JPH022353A - ヒトｂ細胞分化因子の製造法 - Google Patents
ヒトｂ細胞分化因子の製造法Info
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- JPH022353A JPH022353A JP63179118A JP17911888A JPH022353A JP H022353 A JPH022353 A JP H022353A JP 63179118 A JP63179118 A JP 63179118A JP 17911888 A JP17911888 A JP 17911888A JP H022353 A JPH022353 A JP H022353A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
Ｂ細胞分化因子（以下、ＢＳｒ−２と略称する）は、Ｔ
リンパ球代替因子、ＴＲＦとしてマウスのリンパ球混合
物培養後の培養上清又は、抗原やマイトゲンにより刺激
を受けたマウスのリンパ球上清中に、マウスのＴ細胞を
除去されたリンパ球細胞集団やヌードマウス由来のリン
パ球のヒツジ赤血球に対する一次免疫応答を増幅させる
物質として見出された。それ以来、ＴＲＦは抗原非特異
的に主要組織適合遺伝子複合体 （以下、ＭＭＣと略称
する。）の一致を必要としない様式で、Ｂ細胞に作用し
、Ｂ細胞の分裂増殖を誘導せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞
への分化を誘導する液性因子であると定義されている。
リンパ球代替因子、ＴＲＦとしてマウスのリンパ球混合
物培養後の培養上清又は、抗原やマイトゲンにより刺激
を受けたマウスのリンパ球上清中に、マウスのＴ細胞を
除去されたリンパ球細胞集団やヌードマウス由来のリン
パ球のヒツジ赤血球に対する一次免疫応答を増幅させる
物質として見出された。それ以来、ＴＲＦは抗原非特異
的に主要組織適合遺伝子複合体 （以下、ＭＭＣと略称
する。）の一致を必要としない様式で、Ｂ細胞に作用し
、Ｂ細胞の分裂増殖を誘導せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞
への分化を誘導する液性因子であると定義されている。
現在では、上述のように定義されたＢ細胞を抗体産生細
胞へ分化させる因子をＢＳＦ−２と称するようになった
。この上うなり５Ｆ−２は、人の体内でＢ細胞の抗体産
生機能に重要な働きをしている。
胞へ分化させる因子をＢＳＦ−２と称するようになった
。この上うなり５Ｆ−２は、人の体内でＢ細胞の抗体産
生機能に重要な働きをしている。
ＢＳＦ−２の臨床への応用としては、１）ＢＳＦ−２に
よりＢＳＦ−２抗体を作り、ＢＳＦ−２と抗ＢＳＦ−２
抗体によるＢＳＦ−２のイムノアッセイ系を用いて免疫
学的な病態の解析に用いる、２）各種疾患の治療への応
用で、例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下にともなうＢ
細胞抗体産生能低下による免疫不全症患者にＢＳＦ−２
単独または、他のリンホカインと共に投与することによ
り、抗体産生機能を正常にもどす、３）Ｂ細胞増殖因子
、その他のリンホカインを含むＴ細胞因子を培地に加え
ることにより正常Ｂ細胞あるいは、ＥＢウィルスで形質
転換したＢ細胞に対し適当な時期にＢＳＦ−２を作用さ
せることにより、生体外で抗体を産生させる等が考えら
れる。さらに、特定の抗体、例えば、病原細菌、病原ウ
ィルス、病原原虫、癌細胞などの表面にある特定抗原を
認識する抗体を産生ずるＢ細胞をモノクロナール化し、
クローン化正常Ｂ細胞または、ＥＢウィルスで形質転換
した細胞をＢ Ｓ １；’ −２とその他のリンホカイ
ンを組み合わせて培養し、有用なモノクロナール抗体を
産生させることが出来る。これらの抗体は感染症や癌の
治療および、診断に利用できる。
よりＢＳＦ−２抗体を作り、ＢＳＦ−２と抗ＢＳＦ−２
抗体によるＢＳＦ−２のイムノアッセイ系を用いて免疫
学的な病態の解析に用いる、２）各種疾患の治療への応
用で、例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下にともなうＢ
細胞抗体産生能低下による免疫不全症患者にＢＳＦ−２
単独または、他のリンホカインと共に投与することによ
り、抗体産生機能を正常にもどす、３）Ｂ細胞増殖因子
、その他のリンホカインを含むＴ細胞因子を培地に加え
ることにより正常Ｂ細胞あるいは、ＥＢウィルスで形質
転換したＢ細胞に対し適当な時期にＢＳＦ−２を作用さ
せることにより、生体外で抗体を産生させる等が考えら
れる。さらに、特定の抗体、例えば、病原細菌、病原ウ
ィルス、病原原虫、癌細胞などの表面にある特定抗原を
認識する抗体を産生ずるＢ細胞をモノクロナール化し、
クローン化正常Ｂ細胞または、ＥＢウィルスで形質転換
した細胞をＢ Ｓ １；’ −２とその他のリンホカイ
ンを組み合わせて培養し、有用なモノクロナール抗体を
産生させることが出来る。これらの抗体は感染症や癌の
治療および、診断に利用できる。
本発明は、このＢＳＦ−２の製造方法に関するものであ
る。
る。
（従来の技術）
ＢＳＦ−２を得る方法としては、人末梢血などより分離
した正常人Ｔ細胞をマイトゲン刺激することによりＢＳ
Ｆ−２を産生させる方法、人Ｔ細胞を人癌と細胞融合し
て人Ｔ融合細胞を得、これによりＢＳＦ−２を産生させ
る方法、さらにＢＳＦ−２をコードするＤＮＡを大腸菌
で発現せしめる方法として、トリプトファンプロモータ
ー支配下にＢＳＦ−２を直接発現する方法と、ヒトＩＬ
−２の部分Ｎ末端ペプチドとの融合蛋白として発現する
方法が知られている。
した正常人Ｔ細胞をマイトゲン刺激することによりＢＳ
Ｆ−２を産生させる方法、人Ｔ細胞を人癌と細胞融合し
て人Ｔ融合細胞を得、これによりＢＳＦ−２を産生させ
る方法、さらにＢＳＦ−２をコードするＤＮＡを大腸菌
で発現せしめる方法として、トリプトファンプロモータ
ー支配下にＢＳＦ−２を直接発現する方法と、ヒトＩＬ
−２の部分Ｎ末端ペプチドとの融合蛋白として発現する
方法が知られている。
本発明者は、以上のような状況に鑑み、ＢＳＦ−２をヒ
ト成長ホルモンと融合した形で製造する方法を完成させ
た。すなわち、本発明は構造遺伝子の発現を調節する制
御遺伝子の下流にリボゾーム結合部位、およびヒト成長
ホルモンＡドメインおよび、ヒト成長ホルモンＢドメイ
ンをコードする遺伝子、ＢＳＦ−２をコードする遺伝子
、終止コドンを含んだプラスミドで形質転換させた大腸
菌を培養し、発現したヒト成長ホルモンＡドメイン、ヒ
ト成長ホルモンＢドメイン、ＢＳＦ−２の融合蛋白を酵
素で処理してＢ Ｓ Ｆ −２を得ることを特徴とする
ＢＳＦ−２の製造法に関するものである。以下、さらに
本発明の詳細な説明する。
ト成長ホルモンと融合した形で製造する方法を完成させ
た。すなわち、本発明は構造遺伝子の発現を調節する制
御遺伝子の下流にリボゾーム結合部位、およびヒト成長
ホルモンＡドメインおよび、ヒト成長ホルモンＢドメイ
ンをコードする遺伝子、ＢＳＦ−２をコードする遺伝子
、終止コドンを含んだプラスミドで形質転換させた大腸
