JPH02234699A - β―ラクタマーゼの検出方法およびそれに用いるキット - Google Patents
β―ラクタマーゼの検出方法およびそれに用いるキットInfo
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- JPH02234699A JPH02234699A JP2006096A JP609690A JPH02234699A JP H02234699 A JPH02234699 A JP H02234699A JP 2006096 A JP2006096 A JP 2006096A JP 609690 A JP609690 A JP 609690A JP H02234699 A JPH02234699 A JP H02234699A
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
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- C12Q2326/92—Nitro blue tetrazolium chloride, i.e. NBT
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- G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、試薬の一つにβ−ラクタマーゼのセファロス
ボリン基質を用いる発色反応（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ
ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）を利用したアッセイ方法および
キットに関する。
ボリン基質を用いる発色反応（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ
ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）を利用したアッセイ方法および
キットに関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）β−
ラクタマーゼは、ある種の細菌によって産生される酵素
群である。これらの酵素は、β−ラクタム抗生物質治療
に対する耐性をこれらの細菌に付与する。β−ラクタマ
ーゼ産生能は、おそらく、細菌におけるβ−ラクタム抗
生物質耐性の最も重要で一般的な原因である。たとえば
、β−ラクタマーゼ産生閑に感染した患者をセファロス
ボリンで治療すると、このセファロスポリンは多くのβ
−ラクタマーゼにより認識され代謝産物に変換されてし
まい、抗生物質能はほとんどもしくは全くなくなる。β
−ラクタマーゼ活性について患者試料をスクリーニング
することにより、不適当な抗生物質治療から患者を回避
させることが可能となる。
ラクタマーゼは、ある種の細菌によって産生される酵素
群である。これらの酵素は、β−ラクタム抗生物質治療
に対する耐性をこれらの細菌に付与する。β−ラクタマ
ーゼ産生能は、おそらく、細菌におけるβ−ラクタム抗
生物質耐性の最も重要で一般的な原因である。たとえば
、β−ラクタマーゼ産生閑に感染した患者をセファロス
ボリンで治療すると、このセファロスポリンは多くのβ
−ラクタマーゼにより認識され代謝産物に変換されてし
まい、抗生物質能はほとんどもしくは全くなくなる。β
−ラクタマーゼ活性について患者試料をスクリーニング
することにより、不適当な抗生物質治療から患者を回避
させることが可能となる。
β−ラクタマーゼはまた、酵素イム／アッセイ（ＥＩＡ
ｓ）において標識としても用いられる。β−ラクタマー
ゼは、ターンオーバー数が非常に大きく、多くの市販源
から非常に高純度で容易に入手可能であり、リガンドー
抗体結合と両立する最適ｐＨを有し、比較的安定であり
、分子量が小さく、安価であり、生体液中には通常存在
しない。
ｓ）において標識としても用いられる。β−ラクタマー
ゼは、ターンオーバー数が非常に大きく、多くの市販源
から非常に高純度で容易に入手可能であり、リガンドー
抗体結合と両立する最適ｐＨを有し、比較的安定であり
、分子量が小さく、安価であり、生体液中には通常存在
しない。
これとは対照的に、他の一般的に用いられる酵素標識、
たとえばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどは、一般に上記利
点のすべてを有しているわけではない。たとえば、西洋
ワサビペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下で種々
の程度に不安定な色原体基質を必要とし、また西洋ワサ
ビベルオキシダーゼの色原体基質の免疫原性および変異
原性が潜在的問題として残る。他の不利な点としては、
西洋ワサビペルオキシダーゼ／ＩｇＧ結合体の収率が低
いこと、および結合後に酵素活性が失われることが挙げ
られる。さらに、西洋ワサビペルオキシダーゼは、異な
るｐＨ値において著しく異なる安定性特性を示す。西洋
ワサビペルオキシダーゼはまた、溶血の問題があること
、およびその基質がヘモグロビンと交差反応性を示すた
め使用が困難である。
たとえばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどは、一般に上記利
点のすべてを有しているわけではない。たとえば、西洋
ワサビペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下で種々
の程度に不安定な色原体基質を必要とし、また西洋ワサ
ビベルオキシダーゼの色原体基質の免疫原性および変異
原性が潜在的問題として残る。他の不利な点としては、
西洋ワサビペルオキシダーゼ／ＩｇＧ結合体の収率が低
いこと、および結合後に酵素活性が失われることが挙げ
られる。さらに、西洋ワサビペルオキシダーゼは、異な
るｐＨ値において著しく異なる安定性特性を示す。西洋
ワサビペルオキシダーゼはまた、溶血の問題があること
、およびその基質がヘモグロビンと交差反応性を示すた
め使用が困難である。
β−ガラクトシダーゼ基質は、しばしば高い割合で非酵
素的加水分解に供され、その結果、数多くの試験が失敗
に終わる。加えて、酵素結合により酵素活性が失われる
ことも起こり得る。最後に、β−ガラクトシダーゼの分
子量が大きいため、ある種の応用には問題がある。その
結果、β−ガラクトシダーゼを利用した市販品は、ある
としてもわずかである。
素的加水分解に供され、その結果、数多くの試験が失敗
に終わる。加えて、酵素結合により酵素活性が失われる
ことも起こり得る。最後に、β−ガラクトシダーゼの分
子量が大きいため、ある種の応用には問題がある。その
結果、β−ガラクトシダーゼを利用した市販品は、ある
としてもわずかである。
アルカリホスファターゼは、妥当な費用で容易に人手可
能な酵素である。しかしながら、アルカリホスファター
ゼの結合効率はかなり低く（一般に約５％）、しかも結
合後は、アルカリホスファ夕−ゼに結合したリガンドの
免疫学的活性のうちわずかに約１０％もしくはそれ以下
しか残らない。
能な酵素である。しかしながら、アルカリホスファター
ゼの結合効率はかなり低く（一般に約５％）、しかも結
合後は、アルカリホスファ夕−ゼに結合したリガンドの
免疫学的活性のうちわずかに約１０％もしくはそれ以下
しか残らない。
アルカリホスファターゼ結合体の熱的安定性は一般に非
常に低い。さらに、ヒトから採取した試料にはアルカリ
ホスファターゼが含まれているため、この内生のアルカ
リホスファターゼ活性から標識アルカリホスファターゼ
を検出することは困難である。
常に低い。さらに、ヒトから採取した試料にはアルカリ
ホスファターゼが含まれているため、この内生のアルカ
リホスファターゼ活性から標識アルカリホスファターゼ
を検出することは困難である。
（課題を解決するための手段）
本発明の目的は、試料中のβ−ラクタマーゼの検出方法
であって、 （ａ）該試料を〜般式Ｉ： （式中、Ｒ．は、β−ラクタマーゼによる被認識能を維
持する基；Ｒ，は、それが結合する硫黄原子と一緒にな
って脱離基を形成し、その際、その共役酸の水中におけ
るｐＫａは８未満である，Ｍは、水素原子または第Ｉ族
金属原子である）で示されるβ−ラクタマーゼ基質にさ
らし、 （ｂ）該脱離基を一般式■． Ｘ６ （式中、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ、得られる
テトラゾリウム塩の酸化還元電位を０もしくは低ボルト
になるように選択した基；Ｘは、アニオンである）で示
されるテトラゾリウム塩にさらして、該脱離基の存在下
で発色沈澱を生成させ、つｌ１ いで （ｃ）該発色沈澱をモニターして活性β−ラクタマーゼ
の存在を検出する ことを特徴とする方法； 試料中のβ−ラクタマーゼを検出するためのアッセイキ
ットであって、 （ａ）上記一般式Ｉで示されるβ〜ラクタマーゼ基質、
および （ｂ）上記一般式ＩＩで示されるテトラゾリウム塩から
なるアッセイキット・および 試料中のリガンドを検出するためのアッセイキットであ
って、 （ａ）該リガンドに対する特異的結合成分と上記一般式
■で示されるβ−ラクタマーゼ基質の結合体、および （ｂ）上記一般式ＩＩで示されるテトラゾリウム塩から
なるアッセイキットを提供することにある。
であって、 （ａ）該試料を〜般式Ｉ： （式中、Ｒ．は、β−ラクタマーゼによる被認識能を維
持する基；Ｒ，は、それが結合する硫黄原子と一緒にな
って脱離基を形成し、その際、その共役酸の水中におけ
るｐＫａは８未満である，Ｍは、水素原子または第Ｉ族
金属原子である）で示されるβ−ラクタマーゼ基質にさ
らし、 （ｂ）該脱離基を一般式■． Ｘ６ （式中、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ、得られる
テトラゾリウム塩の酸化還元電位を０もしくは低ボルト
になるように選択した基；Ｘは、アニオンである）で示
されるテトラゾリウム塩にさらして、該脱離基の存在下
で発色沈澱を生成させ、つｌ１ いで （ｃ）該発色沈澱をモニターして活性β−ラクタマーゼ
の存在を検出する ことを特徴とする方法； 試料中のβ−ラクタマーゼを検出するためのアッセイキ
ットであって、 （ａ）上記一般式Ｉで示されるβ〜ラクタマーゼ基質、
および （ｂ）上記一般式ＩＩで示されるテトラゾリウム塩から
なるアッセイキット・および 試料中のリガンドを検出するためのアッセイキットであ
って、 （ａ）該リガンドに対する特異的結合成分と上記一般式
■で示されるβ−ラクタマーゼ基質の結合体、および （ｂ）上記一般式ＩＩで示されるテトラゾリウム塩から
なるアッセイキットを提供することにある。
本発明は、ある種の感染性細菌を含む試料中のβ−ラク
タマーゼを検出するための方法およびキット、さらに標
識としてβ−ラクタマーゼを泪いた酵素イム／アッセイ
に関する。本発明の方法には、試料を上記一般式■で示
されるβ−ラクタマーゼ基質にさらすことにより、試料
中のβ−ラクタマーゼ活性を検出することが含まれる。
タマーゼを検出するための方法およびキット、さらに標
識としてβ−ラクタマーゼを泪いた酵素イム／アッセイ
に関する。本発明の方法には、試料を上記一般式■で示
されるβ−ラクタマーゼ基質にさらすことにより、試料
中のβ−ラクタマーゼ活性を検出することが含まれる。
上記一般式Ｉにおいて、ＲＩは、β−ラクタマーゼによ
る該セファロスボリン基質Ｉの被認識能を維持する基で
ある。この化合物がβ−ラクタマーゼにさらされると、
