JPH02245192A - ペプチドラクトン及びその誘導体並びにそれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ストレプトマイセス・グリセオフラプス（釘
Ｂ坦因り話Ｌｍ国竺則肛旦）から得られるペプチドラク
トンの構造を有する発酵生成物、これを製造するだめの
製造方法、該ペプチドラクトンからラクトン開裂及び場
合によってはこれに続くエステル化により得られる誘導
体、該ペプチドラクトン及び該誘導体の医薬としての並
びにストレプトマセス（鉦７）における気 中菌糸の形成及び抗生物質の生産のための使用、前記ペ
プチドラクトン又は前記誘導体の１つを含有する医薬製
剤、新規な分解（開裂）生成物、並びに新規な生産株に
関する。

〔従来の技術〕

ストレプトマイセス属の細菌は、固体栄養基質上の基菌
糸（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ）から気中
菌糸（ａｅｒｉａｌ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ）が形成される
複雑な発達サイクルにより特徴付けられる。次に、胞子
形成過程において、末端気中菌糸（ｔｅｒｍｉｎａｌ　
ａｅｒｉａｌ　ｍｙｃｅｌｉｕｍｈｙｐｈａｅ）が胞子
鎖に分裂することができる。実験的知見は、気中菌糸及
び胞子への細胞分化が二次代謝の間、すなわち抗生物質
、色素、貯蔵物質及びジエオスミン（ｇｅｏｓｍｉｎ）
の合成と同時に行われるという仮定を許容する。

放線菌における二次代謝及び分化の制御について今まで
ほとんど知られていないが、両過程は細胞中又は細胞間
で仲介を行う２つの群のシグナル物質により制御される
らしい。

最近、放線菌の場合に、気中菌糸の発達及び抗生物質の
合成の両者が厳格に制御されることが示されている。厳
格な制御は２種類の細胞内エフェクターであるグアノシ
ンテトラホスフェート及びグアノシンペンタホスフェー
トにより開始される。

細菌中に一般に広範に分布するこれらのエフェクターに
加えて、種特異的分子間シグナル分子が見出されている
。放線菌においては、これらは気菌糸及び／又は抗生物
質、例えばＡファクター〔２−イソオクタノイル−３（
Ｒ）−ヒドロキシメチル−γ−ブチロラクトン〕及びＢ
ファクター（３’　−（１−ブチルホスホリル）−アデ
ノシン〕の生成を誘導する。

新しい分子間シグナル物質の探索において、今や寒天拡
散試験により所望の活性を有する物質を生産する株が見
出された。この物質は低濃度において気中菌糸並びに生
産株及び他の幾つかの放線菌株における抗生物質の生成
を刺激し、そしてそれ故に［ホルマオマイシンＪ　（ｈ
ｏｒｍａｏｍｙｃｉｎ）と命名される（ｈｏｒｍａｏ−
ギリシャ語における「私は動かす」）。

〔発明の概要〕

本発明はストレプトマイセス・グリセオフラプスＤＳＭ
　５１９５株を用いる発酵により得られ、そしてアース
ロバフタ−・クリスタロポイエテス（八ｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ　　ｃｒ　　５ｔａｌｌｏ　　ｏｉｅｔｅｓ）
　　ＡＴＣＣ１５４８１株及びアースロバフタ−・オキ
シダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃ’ｔｅｒ　郊り睡ｕ）　
ＡＴＣＣ１４３５８株に対して０．０１ｐｇ／ｍ１未満
、そしてさらにＯ，００１ｍｇ／ｌｄ未満の最小阻止濃
度を示す物質ホルマオマイシンに関する。

今までの知見によれば、ホルマオマイシンはおそらく次
の式（Ｉ）： と１ で表わされる構造を有する。

本発明は特に、実施例に示す特性が値かであるとみなし
得る限りそれらの特性を有するホルーンオマイシンに関
し、これらの特性の選択は明瞭な特徴付けのために十分
であり、すなわち、ホルマオマイシンは測定の正確さの
範囲において次の物理的特性の内の少なくとも１つ、又
は好ましくはすべてを有する：ａ）融点１６６〜１６８
°ｃ、ｂ）旋光度〔α〕ぴ＝＋２０．８°　（ｃ　＝　
０．５、メタノール）、Ｃ）分子量１１２９±２、ｄ）
溶剤としてのＣＤＣｌ！、３中で、内部標準としてのテ
トラメチルシランに対して、＋０．５〜−Ｑ、　７　ｐ
ｐＨｌの化学シフトを有する’Ｈ−ＮＭＲシグナル、特
に１つの陽子について各０．４８０．２９、−０．１５
及び−ｏ、６３ｐｐｍのシグナル。

さらにホルマオマイシンに特徴的なのは、それがアミノ
酸２−アミノ−３−（２−ニトロシクロプロピル）−プ
ロピオン酸であって、３−（２ニトロシクロプロピル）
−アラニン（ＮＣＰ−Ａｌａと略される）とも称される
ものの２個の基を有し、これら２個の基は不斉中心にお
けるコンフィグレーションに関して相互に異る可能性が
ある。

以後の明細書の記載及び実施例に式（１）の構造を推定
することができる知見を記載する。

光学活性ホルマオマイシンは２７８ｎｍ及び２０６ｎｍ
（メタノール）において典型的なＵＶ極大値を示し、こ
れらはｐＨの変化によりわずかにのみシフトする。ＩＲ
スペクトルにおいてＣＯ−ラクトンのバンド（１７４１
ｃ＋＋ｒ　’　）及びＣＯ−アミドのバンド（およそ１
６４０及び１５４５ＣＴＩ＋−’）を観察することがで
きる。ＦＡＢマススペクトルから１１２８．４の分子量
が推定される。元素分析によれば、ホルマオマイシンは
Ｃ，Ｈ，Ｎ及びＯに加えて塩素原子を含有し、実験式Ｃ
ｓ５Ｈ６ｑＮ＋ｏＯ＋ａＣｊ２に相当する。

ＣＤＣ１３中での’Ｈ−Ｎ）ＩＲスペクトルはある程度
ＣＤ３０Ｄと徐々に相互交換する（ｉｎｔｅｒｃｈａｎ
ｇｉｎｇ）　６個の明瞭に区別可能なＮＨ基、及び１１
．ｌｐｐｍにおけるＯＨ基を有する。１０個の密接に隣
接する芳香族性Ｈ及びＡＢ系（６，７５／６．Ｏ８ｐｐ
ｍ、　　Ｊ　＝　４．５　）を同定することができる。

２〜５．５　ｐｐｍの範囲において、相互によく分離さ
れた多くのＩＨシグナルが存在する。シグナルのクラス
ターが１〜２　ｐｐｍの間に存在し、メチル基のための
５個のダブレット及び１個のトリプレットを同定するこ
とができる。ホルマオマイシンで顕著で典型的なのは０
．４８及び０．２９ｐｐｍにおける２個のＩＨマルチプ
レット及び−０，１５及び−０，６３ｐｐｍにテトラメ
チルシラン（ＴＭＳ　）の後のさらなる２個である。

”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて、次のタイプ＝６Ｃ
Ｈ３、７ＣＨ２、１６ｓｐ３−ＣＩ　、　１４ｓｐ２−
ＣＨ、４５ｐ２−Ｃ及び８ＣＯの合計５５個の炭素原子
を同定することができる。ｓｐ’−Ｃ原子の領域におい
て２個のメチル基（１３，４ｐｐｍ）が重複して存在し
、そして５ｐ３−ＣＨの領域における４個のシグナル（
１２７，４，１２７，７，１２８，５゜１２８．６ｐｐ
ｍ）及びＣＣ基の領域における１個のＣＣ基（１６８，
７ｐｐｍ）が２回カウントされている。このスペクトル
は、ホルマオマイシンが２個の芳香族性の及び他の不飽
和のアミノ酸を含有するペプチドであるとする仮定を許
容する。

アミノ　　　プロリン ホルマオマイシン中に存在するアミノ酸は、加水分解の
際に得られる成分の同定により、並びにＩＨ／ＩＨ−及
び’Ｈ／”　Ｃ−ＣＣ−Ｃ０３Ｙ−Ｎ！、　ベクトル助
けによる無傷の抗生物質中の帰属により推定される。

