗体の特性を以下に
示す。

■　抗体のサブクラス マウス抗体サブクラス検出キット（バイオ・ラッド（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）社製）を用いて決定した。

結果は下記第１表の通りである。

第　　　１　　　表 ■　抗体産生レベル 腹水中のＩｇＧをＰ　ｒｏｔｅｉｎＡアフィニティを用
いて精製し、その濃度（ｍｇ／ｚＡ’）を０Ｄ２８ｏの
吸光度測定により求めた。但しＩ　ｇ　Ｇ　１　ｍｇ／
ｘｉのとき、０Ｄ２８ｏ＝１．４とした。

結果を下記第２表に示す。

第　　　２　　　表 単位まで中和できるかで決定された。

結果を下記第３表に示す。

第　　　３　　　表 ■　中和抗体力価 ＴＮＦのバイオアッセイノーつであるＬＭアッセイを用
いて腹水の中和抗体力価を求めた。該中和抗体力価は腹
水１７Ａ’がＴＮＦ−αの何°単位を１■　分子量 ハイブリドーマをマウスの腹腔内で培養した後、ＩｇＧ
精製キット（ＭＯＰＳ　　Ｋ目、バイオ・ラッド社製〕
により、Ｉ　ｇＧ、に精製したものを、２ＭＥ存在下５
ＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動させて、重鎮と軽鎖の分
子量を求め、その和を抗体の分子量とした。

結果を下記第４表に示す。

第　　　４ 表 １００μｇ　／　ｘｉ！になるように処理した。続いて
、５ＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、ニトロセルロースにブロ
ッティングして、各モノクローナル抗体との反応性を調
べた。

結果を下記第５表に示す。

第　　　５　　　表 ■　ウェスタンブロッティング分析 本発明抗体につき、特異的にＴＮＦ−αと結合し、大腸
菌と反応しないことを以下の方法により確かめた。即ち
、ｒＴＮＦ−αとこれを産生じている大腸菌をＳＤＳの
Ｌ７ｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｔで最終濃度が上記第５表より
、ＡＮＯＣ７０１，７０２，７０４，７０５，７０６及
び７０７は、特異的にＴＮＦ−αと結合し、大腸菌の蛋
白質とは反応しないことが判る。またＡＮＯＣ７０３は
ウェスタンブロッティングでｒＴＮＦ−αと反応しない
ことから立体構造を認識している可能性がある。

■　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ感度 モノクローナル抗体（ＡＮＯＣ７０１〜７０７）を、９
６穴マイクロプレートに１０μｇ　／　ｘｉにＰＢＳで
希釈して１００μ！ずつ分注し、４℃で一夜放置した。

１％スキムミルクでブロッキングした後、ＴＮＦ−αの
標準品を各ウェルに１００μｌずつ分注して４℃で一夜
反応させた。プレートを洗浄後、ＴＮＦ−αに対する兎
のポリクローナル抗体（ＯＣＴ７０１）１０００倍希釈
液を各ウェルに１００μ！ずつ分注して、室温で２時間
反応させた。プレートを洗浄後、ＰＯＤ標識ウサつＩｇ
Ｇヤギ抗体を各ウェルに１００μ！ずつ分注して、室温
で２時間反応させた。プレートを洗浄後、ＰＯＤの酵素
活性を測定した。

ＴＮＦ−αの０濃度と０Ｄ４９２の吸光度の差が０．１
になるＴＮＦ−αの濃度をＥＬ　Ｉ　ＳＡ感度とした。

結果を下記第６表に示す。

第　　　６　　　表 ■　ＥＬＩＳＡ法による標準曲線 モノクローナル抗体（ＡＮＯＣ７０５）を、９６穴マイ
クロプレートに１０μｇ／ｌ！にＰＢＳで希釈して１０
０μｌずつ分注し、４℃で−夜放置した。１％スキムミ
ルクでブロッキングした後、ＴＮＦ−αの標準品を各濃
度に希釈し、各ウェルに１００μｌずつトリプリケイト
に分注して４℃で一夜反応させた。プレートを洗浄後Ｔ
ＮＦ−αに対する兎のポリクローナル抗体（ＯＣＴ７０
１）１０００倍希釈液を各ウェルに１００μｌずつ分注
して、室温で２時間反応させた。プレートを洗浄後、Ｐ
ＯＤ標識ウサつＩｇＧヤギ抗体を各ウェルに１００μβ
ずつ分注して、室温で２時間反応させた。プレートを洗
浄後、結合したＰＯＤの酵素活性をＯ−フ二二レンジア
ミンを基質として０Ｄ４９２の吸光度測定により求めた
。

結果を下記第７表に示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトＴＮＦ−αに特異反応性を有することを特徴
   とするモノクローナル抗体。