基Ｒ，は、それが結合している硫黄原子ととともに脱離
基を生成する。その際、該脱離基の共役酸の水中におけ
るｐＫａ値は８未満である。
る該セファロスボリン基質Ｉの被認識能を維持する基で
ある。この化合物がβ−ラクタマーゼにさらされると、
基Ｒ，は、それが結合している硫黄原子ととともに脱離
基を生成する。その際、該脱離基の共役酸の水中におけ
るｐＫａ値は８未満である。
Ｍは水素原子または第Ｉ族金属である。β−ラクタマー
ゼ含有試料を一般式Ｉの化合物にさらして脱離基が生成
した後、この脱離基を上記一般式ＩＩで示されるテトラ
ゾリウム塩にさらす。一般式■においてＲ３、Ｒ４およ
びＲ，は、それぞれ、得られるテトラゾリウム塩の酸化
還元電位をＯもしくは低ボルトになるように選択した基
である。Ｘはアニオンである。
ゼ含有試料を一般式Ｉの化合物にさらして脱離基が生成
した後、この脱離基を上記一般式ＩＩで示されるテトラ
ゾリウム塩にさらす。一般式■においてＲ３、Ｒ４およ
びＲ，は、それぞれ、得られるテトラゾリウム塩の酸化
還元電位をＯもしくは低ボルトになるように選択した基
である。Ｘはアニオンである。
基質Ｉの該脱離基が上記テトラゾリウム塩にさらされる
と、該脱離基の存在下でホルマザンの発色沈澱が生成し
、このことにより試料がβ−ラクタマーゼを含有するこ
とが示される。
と、該脱離基の存在下でホルマザンの発色沈澱が生成し
、このことにより試料がβ−ラクタマーゼを含有するこ
とが示される。
本発明はまた、試料中のβ−ラクタマーゼを検出するた
めのキット、および標識としてβ−ラクタマーゼを用い
たアッセイをも提供する。
めのキット、および標識としてβ−ラクタマーゼを用い
たアッセイをも提供する。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明は、β−ラクタマーゼの検出のための方法および
キットに関する。本発明の方法およびキットにより検出
するのに好ましい酵素は、セファロスポリナーゼと称さ
れるβ−ラクタマーゼのサブクラスである。本発明のキ
ットおよび方法には、一般式ＩＩで示されるテトラゾリ
ウム塩の存在下、上記酵素を一般式Ｉで示されるセファ
ロスポリンにさらすことが含まれる（下記反応式を参照
）。
キットに関する。本発明の方法およびキットにより検出
するのに好ましい酵素は、セファロスポリナーゼと称さ
れるβ−ラクタマーゼのサブクラスである。本発明のキ
ットおよび方法には、一般式ＩＩで示されるテトラゾリ
ウム塩の存在下、上記酵素を一般式Ｉで示されるセファ
ロスポリンにさらすことが含まれる（下記反応式を参照
）。
（Ｎ）
β−ラクタマーゼは基質■中のラクタム環を開裂して中
間体化合物ＩＡを生成し、この中間体化合物から一般式
■の脱離基が生成する。この脱離基は一般式■のテトラ
ゾリウム塩と反応してホルマザン（一般式■）の発色沈
澱を生成し、β−ラクタマーゼの存在または量が示され
る。
間体化合物ＩＡを生成し、この中間体化合物から一般式
■の脱離基が生成する。この脱離基は一般式■のテトラ
ゾリウム塩と反応してホルマザン（一般式■）の発色沈
澱を生成し、β−ラクタマーゼの存在または量が示され
る。
Ｒ，の定義
上記Ｒ，は、一般式Ｉの基質がβ−ラクタマーゼによっ
て基質として認識され、β−ラクタム環を開裂する能力
を維持する基である。Ｒ，は、アセトアミド基によりラ
クタム環に結合した置換もしくは非置換フェニル基、ア
セトアミド基によりラクタム環に結合した置換もしくは
非置換脂肪族炭化水素基、またはアセトアミド基により
ラクタム環に結合した置換もしくは非置換直鎖もしくは
分枝鎖脂肪族炭化水素鎖であってよい。上記基の適当な
置換基としては、ハロゲン原子、シアノ基、スルホキシ
基またはスルホニル基が挙げられる。
て基質として認識され、β−ラクタム環を開裂する能力
を維持する基である。Ｒ，は、アセトアミド基によりラ
クタム環に結合した置換もしくは非置換フェニル基、ア
セトアミド基によりラクタム環に結合した置換もしくは
非置換脂肪族炭化水素基、またはアセトアミド基により
ラクタム環に結合した置換もしくは非置換直鎖もしくは
分枝鎖脂肪族炭化水素鎖であってよい。上記基の適当な
置換基としては、ハロゲン原子、シアノ基、スルホキシ
基またはスルホニル基が挙げられる。
Ｒ，はまた、アミ７基、置換もしくは非置換アルキルア
ミノ基、置換もしくは非置換アリールアミノ基、または
置換もしくは非置換芳香族もしくは非芳香族異項環置換
アミン基であってもよい。
ミノ基、置換もしくは非置換アリールアミノ基、または
置換もしくは非置換芳香族もしくは非芳香族異項環置換
アミン基であってもよい。
アルキルアミノ基およびアリールアミ７基は、脂肪族直
鎖もしくは分枝鎖かまたは脂環基で置換されていてもよ
い。
鎖もしくは分枝鎖かまたは脂環基で置換されていてもよ
い。
Ｒ，はまた、一般式：
ｎ
（式中、Ｒ８は低級脂肪族基、Ｒ７はアミン基またはア
ルキルアミ７基、Ｄは酸素原子または硫黄原子である）
で示される基であってもよい。Ｒ，はまた、一般式： Ｒ８ｌ （式中、Ｒ８は４〜６員異項環である）で示される基で
あってもよい。
ルキルアミ７基、Ｄは酸素原子または硫黄原子である）
で示される基であってもよい。Ｒ，はまた、一般式： Ｒ８ｌ （式中、Ｒ８は４〜６員異項環である）で示される基で
あってもよい。
Ｒ，の好ましい例示としは、
チオフェン−２−アセトアミト
フェニル−２−アセトアミド
フエノキシ−２−アセトアミド：
Ｏ
α一Ｄ−２−アミノアジパミド：
Ｏ
２−アミノ−２−フェニルアセトアミド：テトラゾリル
アセトアミド： ４−ピリジルチオアセトアミド： ｌ９ スルホニル基が含まれる。
アセトアミド： ４−ピリジルチオアセトアミド： ｌ９ スルホニル基が含まれる。
これらは、可能なＲ，置換基の代表例を例示したものに
過ぎない。当業者であれば、妥当な実験により、セファ
ロスポリンの代わりに一般式Ｉの化合物がβ−ラクタマ
ーゼの基質として働く能力を保持させるような他のＲ，
置換基を見出すことであろう。
過ぎない。当業者であれば、妥当な実験により、セファ
ロスポリンの代わりに一般式Ｉの化合物がβ−ラクタマ
ーゼの基質として働く能力を保持させるような他のＲ，
置換基を見出すことであろう。
Ｒ，の定義
上記Ｒ，は、それが結合している硫黄原子とともに脱離
基を生成する。β−ラクタマーゼにより触媒されたβ−
ラクタム環の開裂の結果、この脱離基が溶液中に放出さ
れる。この脱離基の共役酸は、一般式■のテトラゾリウ
ム塩が還元されて上記一般式■のホルマザンの発色沈澱
を生成することができるように、約１０未満のｐＫａ値
を有していなければならない。上記脱離基によるテトラ
ゾリウム塩の発色ホルマザンへの還元反応はｐＨ依存性
であり、溶液のｐＨを上げることにより促進される。従
って、還元はｐＨ６．０〜９．０、好ましくはｐＨ７．
０で行なわれるので、最も好ましい２−（２〜アミノー
４−チアゾリル）−２−（メトキシイミノ）アセトアミ
ド： ２−（２−アミノ−４−チアゾリル）−２−（カルポキ
シメトキシイミノ）アセトアミド・２−（２−アミノ−
４−チアゾリル）−２−（ヒドロキシイミノ）アセトア
ミド： Ｒ，にはまた、アルコキシ力ルボニル基、ハロゲン原子
、シアノ基、スルホキシ基またはアミノ脱離基はこれら
ｐＨ範囲で顕著に脱プロトン化されるもの、たとえば８
もしくはそれ以下のｐＫａ値を有するチオール類である
。当然、この条件は当業者にとって広範囲の脱離基を示
唆するものであり、妥当な実験によって確かめることが
できる。
基を生成する。β−ラクタマーゼにより触媒されたβ−
ラクタム環の開裂の結果、この脱離基が溶液中に放出さ
れる。この脱離基の共役酸は、一般式■のテトラゾリウ
ム塩が還元されて上記一般式■のホルマザンの発色沈澱
を生成することができるように、約１０未満のｐＫａ値
を有していなければならない。上記脱離基によるテトラ
ゾリウム塩の発色ホルマザンへの還元反応はｐＨ依存性
であり、溶液のｐＨを上げることにより促進される。従
って、還元はｐＨ６．０〜９．０、好ましくはｐＨ７．
０で行なわれるので、最も好ましい２−（２〜アミノー
４−チアゾリル）−２−（メトキシイミノ）アセトアミ
ド： ２−（２−アミノ−４−チアゾリル）−２−（カルポキ
シメトキシイミノ）アセトアミド・２−（２−アミノ−
４−チアゾリル）−２−（ヒドロキシイミノ）アセトア
ミド： Ｒ，にはまた、アルコキシ力ルボニル基、ハロゲン原子
、シアノ基、スルホキシ基またはアミノ脱離基はこれら
ｐＨ範囲で顕著に脱プロトン化されるもの、たとえば８
もしくはそれ以下のｐＫａ値を有するチオール類である
。当然、この条件は当業者にとって広範囲の脱離基を示
唆するものであり、妥当な実験によって確かめることが
できる。
好ましい脱離基としては、脂肪族もしくは芳香族チオー
ル；ハロゲンもしくはアミノ置換チオフェノール；ヒド
ロキシ、ハロゲンもしくはアミン置換メルカブトピリジ
ン；脂肪族もしくは芳香族チオール酸；チオスルホン酸
；およびメルカプトアミノ酸が挙げられる。そのような
好ましい脱離基の具体例としては、ｐ−プロモチオフェ
ノール、ｐアミノチオフェノール、２−メルカブト−３
−ピリジノール、チオール酢酸、チオ安息香酸、および
システインなどが挙げられる。
ル；ハロゲンもしくはアミノ置換チオフェノール；ヒド
ロキシ、ハロゲンもしくはアミン置換メルカブトピリジ
ン；脂肪族もしくは芳香族チオール酸；チオスルホン酸
；およびメルカプトアミノ酸が挙げられる。そのような
好ましい脱離基の具体例としては、ｐ−プロモチオフェ
ノール、ｐアミノチオフェノール、２−メルカブト−３
−ピリジノール、チオール酢酸、チオ安息香酸、および
システインなどが挙げられる。
Ｒ３〜Ｒ５の定義
Ｒ３〜Ｒ，は、それぞれ、得られたテトラゾリウム塩の
酸化還元電位（レーニンジャー（Ｌ ｅｈｎｉｎｇｅｒ
）のプリンシブルズ・オブ・バイオケミストリー（Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
、ウオース●バブソツシャーズ（Ｗａｒｔｈ Ｐ ｕｂ
ｌｉｓｈｅｒｓ）、１９８２、４７０〜４７５頁に“′
Ｅ゛。゜゜として定義されている）が０もしくは低ボル
トになるような基から選択される。Ｒ３〜Ｒ，は、それ
ぞれ、フエニル基、ｐ−ヨードフェニル基、ｐ−ニトロ
フェニル基、ナフチル基、チアゾリル基、アルキルチア
ゾリル基、ベンゾチアゾリル基、フタリルヒドラジジル
基、スチリル基、ビフェニル基、３−ビフェニレンー２
．５−ジフェニルテトラゾリウム、クロリド基、３−ジ
メトキシ−４−ビフェニレン−２，５−ジフェニルテト
ラゾリウムクロリド基、３−ジメトキシ−４−ビフェニ
レン−２−ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルテトラゾ
リウムクロリド基または３−ジメトキシ−４−−ビフェ
ニレン−２．５−ｐ−二トロフエニルテトラゾリウムク
ロリド基から選ばれてよい。
酸化還元電位（レーニンジャー（Ｌ ｅｈｎｉｎｇｅｒ
）のプリンシブルズ・オブ・バイオケミストリー（Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
、ウオース●バブソツシャーズ（Ｗａｒｔｈ Ｐ ｕｂ
ｌｉｓｈｅｒｓ）、１９８２、４７０〜４７５頁に“′
Ｅ゛。゜゜として定義されている）が０もしくは低ボル
トになるような基から選択される。Ｒ３〜Ｒ，は、それ
ぞれ、フエニル基、ｐ−ヨードフェニル基、ｐ−ニトロ
フェニル基、ナフチル基、チアゾリル基、アルキルチア
ゾリル基、ベンゾチアゾリル基、フタリルヒドラジジル
基、スチリル基、ビフェニル基、３−ビフェニレンー２