ホルマオマイシンの全加水分解物（６ＭＨＣｆｆｉ／酢
酸、１：１．１１０°Ｃ１４８時間）中に、芳香族アミ
ノ酸分析により及びミクロダンシル化〔■。

Ｌａａｔｓｃｈ、　Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　１７
３　（１９７９）３９８）によりスレオニン（Ｔｈｒ）
及びイソロイシン（Ｉｌｅ）　ヲ検出することができる
。プロリン、バリン（２個のバンド）及びフェニルアラ
ニン（バンドは２倍の強度を有する）の領域に異常な中
性アミノ酸が観察される。ＧＣ−ＭＳカップリング（質
量分析計に連結されたガスクロマトグラフ）における試
験のため、アミノ酸がトリフルオロアセチル化メチルエ
ステル又はイソプロピルエステルに転換され、あるいは
トリメチルシリル誘導体が生成される。最も短い保持時
間を有する物質のマススペクトルからａ−Ｔｈｒ及びＩ
ｌｅを帰属させることができる。さらに、２回現われる
アミノ酸は、トリフルオロアセチル化メチルエステルの
ＥＩ−ＭＳ（エレクトロン・インパクト・イオニゼーシ
ョン・マス・スペクトル）におけるｍ／ｚ　２３０（Ｍ
”−Ｃ００ＣＨ３）及び１０５（［ＣＪｓＣＨＣ１ｌ＋
］　”）の特徴的なフラグメントにより、及びトリフル
オロアセチル化イソプロピルエステルのＣＩ−ＭＳ（化
学イオン化マススペクトル）におけるｍ／ｚ　３１８（
［旧■１＋）の分子イオンによりβ−メチルーフェニル
アー７−１−ン（β−Ｍｅ−Ｐｈｅ）として帰属される
。このデーターは、合成β−Ｍｅ−Ｐｈｅのデーター（
Ｙ、Ｋａｔａｏｋａ　ら、Ｂｕｌｌ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ
、Ｊａｐ、　４９　（１９７６）１０８１）と一致する
。

先に記載したアミノ酸について、メチル基から又はＮＨ
基及びα−ＣＨ基から出発して関連するカップリングパ
ートナ−が’Ｈ／”Ｈ−ＣＯ３Ｙスペクトルにおいて見
出され得、そして’Ｈ／”　Ｃ−Ｃ０５Ｙスペクトルに
より関連するＣ原子にリンクされ得る。２個のβ−Ｍｅ
−Ｐｈｅ構成ブロックのシグナルは幾つかの場合に顕著
に異る。やはり顕著なことには、Ｈα／Ｈβ−カップリ
ングはある場合には遊離アミノ酸におけるごと＜Ｊ＝４
．５Ｈｚであり、そして他の場合にはＪ　＝１０．５Ｈ
ｚであり、このことは側鎖の異るコンホーメーションを
指摘する。

３種の新アミノ酸の１つは（Ｚ）−４−プロペニル−プ
ロリン（４−ＰＥ−Ｐｒｏ）として同定される。

分子量及びプロリン構造の標示は、トリフルオロアセチ
ル化メチルエステルのｍ／ｚ　２６５（Ｍ”）における
イオンとｍ／ｚ　２０６（Ｍ”−ＣＯＯＣＨ３）及び１
６４におけるイオンの組合せにより与えられる。側鎖の
構造及びプロリン構造上のその位置は相関スペクトルが
ら得られる。ＣＤＣｌ！、３中でＨ−Ｃ（４）及びＨ２
Ｃ（５）（第１表を参照のこと）はオーバーラツプし、
そして’　ｌ（／　’　Ｈ−ＣＯ３Ｙスペクトル（３，
２，１及び３．２１／３．９１ｐｐｍ）において言うま
でもなく帰属させることカテきナイ。シカシナがら、Ｃ
ＤＣ４２３／　（ＣＤ３）　ｚｃ。

１ＣｂＤｂ　（１：　１　：　１　）において、正確な
帰属（２，９８及び３．０７／３．８５ｐｐｍ）を得る
ことができる。オレフィン性ＡＢ系（６Ｍ　５．２０１
５．５８　ｉδｃ１２７．５／１２８．２ＣＤＣＩ！、
３中）はＪ　＝１０．５Ｈｚ　（Ｚコンフィグレーショ
ン）のＡＢカップリングを有し、そして一方においてオ
レフィン性メチル基（δ、　１．６１）により分割され
、そして他方においてＣＩ基により分割される。α−Ｃ
Ｉ（４，２０ｐｐｍ）から出発し、ＣＨｚ基（１，７２
／２．３０ｐｐｍ）及びＣＩ基（３，２１ｐｐｍ）を介
して更なるＣ１１２基（３，２１／３．９１ｐｐｍ）に
達する。後者はそのδ。

値（５２，８ｐｐｍ）においてプロリンのｃ（５）に対
応し、これはプロリン構造上のプロペニル基の４位を示
す。自動アミノ酸分析において、４−ＰＥ−Ｐｒ。

の比率は常に明らかに１未満である。Ｇ（、ＭＳ分析に
おいて、Ｎ−トリフルオロアセチル−４−プロペニル−
プロリンメチルエステルに加えて、マススペクトルによ
り対応する４−（１−もしくは２−トリフルオロアセト
キシプロピル）又は４−（ニーもしくは２−クロロプロ
ピル）誘導体を検出することができる。これは、ホルマ
オマイシンの加水分解において４−ＰＨ−Ｐｒｏが二重
結合に水又は）ｌｃｊｌ！を付加するとの仮定により説
明される。

ＧＣ−’ＭＳカップリングにおいて、全加水分解物の２
個のまだ帰属されていないアミノ酸が、トリフルオロア
セチル化メチルエステルとして、いずれの既知化合物に
も帰属させることができない同一のＥＩｌマススペクト
ル与える。これらのアミノ酸をより詳細に研究すること
ができるように、１０■のホルマオマイシンの全加水分
解物を、アセトニトリル／水（７：３）系にてｐ　−Ｂ
ｏｎｄａｐａｋ−Ｎ）＋２カラム（ＮＯ３基を有するシ
リカゲル）上でのＨＰＬＣ分離にかける。芳香族アミノ
酸分析によれば分離は完全ではなく、１つの両分中にあ
り、未知アミノ酸及びイソロイシン（Ｉｌｅ）がおよそ
同量で存在する。誘導体化の後、前者は再び同一のＥｌ
マススペクトルを与え、そしてＣＩ−ＭＳにおいてｍ／
ｚ　２８５［Ｍ＋Ｈ］　”における分子イオンをもたら
す。この偶数分子量は分子中の２個のＮ原子を示し、こ
れはＥＩ−ＭＳにおけるフラグメントイオンの及びトリ
メチルシリル誘導体の分子イオンの高分離により証明さ
れ、そして遊離アミノ酸について実験式Ｃ６Ｈ＋。Ｎ、
０．を与える。トリフルオロアセチル化メチルエステル
はまずＮｏｔ（ｍ／ｚ　２３８）又はＣＯＯＣＨ３（ｍ
／ｚ２２５）を失い、そしてさらにニトロアミノ酸に典
型的なフラグメントイオンを示す。ホルマオマイシンの
相関スペクトルにおける関連する’Ｈ−ＮＭＩ？シグナ
ルについての研究において、ＮＨ／α−ＣＩ基から出発
して２個の同一の相関シリーズが見出され、その一方は
明瞭に区別することができ、そして他方は、オーバーラ
ツプするシグナルのため、４００ＭＨｚにおける’Ｈ／
’Ｉ（−ＣＯ３Ｙ　７！、ベクトルと’Ｈ／’　”Ｃ−
Ｃ０３Ｙスペクトルとの組合せによってのみ示される（
第１表）。ＭＳ及びＮＭＲデーターは３−（２−ニトロ
シクロプロピル）−アラニン（ＮＣＰ−Ａｌａ）の存在
を示し、このものはホルマオマイシン中に２度存在する
。この無傷のペプチド中の２個の構成ブロックの対応す
る’Ｈ−ＮＭＲシグナルは明瞭に異る（Δδ−０．８２
〜１．６７ｐｐｍ）が、匹敵する”Ｃ−ＮＭ）！シグナ
ルは非常に類似している（Δδ＜２ｐｐｍ、第１表）。

ホルマオマイシンに典型的な高収率−シフト’Ｈ−ＮＭ
ＲシグナルはＮＣＰ−八１ａに属する。β−ＭｅＰｈｅ
構成ブロックのフェニル基がシールドに寄与しているの
かも知れない。