菌を培養し、発現したヒト成長ホルモンＡドメイン、ヒ
ト成長ホルモンＢドメイン、ＢＳＦ−２の融合蛋白を酵
素で処理してＢ Ｓ Ｆ −２を得ることを特徴とする
ＢＳＦ−２の製造法に関するものである。以下、さらに
本発明の詳細な説明する。
（発明の構成）
ｒ ＢＳＦ−２遺伝子セグメントとその調製」即ち、本
発明は第一に、式 ％式％ で表される塩基配列からなるＢＳＦ−２遺伝子セグメン
ト［以下式（１）という、式中Ａはデオキシアデニル酸
の、Ｃはデオキシシチジル酸の、Ｇはデオキシグアニル
酸の、Ｔはデオキシチミジル酸の各残基を表しく以下同
じ）、塩基配列上のアミノ酸略号はこの塩基配列により
コードされているアミノ酸配列を示す］を提供するもの
である。
発明は第一に、式 ％式％ で表される塩基配列からなるＢＳＦ−２遺伝子セグメン
ト［以下式（１）という、式中Ａはデオキシアデニル酸
の、Ｃはデオキシシチジル酸の、Ｇはデオキシグアニル
酸の、Ｔはデオキシチミジル酸の各残基を表しく以下同
じ）、塩基配列上のアミノ酸略号はこの塩基配列により
コードされているアミノ酸配列を示す］を提供するもの
である。
このＢＳＦ−２遺伝子セグメントは好ましくは、その上
流末端に、式 ％式％ （式中ＸはＮ末端よりｌｉｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ
で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、ま
たその下流に停止コドンを含み、さらに、その下流に制
限酵素開裂末端で終わる、式 で表されるＤＮＡ配列をもつものを提供するものである
。
流末端に、式 ％式％ （式中ＸはＮ末端よりｌｉｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ
で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、ま
たその下流に停止コドンを含み、さらに、その下流に制
限酵素開裂末端で終わる、式 で表されるＤＮＡ配列をもつものを提供するものである
。
上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ とじては、
式 ％式％ で表される配列を例示することができる。
式 ％式％ で表される配列を例示することができる。
下流側に付加される、停止コドンを含み、さらにその下
流に制限酵素開裂末端で終わるＤＮＡ配列のＹ及びＹ゛
とじては制限酵素ＢａｍＨＩ の開裂末端の配列、式 ％式％ で表される配列を含むものを例示することができる。
流に制限酵素開裂末端で終わるＤＮＡ配列のＹ及びＹ゛
とじては制限酵素ＢａｍＨＩ の開裂末端の配列、式 ％式％ で表される配列を含むものを例示することができる。
上記（２）式では上流末端がＢａｍＨＩ の末端で終
わっている。（１）の上流側に付加される、式％式％ で表されるＤＮＡ配列をもつオリゴヌクレオチドは、以
下に述べる様な方法で調製することができる。
わっている。（１）の上流側に付加される、式％式％ で表されるＤＮＡ配列をもつオリゴヌクレオチドは、以
下に述べる様な方法で調製することができる。
まずこれらのオリゴヌクレオチドの各−本鎖部分を合成
し、水素結合させればよい。この場合、リガーゼを用い
てオリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡ断片を結合
させる際には、あらかじめこれらの５′側の反応ににあ
ずかる成分の５′末端はリン酸化させておく。リン酸化
は慣用の手法および条件で行うことができる。
し、水素結合させればよい。この場合、リガーゼを用い
てオリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡ断片を結合
させる際には、あらかじめこれらの５′側の反応ににあ
ずかる成分の５′末端はリン酸化させておく。リン酸化
は慣用の手法および条件で行うことができる。
得られたＢＳＦ−２遺伝子セグメントは適当なプラスミ
ド中へ挿入して大腸菌等に形質転換し、薬剤感受性など
の指標と、ラビッドアイソレーション等の手法を用いて
クロン化し増幅することができる。
ド中へ挿入して大腸菌等に形質転換し、薬剤感受性など
の指標と、ラビッドアイソレーション等の手法を用いて
クロン化し増幅することができる。
「プラスミド及びその調製」
本発明の第二は、ＢＳＦ−２遺伝子セグメントを含む組
み換えプラスミドを提供するものである。
み換えプラスミドを提供するものである。
即ち、式（１）で表される塩基配列のＢＳＦ−２遺伝子
セグメントを含み、微生物中で自己増殖可能な組み換え
プラスミドを提供するものである。そして好ましくは、
ＢＳＦ−２遺伝子の上流にこの遺伝子を発現可能に支配
するプロモーター・オペレーター系を含み、そのプロモ
ーター・オペレーターの上流とＢＳＦ−２遺伝子の下流
との間に、プラスミドを自己増殖可能とする部分を含む
ものである。プロモーター・オペレーター系としては、
従来、トリプトファンプロモーター／オペレーター系、
ラクトースプロモーター／オペレーター系、あるいは、
ト１リブトフアンプロモーター／ラクトースオペレータ
ー系を用いればよい。本発明の組み換えプラスミドは、
ＢＳＦ−２遺伝子セグメントを慣用の方法で適当なベク
タープラスミドに組み込むことにより調製することがで
きる。特に、その上流及び、下流に制限酵素開裂末端を
持つＢＳＦ−２遺伝子セグメントは、その様なプラスミ
ドの相当する開裂部位、例えば、Ｂｇｌｌｌ 等の部位
へ容易に組み込むことができる。
セグメントを含み、微生物中で自己増殖可能な組み換え
プラスミドを提供するものである。そして好ましくは、
ＢＳＦ−２遺伝子の上流にこの遺伝子を発現可能に支配
するプロモーター・オペレーター系を含み、そのプロモ
ーター・オペレーターの上流とＢＳＦ−２遺伝子の下流
との間に、プラスミドを自己増殖可能とする部分を含む
ものである。プロモーター・オペレーター系としては、
従来、トリプトファンプロモーター／オペレーター系、
ラクトースプロモーター／オペレーター系、あるいは、
ト１リブトフアンプロモーター／ラクトースオペレータ
ー系を用いればよい。本発明の組み換えプラスミドは、
ＢＳＦ−２遺伝子セグメントを慣用の方法で適当なベク
タープラスミドに組み込むことにより調製することがで
きる。特に、その上流及び、下流に制限酵素開裂末端を
持つＢＳＦ−２遺伝子セグメントは、その様なプラスミ
ドの相当する開裂部位、例えば、Ｂｇｌｌｌ 等の部位
へ容易に組み込むことができる。
本発明の組み換えプラスミドは大腸菌などの微生物に形
質転換して、本発明のヒトＢＳＦ−２遺伝子の産物を融
合蛋白質の形で産生させることができる。例えば、ＢＳ
Ｆ−２遺伝子セグメントで、上流に式（２）で表される
末端を持つものは、プラスミドの発現され得る蛋白質を
コードするＤＮＡ配列中に制限酵素Ｂｇｌｎ の部位を
持つもの、Ｂｇｌｌｌの部位へに読取位相の一致する様
に組み入れることによって、その蛋白質のＮ末端側の一
部とアミノ酸配列ｌｉｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇを介