．５−ジフェニルテトラゾリウム、クロリド基、３−ジ
メトキシ−４−ビフェニレン−２，５−ジフェニルテト
ラゾリウムクロリド基、３−ジメトキシ−４−ビフェニ
レン−２−ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルテトラゾ
リウムクロリド基または３−ジメトキシ−４−−ビフェ
ニレン−２．５−ｐ−二トロフエニルテトラゾリウムク
ロリド基から選ばれてよい。
テトラゾリウム塩は、一群の異項環芳香族化合物である
。テトラゾリウム塩は、無色かまたは非常にかすかに色
がついており、そのイオン特性によって自由に水中に溶
解する。テトラゾリウム塩は還元されるとホルマザン（
すなわち一般式■で示される化合物）と呼ばれる水に不
溶性で発色度の高い化合物を生成する。数多くのテトラ
ゾリウム塩が市販もしくは文献に報告されており、これ
らは上記脱離基にさらされると発色沈澱を生成する。代
表的なテトラゾリウム塩の例としては、２，３．５−ト
リフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ） ２−ｐ−ヨードフェニル−３−ｐ−−ニトロフェニル５
−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）
： ３−ナフチル−２．５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリ
ウムクロリド（ＴＶ）： ３−（４．５−ジメチル−２−チアゾリル）−２．５ジ
フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）： ３，３゜−（４．４’−ビフエニレン）一ビスー（２，
５一ジフェニル−２Ｈ テトラゾリウム）クロリド（Ｎ Ｔ）： ２−（２−ペンズチアゾリル’）− ３−（４−フタリ
ルヒドラジジル）−５−スチリル−２Ｈ−テトラゾリウ
ムブロミド（Ｂ Ｐ Ｓ Ｔ）：３，３″−（３．３’
−ジメトキシ−４，４”−ビフェニレン）一ビス−（２
，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）クロリド（
ＢＴ）： ３，３′−（３，３’−ジメトキシ−４，４゛−ビフエ
ニレン）一ビス−（２−ｐ−ニトロフェニル−５一フェ
ニル−２Ｈ−テトラゾリウム）クロリド（ＮＢＴ） ３．３’−（３．３′−ジメトキシ−４ ４′−ビフェ
ニレン）一ビス−（２．５−ジ（ｐ−ニトロフェニル）
２Ｈ−テトラゾリウム）クロリド（ＴＮＢＴ）：上記テ
トラゾリウム塩の種々のｐＨ値に対する酸化還元電位（
Ｅ’。）を第１表に示す。
。テトラゾリウム塩は、無色かまたは非常にかすかに色
がついており、そのイオン特性によって自由に水中に溶
解する。テトラゾリウム塩は還元されるとホルマザン（
すなわち一般式■で示される化合物）と呼ばれる水に不
溶性で発色度の高い化合物を生成する。数多くのテトラ
ゾリウム塩が市販もしくは文献に報告されており、これ
らは上記脱離基にさらされると発色沈澱を生成する。代
表的なテトラゾリウム塩の例としては、２，３．５−ト
リフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ） ２−ｐ−ヨードフェニル−３−ｐ−−ニトロフェニル５
−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）
： ３−ナフチル−２．５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリ
ウムクロリド（ＴＶ）： ３−（４．５−ジメチル−２−チアゾリル）−２．５ジ
フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）： ３，３゜−（４．４’−ビフエニレン）一ビスー（２，
５一ジフェニル−２Ｈ テトラゾリウム）クロリド（Ｎ Ｔ）： ２−（２−ペンズチアゾリル’）− ３−（４−フタリ
ルヒドラジジル）−５−スチリル−２Ｈ−テトラゾリウ
ムブロミド（Ｂ Ｐ Ｓ Ｔ）：３，３″−（３．３’
−ジメトキシ−４，４”−ビフェニレン）一ビス−（２
，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）クロリド（
ＢＴ）： ３，３′−（３，３’−ジメトキシ−４，４゛−ビフエ
ニレン）一ビス−（２−ｐ−ニトロフェニル−５一フェ
ニル−２Ｈ−テトラゾリウム）クロリド（ＮＢＴ） ３．３’−（３．３′−ジメトキシ−４ ４′−ビフェ
ニレン）一ビス−（２．５−ジ（ｐ−ニトロフェニル）
２Ｈ−テトラゾリウム）クロリド（ＴＮＢＴ）：上記テ
トラゾリウム塩の種々のｐＨ値に対する酸化還元電位（
Ｅ’。）を第１表に示す。
上記テトラゾリウム塩を用いて行うことができる。
そのようなアッセイの一つの態様では、β−ラクタマー
ゼ産生菌の存在は、そのような細菌を含んでいると思わ
れる生物学的流体試料中に上記一般式Ｉの化合物および
一般式■の化合物を導入することによって検出すること
ができる。もしもβラクタマーゼ産生菌が存在している
と、化合物Ｉは開裂され、一般式■で示される還元基を
放出する。この還元基は一般式ＩＩで示されるテトラゾ
リウム塩を還元して一般式■で示される発色ホルマザン
化合物を生成する。
ゼ産生菌の存在は、そのような細菌を含んでいると思わ
れる生物学的流体試料中に上記一般式Ｉの化合物および
一般式■の化合物を導入することによって検出すること
ができる。もしもβラクタマーゼ産生菌が存在している
と、化合物Ｉは開裂され、一般式■で示される還元基を
放出する。この還元基は一般式ＩＩで示されるテトラゾ
リウム塩を還元して一般式■で示される発色ホルマザン
化合物を生成する。
本発明のβ−ラクタマーゼ産生菌のアッセイキットには
、同じ溶液中かまたは別の溶液中に入れた、または溶液
にするための乾燥形で供給される一般式Ｉおよび■の化
合物が含まれる。このキットには、適当なバッファーも
しくは希釈溶液が含まれていてよい。加えて、このキッ
トに電子伝達体（すなわち促進剤）を用いて一般式Ｉの
化合物および一般式■の化合物の混合物中に導入するの
が望ましい。促進剤とは、上記脱離基によって瞬間的に
鼻土人 一般的な定義 本明細書において、「ハロゲン」とはクロロ基、ブロモ
基、フルオロ基またはヨード基をさし、また「Ｃ，〜Ｃ
８アルキル基」とはメチル基、エチル基、プロビル基、
イソプロビル基、ブチル基などを含む低級アルキル基を
さす。
、同じ溶液中かまたは別の溶液中に入れた、または溶液
にするための乾燥形で供給される一般式Ｉおよび■の化
合物が含まれる。このキットには、適当なバッファーも
しくは希釈溶液が含まれていてよい。加えて、このキッ
トに電子伝達体（すなわち促進剤）を用いて一般式Ｉの
化合物および一般式■の化合物の混合物中に導入するの
が望ましい。促進剤とは、上記脱離基によって瞬間的に
鼻土人 一般的な定義 本明細書において、「ハロゲン」とはクロロ基、ブロモ
基、フルオロ基またはヨード基をさし、また「Ｃ，〜Ｃ
８アルキル基」とはメチル基、エチル基、プロビル基、
イソプロビル基、ブチル基などを含む低級アルキル基を
さす。
「共役酸」とは、脱離基アニオンにプロトン付与された
化学種をいう。
化学種をいう。
アッセイ法およびアッセイキット
アッセイは上記セファロスポリン誘導体および還元され
、ついでテトラゾリウム塩に電子を放出することにより
直ちに再酸化される分子種をいう。
、ついでテトラゾリウム塩に電子を放出することにより
直ちに再酸化される分子種をいう。
この促進剤は、上記脱離基からテトラゾリウム塩への電
子の移動を助ける。促進剤を使用することにより、反応
のスピードは大幅にアップする。好ましい促進剤として
は、フェナジンメトサルフエート（ＰＭＳ）、フェナジ
ンエトサルフェート、１アルコキシフェナジニウムメト
サルフェート、およびメルドラブルーが挙げられる。
子の移動を助ける。促進剤を使用することにより、反応
のスピードは大幅にアップする。好ましい促進剤として
は、フェナジンメトサルフエート（ＰＭＳ）、フェナジ
ンエトサルフェート、１アルコキシフェナジニウムメト
サルフェート、およびメルドラブルーが挙げられる。
上記試薬はまた、β−ラクタマーゼを特異的結合成分の
標識として用いたアッセイにおいても用いることができ
る。ここで「特異的結合成分」とは、特定のリガンドに
対しては特異的結合親和性を示すが他のものには実質的
に親和性を示さない（一群の）物質を意味する。「リガ
ンド」とは、試料中で存在または量を検出しようとする
（一群の）物質をいう。たとえば、特異的結合成分は抗
体であり、リガンドは該抗体に結合する、試料中の検出
すべき医薬、タンパク質などであってよい。逆に、特異
的結合成分が、試料中で検出しようとする抗体に結合す
る医薬、タンパク質などであってよい。
標識として用いたアッセイにおいても用いることができ
る。ここで「特異的結合成分」とは、特定のリガンドに
対しては特異的結合親和性を示すが他のものには実質的
に親和性を示さない（一群の）物質を意味する。「リガ
ンド」とは、試料中で存在または量を検出しようとする
（一群の）物質をいう。たとえば、特異的結合成分は抗
体であり、リガンドは該抗体に結合する、試料中の検出
すべき医薬、タンパク質などであってよい。逆に、特異
的結合成分が、試料中で検出しようとする抗体に結合す
る医薬、タンパク質などであってよい。
特異的結合成分／リガンドペアの他の例としては、酵素
／酵素レセプター、炭水化物／レクチン、核酸の相補鎖
などが挙げられる。
／酵素レセプター、炭水化物／レクチン、核酸の相補鎖
などが挙げられる。
標識特異的結合成分は、種々の異なる仕方でリガントの
アソセイに用いることができる。このアノセイは、不均
一もしくは均一アッセイ、前進（ｆｏｒｗａｒｄ）もし
くは逆アッセイ、またはリポソーム溶解イムノアッセイ
であってよい。
アソセイに用いることができる。このアノセイは、不均
一もしくは均一アッセイ、前進（ｆｏｒｗａｒｄ）もし
くは逆アッセイ、またはリポソーム溶解イムノアッセイ
であってよい。
本発明の試薬を用いたリガンドのアッセイキットには、
特異的結合成分に結合したβ−ラクタマーゼ、一般式Ｈ
のテトラゾリウム塩および一般式Ｉの基質が含まれる。
特異的結合成分に結合したβ−ラクタマーゼ、一般式Ｈ
のテトラゾリウム塩および一般式Ｉの基質が含まれる。
適当なバッファ一溶液などが含まれていてもよい。加え
て、上記脱離基からテトラゾリウム塩への電子の移動を
助けるために、電子伝達体（すなわち促進剤）を用いる
のが望ましい。
て、上記脱離基からテトラゾリウム塩への電子の移動を
助けるために、電子伝達体（すなわち促進剤）を用いる
のが望ましい。
つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。なお、実
施例１では、一般弐Ｉの基質（７チオフエニ−ルアセト
アミド−３−チオアセトキシメチル−３−セフエム−４
−カルボン酸ナトリウム塩）を用いたアッセイを記載す
る。実施例２では、一般式■の基質を用いたβ一ｈＣＧ
アッセイを記載する。実施例３では、他のβ一ｈＣＧア
ッセイを記載する。実施例４では、本発明の試薬の感度
を示す。実施例５では、他のβ−ラクタマーゼアッセイ
を記載する。
が、本発明はこれらに限られるものではない。なお、実
施例１では、一般弐Ｉの基質（７チオフエニ−ルアセト
アミド−３−チオアセトキシメチル−３−セフエム−４
−カルボン酸ナトリウム塩）を用いたアッセイを記載す
る。実施例２では、一般式■の基質を用いたβ一ｈＣＧ
アッセイを記載する。実施例３では、他のβ一ｈＣＧア