同じ構造を有するから、自動アミノ酸分析における及び
誘導体にした後ＧＣ−ＭＳ分析におけるこの遊離アミノ
酸の分離性は立体化学によってのみ説明することができ
る。Ｈ−Ｃ（５）（２，９０及び３．９９ｐｐｍ）は２
個の構成ブロックにおいてマスクされず、そして同一の
カップリングパターン（ｄｄｄ、５ライン）を示し、こ
れからカップリング定数（Ｊ＝６、６　、３．３及び３
．３）を導くことができる。シクロプロパン環上のＨ原
子のカップリング定数の強度（Ｈ，Ｆｒ１ｔｓｃｈｉら
、■ｅｌｖ、ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ　７１（１９８８）１
５５３）から、Ｈ−Ｃ（５）上にＣ−（６）の２個のプ
ロトンの１つに対するｃｉｓ−カップリングのみが存在
し、そしてニトロ基及びアラニル基はシクロプロパン環
上で相互に対してｔｒａｎｓ−コンフィグレーションに
ある。Ｈ−Ｃ（５）カップリングパターンは、遊離の肝
ＬＣ−濃縮されたアミノ酸ＮＣＰ−Ａｌａの’Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルにおいて４．４０ｐｐｍでのシグナル上に
同様に再現し、これは立体異性体の存在にも拘らず２度
存在しない。おそらく、２個のアミノ酸はα−Ｃ原子に
おけるコンフィグレーションにおいて異るのであろう。

ホルマオマイシンの全加水分解物中に検出されるアミノ
酸が縮合と組合わされる場合、ペプチド鎖上でアミノ末
端、カルボキシ末端及びａ−スレオニン−ＯＨ基（アロ
ースレオニン−ＯＨ基）は遊離しており、そしてＨ及び
０原子に加えて検出されるＣＩ！、原子を含有すべきＣ
ＡＮがなお欠けている。ペプチド鎖のアミノ末端がアシ
ル化され、この場合のみ６個のアミドＮＨ基の全体が’
Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて得られる。従って、２，
４−ジニトロフルオロベンゼン及びダンシルクロリドに
よる末端基分析は陰性である。ａ−スレオニンＯＨ基が
エステル化され、Ｈ−Ｃ（３）の低収率位置（５，３５
ｐｐｍ）から検出可能である。Ｃ５Ｎ基がエステルとし
てではなくアミド化的にペプチド鎖に結合しているとい
う事実はメタノール／に、Ｃ０３によるホルマオマイシ
ンのラクトン開裂（Ｗ、Ａ、八ｙｅｒ及びり、Ｍ、　Ｐ
ｅｎａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、　Ｊ、Ｎａｔ、Ｐｒｏｄ
、　５０（１９８７）４００〕から推定することができ
る。メタノールの吸収により分子１Ｅ１１６０　（ファ
スト・アトム・ボンバードメント・マス・スペクトル（
ｆａｓｔ　ａｔｏｍｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　　ｍａｓ
ｓ　　ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、　　ＦＡＢ−ＭＳ）　　、
　１１８３［Ｍ＋Ｎａピを有するホルマオマイシンメチ
ルエステルが生成し、その’Ｈ−ＮＭＲスペクトルにお
いて、スレオニンのＨ−Ｃ（３）がδ□＜　５　ｐｐｍ
にシフトし、そしてエステル−〇ＣＩ（３が３．７４ｐ
ｐｍに現われる。従って、分子のまだ帰属されていない
部分はＣＯ基（δｃ　１５９．３ｐｐｍ）及び基Ｃ４Ｈ
３ＮＯＣｆｆｉから成る。このＣ原子は１０３．５〜１
２１．４ｐｐｍのδ。値と５ｐ２−ハイブリダイズする
。Ｈ原子の内の２個はδ、　６．０８／６．７５ｐｐｍ
においてＡＢ系を形成し、第三のものは１１．１０にあ
る（第１表）。これらのデーターをうまく組合わせれば
アミド結合した５−クロロＮ−ヒドロキシピロール−２
−カルボン酸（ＣＨＰＣＡ）が得られ、このものは文献
中に知られておらず、そしてホルマオマイシンの加水分
解物中に今まで検出し得なかった。ＮＭＲデーター（第
１表）は５−位において置換されたピロール−２−カル
ボン酸のそれと、並びに抗生物質クロモキシマイシン（
ｃｈｒｏｍｏｘｙｍｉｃｉｎ）　　（Ｙ、Ｋａｗａｉ　
　ら、Ｔｅ　ｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、　２６（１
９８５）３２．７３）及び５５１８５ＲＰ　−（Ｍ、Ｄ
ｅｃｈａｍｐｓら、ヨーロッパ特許出願２４６．．９７
５）中の匹敵する基のそれとよ（一致する。

ホルマオマイシンにおいては、検出されるアミノ酸及び
仮定されるピロール−２−カルボン酸がアミド結合によ
り線状ペプチド鎖を形成し、そのペプチド鎖のカルボキ
シ末端がα−スレオニン−ＯＨ基と共に閉じてラクトン
環を形成する。このラクトン環はａ−′：スレオニン上
にアミド結合した側鎖を担持する。

ラクトン環中のアミノ酸構成ブロックの仮定される配列
は次の実験により推定される。

前記のごとく、ａ−スレオニンはそのヒドロキシ官能基
によりラクトン結合に関与し、このことは’Ｈ−ＮＭＲ
データーから見ることができる。

エステル官能基のアルコールへの還元により、ラクトン
結合のためにカルボキシ官能基を提供するアミノ酸を決
定することが可能なはずである。

テトラヒドロフラン中０°Ｃでのホルマオマイシン゛と
ＬｉＡｌＨ４との反応において、還元生成物の全加水分
解及びそれに続くトリフルオロアセチル化メチルエステ
ルへの誘導体化の後、対応する４−プロペニル−プロリ
ノール誘導体をＧＣ−ＭＳ分析により検出することがで
きる。

２０６（１００χ、　　Ｍ”−［ＣＨ２−０ＣＯＣＦ３
］、　　１６４（１０χ、　　Ｍ”−［ＣＨ２０ＣＯＣ
Ｆ３＋ＣＨ＝ＣＩｌ−ＣＨ３＋Ｈ］　）。

ホルマオマイシンのラクトン環を開きそしてメチルエス
テルを形成することにより、ホルマオマイシンメチルエ
ステルと称する式（ＩＩ）の化合物が得られる。

（ＩＩ） 本発明はまた、ラクトン開裂及び低級アルカノールによ
るエステル化によりホルマオマイシンから得られる物質
、特にボルマオマイシンメチルエステルに関する。

ボルマオマイシン及び式（ＩＩ）の開鎖メチルエステル
のＦＡＢマススペクトルの比較分析は次のデーターをも
たらす。

ポルマオマイシンのＦＡＢ−ＭＳ　：　ｍ／ｚ＝１１２
９．４／１１３１．５（１１χ、団＋Ｈ１’）、　９３
８（１χ、　　［Ｍ＋ｌ−１１”−（ＣＨＰＣＡ＋１ｌ
ＮＯ□））。

８３０（２％、　　［Ｍ＋２１１］’−（ＮＣＰ−八Ｉ
ａ　−ＣＨＰＣＡ））、　　７００／７０２（２χ、　
　［Ｍ＋２１１１　”−（ＮＣＰ−八Ｉａ　・　β−Ｍ
ｅ−Ｐｈｅ　−１１ｅ））。

５３Ｂ１５４０（１χ、［ト旧“−（β−Ｍｅ−１”ｂ
Ｃ−ＮＣＰ−八ｌａ・　β−ＭｅＰｈｅ・ＩＩｅ））、
　５１６１５１Ｂ（２Ｌ　　［Ｍ＋ＩＩ］’−（ＮＣＰ
−＾１ａ・βＭｅ−Ｐｈｅ−１１ｅ　・４−ＰＥ−Ｐｒ
ｏ＋Ｎ０ｚ））、　４０１／４０３（２χ。

［Ｍ＋Ｈ］　４−　（β−Ｍｅ−Ｐｈｅ　−ＮＣＰ−八
１ａ　・　β−Ｍｅ−Ｐｈｅ・　ＩＩｅ・４−ＰＥ−Ｐ
ｒｏ））、３００／３０２（２％、ＮＣＰ−Ａｌａ−Ｃ
ＨＰＣＡ）、１４４／１４６（２２χ、　　Ｃ）ＩＰＣ
八、　　１３４（１００χ））。