して連結された、ＢＳＦ−２蛋白質との融合蛋白を産生
させることのできるプラスミドを構築することができる
。この様な蛋白質としてはヒト成長ホルモンを例示する
ことができ、Ｂｇ１１１部位を含むＤＮＡ配列としては
、特開昭６０−２３４５８４号明細書中で開示されてい
るｐＧＩＩ−Ｌシリーズのプラスミドを例示することが
できる。
質転換して、本発明のヒトＢＳＦ−２遺伝子の産物を融
合蛋白質の形で産生させることができる。例えば、ＢＳ
Ｆ−２遺伝子セグメントで、上流に式（２）で表される
末端を持つものは、プラスミドの発現され得る蛋白質を
コードするＤＮＡ配列中に制限酵素Ｂｇｌｎ の部位を
持つもの、Ｂｇｌｌｌの部位へに読取位相の一致する様
に組み入れることによって、その蛋白質のＮ末端側の一
部とアミノ酸配列ｌｉｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇを介
して連結された、ＢＳＦ−２蛋白質との融合蛋白を産生
させることのできるプラスミドを構築することができる
。この様な蛋白質としてはヒト成長ホルモンを例示する
ことができ、Ｂｇ１１１部位を含むＤＮＡ配列としては
、特開昭６０−２３４５８４号明細書中で開示されてい
るｐＧＩＩ−Ｌシリーズのプラスミドを例示することが
できる。
こうして構築される組み換えプラスミドのプロモーター
・オペレーター系のメツセンジャーＲＮＡ転写開始点よ
りＢＳＦ−２遺伝子までのＤＮＡ配列が、式 ％式％ （Ｘ及びＸ−は前記同様の意味を表す）であるものが特
に好ましい。この様な配列を持つプラスミドは、例えば
、ｐＧＨ−Ｌ９プラスミドをＢｇｌＩＩ消化したものに
ＢＳＦ−２遺伝子セグメントで上流側に式（２）で表さ
れる末端配列をもち、下流側に式（３）で表される末端
配列をもつものを接着閉環させることによって調製でき
る。第（２）図にこの調製を示した。この様にしてプラ
スミドｐＧＢｓ１ ｍ製することができる。 なお、プ
ラスミドｐＧ■−１，９を持つＥ、コリ菌株、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ｐＧＨ−Ｌ９は通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所に、微工研菌寄第７６０６号として寄託され
ている。
・オペレーター系のメツセンジャーＲＮＡ転写開始点よ
りＢＳＦ−２遺伝子までのＤＮＡ配列が、式 ％式％ （Ｘ及びＸ−は前記同様の意味を表す）であるものが特
に好ましい。この様な配列を持つプラスミドは、例えば
、ｐＧＨ−Ｌ９プラスミドをＢｇｌＩＩ消化したものに
ＢＳＦ−２遺伝子セグメントで上流側に式（２）で表さ
れる末端配列をもち、下流側に式（３）で表される末端
配列をもつものを接着閉環させることによって調製でき
る。第（２）図にこの調製を示した。この様にしてプラ
スミドｐＧＢｓ１ ｍ製することができる。 なお、プ
ラスミドｐＧ■−１，９を持つＥ、コリ菌株、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ｐＧＨ−Ｌ９は通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所に、微工研菌寄第７６０６号として寄託され
ている。
「形質転換体」
本発明の組み換えプラスミドｐＧＢｓｌでＥ、 ｃｏｌ
ｉ株、例えば、Ｒ８７９１株等を形質転換し、これを栄
養培地中で培養することによってＢＳＦ−２遺伝子を効
率よく増幅することができる。また、本発明のＢＳＦ−
２遺伝子の上流にその発現を支配するプロモーター・オ
ペレーター系、特にトリプトファン・プロモーター・オ
ペレーター系を持つものは、ＢＳＦ−２をヒト成長ホル
モンのＮ末端側の一部との融合蛋白質の形で発現し、菌
体内に蓄積する。
ｉ株、例えば、Ｒ８７９１株等を形質転換し、これを栄
養培地中で培養することによってＢＳＦ−２遺伝子を効
率よく増幅することができる。また、本発明のＢＳＦ−
２遺伝子の上流にその発現を支配するプロモーター・オ
ペレーター系、特にトリプトファン・プロモーター・オ
ペレーター系を持つものは、ＢＳＦ−２をヒト成長ホル
モンのＮ末端側の一部との融合蛋白質の形で発現し、菌
体内に蓄積する。
この場合（トリプトファン・プロモーター・オベレータ
−系のとき）ＢＳＦ−２の産生（ｍＲＮＡ合成）はイン
ドールアクリル酸の添加によって強く誘導される。
−系のとき）ＢＳＦ−２の産生（ｍＲＮＡ合成）はイン
ドールアクリル酸の添加によって強く誘導される。
菌体内に蓄積されたＢＳＦ−２及びヒト成長ホルモンと
の融合蛋白質は菌体を溶菌させたのち、通常の生理活性
蛋白質回収法によって分離回収することができる。例え
ば培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、トリス−
塩酸緩衝液に懸濁し、破砕後、尿素等の処理をして得ら
れる上清液をゲルろ過等により目的の蛋白質分画をつる
。
の融合蛋白質は菌体を溶菌させたのち、通常の生理活性
蛋白質回収法によって分離回収することができる。例え
ば培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、トリス−
塩酸緩衝液に懸濁し、破砕後、尿素等の処理をして得ら
れる上清液をゲルろ過等により目的の蛋白質分画をつる
。
本発明の微生物によるヒト成長ホルモンとの融合蛋白質
はその融合部位に血液凝固因子Ｘａの認識部位（ｌ ｌ
ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）を有し、この酵素で処理
することによってＮ末端側から三個のアミノ酸残基（Ｇ
ｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）の付加したＢＳＦ−２とするこ
とができる。
はその融合部位に血液凝固因子Ｘａの認識部位（ｌ ｌ
ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）を有し、この酵素で処理
することによってＮ末端側から三個のアミノ酸残基（Ｇ
ｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）の付加したＢＳＦ−２とするこ
とができる。
実施例１
（オリゴヌクレオチドの調製）
（１）Ｓ″ＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧ
３−（２） ’ −ＡＡＴＴＣＣＡＧＡＣＣＴＴＣ
ＧＡＴＧＡＧ ３− の調製操作 上記のオリゴヌクレオチド（１）、（２）をＤＮＡシン
セサイザーｍ ｏ ｄ ｅ １−３８１ Ａ（Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓＬｅｍ社製）を用いて合成した。合
成終了後、カラム中の担体に吸着したオリゴヌクレオチ
ドをアンモニア水１ｍｌで一時間処理し溶出した。スク
リューバイアル付きの容器にこのアンモニア溶液を入れ
５５℃で一夜反応させた。減圧下で溶媒を留去し、残さ
を蒸留水５００μｌに溶解し、三度ジエチルエーテル５
００μｌで不要物を抽出後、再び溶媒を減圧留去した。