ッセイを記載する。実施例４では、本発明の試薬の感度
を示す。実施例５では、他のβ−ラクタマーゼアッセイ
を記載する。
実施例１
β−ラクタマーゼ産生菌のアッセイ
Ａ， ７−チオフェニルアセトアミド−３−チオアセ
１・キシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸ナトリ
ウム塩の合成： 上記反応式に示すように、チオール酢酸（０．７７６ｇ
、１０ ２ミリモル）および炭酸水素ナトリウム（０．
８５７ｇ、１０、２ミリモル）を水（３０叶）中に溶解
し、５０゜Ｃに加温した。この温めた溶液をシリカゲル
で濾過し、水（１０ｍの中のセファロチン（１．４３９
、３．４ミリモル）の溶液に加えた。
１・キシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸ナトリ
ウム塩の合成： 上記反応式に示すように、チオール酢酸（０．７７６ｇ
、１０ ２ミリモル）および炭酸水素ナトリウム（０．
８５７ｇ、１０、２ミリモル）を水（３０叶）中に溶解
し、５０゜Ｃに加温した。この温めた溶液をシリカゲル
で濾過し、水（１０ｍの中のセファロチン（１．４３９
、３．４ミリモル）の溶液に加えた。
この反応混合物を５０°Ｃで３１時間撹拌した。室温に
冷却した後、水を真空蒸発によって除き、得られた残渣
をメチルアルコール中に溶解した。ジエチルエーテルを
加えて粗製の生成物を沈澱させ、この固体を酢酸エチル
でトリチュレートした。純粋な７−チオフェニルアセト
アミド−３−チオアセトキシメチル−３−セフェム−４
−カルボン酸ナトリウム塩（１．１６９）が得られるま
で沈澱およびトリチュレートを繰り返した。
冷却した後、水を真空蒸発によって除き、得られた残渣
をメチルアルコール中に溶解した。ジエチルエーテルを
加えて粗製の生成物を沈澱させ、この固体を酢酸エチル
でトリチュレートした。純粋な７−チオフェニルアセト
アミド−３−チオアセトキシメチル−３−セフェム−４
−カルボン酸ナトリウム塩（１．１６９）が得られるま
で沈澱およびトリチュレートを繰り返した。
融点：２０７〜２１０℃（分解）
Ｉ Ｒ（Ｋ Ｂｒ， ｃｒ’）：３ ２ ９ ０、１７
５０、１６５０、１６００、１５３０、１４００、１３
５５ＮＭＲ（Ｄ．Ｏ、δ）：２．３０（３Ｈ，ｓ）、３
．４５（２Ｈ，ｄｄ）、３． ８ ５ （２ Ｈ， ｄ
ｄ）、３．９０（２Ｈ，ｓ）、５．０５（ＩＨＳａ）、
５．６０（ＩＨＳｄ）、７．００（２Ｈ，ｄ）、７．３
０（ＩＨ，ｔ） Ｂ．β−ラクタマーゼアッセイ： ファットマン（Ｗｈａｔｍａｎ） ＃ ｌ濾紙ディスク
に０．０５Ｍリン酸バッファ一（ｐＨ７．０）を含浸さ
せ、乾燥させた。このディスクを脱イオン水中のＩＮＴ
（ｌＸ １０−３Ｍ）、ＰＭＳ（２．５Ｘ ＩＯ−５Ｍ
）および上記工程Ａのセファロスポリン基質（２．５Ｘ
１ ０−３Ｍ）の溶液で飽和させた。このディスクを高
真空下、室温、暗所にて乾燥させた。ついで、これらの
ディスクからカッティングしたストリップを、エンテロ
バクター・クロアヵエ（ Ｅ ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ｃｌｏａｃａｅ）からの種々の濃度のβ−ラクタマー
ゼ中に浸した。目に見える色の変化が観察され、ストリ
ップは赤みがかったピンク色に変わった。
５０、１６５０、１６００、１５３０、１４００、１３
５５ＮＭＲ（Ｄ．Ｏ、δ）：２．３０（３Ｈ，ｓ）、３
．４５（２Ｈ，ｄｄ）、３． ８ ５ （２ Ｈ， ｄ
ｄ）、３．９０（２Ｈ，ｓ）、５．０５（ＩＨＳａ）、
５．６０（ＩＨＳｄ）、７．００（２Ｈ，ｄ）、７．３
０（ＩＨ，ｔ） Ｂ．β−ラクタマーゼアッセイ： ファットマン（Ｗｈａｔｍａｎ） ＃ ｌ濾紙ディスク
に０．０５Ｍリン酸バッファ一（ｐＨ７．０）を含浸さ
せ、乾燥させた。このディスクを脱イオン水中のＩＮＴ
（ｌＸ １０−３Ｍ）、ＰＭＳ（２．５Ｘ ＩＯ−５Ｍ
）および上記工程Ａのセファロスポリン基質（２．５Ｘ
１ ０−３Ｍ）の溶液で飽和させた。このディスクを高
真空下、室温、暗所にて乾燥させた。ついで、これらの
ディスクからカッティングしたストリップを、エンテロ
バクター・クロアヵエ（ Ｅ ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ｃｌｏａｃａｅ）からの種々の濃度のβ−ラクタマー
ゼ中に浸した。目に見える色の変化が観察され、ストリ
ップは赤みがかったピンク色に変わった。
最大の色の変化はｌＸＩＯ−５Ｍのβ−ラクタマーゼ（
ストリップ上に５Ｘ１０−”モル沈積）で観察され、検
出能の限度は１ｘｌＯ−８Ｍ（ストリップ上に５Ｘ１０
−１３モル沈積）であった。
ストリップ上に５Ｘ１０−”モル沈積）で観察され、検
出能の限度は１ｘｌＯ−８Ｍ（ストリップ上に５Ｘ１０
−１３モル沈積）であった。
Ｃ．対照実験：
対照として、β−ラクタマーゼを用いずに上記工程Ｂに
記載の方法に従って溶液を調製し、同様に分析した。酵
素を含まない脱イオン水中に浸したストリップからは色
の変化は観察されなかった。
記載の方法に従って溶液を調製し、同様に分析した。酵
素を含まない脱イオン水中に浸したストリップからは色
の変化は観察されなかった。
実施例２
Ａ．抗β一ｈＣＧ ＩｇＧの産生：
ｈＣＧの精製βサブユニットをアジュバントとともにヤ
ギに接種することにより、β一ｈＣＧに対する抗体を産
生させた。ついで、この乳濁液をわき窩領域および鼠跋
部領域に皮下注射した。２回目の注射を３０日後に行い
、３回目の注射をそれから３０日後に行った。２週間後
に血液試料を取り、その血清を抗β−ｈｃＧＩｇＧの存
在について試験した。抗体力価が許容レベルに達したと
き、このヤギを採血処理（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｌ
ｅｅｄｉｎｇｓｃｈｅｄｕｌｅ） シて多量の血清を集
めた。ついで、この血清を蓄積し、精製のためにプール
した。
ギに接種することにより、β一ｈＣＧに対する抗体を産
生させた。ついで、この乳濁液をわき窩領域および鼠跋
部領域に皮下注射した。２回目の注射を３０日後に行い
、３回目の注射をそれから３０日後に行った。２週間後
に血液試料を取り、その血清を抗β−ｈｃＧＩｇＧの存
在について試験した。抗体力価が許容レベルに達したと
き、このヤギを採血処理（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｌ
ｅｅｄｉｎｇｓｃｈｅｄｕｌｅ） シて多量の血清を集
めた。ついで、この血清を蓄積し、精製のためにプール
した。
精製は、この血清をβ−サブユニット特異的アフィニテ
ィーカラムに通すことにより行った。ついで、β一特異
的ＩｇＧを回収し、タンパク質濃ことにより、β−ラク
タマーゼを修飾した。つ〜）で、この誘導体化酵素をゲ
ル濾過（セファデ，ソクスＧ−２５）カラムに通すこと
により未反応の反応物を除去し、酵素含有フラクション
を回収しプールした。
ィーカラムに通すことにより行った。ついで、β一特異
的ＩｇＧを回収し、タンパク質濃ことにより、β−ラク
タマーゼを修飾した。つ〜）で、この誘導体化酵素をゲ
ル濾過（セファデ，ソクスＧ−２５）カラムに通すこと
により未反応の反応物を除去し、酵素含有フラクション
を回収しプールした。
上記還元抗体および修飾酵素を酵素：抗体−２．５＝１
のモル比で混合し、ＩＯＯＲＰＭで回転撹拌しながら５
℃で１８時間インキユベートした。
のモル比で混合し、ＩＯＯＲＰＭで回転撹拌しながら５
℃で１８時間インキユベートした。
ついで、結合体（１．５１のに５ｍＭＮ一エチルマレイ
ミド（１００μＱ）を加えることにより、未反応のチオ
ールを保護し、結合／凝集をプロ・ソキングした。つい
で、使用するときまで結合体を５°Ｃで貯蔵した。
ミド（１００μＱ）を加えることにより、未反応のチオ
ールを保護し、結合／凝集をプロ・ソキングした。つい
で、使用するときまで結合体を５°Ｃで貯蔵した。
Ｃ．アフィニテイー精製ヤギ抗β一ｈＣＧを有するビー
ズの調製： ５／１６”ポリスチＬ／７ビーズ（エブコ（ Ｅ ｖｃ
ｏ）より入手）を粉砕して表面を粗くした。このビーズ
の表面にアフイニテイー精製抗β一ｈｃ Ｇ （実施例
２、工程Ａ）を吸着させ、このビーズをゼラチン／ンヨ
糖混合物でオーバーコーティングして非度を計算し、こ
の抗体を３．５ｍｇ／ｔｌ２に希釈した。
ズの調製： ５／１６”ポリスチＬ／７ビーズ（エブコ（ Ｅ ｖｃ
ｏ）より入手）を粉砕して表面を粗くした。このビーズ
の表面にアフイニテイー精製抗β一ｈｃ Ｇ （実施例
２、工程Ａ）を吸着させ、このビーズをゼラチン／ンヨ
糖混合物でオーバーコーティングして非度を計算し、こ
の抗体を３．５ｍｇ／ｔｌ２に希釈した。
Ｂ，ＳＭＣＣによるβ−ラクタマーゼ／抗β一ｈＣＧＩ
ｇＧ結合： ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）より入手したスクシンイミジル
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンｌ一カル
ボキシレート（ＳＭＣＣ）を用い、β−ラクタマーゼ（
ボートン・プログクツ（Ｐｏｒｔｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ）より入手したＰ−９９）を抗β−ｈｃＧＩｇＧ（実
施例２、工程Ａ）に結合させた。この抗体を還元してチ
オールを生成させることは、抗体（２ｏ）を２５ｍＭジ
チオトレイトール（ＤＴＴ）中、３．５ｏ／ｍＱにてＩ
ＯＯＲＰＭで回転撹拌しながら室温で３０分間インキユ
ベートすることにより行った。ついで、還元抗体をゲル
濾過（セファデックスＧ−２５）カラムに通すことによ
りＤＴＴを除去し、抗体含有フラクションを回収しプー
ルした。
ｇＧ結合： ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）より入手したスクシンイミジル
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンｌ一カル
ボキシレート（ＳＭＣＣ）を用い、β−ラクタマーゼ（
ボートン・プログクツ（Ｐｏｒｔｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ）より入手したＰ−９９）を抗β−ｈｃＧＩｇＧ（実
施例２、工程Ａ）に結合させた。この抗体を還元してチ
オールを生成させることは、抗体（２ｏ）を２５ｍＭジ
チオトレイトール（ＤＴＴ）中、３．５ｏ／ｍＱにてＩ
ＯＯＲＰＭで回転撹拌しながら室温で３０分間インキユ
ベートすることにより行った。ついで、還元抗体をゲル
濾過（セファデックスＧ−２５）カラムに通すことによ
りＤＴＴを除去し、抗体含有フラクションを回収しプー
ルした。
ＮＮ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の５０モル過
剰のＳＭＣＣとともにβ−ラクタマーゼ（２巧）を２．
０ｙｇ／ｙｌＱにてＩＯＯＲＰＭで回転撹拌しながら室
温にて３０分間インキユベートする特異的結合をプロノ
キングした。
剰のＳＭＣＣとともにβ−ラクタマーゼ（２巧）を２．
０ｙｇ／ｙｌＱにてＩＯＯＲＰＭで回転撹拌しながら室
温にて３０分間インキユベートする特異的結合をプロノ
キングした。
Ｄ．β−ｈＣＧアッセイ：
上記工程Ｂのβ−ラクタマーゼ／抗β−ｈＣＧＩｇＧ結
合体を用いて、β一ｈＣＧの標準曲線（第１図）を作成
した。このアッセイは不均一ビーズ態様にて行い、基質
としては実施例１、工程Ａのチオール置換セファロスポ
リン（ＴＡＣ）を用いた。
合体を用いて、β一ｈＣＧの標準曲線（第１図）を作成