エ　■　のヒ入　のＦＡＢ−ＭＳ　：　ｍ／ｚ＝１１８
３／１１８５（３，５Ｌ団＋Ｎａｐ”）、　１１６１／
１１６３（２χ、［トＨド）、　９９２／９９４（３，
６χ。

団＋Ｈドー（４−ＰＥ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ＋Ｈ））、　８
７９／８８Ｈ１χ、　　［Ｍ＋Ｈド（Ｉｌｅ　・４−Ｐ
Ｒ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ＋Ｈ））、　　７１８／７２０（３
χ、団＋Ｈ１”（β−Ｍｅ−Ｐｈｅ−１１ｅ　・４−Ｐ
Ｅ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ＋Ｈ））、　　５６２１５６４（０
，９％、　　［Ｍ＋ｌｌドー（ＮＣＰ−Ａｌａ−β−Ｍ
ｅ−Ｐｈｅ−１１ｅ　・４−ＰＲＰｒｏ−ＯＭｅ’＋Ｈ
））、　５３４１５３６（０，７！、　　［Ｍ＋１”−
（ＱＣ−ＮＣＰＡｌａ・β−Ｍｄ−Ｐｈｅ　・Ｉｌｅ　
・’４−ＰＥ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ＋Ｈ））、　４１９（３
χ、ａ−Ｔｈｒ・　β−Ｍｅ−Ｐｈｅ−ＮＣＰ−Δ１ａ
＋Ｈ）、　　４０１／４０３（０，９χ、ａ−Ｔｈｒ　
・　β−Ｍｅ−Ｐｈｅ　−ＮＣＰ−八１ａ＋Ｈ）。

アミノ酸構成ブロックＣｏ−ＣＨＲ−ＮＨの質量数：ａ
−Ｔｈｒ　：　１００又は１０１４−ＰＥ−Ｐｒｏ　：
　１３７１１ｅ　：　１１３　ＮＣＰＡｌａ　：　１５
６β−Ｍｅ−Ｐｈｅ　：　１６１　ＣＨＰＣＡ：１４４
゜式（ＩＩ）の化合物のＦＡＢ−ＭＳはまた開鎖ペプチ
ドのカルボキシ末端からの４−ＰＲ−Ｐｒｏ−ＯＣＨｚ
の開裂を示し、このことはホルマオマイシン中のラクト
ン結合へのその関与を確認するものである。

ホルマオマイシンの部分加水分解（１２Ｎ　ＨＣｆｆｉ
／酢酸１：１、室温、４８時間の場合、トリフルオロア
セチル化メチルエステルへの誘導体化の後、２個のジペ
プチド及び１個のトリペプチドがＧＣ−ＭＳ分析におい
て見出される。

ｍ／ｚ＝４０２　（５χ、　　Ｍ”Ｌ　　３４３（２χ
、　　Ｍ”−ＣＯＯＣＨｓ）、２３０（５Ｘ。

Ｍ”−（ＯＣ−１１ｅ−ＯＣＨ：＋））＋　　１０５（
１００χ、　　Ｃ６Ｈ３−ＣＦＩ−ＣＦＩ３）　　。

ルエステル：　ＥＩ−ＭＳ　：　ｍ／ｚ＝４２７（０，
３χ、　Ｍ”−ＣＯＯＣＲ３）。

２６６（０，２χ、　　Ｍ”−（ＱＣ−β−Ｍｅ−Ｐｈ
ｅ−ＯＣＨ３））、　　１９２（１，’５χβ−Ｍｅ−
Ｐｈｅ−ＯＣＨｚ））、１７６（１６Ｘ、　　ＣＪｓ−
Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨＣＯＯＣ）１３）、　　１３４（９
χ、　　Ｎ０２−ＣＨ−ＣＩ（ＣＩ（３）−Ｃ６Ｈ５）
、　　１０５（１００χ、　　Ｃ６Ｈ３−ＣＨ−ＣＨ３
）。

４８３　（３χ、　　Ｍ”−（Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ（Ｃ
Ｈ３））、　　３４３（５χ、　　Ｍ、”−（ＱＣ４−
ＰＥ−Ｐｒｏ−ＯＣＨｚ））、　　２３０（１χ、　　
Ｍ”−（ＱＣ−１１ｅ・４−ＰＲＰｒｏ−ＯＣＨ３）、
　　１０５（９６χ、　　Ｃ６Ｈ３−ＣＨ−ＣＨ３）。

これらの結果はＦＡＢ−ＭＳスペクトルからの配列分析
の部分を゛確認する。

アミノ酸の立体化学及びラクトン環のコンホーメーショ
ンはなお幾分解明されていない。

インビトロでの寒天稀釈列試験において、ホルマオマイ
シンは多数の細菌、例えば、アースロバフタ−・クリス
タロポイエテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｃｒ　５ｔ
ａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）　、アースロバフタ−・オキ
シダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　停止１匣）　、
コリネバクテリウム・スペシース（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、　）、ブレビバクテリウム・リネ
ンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｎｅｎｓ）及
びサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ　立前１社ｕ）に対して抗菌作用を示す。最小阻止濃
度は０．０００１〜５０μｇ／ｄの範囲である。次の表
に若干の特定の例を記載する。

コリネバクテリウムｓｐ、ＡＴＣＣ２３８３００，１ “八ＴＣＣ：アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレ
クション；米国、ＭＤ、ロックビル。

従って、ホルマオマイシンは抗菌剤として使用すること
ができる。サルモネラ・ティフィムリウムによる感染の
症例において抗生物質として使用する場合、約７０ｋｇ
の体重の温血動物に投与すべき日用量は約０．５〜５ｇ
、好ましくは１〜２ｇである。

若干の放射菌株の場合、ホルマオマイシンは約０．０５
μｇ　／　ｍ以上という低い濃度において抗生物質の生
成を増加せしめる。例えば、ストレプトマイセス・グリ
セオフラプス（旦匹旦竺バ競■ｕ匹■鉦匹）（Ｔｉｉ　
１３０６）を含む発酵液への０．０５μｇ／戚の濃度の
ホルマオマイシンの添加により抗生物質チランダマイシ
ン（ｔｉｒａｎｄａｍｙｃｉｎ）の生産がおよそ２倍と
なり、１μｇ　／　ｍｌの濃度においては生産が約４倍
増加する。

従ってホルマオマイシンはまた価値ある発酵生産物の収
量を増加させるためにも使用することができる。

ホルマオマイシンはストレプトマイセス・グリセオフラ
プス（ＤＳＭ　５１９５）及びストレプトマイセスの他
の株の気中菌糸の形成を誘導する。これらの株が試験プ
レートのための指示細菌として使用される場合、及びさ
らに気中菌糸（白色の着色により同定することができる
）が発達しない栄養寒天が使用される場合、該寒天の表
面へのペーパーディスク中１ｔｔｇのホルマオマイシン
の適用が該ディスクの周囲での豊富な気中菌糸の形成を
開始することができる。

ホルマオマイシンの製造のための本発明の方法において
は、ストレプトマイセス・グリセオフラプスＤＳＭ　５
１９５株又は該株から誘導され得る培養物を適当な培地
中で培養し、そして培地からホルマオマイシンを単離す
る。

上記の方法をさらに具体的に記載する。ホルマオマイシ
ンは新規な微生物学的方法により、すなわち新規なスト
レプトマイセス・グリセオフラプスＤＳＭ　５１９５を
用いる発酵により得られる。この株は寄託番号ＤＳＭ　
５１９５のもとにＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ
ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚ
ｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭ）。

Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ＩＢ＋　Ｄ−３３０
０Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ　、西独国、に１９８９年
１月３１日に寄託された。

ホルマオマイシン生産株ＤＳＭ　５１９５は八ｎｕｒａ
ｄｈａｐｕｒａ（スリラン力）から採集した土壌サンプ
ルから単離された。この株は、ストレプトマイセス属に
属し、すべてのタイプ決定特性においてストレプトマイ
セス・グリセオフラプスのタイプストレインに一致し、
そしてそれ故にこのタイプに帰属せしめられる。