３−（２） ’ −ＡＡＴＴＣＣＡＧＡＣＣＴＴＣ
ＧＡＴＧＡＧ ３− の調製操作 上記のオリゴヌクレオチド（１）、（２）をＤＮＡシン
セサイザーｍ ｏ ｄ ｅ １−３８１ Ａ（Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓＬｅｍ社製）を用いて合成した。合
成終了後、カラム中の担体に吸着したオリゴヌクレオチ
ドをアンモニア水１ｍｌで一時間処理し溶出した。スク
リューバイアル付きの容器にこのアンモニア溶液を入れ
５５℃で一夜反応させた。減圧下で溶媒を留去し、残さ
を蒸留水５００μｌに溶解し、三度ジエチルエーテル５
００μｌで不要物を抽出後、再び溶媒を減圧留去した。
残さを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７，５）／
１ｍエチレンジアミンテトラアセテート２００μｍに溶
解し、アニ−リング２６０ｎｍで吸光度を測定し濃度検
定を行い、各々１０ｐｍｏｌ／μｌの溶液を調製した。
１ｍエチレンジアミンテトラアセテート２００μｍに溶
解し、アニ−リング２６０ｎｍで吸光度を測定し濃度検
定を行い、各々１０ｐｍｏｌ／μｌの溶液を調製した。
合成により得られた上述のオリゴヌクレオチド（１）、
（２）を用いて次の条件で反応を行い、合成フラグメン
トを得た。
（２）を用いて次の条件で反応を行い、合成フラグメン
トを得た。
合成オリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ） ５μＱ５
×カイネーシヨン緩衝液 ＩＯμｅＯ，０１Ｍ
ＡＴＰ ５μＱＴ４ポリヌク
レオチドカイネース ２μＱ（全酒造社製、１０Ｕ／
μｌ） カイネーション緩衝液の組成は、５０ｍＭ）リス塩酸緩
衝溶液（ｐＨ９’、６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、
２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭジチオスレトール、１０
０ｍＭ塩化カリウムで、３７”Ｃ２０分間インキュベー
トした。インキュベート後、合成オリゴヌクレオチド（
１）、（２）溶液を混合し６５℃１０分間反応させ、そ
れからゆっくり室温まで冷却しアニーリングを行った。
×カイネーシヨン緩衝液 ＩＯμｅＯ，０１Ｍ
ＡＴＰ ５μＱＴ４ポリヌク
レオチドカイネース ２μＱ（全酒造社製、１０Ｕ／
μｌ） カイネーション緩衝液の組成は、５０ｍＭ）リス塩酸緩
衝溶液（ｐＨ９’、６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、
２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭジチオスレトール、１０
０ｍＭ塩化カリウムで、３７”Ｃ２０分間インキュベー
トした。インキュベート後、合成オリゴヌクレオチド（
１）、（２）溶液を混合し６５℃１０分間反応させ、そ
れからゆっくり室温まで冷却しアニーリングを行った。
この操作により、５ｐｍｏｌ／μｌの濃度の合成フラグ
メントを得た。
メントを得た。
実施例２
（組換プラスミド及び形質転換株の調製）本発明の組換
プラスミドは融合蛋白質発現型であり、以下実施例で詳
細に述べる。
プラスミドは融合蛋白質発現型であり、以下実施例で詳
細に述べる。
既知のプラスミドｐＢｓＦ２．３８を制限酵素Ａｌｕｌ
及びＢａｍＨＩで消化して約１０００塩基対のＡ Ｉ
ｕ Ｉ−ＢａｍＨ１断片を取り出した。
及びＢａｍＨＩで消化して約１０００塩基対のＡ Ｉ
ｕ Ｉ−ＢａｍＨ１断片を取り出した。
一方、公知のプラスミドｐＧＥＭ４をＳｍａｌ及びＢａ
ｍＨＩで消化して開裂させた。切り出したＡｌｕｌ−Ｂ
ａｍＨＩ断片をＴ、ＤＮＡリガーゼの存在下でｐＧＥＭ
４のＳｍａ Ｌ ＢａｍＨ１切断部に挿入し、プラスミ
ドｐＢＳＦ２．３８１を調製した。続いて該プラスミド
をＢ ｃ ｏ ＲＩＩ及びＨｉ ｎ ｄ ｍで消化して
、約１０００塩基対の翻訳開始コドンを取り除いたＥｃ
ｏＲＩＩ−ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片を得た。次に翻訳開始コ
ドンを含んだ式、’ −ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧＴＴ
ＣＣＧ ３−ＧＴＡＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＧＧＴＣＣに
示したオリゴヌクレオチドを合成し、この合成オリゴヌ
クレオチドと上記の翻訳開始コドンを取り除いたＥｃｏ
ＲＵ−Ｈｉ ｎｄＩＩ［断片を、公知のプラスミドｐｋ
ｋ２２３−３をＥ ｃ ｏ ＲＩ及びＨｉｎｄｌＩＩで
消化し開裂させたものにＴ、ＤＮＡすガーゼを用いて挿
入閉環して、Ｂ細胞分化因子遺伝子の組み込まれたｐＴ
ＡＢ１プラスミドを得ることができた（図１）。得られ
たプラスミドｐＴＡＢＩは、大腸菌に形質転換してクロ
ーニングおよび増幅を行った。プラスミドｐＴＡＢ１を
Ｅｃｏ ＲＴ及び５ａｉｌで消化し、ポリアクリルアミ
ド電気泳動によりて約１０００塩基対のＥｃｏＲｌ−５
ａｉｌ断片を得た。続いて式、 ”ＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧ ３
ＧＡＧＴＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴ八人で表される
オリゴヌクレオチドを合成した。上記オリゴヌクレオチ
ドは５−末端がＢａｍＨＩ構造、３−末端がＥ ｃ ｏ
ｎ Ｉ構造を有し、ｌｉｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ａｒｇで表される血液凝固因子Ｘａの消化認識アミノ酸
配列をコードする。上記の合成オリゴヌクレオチドとプ
ラスミドｐＴＡＢ１のＥｃｏＲＩ−Ｓａｉｌ断片を、Ｂ
ａｍＨｌ及び５ａｌｌで消化し開裂したｐｔＪｃ９に挿
入閉環しｐｔＪＢｓ−１プラスミドを調製した。さらに
、プラスミドｐｔＪＢｓ−１は、大腸菌に形質転換して
クローニング及び増幅を行った。
ｍＨＩで消化して開裂させた。切り出したＡｌｕｌ−Ｂ
ａｍＨＩ断片をＴ、ＤＮＡリガーゼの存在下でｐＧＥＭ
４のＳｍａ Ｌ ＢａｍＨ１切断部に挿入し、プラスミ
ドｐＢＳＦ２．３８１を調製した。続いて該プラスミド
をＢ ｃ ｏ ＲＩＩ及びＨｉ ｎ ｄ ｍで消化して
、約１０００塩基対の翻訳開始コドンを取り除いたＥｃ
ｏＲＩＩ−ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片を得た。次に翻訳開始コ
ドンを含んだ式、’ −ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧＴＴ
ＣＣＧ ３−ＧＴＡＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＧＧＴＣＣに
示したオリゴヌクレオチドを合成し、この合成オリゴヌ
クレオチドと上記の翻訳開始コドンを取り除いたＥｃｏ
ＲＵ−Ｈｉ ｎｄＩＩ［断片を、公知のプラスミドｐｋ
ｋ２２３−３をＥ ｃ ｏ ＲＩ及びＨｉｎｄｌＩＩで