した。このアッセイは不均一ビーズ態様にて行い、基質
としては実施例１、工程Ａのチオール置換セファロスポ
リン（ＴＡＣ）を用いた。
既知濃度のβ一ｈＣＧ標準（３００μのを入れた反応ト
レイの各ウエルに上記工程Ｃのビーズの一つを加えた。
レイの各ウエルに上記工程Ｃのビーズの一つを加えた。
このビーズを該標準とともに室温にて１時間インキユベ
ートし、その間、反応トレイを１８ＱＲＰＭで回転撹拌
した。このビーズを各５１１Ｑのリン酸バッファーで３
回洗浄して未結合分析対象物を洗い落とした。実施例２
、工程Ｂのβラクタマーゼ／抗β−ｈＣＧＩｇＧ結合体
（３００μｆｆ，４．０μ９／酎）を反応トレイの各ウ
エルに加えた。このビーズを結合体とともに室温にて１
時間インキユベートし、その間、反応トレイを１３ＱＲ
ＰＭで回転撹拌した。このビーズを各５１ＩＱのリン酸
バッファーで３回洗浄して未結合結合体を洗い落とした
。このビーズを清浄な反応管に移し、基質混合物（１．
０順）を加えた。０．１ＭＮａｐｏ４、Ｏ．ｌＭＮａＣ
Ｉ、０．３２％ＢＳＡ（ｐＨ７０）中の１．３Ｘ１０−
’Ｍヨードニト口テトラゾリウムバイオレット（ＩＮＴ
）、３．２ｘ １０−’Ｍ ＴＡＣおよび３．２Ｘ１０
”’Ｍフエナジンメトサルフエ−ト（ＰＭＳ）からなる
基質混合物を調製した。
ートし、その間、反応トレイを１８ＱＲＰＭで回転撹拌
した。このビーズを各５１１Ｑのリン酸バッファーで３
回洗浄して未結合分析対象物を洗い落とした。実施例２
、工程Ｂのβラクタマーゼ／抗β−ｈＣＧＩｇＧ結合体
（３００μｆｆ，４．０μ９／酎）を反応トレイの各ウ
エルに加えた。このビーズを結合体とともに室温にて１
時間インキユベートし、その間、反応トレイを１３ＱＲ
ＰＭで回転撹拌した。このビーズを各５１ＩＱのリン酸
バッファーで３回洗浄して未結合結合体を洗い落とした
。このビーズを清浄な反応管に移し、基質混合物（１．
０順）を加えた。０．１ＭＮａｐｏ４、Ｏ．ｌＭＮａＣ
Ｉ、０．３２％ＢＳＡ（ｐＨ７０）中の１．３Ｘ１０−
’Ｍヨードニト口テトラゾリウムバイオレット（ＩＮＴ
）、３．２ｘ １０−’Ｍ ＴＡＣおよび３．２Ｘ１０
”’Ｍフエナジンメトサルフエ−ト（ＰＭＳ）からなる
基質混合物を調製した。
上記ビーズをこの基質混合物とともに室温にて１時間イ
ンキユベートし、その間、反応管を１８ＯＲＰＭで回転
撹拌した。ついで、この基質混合物を清浄なキュベット
に移し、５００ｎｍにおける吸光度をＵＶ／Ｖｉｓ分光
光度計で読み取った。ついで、Ａ ５ｏｏ読み取りを標
準濃度に対してプロットして第１図に示す標準曲線を作
成した。
ンキユベートし、その間、反応管を１８ＯＲＰＭで回転
撹拌した。ついで、この基質混合物を清浄なキュベット
に移し、５００ｎｍにおける吸光度をＵＶ／Ｖｉｓ分光
光度計で読み取った。ついで、Ａ ５ｏｏ読み取りを標
準濃度に対してプロットして第１図に示す標準曲線を作
成した。
実施例３
イ
Ａ．３０原子リンカーを有するβ−ラクタマーゼ／抗β
−ｈＣＧ ｒｇＧ結合体の調製：修飾した。ついで、
この誘導体化酵素をゲル濾過（セフ１デックスＧ−２５
）カラムに通すことにより未反応のリンカーを除去し、
酵素含有フラクションを回収しプールした。
−ｈＣＧ ｒｇＧ結合体の調製：修飾した。ついで、
この誘導体化酵素をゲル濾過（セフ１デックスＧ−２５
）カラムに通すことにより未反応のリンカーを除去し、
酵素含有フラクションを回収しプールした。
上記還元抗体および修飾酵素を酵素：抗体−２、５：１
のモル比で混合し、ＩＯＯＲＰＭで回転撹拌しながら５
°Ｃで１８時間インキユベートした。
のモル比で混合し、ＩＯＯＲＰＭで回転撹拌しながら５
°Ｃで１８時間インキユベートした。
ついで、結合体（１．５１のに５ｍＭＮ−エチルマレイ
ミド（１００μ１２）を加えることにより、未反応のチ
オールを保護し、結合／凝果をブロッキングした。つい
で、使用するときまで結合体を５゜Ｃで貯蔵した。
ミド（１００μ１２）を加えることにより、未反応のチ
オールを保護し、結合／凝果をブロッキングした。つい
で、使用するときまで結合体を５゜Ｃで貯蔵した。
Ｂ．３０原子リンカーを有するβ−ラクタマーゼ／抗β
−ｈＣＧを用いたβ一ｈＣＧアッセイ：実施例２、工程
Ｂの結合体の代わりに上記工程Ａで得た結合体を用い、
実施例２と同様にしてアッセイを行った。
−ｈＣＧを用いたβ一ｈＣＧアッセイ：実施例２、工程
Ｂの結合体の代わりに上記工程Ａで得た結合体を用い、
実施例２と同様にしてアッセイを行った。
実施例４
ＵＶ／Ｖｉｓ分光測光アッセイ
いくつかのキュベットの各々で、１）２Ｘ１０−３米国
特許出願第１１４，９３０号明細書（１９８７年１０月
３０日出願）に開示されたスクシンイミジル４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロへキシルトリ力プロアミド−
１−カルホキシレート（３０原子リンカー基）を用い、
β−ラクタマーゼ（ポートン・プロダクツより入手した
Ｐ−９９）を抗β一ｈＣＧ ＩｇＧ（実施例２、工程
Ａ）に結合させた。この抗体を還元してチオールを生成
させることは、抗体（２ ｍｇ）を２５ｍＭジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）中、３．５ｍｇ／ｘｇにてＩＯＯＲ
ＰＭで回転撹拌しながら室温で３０分間インキユベート
すること７により行った。ついで、還元抗体をゲル濾過
（セファデックスＧ−２５）カラムに通すことによりＤ
ＴＴを除去し、抗体含有フラクションを回収しプールし
た。
特許出願第１１４，９３０号明細書（１９８７年１０月
３０日出願）に開示されたスクシンイミジル４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロへキシルトリ力プロアミド−
１−カルホキシレート（３０原子リンカー基）を用い、
β−ラクタマーゼ（ポートン・プロダクツより入手した
Ｐ−９９）を抗β一ｈＣＧ ＩｇＧ（実施例２、工程
Ａ）に結合させた。この抗体を還元してチオールを生成
させることは、抗体（２ ｍｇ）を２５ｍＭジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）中、３．５ｍｇ／ｘｇにてＩＯＯＲ
ＰＭで回転撹拌しながら室温で３０分間インキユベート
すること７により行った。ついで、還元抗体をゲル濾過
（セファデックスＧ−２５）カラムに通すことによりＤ
ＴＴを除去し、抗体含有フラクションを回収しプールし
た。
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の５０モル
過剰の３０原子リンカーアームとともにβラクタマーゼ
（２即）を２．Ｏｕ／ａ（ｌにて１００ＲＰＭで回転撹
拌しながら室温にて３０分間インキユベートすることに
より、β−ラクタマーゼをＭ ＩＮＴ，０．０５Ｍリ
ン酸バッファーおよび１％ウシ血清アルブミンを含有す
る溶液（ｐＨ７．０）のアリコート（２、０酎）、２）
脱イオン水（１，Ｏ酎）中の実施例１、工程Ａで得た１
×１０−’Ｍのチオール置換セファロスボリン（ＴＡＣ
）、および３）脱イオン水（０．１ｉＱ）中の１×ＩＯ
−″″Ｍフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を混合
した。各ヰユベットに、脱イオン水中の５Ｘ１０−５Ｍ
から１×１ ０−７Ｍノ範囲の濃度のβ−ラクタマーゼ
溶液（０．１ＪＩのを加えた。各キュベットにおける反
応混合物の吸光度を５００ｎｍで９０分間モニターした
。
過剰の３０原子リンカーアームとともにβラクタマーゼ
（２即）を２．Ｏｕ／ａ（ｌにて１００ＲＰＭで回転撹
拌しながら室温にて３０分間インキユベートすることに
より、β−ラクタマーゼをＭ ＩＮＴ，０．０５Ｍリ
ン酸バッファーおよび１％ウシ血清アルブミンを含有す
る溶液（ｐＨ７．０）のアリコート（２、０酎）、２）
脱イオン水（１，Ｏ酎）中の実施例１、工程Ａで得た１
×１０−’Ｍのチオール置換セファロスボリン（ＴＡＣ
）、および３）脱イオン水（０．１ｉＱ）中の１×ＩＯ
−″″Ｍフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を混合
した。各ヰユベットに、脱イオン水中の５Ｘ１０−５Ｍ
から１×１ ０−７Ｍノ範囲の濃度のβ−ラクタマーゼ
溶液（０．１ＪＩのを加えた。各キュベットにおける反
応混合物の吸光度を５００ｎｍで９０分間モニターした
。
ついで、この結果を、同濃度のＩＮＴ，ＴＡＣおよびＰ
ＭＳを含有するが酵素は含まない対照反応混合物の吸光
度と比較した。このシステムでは、Ｉ Ｘ １ ０−”
モルのβ−ラクタマーゼヘ感度の低下が観察された。
ＭＳを含有するが酵素は含まない対照反応混合物の吸光
度と比較した。このシステムでは、Ｉ Ｘ １ ０−”
モルのβ−ラクタマーゼヘ感度の低下が観察された。
実施例５
β−ラクタマーゼの他のアッセイ
Ａ 一般論：
実施例１のテトラゾリウム塩および基質だけでなく、他
のテトラゾリウム塩および基質を用いてβ−ラクタマー
ゼの他のアッセイを行った。他の基質の合成は、本実施
例の工程Ｃ−Ｇに記載してある。本アッセイ法は工程Ｂ
に記載してあり、得られたデータは第２表に記載した。
のテトラゾリウム塩および基質を用いてβ−ラクタマー
ゼの他のアッセイを行った。他の基質の合成は、本実施
例の工程Ｃ−Ｇに記載してある。本アッセイ法は工程Ｂ
に記載してあり、得られたデータは第２表に記載した。
Ｂ．アッセイ法
第２表に示したように、促進剤およびウシ血清アルブミ
ン（Ｂ Ｓ Ａ）を用いあるいは用いずに、テトラゾリ
ウム塩の溶液、β−ラクタマーゼ基質およびβ−ラクタ
マーゼを反応容器中で混合した。
ン（Ｂ Ｓ Ａ）を用いあるいは用いずに、テトラゾリ
ウム塩の溶液、β−ラクタマーゼ基質およびβ−ラクタ
マーゼを反応容器中で混合した。
反応が起こっている間（すなわち、第２表において「ラ
ン時間」と表示されている）に、第２表で１波長」と表
示したカラムに示した波長にてこの反応混合物の吸光度
をモニターした。各被験混合物について最大吸光度を記
録した。各混合物について対照溶液を調製したが、これ
はβ−ラクタマーゼを加えなかった他は反応混合物と同
じであった。
ン時間」と表示されている）に、第２表で１波長」と表
示したカラムに示した波長にてこの反応混合物の吸光度
をモニターした。各被験混合物について最大吸光度を記
録した。各混合物について対照溶液を調製したが、これ
はβ−ラクタマーゼを加えなかった他は反応混合物と同
じであった。
対照の吸光度を各場合について５００ｎｍで記録し、こ
の対照溶液吸光度に対する最大吸光度の比を記録した（
第２表において「比」と表示した最後のカのセファロチ
ン（０．９４．８９、２、２７ミリモル）を加えた。こ
の混合物を５０゜Ｃで３０時間撹拌した。真空下で溶媒
を除去した。残渣をメタノール中に溶解し、ジエチルエ
ーテルを加えて純粋な７チオフエニルアセトアミド−３
−（４−プロモチオフェノキシ）メチル−３−セフエム
−４−カルボン酸ナトリウム塩を沈澱させた。
の対照溶液吸光度に対する最大吸光度の比を記録した（
第２表において「比」と表示した最後のカのセファロチ
ン（０．９４．８９、２、２７ミリモル）を加えた。こ
の混合物を５０゜Ｃで３０時間撹拌した。真空下で溶媒
を除去した。残渣をメタノール中に溶解し、ジエチルエ
ーテルを加えて純粋な７チオフエニルアセトアミド−３
−（４−プロモチオフェノキシ）メチル−３−セフエム
−４−カルボン酸ナトリウム塩を沈澱させた。
融点．１６３〜１７１°Ｃ（分解）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｒ’）＋ ３４２０、１７５０、１６