ＤＳＭ　５１９５株は次の特徴（Ｒ９Ｈｉｉｔｔｅｒ、
　ｒｓｙｓｔｅｍａｔｉｋｄｅｒ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｔｅｎＪ＋　　Ｖｅｒｌａｇ　Ｋａｒｇｅｒ、　、
Ｂａ５ｌｅ　１９６７、による命名及び分類）を有する
。胞子はトゲを有する。気中菌子は最初淡青白色（ｐａ
ｌｅ　ｗｈｉｔｅ）であり、そして成熟した状態におい
て灰白色（ａｓｈ−ｇｒｅｙ　；ｃｉｎｅｒｅｏｕｓ）
となる。気中菌子は単軸型（ｍｏｎｏｐｏｄｉａｌｌｙ
）に分岐し、そして一般に４〜６回巻きの幾分規則的た
らせん（スピラタイプＢ）を有する側枝を有する。ペプ
トン／鉄／寒天上でこの株はメラニンを形成しない。こ
の株は単一炭素源として次の糖及びアルコール、すなわ
ちＤ−フラクトース、Ｄグルコース、ミオ−イノシトー
ル、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、及び特によくＤ
−キシロースを利用する。Ｌ−アラビノース、ラフィノ
ース又はサッカロース上で増殖が観察されない。

上記の意味における［由来する培養物Ｊ　（ｄｅｒｉｖ
ａｂｌｅｃｕｌｔｕｒｅ）は、本発明の実施のために必
須の寄託された培養物の特徴を有する任意の培養物、す
なわち主として由来する培養物、特にホルマオマイシン
の生成の原因となるＤＳＭ　５１９５株の構造遺伝子と
同じ構造遺伝子を含有する微生物培養物である。

由来する培養物はまた、ホルマオマイシンの生成の原因
となるＤＳＭ　５１９５株の構造遺伝子の、遺伝コード
の縮重の故に可能性ある均等物を含有する任意の微生物
培養物である。由来する培養物は特に、ホルマオマイシ
ンを生産することができるストレプトマイセス属の微生
物、好ましくはストレプトマイセス・グリセオフラプス
種の微生物を含む任意の培養物である。ＤＳＭ　５１９
５の「由来する培養物」はまた、ホルマオマイシンを生
産することができる該株のすべての変異株を包含する。

使用される栄養培地は溶液又は懸濁液、好ましくは水溶
液又は水性懸濁液であり、これらは少なくとも一種の炭
素源及び少なくとも一種の窒素源並びに好ましくはさら
に無機物を含有する。適当な炭素源の例として、グリセ
リン、資化性炭水化物、例えばシクリトール類、例えば
マンニトール、ポリサッカライド類、例えば澱粉、三糖
類、例えばラクトース及びサッカロース、並びに単糖類
、特にグルコース及びフラクトース、そしてさらに対応
する炭水化物含有工業原料、例えばシュガービート糖蜜
又はシュガーケーン糖蜜が挙げられる。

適当な窒素源は、アミノ酸、特に天然α−アミノ酸、ペ
プチド及び蛋白質並びにその分解生成物、例えばペプト
ン及びトリプトン、そしてさらにアンモニウム塩及び硝
酸塩、並びに対応する窒素含有工業原料、例えば肉エキ
ス、カゼイン加水分解物及び酵母自己消化物並びに酵母
エキスである。

さらに、工業用混合Ｃ及びＮ源、例えば、水抽出物の形
で使用される種々の植物種子、例えば豆類の、例えば大
豆の粉又はマツシュ、穀類、例えば小麦、そして特にト
ウモロコシ（コーンステイープリヤー）、さらに綿実及
びマルトエキスである。

アンモニウム塩、例えば特に塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム又は硝酸アンモニウム、及び他の硝酸塩に加
えて、栄養培地は無機塩として、アルカリ金属及びアル
カリ土類金属、例えば特にナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム及びカルシウムの、そしてさらに微量元素、例
えば鉄、亜鉛及びマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩及
び特にリン酸塩を含有することができる。

好ましくは、例１に記載する培地を用いる。

栄養培地は常法に従って殺菌され、そして生産株の培養
物が接種される。

培養は好気的に、すなわち静置表面培養で、あるいは好
ましくは振とうフラスコ中又は発酵槽中で空気又は酸素
と共に振とう又は撹拌しながら液中で行われる。適温は
約１５°Ｃ〜４０°Ｃ１特に約２０°Ｃ〜３０°Ｃであ
る。発酵期間は好ましくは１〜３日間である。本発明の
方法の好ましい形態においては、培養物をまず２７°Ｃ
にて８時間インキュベートし、そして次に温度を２０°
Ｃに下げる。この温度変化がホルマオマイシンの収量を
増加せしめる。これらの条件下で、寒天拡散試験及び高
圧液体クロマトグラフィーを用いて見られるように、ホ
ルマオマイシンの生成は４５時間後に最大に達する。培
養は好ましくは段階的に行われる。すなわち、まず液体
栄養培地中での１又は複数の前培養物が調製され、そし
てこの前培養物が次に実際の生産培地に、例えば１：２
０比率で接種される。

単離はそれ自体既知の分離法を用いる物理化学的方法に
より、特に遠心分離、濾過、溶剤抽出、沈澱、結晶化、
並びにクロマトグラフィー、特に吸着及び分配クロマト
グラフィーにより行われる。

ホルマオマイシンは９８％の比率で細胞中に見出される
。まず、適当な溶剤、例えばメタノールのごときアルコ
ールを用いて細胞から抽出される。

得られる粗生成物は、適当な溶剤、例えば酢酸エチルを
用いる抽出、並びに種々の溶剤中シリカゲル及び修飾デ
キストランゲル例えばセファデックスＬ）Ｉ−２０上で
の逐次的クロマトグラフィーにより精製される。

本発明は特にホルマオマイシンの製造方法に関し、この
方法は、ストレプトマイセス・グリセオフラプスＤＳＭ
　５１９５又はホルマオマイシンの生成の原因となる該
株の構造遺伝子と同じ構造遺伝子を含有する微生物を、
炭素源及び窒素源並びに無機塩類を含有する水性栄養培
地中で好気的に培養し、そしてホルマオマイシンを単離
する、ことを含んで成る。

本発明は特に、ストレプトマイセス・グリセオフラプス
種のホルマオマイシン生成微生物を培養することを含ん
で成る上記の方法の形態に関する。

上記の方法の好ましい形態はストレプトマイセス・グリ
セオフラプスＤＳＭ　５１９５株又は該株ホルマオマイ
シン生成変異株を培養することを含んで成る。

上記の方法の特に好ましい形態はストレプトマイセス・
グリセオフラプスＤＳＭ　５１９５を培養することを含
んで成る。

発酵は好ましくは実施例に記載する条件下で行われる。

ホルマオマイシンの生成の原因となる、ＤＳＭ　５１９
５株が含有するのと同じ構造遺伝子を含有する微生物は
、例えば遺伝子操作の手段により、それ自体既知の方法
で、対応する構造遺伝子をＤＳＭ　５１９５株から単離
しそしてこれらを適当な部位において適当な異る微生物
の遺伝物質に導入することにより、人工的に製造するこ
とができる。適当な微生物は、問題の構造遺伝子がそれ
に導入され得るのみならずその中で該構造遺伝子が発現
することができ、そしてそこで生成されたホルマオマイ
シンが分解されず、好ましくは発酵培地中に分泌される
ようなものである。この様な適当な微生物は特にストレ
プトマイセス属の他の株、特にストレプトマイセス・グ
リセオフラプス種の株であって、上記の構造遺伝子をま
だ有していないものである。

上記の構造遺伝子のヌクレオチド配列が解明された後、
これらを合成的に製造することもでき、この場合、遺伝
コードの縮重の結果として、３個連続するヌクレオチド
から成るあるヌクレオチド配列、いわゆるコドン、を同
じアミノ酸をコードする他のコドンにより置換えること
ができる。

ホルマオマイシン生成変異株は、例えば、紫外線もしく
はＸ−線又は化学変異剤、例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソ−グアニジンの作用のもとで生じさ
せ、そしてそれ自体既知の方法でそれらの特定の性質に
従って選択することにより単離することができる。

本発明はまた、検出可能な量でホルマオマイシンを含有
する発酵材料の製造方法に関し、この方法はストレプト
マイセス・グリセオフラプスＤＳＭ５１９５株又は該株
に由来する培養物を栄養培地中で培養し、そしてホルマ
オマイシンを単離しそして精製するために適当な時点で
この方法を中断することを含んで成る。