消化し開裂させたものにＴ、ＤＮＡすガーゼを用いて挿
入閉環して、Ｂ細胞分化因子遺伝子の組み込まれたｐＴ
ＡＢ１プラスミドを得ることができた（図１）。得られ
たプラスミドｐＴＡＢＩは、大腸菌に形質転換してクロ
ーニングおよび増幅を行った。プラスミドｐＴＡＢ１を
Ｅｃｏ ＲＴ及び５ａｉｌで消化し、ポリアクリルアミ
ド電気泳動によりて約１０００塩基対のＥｃｏＲｌ−５
ａｉｌ断片を得た。続いて式、 ”ＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧ ３
ＧＡＧＴＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴ八人で表される
オリゴヌクレオチドを合成した。上記オリゴヌクレオチ
ドは５−末端がＢａｍＨＩ構造、３−末端がＥ ｃ ｏ
ｎ Ｉ構造を有し、ｌｉｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ａｒｇで表される血液凝固因子Ｘａの消化認識アミノ酸
配列をコードする。上記の合成オリゴヌクレオチドとプ
ラスミドｐＴＡＢ１のＥｃｏＲＩ−Ｓａｉｌ断片を、Ｂ
ａｍＨｌ及び５ａｌｌで消化し開裂したｐｔＪｃ９に挿
入閉環しｐｔＪＢｓ−１プラスミドを調製した。さらに
、プラスミドｐｔＪＢｓ−１は、大腸菌に形質転換して
クローニング及び増幅を行った。
（融合発現型 ｐＧＢＳ−１＞
プラスミドｐＧＨ−Ｌ９ （Ｅ、コリ ｐＧＨ−Ｌ９
、微工研菌寄第７６０６号）３０μｇを１００ユニツト
のＢｇｌｎ（全酒造社製）と３７℃、３時間反応させた
。反応液ｍ１００μｌで組成は、１０ｍＭ）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）、７ｍＭ塩化マグネシウム、１０
０ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、１００μｇ／ｍ１牛血清アルブミンであった。
、微工研菌寄第７６０６号）３０μｇを１００ユニツト
のＢｇｌｎ（全酒造社製）と３７℃、３時間反応させた
。反応液ｍ１００μｌで組成は、１０ｍＭ）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）、７ｍＭ塩化マグネシウム、１０
０ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、１００μｇ／ｍ１牛血清アルブミンであった。
エタノールにて沈澱させＤＮＡを回収後、１００μｌの
トリス−塩酸緩衝溶液に溶解し、０．９ユニツトのアル
カリフォスファターゼ（全酒造社製）で６５℃、３０分
反応させ、５−末端のリン酸基を除去した。さらに、フ
ェノール処理、クロロフォルム処理を行い、エタノール
にて沈澱させＤＮＡを回収し、ベクターＤＮＡｐＧＨ−
Ｌ９／Ｂｇ Ｉ ＩＩを得た。得られたベクターＤＮＡ
ｐＧＨ−Ｌ９／ＢｇｌＩＩ （０，５μｇ／ｍ１）ｌｐ
ｌとｐｔｒＢｓ−１をＢａｍＨＩにて消化し、ポリアク
リルアミド電気泳動によって得られた約１０００塩基対
のＢａｍＨＩ ＢａｍＨＩ断片（０，１μｇ／μｌ）
５μｌを混合しライゲーションキット（全酒造社製）を
用いて１６℃３０分反応させた。この反応溶液１０μｌ
を大腸菌に形質転換し、形質転換株Ｅ、コリ／ｐＧＢＳ
−１を得た（図２）。
トリス−塩酸緩衝溶液に溶解し、０．９ユニツトのアル
カリフォスファターゼ（全酒造社製）で６５℃、３０分
反応させ、５−末端のリン酸基を除去した。さらに、フ
ェノール処理、クロロフォルム処理を行い、エタノール
にて沈澱させＤＮＡを回収し、ベクターＤＮＡｐＧＨ−
Ｌ９／Ｂｇ Ｉ ＩＩを得た。得られたベクターＤＮＡ
ｐＧＨ−Ｌ９／ＢｇｌＩＩ （０，５μｇ／ｍ１）ｌｐ
ｌとｐｔｒＢｓ−１をＢａｍＨＩにて消化し、ポリアク
リルアミド電気泳動によって得られた約１０００塩基対
のＢａｍＨＩ ＢａｍＨＩ断片（０，１μｇ／μｌ）
５μｌを混合しライゲーションキット（全酒造社製）を
用いて１６℃３０分反応させた。この反応溶液１０μｌ
を大腸菌に形質転換し、形質転換株Ｅ、コリ／ｐＧＢＳ
−１を得た（図２）。
実施例３
（発現）
実施例１で得られたＥ、コリ／ｐＧＢＳ−１をし培地５
ｍｌにて３７℃−晩培養した。得られた培養液５０μｌ
をＬ培地５ｍｌに加え培養し、アブソーバンス６００
ｎｍで吸光度０．４〜０．５となった時点で、インドー
ルアクリル酸（ＩＯｍｇ／ｍ１）５０μｍを加えさらに
４時間培養した。
ｍｌにて３７℃−晩培養した。得られた培養液５０μｌ
をＬ培地５ｍｌに加え培養し、アブソーバンス６００
ｎｍで吸光度０．４〜０．５となった時点で、インドー
ルアクリル酸（ＩＯｍｇ／ｍ１）５０μｍを加えさらに
４時間培養した。
培養終了後、遠心分離機で１０．ＯＯＯｒｐｍ。
１０分間遠心し菌体を集めた。その一部をサンプルバッ
ファー（６２，５ｍｌ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ６
−８）、２％ＳＤＳ、５ｍＭエチレンデアミンチトラア
セテート、１０％グリセロール、３５ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）
に懸濁、沸騰水中で５分間加熱した後、０− １％５Ｄ
Ｓ−１２，５％ＰＡＧＥで電気泳動を行い、分子量３．
６ｘ１０４のものが得られた（図３）。
ファー（６２，５ｍｌ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ６
−８）、２％ＳＤＳ、５ｍＭエチレンデアミンチトラア
セテート、１０％グリセロール、３５ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）
に懸濁、沸騰水中で５分間加熱した後、０− １％５Ｄ
Ｓ−１２，５％ＰＡＧＥで電気泳動を行い、分子量３．
６ｘ１０４のものが得られた（図３）。
実施例４
（血液凝固因子Ｘａによる融合蛋白質からのＢＳＦ−２
の切断） ５１のし培地中、Ｅ、コリ／ｐＧＢＳ−１をインドール
アクリル酸で誘導し４時間培養後、集菌し、約ＩＱｇ（
湿重量）を得た。得られた菌体を５０ｍＭ）リスー塩？
！ｌ！２１衝液（ｐＨ８，０）に懸濁し、破砕後、遠心
し沈澱を得た。得られた沈澱を５０ｍＭグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）に懸濁し、さらに尿
素の最終濃度が８Ｍとなるように緩衝溶液を調製した。
の切断） ５１のし培地中、Ｅ、コリ／ｐＧＢＳ−１をインドール
アクリル酸で誘導し４時間培養後、集菌し、約ＩＱｇ（
湿重量）を得た。得られた菌体を５０ｍＭ）リスー塩？
！ｌ！２１衝液（ｐＨ８，０）に懸濁し、破砕後、遠心
し沈澱を得た。得られた沈澱を５０ｍＭグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）に懸濁し、さらに尿
素の最終濃度が８Ｍとなるように緩衝溶液を調製した。
６０℃で１時間加温し、ＩＭの尿素を含んだ透析液（１
Ｍ尿素、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（
ｐＨ９，０）、２ｍＭ還元型グルタチオン、０゜２ｍＭ