５０、１６００、１４００、１０９０、１０１０、８１
０、７００ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ．，δ）： ３．３５（２Ｈ，ｄ
ｄ）、３．７２（２Ｈ，８）、４．２２（２Ｈ，ｄｄ）
、４．７５（ＬＨ，ｄ）、５．４ ０（Ｉ Ｈ， ｄｄ
）、６．８５（２Ｈ、ｔ）、７．３５（５Ｈ，ｍ）、８
．９３（ＩＨ，ｄ）Ｄ． ７−チオフェニルアセトア
ミド−３−（３ヒドロキシー２−チオピリジル）メチル
−３−セフェム−４−カルボン酸ナトリウム塩の合成：
ラム）。１ ０よりも大きな比は、「ラン時間」中に反
応混合物中で反応が観察可能であることを示していた。
５０、１６００、１４００、１０９０、１０１０、８１
０、７００ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ．，δ）： ３．３５（２Ｈ，ｄ
ｄ）、３．７２（２Ｈ，８）、４．２２（２Ｈ，ｄｄ）
、４．７５（ＬＨ，ｄ）、５．４ ０（Ｉ Ｈ， ｄｄ
）、６．８５（２Ｈ、ｔ）、７．３５（５Ｈ，ｍ）、８
．９３（ＩＨ，ｄ）Ｄ． ７−チオフェニルアセトア
ミド−３−（３ヒドロキシー２−チオピリジル）メチル
−３−セフェム−４−カルボン酸ナトリウム塩の合成：
ラム）。１ ０よりも大きな比は、「ラン時間」中に反
応混合物中で反応が観察可能であることを示していた。
星印（＊）で特に示さない限り、β−ラクタマーゼとし
てはシグマ・ケミカル社の１”０３８９を用いた。星印
（＊）で示した実験においては、ポートン・ブロダクツ
から入手したβ−ラクタマーゼ（Ｐ＝９９）を用いた。
てはシグマ・ケミカル社の１”０３８９を用いた。星印
（＊）で示した実験においては、ポートン・ブロダクツ
から入手したβ−ラクタマーゼ（Ｐ＝９９）を用いた。
Ｃ． ７−チオフエニルアセトアミド−３−（４ブロ
モチオフェノキシ）メチル−３−セフエム−４−カルボ
ン酸ナトリウム塩の合成： 上記反応式に示すように、４−プロモチオフエノール（
１．２８５ｇ、６．８ミリモル）および炭酸水素ナトリ
ウム（０、５７１９、６．８ミリモル）を水（２０Ｒの
中で撹拌し、５０゜Ｃに加熱した。この混合物をシリカ
ゲルで濾過し、濾液を水（５ｍの中上記反応式に示すよ
うに、水（５０ｆｆｆ２）中の２メルカブト−３−ピリ
ジノーノ喧０． ３ ２ ２ｇ、２．５ミリモル）およ
びトリエチルアミン（０．２５７ｇ、２．５ミリモル）
の溶液にセファロチン（１．０６ｇ、２．５ミリモノｔ
）を加えた。この混合物を７０゜Ｃで６時間撹拌した。
モチオフェノキシ）メチル−３−セフエム−４−カルボ
ン酸ナトリウム塩の合成： 上記反応式に示すように、４−プロモチオフエノール（
１．２８５ｇ、６．８ミリモル）および炭酸水素ナトリ
ウム（０、５７１９、６．８ミリモル）を水（２０Ｒの
中で撹拌し、５０゜Ｃに加熱した。この混合物をシリカ
ゲルで濾過し、濾液を水（５ｍの中上記反応式に示すよ
うに、水（５０ｆｆｆ２）中の２メルカブト−３−ピリ
ジノーノ喧０． ３ ２ ２ｇ、２．５ミリモル）およ
びトリエチルアミン（０．２５７ｇ、２．５ミリモル）
の溶液にセファロチン（１．０６ｇ、２．５ミリモノｔ
）を加えた。この混合物を７０゜Ｃで６時間撹拌した。
減圧下で水を除去した。残渣をＭｅＯＨ／ベンゼン（１
：１）中に溶解し、ジエチルエーテルを加えて生成物を
沈澱させた。この手順をさらに２回繰り返して純粋な７
−チオフエニルアセトアミド−３−（３−ヒドロキシ−
２−チオピリジル）メチル−３−セフェム−４−カルボ
ン酸ナトリウム塩（０．６７７９）を得た。
：１）中に溶解し、ジエチルエーテルを加えて生成物を
沈澱させた。この手順をさらに２回繰り返して純粋な７
−チオフエニルアセトアミド−３−（３−ヒドロキシ−
２−チオピリジル）メチル−３−セフェム−４−カルボ
ン酸ナトリウム塩（０．６７７９）を得た。
融点：１７５〜１８４゜Ｃ（分解）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｔｎ−１）： ３２６０，１ ７４０
、Ｉ５５０、１３５０、６９０ ＮＭＲ（ＤＭＳＣ）−ｄ６、δ）： ３．７２（２Ｈ，
ｄｄ）、３．７６（２Ｈ，Ｓ）、４．４０（２Ｈ，ｓ）
、５．２８（ＩＨ，ｄｄ）、５．５０（ＩＩ−｛，ａ）
、６．５８（ＬＨ，ｄ）、６．９０−７．０３（３Ｈ，
ｍ）、７．３０（ＩＨ，ｄ）、７．３８（ＩＨ，ｄ）、
９．１８（ＩＨ，ｄ）Ｅ． ７−チオフエニルアセト
アミド−３−チオベンゾイルメチル−３−セフエム−４
−カルボン酸ナトリウム塩の合成： ｎ チオ安息香酸（１．４１？、１０．２ミリモル）および
炭酸水素ナトリウム（０．８５７９、１０，２ミリモル
）を水（３０ｍｌ２）中で撹拌し、５０゜Ｃに加熱した
。この混合物をシリカゲルで濾過し、この濾液を水（２
０蛙）中のセファロチン（１．４３ｇ、３．Ｈ，ｄ） Ｆ． ７−チオフェニルアセトアミド−３−（４アミ
ノチオフェノキシ）メチル−３−セフエム４−カルボン
酸ナトリウム塩の合成： 上記反応式に示すように、４−アミノチオフエノール（
０．５’８０ｇ、４．６ミリモル）をＤＭＦ（１０蛙）
中に溶解した。この溶液を、トリエチルアミン（４ ６
ミリモル、０．４６５ｇ）を含有する水（１０ｏｘＱ）
に加えた。セファロチン（１．９４ｇ、４．６ミリモル
）を加え、この混合物を７０゜Ｃにもっていき、６時間
撹拌した。この混合物を室温に冷却し、水を真空除去し
た。この残渣にジエチルエーテルを加えることによりＭ
ｅＯＨ／ベンゼン（１：１）から２回沈澱させて純粋な
７−チオフェニルアセトアミド−３−（４−アミノチオ
フエノキシ）４ミリモル）に加えた。この反応混合物を
５０’Ｃで２０時間撹拌した。濾過して７−チオフェニ
ルアセトアミド−３−チオベンゾイルメチル−３セフェ
ム−４−カルボン酸（０．７９１ｇ）を回収した。この
物質（．５ ０ Ｒ９）をＤＭＦ（２ｍｇ）中に溶解し
た。水素化ナトリウム（４．４＋ｙ、０． １ １ ミ
リモル）を加え、混合物を２時間撹拌し、濾過し、真空
乾燥した。残渣を水中に溶解し、再濾過し凍結乾燥して
純粋な７−チオフェニルアセトアミド３−チオベンゾイ
ルメチル−３−セフェム−４カルボン酸ナトリウム塩を
得た。
、Ｉ５５０、１３５０、６９０ ＮＭＲ（ＤＭＳＣ）−ｄ６、δ）： ３．７２（２Ｈ，
ｄｄ）、３．７６（２Ｈ，Ｓ）、４．４０（２Ｈ，ｓ）
、５．２８（ＩＨ，ｄｄ）、５．５０（ＩＩ−｛，ａ）
、６．５８（ＬＨ，ｄ）、６．９０−７．０３（３Ｈ，
ｍ）、７．３０（ＩＨ，ｄ）、７．３８（ＩＨ，ｄ）、
９．１８（ＩＨ，ｄ）Ｅ． ７−チオフエニルアセト
アミド−３−チオベンゾイルメチル−３−セフエム−４
−カルボン酸ナトリウム塩の合成： ｎ チオ安息香酸（１．４１？、１０．２ミリモル）および
炭酸水素ナトリウム（０．８５７９、１０，２ミリモル
）を水（３０ｍｌ２）中で撹拌し、５０゜Ｃに加熱した
。この混合物をシリカゲルで濾過し、この濾液を水（２
０蛙）中のセファロチン（１．４３ｇ、３．Ｈ，ｄ） Ｆ． ７−チオフェニルアセトアミド−３−（４アミ
ノチオフェノキシ）メチル−３−セフエム４−カルボン
酸ナトリウム塩の合成： 上記反応式に示すように、４−アミノチオフエノール（
０．５’８０ｇ、４．６ミリモル）をＤＭＦ（１０蛙）
中に溶解した。この溶液を、トリエチルアミン（４ ６
ミリモル、０．４６５ｇ）を含有する水（１０ｏｘＱ）
に加えた。セファロチン（１．９４ｇ、４．６ミリモル
）を加え、この混合物を７０゜Ｃにもっていき、６時間
撹拌した。この混合物を室温に冷却し、水を真空除去し
た。この残渣にジエチルエーテルを加えることによりＭ
ｅＯＨ／ベンゼン（１：１）から２回沈澱させて純粋な
７−チオフェニルアセトアミド−３−（４−アミノチオ
フエノキシ）４ミリモル）に加えた。この反応混合物を
５０’Ｃで２０時間撹拌した。濾過して７−チオフェニ
ルアセトアミド−３−チオベンゾイルメチル−３セフェ
ム−４−カルボン酸（０．７９１ｇ）を回収した。この
物質（．５ ０ Ｒ９）をＤＭＦ（２ｍｇ）中に溶解し
た。水素化ナトリウム（４．４＋ｙ、０． １ １ ミ
リモル）を加え、混合物を２時間撹拌し、濾過し、真空
乾燥した。残渣を水中に溶解し、再濾過し凍結乾燥して
純粋な７−チオフェニルアセトアミド３−チオベンゾイ
ルメチル−３−セフェム−４カルボン酸ナトリウム塩を
得た。
融点＝２３９〜２４１°Ｃ（分解）
Ｉ Ｒ（Ｋ Ｂｒ， ｃｒ’）： ３ ４ ０ ０、３
２８０，１７３６、１５８８、ｌ５２６、１３４５、１
ｌ８５、９１０、６８５ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄｅ、δ）： ３．３５（２ＨＳｄ
ｄ）、３．７８（２Ｈ，ｓ）、４． ２ ５ （２ Ｈ
， ｄｄ）、４．９６（ＬＨ，ｄ）、５．４７（ＬＨ，
ｄｄ）、６．９５（２Ｈ，ｔ）、７．３５（ＬＨ，ｄ）
、７．５８（２Ｈ，ｔ）、７．７１（ＬＨ，ｔ）、７．
９６（２ＨＳｄ）、９．０４（１メチル−３−セフェム
−４−カルボン酸ナトリウム塩（ｔ．０２６ｙ）を得た
。
２８０，１７３６、１５８８、ｌ５２６、１３４５、１
ｌ８５、９１０、６８５ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄｅ、δ）： ３．３５（２ＨＳｄ
ｄ）、３．７８（２Ｈ，ｓ）、４． ２ ５ （２ Ｈ
， ｄｄ）、４．９６（ＬＨ，ｄ）、５．４７（ＬＨ，
ｄｄ）、６．９５（２Ｈ，ｔ）、７．３５（ＬＨ，ｄ）
、７．５８（２Ｈ，ｔ）、７．７１（ＬＨ，ｔ）、７．
９６（２ＨＳｄ）、９．０４（１メチル−３−セフェム
−４−カルボン酸ナトリウム塩（ｔ．０２６ｙ）を得た
。
融点：１６９〜１７５℃
Ｉ Ｒ（Ｋ Ｂｒ， ｃｒ’）： ３ ３ ６ ０、３
０２０、１７４０，１５８０，１４９０、１３８０、１
１８０ＮＭＲ（ＤＭＦ−ｄ７、δ）： ３．３３（２Ｈ
Ｓｄｄ）、３．５２（２Ｈ，ｓ）、４． ３ ８ （２
Ｈ， ｄｄ）、４．９３（ＩＨ，ｄ）、５． ６ ２
（Ｉ Ｈ， ｄｄ）、６．６２（２Ｈ，ｄ）、６．９５
（２Ｈ，ｔ）、７．１ ７（２Ｈ，ｄ）、７４０（ＬＨ
，ｄ）、８、９５（ＩＨＳｄｄ）Ｇ． ７−チオフエ
ニルアセトアミド−３−（Ｓシステイニル）メチル−３
−セフェム−４−カルボン酸ナトリウム塩の合成： ■、一システイン（２． １ ０ｇ、１７．３ミリモル
）および炭酸水素ナトリウム（１．４５ｇ、１７．３ミ
リモル）を水（５０ｉＱ）中に溶解し、７０゜Ｃに加熱
した。この温溶液を、水（１０＋＋１２）中のセファロ
チン（２．４２ｇ、５．７７ミリモル）中ヘシリカゲノ
レで濾過した。この溶液を７０゜Ｃで３０時間撹拌した
。溶媒を減圧下に除去した。残渣をＤＭＦ中番こ溶解し
、２−プロパノールを加えて７−チオフエニルアセトア
ミド−３−（Ｓ−システイニノレ）メチル−３−セフエ
ム−４−カルボン酸ナトＩＪ ’７ム塩を得た。
０２０、１７４０，１５８０，１４９０、１３８０、１
１８０ＮＭＲ（ＤＭＦ−ｄ７、δ）： ３．３３（２Ｈ
Ｓｄｄ）、３．５２（２Ｈ，ｓ）、４． ３ ８ （２
Ｈ， ｄｄ）、４．９３（ＩＨ，ｄ）、５． ６ ２
（Ｉ Ｈ， ｄｄ）、６．６２（２Ｈ，ｄ）、６．９５
（２Ｈ，ｔ）、７．１ ７（２Ｈ，ｄ）、７４０（ＬＨ
，ｄ）、８、９５（ＩＨＳｄｄ）Ｇ． ７−チオフエ
ニルアセトアミド−３−（Ｓシステイニル）メチル−３
−セフェム−４−カルボン酸ナトリウム塩の合成： ■、一システイン（２． １ ０ｇ、１７．３ミリモル
）および炭酸水素ナトリウム（１．４５ｇ、１７．３ミ
リモル）を水（５０ｉＱ）中に溶解し、７０゜Ｃに加熱
した。この温溶液を、水（１０＋＋１２）中のセファロ
チン（２．４２ｇ、５．７７ミリモル）中ヘシリカゲノ