本発明はさらに、ホルマオマイシンの新規な開裂生成物
又は分解生成物、特に新規なアミノ酸、例えば２−アミ
ノ−３−（２−ニトロシクロプロピル）−プロピオンＬ
（Ｚ）−４−プロペニルプロリン及び２−アミノ−３−
フェニル酪酸、並びにさらに５−クロロ−Ｎ−ヒドロキ
シピロール−２−カルボン酸及びホルマオマイシン中に
前生成されるペプチド断片であって、上記の新規な酸の
少なくとも１つを含有するものである。

これらの開裂生成物はホルマオマイシンの化学合成のた
めに使用することができる。

本発明は特に、ホルマオマイシンのラクトン開裂及び場
合によってはこれに続く低級アルカノールによるエステ
ル化により得られる、次の式（■）：（式中、Ｒは水素
又は低級アルキルである）により表わされる化合物、及
びＲが水素である式（ＩＩＩ）の化合物の塩に関する。

式（１）の化合物の塩は好ましくは医薬として許容され
るそして非毒性の、例えばアルカリ金属又はアルカリ土
類金属の塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウ
ムもしくはカルシウム塩、又はアンモニアもしくは適当
な有機アミンとの塩であり、特に塩形成のために脂肪族
、脂環族、脂環−脂肪族もしくは芳香−脂肪族一級、二
級もしくは三級モノ−、ジーもしくは一ポリアミンの塩
、そしてさらに複素環塩基、例えば低級アルキルアミン
、例えばトリエチルアミン、ヒドロキシ−低級アルキル
アミン、例えば２−ヒドロキシエチルアミン、ビス−（
２−ヒドロキシエチルアミンミン、２−ヒドロキシエチ
ルジェニルアミン又はトリー（２−ヒドロキシエチル）
−アミン、カルボン酸の塩基性脂肪族エステル、例えば
４−アミノ安息香酸２−ジエチルアミノエチルエステル
、低級アルキレンアミン、例えば１−エチルピペリジン
、シクロアルキルアミン、例えばジシクロヘキシルアミ
ン、又はベンジルアミン、例えばＮ、Ｎ’ジベンジルエ
チレンジアミン、そしてさらにピリジンタイプの塩基、
例えばピリジン、コリジン又はキノリン、の塩である。

単離又は精製方法のため、医薬として適当でない塩を使
用することができる。しかしながら、医薬として許容さ
れる非毒性塩のみが療法的に使用されるから、これらが
好ましい。

本発明はまた、式（Ｉ［［）の化合物又はＲが水素であ
る式（ＩＩＩ）の化合物の塩の製造方法に関し、この方
法においては式（Ｉ）のホルマオマイシンをラクトース
開裂にかけ、こうしてＲが水素である式（ＩＩＩ）の化
合物又はその塩を得、そしてＲが低級アルキルである式
（ＩＩＩ）の化合物の製造のためにはＲが水素である式
（ＩＩ［）の化合物を場合によってはエステル化し、必
要により遊離ヒドロキシ基を容易に除去され得る保護基
により保護し、そしてすべての保護基を除去し、又は塩
の製造のためにＲが水素である式（ＩＩＯの化合物を塩
に転換し、又は生ずる塩を遊離酸に転換する。

ラクトン開裂はそれ自体既知の方法で行われる。

好ましくは、ホルマオマイシンを適当な溶剤中で適当な
塩基性剤により、特に、弱い塩基性剤、例えば強塩基と
弱酸との塩、例えば炭酸カリウム、シアン化アルカリ金
属又は亜硫酸水素ナトリウムにより処理する。所望によ
り、これらの塩基性剤は触媒量で使用することができる
。ラクトン開裂が適当なアルコール、例えばメタノール
又はエタノール中で行われる場合、Ｒが低級アルカノー
ルに対応する低級アルキル基である式（ＩＩ［）のエス
テルが得られる。

ラクトン開裂がこの様な低級アルカノール中で行われな
い場合、Ｒが水素である式（ＩＩＩ）の得られる化合物
をそれ自体既知の方法でエステル化することができる。

エステル化は例えば、Ｒが水素である式（ＩＩＩ）の化
合物の反応性カルボン酸誘導体を対応するアルコールと
反応せしめることにより行うことができる。あるいは、
Ｒが水素である式（ＩＩＩ）の化合物を、エステル化成
分として望まれるアルコールの反応性誘導体との反応に
よりエステル化することができる。

エステル化のためのエステル化剤は、例えば、対応する
ジアゾ−低級アルカン、例えばジアジンタン、ジアゾエ
タン又はジアゾ−ｎ−ブタンである。これらの試薬は、
適当な不活性溶剤、例えば脂肪族、脂環族もしくは芳香
族炭化水素、例えばヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼ
ンもしくはトルエン、ハロゲン化脂肪族炭化水素、例え
ば塩化メチレン、又はエーテル、例えばジ低級アルキル
エーテル、例えばジエチルエーテル、又は環状エーテル
、例えばテトラヒドロフランもしくはジオキサン、又は
溶剤混合物中で、そしてジアゾ試薬に依存して冷却しな
がら、室温にて又は穏和に加熱しながら、そしてさらに
、必要により密閉容器中及び／又は不活性ガス雰囲気下
、例えば窒素雰囲気下で使用される。

他の適当なエステル化剤は対応するアルコールのエステ
ル、特に強い無機又は有機酸、例えば鉱酸、例えばハロ
ゲン化水素酸、例えば塩酸、臭化水素酸もしくはヨウ化
水素酸、そして硫酸、又はハロ硫酸、例えばフルオロ硫
酸、あるいは強有機スルホン酸、例えば非置換の又は例
えばハロゲンにより例えば弗素により置換された低級ア
ルカンスルホン酸、又は芳香族スルホン酸、例えば非置
換の又はメチルのごとき低級アルキル、臭素のごときハ
ロゲン及び／又はニトロにより置換されたベンゼンスル
ホン酸、例えばメタンスルホン酸、トリフルオロメタン
スルホン酸又はＰ−１−ルエンスルホン酸、のエステル
である。この様なエステルは特に低級アルキルハライド
、ジー低級アルキルサルフェート、例えばジメチルサル
フェート、さらにフルオロスルホン酸低級アルキルエス
テル、例えばフルオロスルホン酸メチルエステル、又は
非置換のもしくはハロゲン置換されたメタンスルホン酸
低級アルキルエステル、例えばトリフルオロメタンスル
ホン酸メチルエステルである。これらは通常、不活性溶
剤、例えば非置換の又はハロゲン化例えば塩素化された
脂肪族、脂環族もしくは芳香族炭化水素、例えば塩化メ
チレン、エーテル、例えばジオキサンもしくはテトラヒ
ドロフラン、又はその混合物の存在化で使用される。適
当な縮合剤、例えばアルカリ金属炭酸塩又は炭酸水素塩
、例えばナトリウムもしくはカリウムの炭酸塩もしくは
炭酸水素塩（通常、サルフェートと共に）、又は有機塩
基、例えば、通常立体的に障害されたトリ低級アルキル
アミン、例えばＮ、Ｎジ−イソプロピル−Ｎ−エチルア
ミン（好ましくは、ハロスルホン酸低級アルキルエステ
ル又は非置換のもしくはハロー置換されたメタンスルホ
ン酸低級アルキルエステルが用いられ、操作は、冷却し
ながら、室温にて又は加熱しながら、例えば約−２０°
Ｃ〜約±５０°Ｃの温度にて、そして所望により密閉容
器及び／又は不活性ガス雰囲気、例えば窒素雰囲気中で
行われる。