酸化型グルタチオン、１ｍＭエチレンジアミンテトラア
セテート）で１２時間透析後、５０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）で６時間透析した。透析内液を遠心
し、上清を最終濃度１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ
塩化カルシウム、５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
−０）になるように調製した。この溶液に、血液凝固因
子Ｘａ（ベーリンガーマンハイム山）自社製）を蛋白質
５０ｍｇあたり１０ユニット加え、３７℃１０時間反応
させた。反応液を遠心後、その上清をＤｉａｆｌｏ
ＹＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて約１０倍濃縮
し、最終的に５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６
）、２ｍＭジチオスレトール、６Ｍグアニジン塩酸塩、
０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液を調製した。この溶液をＴ
ＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ カラム（２５ｍ
ｍＸ ６００ｍｍ）にかけ、Ｂ細胞分化因子溶出画分を
１Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝溶液（
ｐＨ８，０）、１ｍＭエチレンジアミンテトラアセテー
ト、続いて１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）
で透析した。この透析液をＴＳＫＧｅｌ ＤＥＡＥ−
５ＦＷ カラム（２５ｍｍＸ２００ｍｍ）にかけ、０
から０．８Ｍの塩化ナトリウム溶液による直線濃度勾配
法により溶出した。溶出フラクションをアクリルアミド
電気泳動に付し、Ｂ細胞分化因子と推定される分子９２
１゜０００の画分を得た（図３）。
Ｍ尿素、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（
ｐＨ９，０）、２ｍＭ還元型グルタチオン、０゜２ｍＭ
酸化型グルタチオン、１ｍＭエチレンジアミンテトラア
セテート）で１２時間透析後、５０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）で６時間透析した。透析内液を遠心
し、上清を最終濃度１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ
塩化カルシウム、５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
−０）になるように調製した。この溶液に、血液凝固因
子Ｘａ（ベーリンガーマンハイム山）自社製）を蛋白質
５０ｍｇあたり１０ユニット加え、３７℃１０時間反応
させた。反応液を遠心後、その上清をＤｉａｆｌｏ
ＹＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて約１０倍濃縮
し、最終的に５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６
）、２ｍＭジチオスレトール、６Ｍグアニジン塩酸塩、
０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液を調製した。この溶液をＴ
ＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ カラム（２５ｍ
ｍＸ ６００ｍｍ）にかけ、Ｂ細胞分化因子溶出画分を
１Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝溶液（
ｐＨ８，０）、１ｍＭエチレンジアミンテトラアセテー
ト、続いて１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）
で透析した。この透析液をＴＳＫＧｅｌ ＤＥＡＥ−
５ＦＷ カラム（２５ｍｍＸ２００ｍｍ）にかけ、０
から０．８Ｍの塩化ナトリウム溶液による直線濃度勾配
法により溶出した。溶出フラクションをアクリルアミド
電気泳動に付し、Ｂ細胞分化因子と推定される分子９２
１゜０００の画分を得た（図３）。
（発明の効果）
本発明の組換プラスミド（発現型）はＢＳＦ−２遺伝子
セグメントを効率よく増幅し、これによって形質転換さ
れた微生物に、ＢＳＦ−２蛋白質をヒト成長ホルモンと
の融合蛋白質の形での産生能を与えることができる。
また、本発明のＢＳＦ−２融合蛋白質は血液凝固因子Ｘ
ａで処理することにより、Ｎ末端側から三個のアミノ酸
残基（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）の付加したＢＳＦ−２
とすることができる。
セグメントを効率よく増幅し、これによって形質転換さ
れた微生物に、ＢＳＦ−２蛋白質をヒト成長ホルモンと
の融合蛋白質の形での産生能を与えることができる。
また、本発明のＢＳＦ−２融合蛋白質は血液凝固因子Ｘ
ａで処理することにより、Ｎ末端側から三個のアミノ酸
残基（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）の付加したＢＳＦ−２
とすることができる。
第４図および第２図は本発明のヒトＢＳＦ−２融合発現
型プラスミドの調製を説明する図であり、第３図は本発
明で得られるＢＳＦ−２融合蛋白質のアクリルアミド電
気泳動パターンを説明する図であり、第４図はＢＳＦ−
２融合蛋白質を血液凝固因子Ｘａで処理後、精製して得
られたＢＳＦ−２蛋白質のアクリルアミド電気泳動パタ
ーンを説明する図である。 図４ ａｒｋｅｒ １自−ν 吻− ＃ 一− １５＠１．５ＤＳ−ＰＡＧＥ ◆−９３ｋＤ 嬌−−６８ｋＤ ４３ｋＤ ３０ｋＤ 噌−−１４，４ｋＤ
型プラスミドの調製を説明する図であり、第３図は本発
明で得られるＢＳＦ−２融合蛋白質のアクリルアミド電
気泳動パターンを説明する図であり、第４図はＢＳＦ−
２融合蛋白質を血液凝固因子Ｘａで処理後、精製して得
られたＢＳＦ−２蛋白質のアクリルアミド電気泳動パタ
ーンを説明する図である。 図４ ａｒｋｅｒ １自−ν 吻− ＃ 一− １５＠１．５ＤＳ−ＰＡＧＥ ◆−９３ｋＤ 嬌−−６８ｋＤ ４３ｋＤ ３０ｋＤ 噌−−１４，４ｋＤ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）式 【遺伝子配列があります】 で表されるＤＮＡ配列からなる、ヒトＢ細胞分化因子遺
伝子セグメント。 （２）ヒトＢ細胞分化因子遺伝子の上流側末端に、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇで表さ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はそ
の相補配列を示す）で表されるＤＮＡ配列を、また、そ
の下流側末端に停止コドンを含み、さらにその下流に制