レで濾過した。この溶液を７０゜Ｃで３０時間撹拌した
。溶媒を減圧下に除去した。残渣をＤＭＦ中番こ溶解し
、２−プロパノールを加えて７−チオフエニルアセトア
ミド−３−（Ｓ−システイニノレ）メチル−３−セフエ
ム−４−カルボン酸ナトＩＪ ’７ム塩を得た。
＝５１
実施例６
尿路感染アッセイ
Ａ，尿路感染抗体の調製
熱不活化微生物［シュードモナス・アエルギノーサ（
Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、
ストレプトコッカス・テ゛イ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ Ｄ）、エシェリ牛ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）、プロテウス・ミラビリ７． （ Ｐ
ｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌ ｉｓ）およびクレブ
シェラ０ニューモニエ（Ｋ ｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ）を含む］を含有する乳濁液をウサギ
に接種するこ七により、尿路感染微生物に対する抗体を
産生させた。
Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、
ストレプトコッカス・テ゛イ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ Ｄ）、エシェリ牛ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）、プロテウス・ミラビリ７． （ Ｐ
ｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌ ｉｓ）およびクレブ
シェラ０ニューモニエ（Ｋ ｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ）を含む］を含有する乳濁液をウサギ
に接種するこ七により、尿路感染微生物に対する抗体を
産生させた。
その際、各ウサギには異なる微生物を注射した。
該乳濁液のウサギへの注射は皮下および筋肉内にて行い
、後の注射は２１日後に、３回目の注射はその２１日後
に行った。１週間後に血液試料を取り、上記抗原プール
に対する抗体の存在について血清を試験した。抗体力価
が許容レベルに達したとき、特定の尿路感染微生物に対
する抗体の精製のために各ウサギを採血処理して充分な
容量の血清を集めた。この血清をＤＥ５２（ファットマ
ン）アニオン交換力ラムに通すことにより、他のタンパ
ク質からＩｇＧを分離して精製した。ついで、抗体含有
フラクションを各ウサギについて集め、タンパク質濃度
を計算した。ついで、種々の微生物に対する抗体をプー
ルし、この抗体プールを１１Ｍｇ／ｘＱに希釈した。
、後の注射は２１日後に、３回目の注射はその２１日後
に行った。１週間後に血液試料を取り、上記抗原プール
に対する抗体の存在について血清を試験した。抗体力価
が許容レベルに達したとき、特定の尿路感染微生物に対
する抗体の精製のために各ウサギを採血処理して充分な
容量の血清を集めた。この血清をＤＥ５２（ファットマ
ン）アニオン交換力ラムに通すことにより、他のタンパ
ク質からＩｇＧを分離して精製した。ついで、抗体含有
フラクションを各ウサギについて集め、タンパク質濃度
を計算した。ついで、種々の微生物に対する抗体をプー
ルし、この抗体プールを１１Ｍｇ／ｘＱに希釈した。
Ｂ．抗細菌抗体を有する微細粒子の調製：アブラメアス
（Ａｖｒａｍｅａｓ）、Ｓ ， Ｃ． Ｒ．， Ａｃａ
ｄ．Ｓ ｃｉ． Ｐ ａｒｉｓ， Ｖｏｌ． ２ ６
２、２５４３頁（１９６６）の記載に従い、ＥＤＣ（ｌ
一エチル−３−（３ジメチルアミノブロピル）カルボジ
イミド塩酸塩）を用い、上記工程Ａで得たウサギ抗細菌
ＩｇＧをポリスチレンカルポキシル化微細粒子［セラジ
ン（ Ｓ ｅｒａｄｙｎ）、インディアナポリス、イン
ディアナ］に結合させた。
（Ａｖｒａｍｅａｓ）、Ｓ ， Ｃ． Ｒ．， Ａｃａ
ｄ．Ｓ ｃｉ． Ｐ ａｒｉｓ， Ｖｏｌ． ２ ６
２、２５４３頁（１９６６）の記載に従い、ＥＤＣ（ｌ
一エチル−３−（３ジメチルアミノブロピル）カルボジ
イミド塩酸塩）を用い、上記工程Ａで得たウサギ抗細菌
ＩｇＧをポリスチレンカルポキシル化微細粒子［セラジ
ン（ Ｓ ｅｒａｄｙｎ）、インディアナポリス、イン
ディアナ］に結合させた。
Ｃ，酵素／抗体結合体の調製；
実施例２、工程Ｂのβ−ｈＣＧ ＩｇＧの代わりに本
実施例、工程Ａで得た抗細菌１ｇＧを用いた他は実施例
２、工程Ｂの手順に従ってβ−ラクタマーゼ／抗細菌■
ｇＧ結合体を得、下記工程Ｄの尿路感染微生物のアッセ
イに用いた。
実施例、工程Ａで得た抗細菌１ｇＧを用いた他は実施例
２、工程Ｂの手順に従ってβ−ラクタマーゼ／抗細菌■
ｇＧ結合体を得、下記工程Ｄの尿路感染微生物のアッセ
イに用いた。
Ｄ．尿路感染微生物のアッセイ：
上記工程Ｂの抗体結合微細粒子をバッファ一中に懸濁さ
せた（シグマ・ケミカルからのリン酸緩衝食塩水および
０．１％アシ化ナトリウム、ｐＨ７４中に０．０８％の
濃度まで）。この微細粒子（１３５μσ；０ ０８％固
形分）を、ＩＩｌ２当たり１０７個の尿路感染微生物お
よびＥＤＴＡ／サルコシル（シグマ・ケミカル社）抽出
バッファ一（１３５μのを含有する試料（ １ ． ０
ＩＩ！１！）と混合し、この混合物を室温にて５分間
インキコベート．した。ついで、この混合物を多孔質フ
ィルター媒体［アボット・ラボラトリーズ、アボットパ
ーク、イリノイより市販されているテストパック（Ｔｅ
ｓｔｐａｃｋ）装置］に注ぎ、バッファ一（１．０Ｍグ
アニジン−ＨＣＩ，１．０ＭＮａＣ１、０．１％ツィー
ン２０、０．１％アジ化ナトリウム；１．ＯｉＣ、以下
「バッファ一Ａ」と称する）で洗浄した。本実施例の上
記工程Ｃで得たβ−ラクタマーゼ／抗細菌１ｇＧ結合体
溶液を上記フィルター媒体に加え、室温にて５分間イン
キュベートした。ついで、このフィルター媒体をバッフ
ァ一Ａ（ｌＲＩ２）で洗浄した。ついで、ＩＮＴ（２．
４ ×１ ０−’％ル）、ＴＡＣ（４．８Ｘ １０−３
モル）、ＰＭＳ’（４．３ｘ ｌ Ｑ−’モル）および
Ｊ：／酸ナトリウム（０ １モル、ｐＨ７．０）を含有
する溶液（２００μのを上記フィルター媒体に通し、室
温にて５分間インキユベートした。ついで、このフィル
ター媒体をバッファ一Ａ （ １ ． ０ ｍｌ２）で
洗浄し、対照のフィルター媒体（同様に処理したが、細
菌を用いない）と視覚で比較した。細菌を含有するフィ
ルターはピンク色であったが対照は白色のままであり、
細菌含有フィルター媒体において細菌が検出されたこと
を示していた。
せた（シグマ・ケミカルからのリン酸緩衝食塩水および
０．１％アシ化ナトリウム、ｐＨ７４中に０．０８％の
濃度まで）。この微細粒子（１３５μσ；０ ０８％固
形分）を、ＩＩｌ２当たり１０７個の尿路感染微生物お
よびＥＤＴＡ／サルコシル（シグマ・ケミカル社）抽出
バッファ一（１３５μのを含有する試料（ １ ． ０
ＩＩ！１！）と混合し、この混合物を室温にて５分間
インキコベート．した。ついで、この混合物を多孔質フ
ィルター媒体［アボット・ラボラトリーズ、アボットパ
ーク、イリノイより市販されているテストパック（Ｔｅ
ｓｔｐａｃｋ）装置］に注ぎ、バッファ一（１．０Ｍグ
アニジン−ＨＣＩ，１．０ＭＮａＣ１、０．１％ツィー
ン２０、０．１％アジ化ナトリウム；１．ＯｉＣ、以下
「バッファ一Ａ」と称する）で洗浄した。本実施例の上
記工程Ｃで得たβ−ラクタマーゼ／抗細菌１ｇＧ結合体
溶液を上記フィルター媒体に加え、室温にて５分間イン
キュベートした。ついで、このフィルター媒体をバッフ
ァ一Ａ（ｌＲＩ２）で洗浄した。ついで、ＩＮＴ（２．
４ ×１ ０−’％ル）、ＴＡＣ（４．８Ｘ １０−３
モル）、ＰＭＳ’（４．３ｘ ｌ Ｑ−’モル）および
Ｊ：／酸ナトリウム（０ １モル、ｐＨ７．０）を含有
する溶液（２００μのを上記フィルター媒体に通し、室
温にて５分間インキユベートした。ついで、このフィル
ター媒体をバッファ一Ａ （ １ ． ０ ｍｌ２）で
洗浄し、対照のフィルター媒体（同様に処理したが、細
菌を用いない）と視覚で比較した。細菌を含有するフィ
ルターはピンク色であったが対照は白色のままであり、
細菌含有フィルター媒体において細菌が検出されたこと
を示していた。
第１図は、β−ｈＣＧの標準濃度に対して５ｏＯｎｍで
の吸光度をプロットした標準曲線である。
の吸光度をプロットした標準曲線である。
Claims (10)
- （１）試料中のβ−ラクタマーゼの検出方法であって、 （ａ）該試料を一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ I （式中、Ｒ＿１は、β−ラクタマーゼによる被認識能を
維持する基；Ｒ＿２は、それが結合する硫黄原子と一緒
になって脱離基を形成し、その際、その共役酸の水中に
おけるｐＫａは８未満である；Ｍは、水素原子または第
I 族金属原子である）で示されるβ−ラクタマーゼ基
質にさらし、 （ｂ）該脱離基を一般式II： ▲数式、化学式、表等があります▼II （式中、Ｒ＿３、Ｒ＿４およびＲ＿５は、それぞれ、得
られるテトラゾリウム塩の酸化還元電位を０もしくは低
ボルトになるように選択した基；Ｘは、アニオンである
）で示されるテトラゾリウム塩にさらして、該脱離基の
存在下で発色沈澱を生成させ、ついで （ｃ）該発色沈澱をモニターして活性β−ラクタマーゼ
の存在を検出する ことを特徴とする方法。 - （２）一般式 I において、Ｒ＿１が、アミノ基、チオ
フェン−２−アセトアミド基、フェニル−２−アセトア
ミド基、フェノキシ−２−アセトアミド基、Ｄ−２−ア
ミノアジパミド基、２−アミノ−２−フェニルアセトア
ミド基、テトラゾリルアセトアミド基、４−ピリジルチ
オアセトアミドおよび一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿６は低級脂肪族基、Ｒ＿７はアミノ基また
はアルキルアミノ基、Ｄは酸素原子または硫黄原子であ
る）で示される基よりなる群から選ばれた基である請求
項（１）記載の方法。 - （３）一般式IIにおいてＲ＿３、Ｒ＿４およびＲ＿５が
、それぞれ、フェニル基、ｐ−ヨードフェニル基、ｐ−
ニトロフェニル基、ナフチル基、チアゾリル基、アルキ
ルチアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、フタリルヒドラ
ジジル基、スチリル基、ビフェニル基、３−ビフェニレ
ン−２，５−ジフェニルテトラゾリウムクロリド基、３
−ジメトキシ−４−ビフェニレン−２，５−ジフェニル
テトラゾリウムクロリド基、３−ジメトキシ−４−ビフ
ェニレン−２−ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルテト
ラゾリウムクロリド基および３−ジメトキシ−４−ビフ
ェニレン−２，５−ｐ−ニトロフェニルテトラゾリウム
クロリド基よりなる群から選ばれた基である請求項（１
）記載の方法。 - （４）試料中のβ−ラクタマーゼを検出するためのアッ
セイキットであって、 （ａ）一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ I （式中、Ｒ＿１は、β−ラクタマーゼによる被認識能を
維持する基；Ｒ＿２は、それが結合する硫黄原子と一緒
になって脱離基を形成し、その際、その共役酸の水中に
おけるｐＫａは８未満である；Ｍは、水素原子または第