他のエステル化剤は、対応するトリー置換されたオキシ
ム塩（いわゆるＭｅｅｒｖｅｉｎ塩）、又はジ置換され
たカルベニラムもしくはハロニウム塩（置換基はエーテ
ル化基である）、例えばトリ低級アルコキソニウム塩、
そしてさらにジー低級アルコキシカルベニラムもしくは
ジ−アルキルハロニウム塩、特に複雑な弗素含有酸との
塩、例えば対応するテトラフルオロボレート、ヘキサフ
ルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェ−ト、又
はヘキサクロロアンチモネートである。これらの試薬は
例えば、トリメチルオキソニウムもしくはトリエチルオ
キソニウムヘキサフルオロアンチモネート、ヘキサクロ
ロアンチモネート、ヘキサフルオロホスフェートもしく
はテトラフルオロボレート、ジメトキシカルベニラムへ
キサフルオロホスフェート又はジメチルブロモニウムヘ
キサフルオロアンチモネートである。これらの試薬は好
ましくは不活性溶剤、例えばエーテル又はハロゲン化炭
化水素、例えばジメチルエーテル、テトラヒドロフラン
又は塩化メチレン中で、あるいはこれらの混合物中で、
必要により塩基、例えば有機塩基、例えばトリー低級ア
ルキルアミン、好ましくは立体的に障害されたトリー低
級アルキルアミン、例えばＮ、Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ
−エチルアミンの存在下で、そして冷却しながら、室温
にて又は穏和に加熱しながら、例えば約−２０°Ｃ〜約
５０°Ｃにて、必要により密閉容器中でそして／又は不
活性ガス雰囲気、例えば窒素雰囲気中で、用いられる。

エステル化反応の好ましい形態は、Ｒが水素である式（
ｎＩ）の化合物のセシウム塩と、ヒドロキシル基が反応
性エステル化形例えばハライド形であるエステル化成分
として望ましいアルコールとの反応である。

ラクトンの形成を回避するため、操作は例えば同時に溶
剤として使用されるエステル化成分として望ましい低級
アルカノールを過剰に用いて行い、あるいは式（ＩＩＩ
）の化合物中に存在する遊離ヒドロキシル基をエステル
化の前に保護する。

ヒドロキシ保護基並びにその導入及び除去は例えば、ｒ
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎ
ｉｃ　ＣｈｏｍｉｓｔｒｙＪ。

Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、ニューヨーク、
１９７８　；ｒＭｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎ
ｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ」、　ＨｏｕｂｅｎＷｅｙ
ｌ、第４版、Ｖｏｌ　１５／Ｌ　Ｇｅｏｒｙ−Ｔｈｉｅ
ｍｅ　Ｖｅｒｌａｙ。

スツツツガルト１９７４　；及びＴｈｅｏｄｏｒａ　Ｗ
、Ｇｒｅｅｎｅ。

ｒＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇ
ａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓＪ。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ｏｆ　５ｏｎｓ、ニューヨーク
１９８１に記載されている。容易に除去することができ
ること、すなわち、不所望の二次反応を伴わないで、例
えば加溶媒分解、還元、光分解又は生理的条件下で除去
されるのが保護基の特徴である。

ヒドロキシ保護基は例えば、アシル基、例えば、非置換
のもしくは例えばハロゲンにより置換された低級アルカ
ノール、例えば２．２−ジクロロアセチル、又は炭酸半
エステルのアシル基、特にｔｅｒ　ｔ−ブトキシカルボ
ニル、非置換のもしくは置換されたベンジルオキシカル
ボニル、例えば４ニトロベンジルオキシカルボニル、又
はジフェニルメトキシカルボニル、又は２−ハロー低級
アルコキシカルボニル、例えば２，２．２−）リクロロ
エトキシカルポニル、さらにトリチルもしくはホルミル
、又は有機シリルもしくはスタンニル基、そしてさらに
容易に除去できるエーテル化基、例えばｔｅｒ　を−低
級アルキル、例えばｔｅｒ　ｔ−ブチル、２−オキソ−
もしくは２−チア−脂肪族又は２オキサ−もしくは２−
チア−シクロ芳香族基、特に１−低級アルコキシー低級
アルキルもしくは１個級アルキルチオー低級アルキル、
例えばメトキシメチル、１−メトキシエチル、１−エト
キシエチル、メチルチオメチル、■−メチルチオエチル
もしくは１−エチルチオエチル、又は５個もしくは６個
の環原子を有する２−オキサ−もしくは３−チア−シク
ロアルキル、例えばテトラヒドロフリルもしくは２−テ
トラヒドロピラニル又は対応するチア類似体、そしてさ
らに非置換のもしくは置換された１−フェニル−低級ア
ルキル、例えば非置換のもしくは置換されたベンジルも
しくはジフェニルメチルであり、このフェニル基のため
の適当な置換基は例えばハロゲン、例えば塩素、低級ア
ルコキシ、例えばメトキシ、及び／又はニトロである。

上記の有機シリル基又はスタンニル基は、珪素原子又は
錫原子の置換基として低級アルキル、特にメチルを含有
する。対応するシリル又はスタンニル基は特にトリー低
級アルキルシリル、特にトリメチルシリル、さらにジメ
チル−ｔｅｒ　ｔ−ブチル−シリル、又は対応して置換
されたスタンニル、例えばトリーｎ−ブチルスタンニル
である。

ヒドロキシ保護基の除去はそれ自体既知の方法で、例え
ば加溶媒分解、特に加水分解、アルコール分解又は酸分
解により、あるいは還元、特に水素化又は化学還元によ
り、場合によっては段階的に又は同時に行われる。トリ
ー低級アルキルシリルはまた、弗素イオンをもたらす弗
化水素酸の塩、例えば弗化アルカリ金属、例えば弗化ナ
トリウム又は弗化カリウムにより巨環ポリエーテル（ク
ラウンエーテル）の存在下で処理することにより、ある
いは有機四級塩基の弗化物、例えばテトラ−低級アルキ
ルアンモニウムフルオリド又はトリー低級アルキルーア
リールアンモニウムフルオリド、例えばテトラエチルア
ンモニウムフロリド又はテトラブチルアンモニウムフロ
リドにより非プロトン性極性溶剤、例えばジメチルスル
ホキシド又はＮ、Ｎ−ジメチルアセタミドの存在下で処
理することにより除去することができる。

Ｒが水素である式（酸）の化合物の塩は、それ自体既知
の方法で、例えば適当な塩基との反応により、例えば適
当な金属化合物、例えば適当な有機カルボン酸のアルカ
リ金属塩、例えばα−エチルカプロン酸のナトリウム塩
、あるいは適当な無機アルカリ金属塩又はアルカリ土類
金属塩、特に弱いそして好ましくは揮発性酸に由来する
もの、例えば炭酸水素ナトリウム、あるいはアンモニア
又は適当な有機アミンにより処理することにより製造す
ることができ、好ましくは化学量論的量又はわずかに過
剰量の塩形成剤を用いる。

塩は常法により、例えば適当な酸で処理することにより
遊離化合物に転換することができる。

特にことわらない限り、保護基を除去する方法及び追加
の工程段階を含桧ての上記の方法は、それ自体既知の方
法で、例えば溶剤又は稀釈剤の存在下で、必要により縮
合剤又は触媒の存在下で、低下した温度又は上昇した温
度において、例えば約−２０°Ｃ〜約＋１００°Ｃ１特
に約＋１°Ｃ〜約＋７０°Ｃの温度範囲において、主と
して室温（約＋２０°Ｃ）〜４５°Ｃにおいて、常圧又
は加圧下で、適当な容器中で、そして必要により不活性
ガス雰囲気、例えば窒素雰囲気中で行われる。

分子中に存在するすべての置換基を考慮して、必要であ
れば、例えば容易に加水分解される基が存在する場合に
は特に穏和な反応条件を使用すべきであり、例えば短い
反応時間、低温度での中程度の酸性剤又は塩基性剤、化
学量論的量比、並びに適当な触媒、溶剤、温度及び／又
は圧力条件を用いるべきである。

本発明はまた、方法の任意の段階で中間体として得られ
る化合物を出発物質として使用して残りの段階を実施す
る態様、方法を任意の段階で中断する態様、又は出発物
質を反応条件下で生成せしめ、もしくは反応性誘導体も
しくは塩の形で使用する態様を包含する。遊離酸とその
塩との密接な関連性の観点から、状況において可能であ
り又は適当である限り、遊離酸への言及は対応する酸を
も包含することができ、そしてこの逆の場合もある。こ
の方法に従えば、特に価値があるものとして前に記載し
た化合物をもたらす出発物質を使用するのが好ましい。

本発明はまた、新規な出発物質及び／又は中間体並びに
それらの製造方法に関する。好ましくは、使用される出
発物質及び採用される反応条件は、この明細書において
特に好ましいものとして記載される化合物が得られるよ
うに選択される。