限酵素開裂末端で終わる、式、【遺伝子配列があります
】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表し、Ｙ′はＹの相補配列で
、制限酵素開裂末端の５′末端までを表す）で表される
ＤＮＡ配列を有する特許請求の範囲第１項記載のヒトＢ
細胞分化因子遺伝子セグメント。 （３）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が、
式 【遺伝子配列があります】 で表される配列である特許請求の範囲第２項記載のヒト
Ｂ細胞分化因子遺伝子セグメント。 （４）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が停
止コドンの第二、第三の塩基配列を含んだ配列である特
許請求の範囲第２項記載のヒトＢ細胞分化因子遺伝子セ
グメント。（５）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及
びＹ′の制限酵素開裂末端が、式、 【遺伝子配列があります】 で表される配列を含む特許請求の範囲第２項記載のヒト
Ｂ細胞分化因子遺伝子セグメント。 （６） 【遺伝子配列があります】 で表されるＤＮＡ配列からなる、ヒトＢ細胞分化因子遺
伝子セグメントの製造法。 （７）ヒトＢ細胞分化因子遺伝子の上流側末端に、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇで表さ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はそ
の相補配列を示す）で表されるＤＮＡ配列を、また、そ
の下流側末端に停止コドンを含み、さらにその下流に制
限酵素開裂末端で終わる、式、【遺伝子配列があります
】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表し、Ｙ′はＹの相補配列で
、制限酵素開裂末端の５′末端までを表す）で表される
ＤＮＡ配列を有する特許請求の範囲第６項記載のヒトＢ
細胞分化因子遺伝子セグメントの製造法。 （８）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が、
式 【遺伝子配列があります】 で表される配列である特許請求の範囲第７項記載のヒト
Ｂ細胞分化因子遺伝子セグメントの製造法。 （９）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が停
止コドンの第二、第三の塩基配列を含んだ配列である特
許請求の範囲第７項記載のヒトＢ細胞分化因子遺伝子セ
グメントの製造法。 （１０）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′の
制限酵素開裂末端が、式、 【遺伝子配列があります】 で表される配列を含む特許請求の範囲第７項記載のヒト
Ｂ細胞分化因子遺伝子セグメントの製造法。 （１１） 【遺伝子配列があります】 で表されるＤＮＡ配列からなる、ヒトＢ細胞分化因子遺
伝子セグメントを含み、微生物中で自己増殖可能な組換
プラスミド。 （１２）ヒトＢ細胞分化因子遺伝子の上流側末端に、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇで表さ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はそ
の相補配列を示す）で表されるＤＮＡ配列を、また、そ
の下流側末端に停止コドンを含み、さらにその下流に制
限酵素開裂末端で終わる、式、【遺伝子配列があります
】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表し、Ｙ′はＹの相補配列で
、制限酵素開裂末端の５′末端までを表す）で表される
ＤＮＡ配列を有するヒトＢ細胞分化因子遺伝子セグメン
ト含むものである特許請求の範囲第１１項記載の組換プ
ラスミド。 （１３）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が
、式 【遺伝子配列があります】 で表される配列であるヒトＢ細胞分化因子遺伝子セグメ
ントを含むものである特許請求の範囲第１２項記載の組
換プラスミド。 （１４）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が
停止コドンの第二、第三の塩基配列を含んだ配列である
Ｂ細胞分化因子遺伝子セグメントを含むものである特許
請求の範囲第１２項記載の組換プラスミド。 （１５）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′の
制限酵素開裂末端が、式、 【遺伝子配列があります】 で表される配列を含むヒトＢ細胞分化因子遺伝子セグメ
ントを含むものである特許請求の範囲第１２項記載の組
換プラスミド。 （１６）プロモーター／オペレーター系のメッセンジャ
ーＲＮＡ転写開始点よりヒトＢ細胞分化因子遺伝子まで
のＤＮＡ配列が、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇで表さ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はそ
の相補配列を示す）で表される配列である組換プラスミ
ド。 （１７）式 【遺伝子配列があります】 で表される配列のヒトＢ細胞分化因子遺伝子を含み、微
生物中で自己増殖可能な組換プラスミドを微生物中に保
有するエシャリシャ属に属する微生物。 （１８）組換プラスミドのヒトＢ細胞分化因子遺伝子の
上流側末端に、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＩ１ｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇで表さ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はそ
の相補配列を示す）で表されるＤＮＡ配列を、また、そ
の下流側末端に停止コドンを含み、さらにその下流に制
限酵素開裂末端で終わる、式、【遺伝子配列があります
】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表し、Ｙ′はＹの相補配列で
、制限酵素開裂末端の５′末端までを表す）で表される
ＤＮＡ配列を有する特許請求の範囲第１７項記載の微生
物。 （１９）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が
、式 【遺伝子配列があります】 で表される配列であるヒト細胞分化因子遺伝子を含む組
換プラスミドを保有する特許請求の範囲第１８項記載の
微生物。 （２０）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が
停止コドンの第二、第三の塩基配列を含む組換プラスミ
ドを保有するものである特許請求の範囲第１８項記載の
微生物。 （２１）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′の