I 族金属原子である）で示されるβ−ラクタマーゼ基
質、および （ｂ）一般式II： ▲数式、化学式、表等があります▼II （式中、Ｒ＿３、Ｒ＿４およびＲ＿５は、それぞれ、得
られるテトラゾリウム塩の酸化還元電位を０もしくは低
ボルトになるように選択した基；Ｘは、アニオンである
）で示されるテトラゾリウム塩 からなるアッセイキット。 - （５）さらに促進剤を含む請求項（４）記載のアッセイ
キット。 - （６）該脱離基が、脂肪族もしくは芳香族チオール基；
ハロゲンもしくはアミノ置換チオフェノール基；ヒドロ
キシ、ハロゲンもしくはアミノ置換メルカプトピリジン
基；脂肪族もしくは芳香族チオールカルボン酸基；チオ
スルホン酸基およびメルカプトアミノ酸基よりなる群か
ら選ばれた基である請求項（４）記載のアッセイキット
。 - （７）一般式 I で示されるβ−ラクタマーゼ基質にお
いて、Ｒ＿１が、アミノ基、チオフェン−２−アセトア
ミド基、フェニル−２−アセトアミド基、フェノキシ−
２−アセトアミド基、Ｄ−２−アミノアジバミド基、２
−アミノ−２−フェニルアセトアミド基、テトラゾリル
アセトアミド基、４−ピリジルチオアセトアミドおよび
一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿６は低級脂肪族基、Ｒ＿７はアミノ基また
はアルキルアミノ基、Ｄは酸素原子または硫黄原子であ
る）で示される基よりなる群から選ばれた基である請求
項（４）記載のアッセイキット。 - （８）一般式IIで示されるテトラゾリウム塩においてＲ
＿３、Ｒ＿４およびＲ＿５が、それぞれ、フェニル基、
ｐ−ヨードフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ナフチ
ル基、チアゾリル基、アルキルチアゾリル基、ベンゾチ
アゾリル基、フタリルヒドラジジル基、スチリル基、ビ
フェニル基、３−ビフェニレン−２，５−ジフェニルテ
トラゾリウムクロリド基、３−ジメトキシ−４−ビフェ
ニレン−２，５−ジフェニルテトラゾリウムクロリド基
、３−ジメトキシ−４−ビフェニレン−２−ｐ−ニトロ
フェニル−５−フェニルテトラゾリウムクロリド基およ
び３−ジメトキシ−４−ビフェニレン−２，５−ｐ−ニ
トロフェニルテトラゾリウムクロリド基よりなる群から
選ばれた基である請求項（４）記載のアッセイキット。 - （９）試料中のリガンドを検出するためのアッセイキッ
トであって、 （ａ）該リガンドに対する特異的結合成分と一般式 I
： ▲数式、化学式、表等があります▼ I （式中、Ｒ＿１は、β−ラクタマーゼによる被認識能を
維持する基；Ｒ＿２は、それが結合する硫黄原子と一緒
になって脱離基を形成し、その際、その共役酸の水中に
おけるｐＫａは８未満である；Ｍは、水素原子または第
１族金属原子である）で示されるβ−ラクタマーゼ基質
の結合体、および （ｂ）一般式II： ▲数式、化学式、表等があります▼II （式中、Ｒ＿３、Ｒ＿４およびＲ＿５は、それぞれ、得
られるテトラゾリウム塩の酸化還元電位を０もしくは低
ボルトになるように選択した基；Ｘは、アニオンである
）で示されるテトラゾリウム塩 からなるアッセイキット。 - （１０）さらに促進剤を含む請求項（９）記載のアッセ
イキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US298098 | 1989-01-17 | ||
| US07/298,098 US4978613A (en) | 1989-01-17 | 1989-01-17 | Beta-lactamase assay employing chromogenic precipitating substrates |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02234699A true JPH02234699A (ja) | 1990-09-17 |
Family
ID=23149021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006096A Pending JPH02234699A (ja) | 1989-01-17 | 1990-01-12 | β―ラクタマーゼの検出方法およびそれに用いるキット |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0379048B1 (ja) |
| JP (1) | JPH02234699A (ja) |
| CA (1) | CA2007885A1 (ja) |
| DE (1) | DE69022255T2 (ja) |
| ES (1) | ES2079386T3 (ja) |
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| DE3900649A1 (de) * | 1989-01-11 | 1990-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur abloesung eines analyten von seinem bindeprotein |
| US5126275A (en) * | 1990-09-19 | 1992-06-30 | Miles Inc. | Analytical method using tetrazolium salt indicators having a reflectance plateau |
| US5338843A (en) * | 1992-01-30 | 1994-08-16 | Becton, Dickinson And Company | Fluorogenic and chromogenic β-lactamase substrates |
| US5354658A (en) * | 1993-01-28 | 1994-10-11 | Dennis Wright | Non-radioactive method for detecting a labelled segment and a solution or composition therefor |
| US5741657A (en) * | 1995-03-20 | 1998-04-21 | The Regents Of The University Of California | Fluorogenic substrates for β-lactamase and methods of use |
| ES2285713T3 (es) * | 1995-06-07 | 2007-11-16 | Bioveris Corporation | Enzimoinmunoanalisis electroquimioluminiscente. |
| US20030235877A1 (en) * | 1996-04-30 | 2003-12-25 | La Region Wallone | Conjugates of haptens to beta-lactam derivatives and their use for detecting and/or quantifying haptens in solution and device for implementation thereof |
| US20040157262A1 (en) * | 1996-04-30 | 2004-08-12 | Michel Kohl | Conjugates of haptens to beta-lactam derivatives and their use for detecting and/or quantifying haptens in solution and device for implementation thereof |
| US5955604A (en) * | 1996-10-15 | 1999-09-21 | The Regents Of The University Of California | Substrates for β-lactamase and uses thereof |
| US6225074B1 (en) | 1997-08-18 | 2001-05-01 | Dennis Wright | Direct chloramphenicol acetyl transferase assay |
| US6031094A (en) * | 1998-07-23 | 2000-02-29 | The Regents Of The University Of California | Beta-lactam substrates and uses thereof |
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| EP1122542A1 (en) * | 2000-02-01 | 2001-08-08 | Anda Biologicals S.A. | Method for the rapid detection of whole microorganisms on retaining membranes by use of chaotropic agents |
| SI1799844T1 (sl) | 2004-09-10 | 2010-04-30 | Genencor Int | Postopki za detektiranje tarŽŤ |
| GB201017547D0 (en) * | 2010-10-18 | 2010-12-01 | Univ Cardiff | Method and device for the detection of sulphur containing species |
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| EP3583226B1 (en) * | 2017-02-20 | 2025-07-02 | The Regents of the University of California | Amplification technology using dual enzyme cascade detection |
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| CN107607719B (zh) * | 2017-11-02 | 2019-08-02 | 北京中生金域诊断技术股份有限公司 | 一种测定样品中β-内酰胺酶方法 |
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| IL85018A0 (en) * | 1988-01-03 | 1988-06-30 | Orgenics Ltd | Stable chromogenic substrate mixture of indoxyl phosphate and tetrazolium salt,method of making and using same in biological and diagnostic assays |
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1989
- 1989-01-17 US US07/298,098 patent/US4978613A/en not_active Expired - Fee Related
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