制限酵素開裂末端が、式、 【遺伝子配列があります】 で表される配列であるヒトＢ細胞分化因子遺伝子セグメ
ントを含む組換プラスミドを保有する特許請求の範囲第
１８項記載の微生物。 （２２）プロモーター／オペレーター系のメッセンジャ
ーＲＮＡ転写開始点よりヒトＢ細胞分化因子遺伝子まで
のＤＮＡ配列が、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇで表さ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はそ
の相補配列を示す）で表される配列である組換プラスミ
ドを保有する微生物。 （２３）式 【遺伝子配列があります】 で表されるＤＮＡ配列のヒトＢ細胞分化因子遺伝子を含
み、微生物中で自己増殖可能でかつヒトＢ細胞分化因子
を発現することのできる組換プラスミドを細胞中に保有
する、エシャリシャ属に属する微生物を栄養培地に培養
して、ヒトＢ細胞分化因子蛋白を蓄積させてこれを採取
し、必要に応じて血液凝固因子Ｘａで消化することを特
徴とするヒトＢ細胞分化因子の製造法。 （２４）ヒトＢ細胞分化因子遺伝子の上流側末端に、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇで表さ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はそ
の相補配列を示す）で表されるＤＮＡ配列を、また、そ
の下流側末端に停止コドンを含み、さらにその下流に制
限酵素開裂末端で終わる、式、【遺伝子配列があります
】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表し、Ｙ′はＹの相補配列で
、制限酵素開裂末端の５′末端までを表す）で表される
ＤＮＡ配列からなるプラスミドを保有する微生物を用い
る特許請求の範囲第２３項記載の製造法。 （２５）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が
、式 【遺伝子配列があります】 で表される配列であるヒトＢ細胞分化因子遺伝子セグメ
ントを含む組換プラスミドを保有する微生物を用いる特
許請求の範囲第２４項記載の製造法。 （２６）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が
停止コドンの第二、第三の塩基配列を含んだ配列である
Ｂ細胞分化因子遺伝子セグメントを含む組換プラスミド
を保有する微生物を用いる特許請求の範囲第２４項記載
の製造法。 （２７）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′の
制限酵素開裂末端が、式、 【遺伝子配列があります】 で表される配列を含むヒトＢ細胞分化因子遺伝子セグメ
ントを含む組換プラスミドを保有する微生物を用いる特
許請求の範囲第２４項記載の製造法。 （２８）ヒト成長ホルモンのＮ末端側の一部とＮ末端よ
りＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇで表されるＤＮＡの塩基配
列を介して融合された蛋白質の形でヒトＢ細胞分化因子
を得、これを血液凝固因子Ｘａで消化することを特徴と
する特許請求の範囲第２３項記載の製造法。（２９）Ｎ
末端側より血液凝固因子Ｘａの切断認識配列、Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇで表されるアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列が、式【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第２８項記載の
製造法。 （３０）プロモーター／オペレーター系のメッセンジャ
ーＲＮＡ転写開始点よりトロンビンの認識部位をコード
するＤＮＡ塩基配列までが、 式 【遺伝子配列があります】 で表される配列であることを特徴とする特許請求の範囲
第２８項記載の製造法。 （３１）式 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 で表されるヒトＢ細胞分化因子融合蛋白質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63179118A JPH022353A (ja) | 1988-03-10 | 1988-07-20 | ヒトｂ細胞分化因子の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5486788 | 1988-03-10 | ||
| JP63-54867 | 1988-03-10 | ||
| JP63179118A JPH022353A (ja) | 1988-03-10 | 1988-07-20 | ヒトｂ細胞分化因子の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022353A true JPH022353A (ja) | 1990-01-08 |
Family
ID=26395688
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63179118A Pending JPH022353A (ja) | 1988-03-10 | 1988-07-20 | ヒトｂ細胞分化因子の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH022353A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007230778A (ja) * | 2006-01-31 | 2007-09-13 | Canon Inc | シート搬送装置及び画像形成装置 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988000206A1 (en) * | 1986-07-08 | 1988-01-14 | Genetics Institute, Inc. | Production and use of il-6 |
-
1988
- 1988-07-20 JP JP63179118A patent/JPH022353A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988000206A1 (en) * | 1986-07-08 | 1988-01-14 | Genetics Institute, Inc. | Production and use of il-6 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007230778A (ja) * | 2006-01-31 | 2007-09-13 | Canon Inc | シート搬送装置及び画像形成装置 |
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