ホルマオマイシンについて前記した生物学的及び薬理学
的活性に加えて、ホルマオマイシン及び式（ＩＩ［）の
化合物並びにそれらの医薬として許容される塩は、例え
ば次の実験かられかるように、抗−増殖性、免疫抑制性
及び炎症抑制性を示す。

抗−増殖性を証明するため、ヒ１−Ｔ２４膀胱癌細胞の
増殖に対する式（Ｉ）の化合物の阻害作用を決定する。

これらの細胞を、５％（Ｖ／Ｖ）のウシ胎児血清を加え
た［イーグルの最少必須培地」（Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｉ
ｎｉｍｏｌ　ｅｓｒｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）中で
、３７℃及び空気中５容量％Ｃｏｇの加湿インキュヘー
ター中でインキュベートする。癌細胞（１０００〜１５
００＞を９６−ウェルミクロタイタープレートに接種し
、そして上記の条件下で一夜インキユヘートする。

１日日に逐次稀釈した被験物質を加える。プレートを上
記の条件下で５日間インキュベートする。

この間、対照培養物は少なくとも４回細胞分裂する。イ
ンキュベーションの後、細胞を３．３％（Ｗ／Ｖ）グル
タルアルデヒド水溶液中で固定し、水で洗浄し、そして
０．０５％（Ｗ／Ｖ）メチレンブルー水溶液で染色する
。洗浄後、色素を３％（ｗ／Ｖ）塩酸水溶液で溶出する
。細胞数に直接比例するウェル当りの光学濃度を６６５
ｎｍで光度計（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　ｍｕｌｔｉｓｋａｎ
）により測定する。次の式：を用いてコンピューターシ
ステムによりＩＣ５ｏ値を計算する。ＩＣ５゜値は、イ
ンキュベーション期間の終点におけるウェル当りの細胞
数が対照培養物中の細胞の数の５０％であるような活性
成分濃度として定義される。式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）の
化合物についての得られるＩＣ５ｏ値はおよそ０．５〜
５μｍｏｌ／２、例えば１μｍｏｌ／ｌである。

従って、式（Ｉ）及び（［１）の化合物はまた、例えば
膀胱の腫瘍の治療のためにも適当である。

免疫抑制性は例えば次の試験から推定することができる
。

ＣＤ３モノクローナル　　によ　珠　されたヒエ０ユニ
ツト／　ｍｌのヘパリンをヒトの静脈血に加え、次にこ
の血液をＲＰＭｒ　１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）により
１　：　６　（ｖ／ｖ）の比率で稀釈する。５０ｎｇ／
ｍＨの抗−ＣＤ３モノクロ一ナル抗体（ＴＲ６６、Ｉｇ
Ｇ］Ｋ）の添加の後、稀釈された血液をウェル当り１５
０μｌずつ９６−ウェルタイタープレートに導入する。

次に、上記のＲＰＭＩ培地中の式（Ｉ）又は（１）の化
合物をウェル当り５０ｔｌｌずつ加える。対照化合物と
してサイクロスポリンＡ　（Ｃ５Ａ、　５ａｎｄｏｚ、
バーゼル、スイス）又はプレドニソロン（ｐｒｅｄｎｉ
ｓｏｌｏｎｅ）を用いる。

３７°Ｃ及び空気中７容量％ＣＯ７にて４８時間の後、
ウェル当り１０μｌのＲＰＭＩ培地中１．０μＣｉの３
Ｈ−チミジン（アメルシャム：比活性５Ｃ４／ｍｍｏｆ
）　ヲ加える。

さらに１６時間の後、９６−ウェル収得器（ＬＫＢ）を
用いてガラス繊維フィルター（ＬＫＢ、　Ｂｒｏｍｍａ
、スエーデン）上に細胞を集める。フィルターが乾燥し
た後、これらの放射能を測定する〔オプティシント（Ｏ
ｐｔｉｓｃｉｎｔ）　（ＬＫＢ）、ベータープレート−
シンチレーション−カウンター（ＬＫＢ）　）。結果は
、被験物質の存在下及び非存在下で異る３種類の濃度で
各ウェルについて決定されたｃｐｍ　（分当りカウント
）の平均値として表わし、そして物質の作用は、次の式
： （式中、 実験のｃｐｍはＴ−細胞＋抗−ＣＤ３モノクローナル抗
体士被験物質のｃｐｍであり、 対照のｃｐ＋ｒｌはＴ−細胞＋抗−ＣＤ３−Ｅツクロー
ナル抗体のｃｐｍである） として定義される阻害％として与えられる。阻害曲線を
描きそしてＩＣ５ｏ値μｍｏｆｆ／ｆｆｉとして得る。

上記の試験において、１．５〜１５、例えば７．５μｍ
ｏｊ２／Ｉ！、のＩＣ１゜値がホルマオマイシン及び式
（ＩＩＩ）の化合物について決定され、そして０．３μ
ｍｏｉ！、／ｌ。

のＩＣ５゜がサイクロスポリンＡについて決定される。

インターロイキン−２によ　球　されるヒト血この試験
は前記と同様にして行われるが、５０ｎｇ／戚の抗−Ｃ
Ｄ３抗体の代りに１００ユニツト／　ｌｌｄｌＯ組換イ
ンターロイキン−２（ホフマンーラ・ロシュ、バーゼル
、スイス）を用いる。この試験において、４〜４０μｍ
ｏｊ２　／　ｊ２、例えば１７μｍｏｒ！、／／２のＩ
Ｃ５ｏ値がホルマオマイシン及び式（Ｉ［）の化合物に
ついて決定される。

従って式（Ｉ）及び（Ｉ［［）の化合物はまた、例えば
移植又はアレルギーにおいて、不所望の免疫反応を抑制
するための免疫抑制剤として使用することができる。

免疫阻害性は、例えば、ホスホリパーゼＡ２　（ヒト白
血球から得られる）の活性の阻害によりインビトロで証
明することができる。

好中多形核ヒト白血球を多段分画沈降により［バフイー
・コートＪ　（ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔｓ）から得、そし
て深冷凍結する。ホスホリパーゼＡ２を細胞懸濁液から
、水冷２ＮＮａＣＩ！、中０．３６Ｎ　Ｈ２ＳＯ４の添
加してホモジネートし、そして１０，０００ｇでの遠心
分離の後に得られた上清を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４，５）に対して透析することにより得る。

酵素活性を決定するため、酵素（蛋白質１０〜３０ｎ）
を３７°Ｃにて１時間０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ　／ＩＩＣ
＃、緩衝液（ｐＨ７）中で、＋４０−オレイン酸により
放射能ラベルされた大腸菌のリン脂質から成る基質、及
び１ｍｍｏＩ！、のＣａＣ１２を添加してインキュベー
トする。ドール（Ｄｏｌｅ）試薬（イソプロパツール／
ヘプタン／　Ｉ　Ｎ　ＨｚＳＯ４４０：　１０　（ｖ／
　ｖ）の添加により反応を停止し、そしてホスホリパー
ゼＡ２により選択的に遊離した＋４Ｃ−オレイン酸を抽
出する。

この抽出物をシリカゲルのカラムに通すことにより、−
緒に抽出された基質を完全に除去する。溶出物中のＩ４
０−オレイン酸の測定は放射能測定により行う。

ホスホリパーゼＡ２に対する式（Ｔ）及び（ＩＩＩ）の
化合物阻害作用を測定するため、この化合物をインキュ
ベーション浴中に、水溶液、ジメチルスルホキシド（浴
中の最終濃度５容量％以下）溶液又はエタノール（浴中
の最終濃度２５容量％以下）溶液の形で加える。被験化
合物の作用の強さをＩＣ５ｏ、すなわち対照活性の５０
％を阻害する濃度、として表わす。ＩＣ５ｏは、横座標
上の濃度（μｍｏｊ２）の対数に対して阻害（％）を縦
座標にプロットすることによりグラフにより決定する。

このモデルにおいて、式（１）及び（ＩＩＩ）の化合物
について、２〜１８　ＩＩ　ｍｏ　ｌ　／　Ｉ！、、例
えば７μｍｏｊ２／！のＩＣ６゜値が得られる。

本発明はまた、ホルマオマイシン、次の式（Ｉ［［）で
表わされる化合物又は次の式（Ｉ［［）で表わされる化
合物の医薬として許容される塩； ハ と１ （式中、Ｒは水素である）の、特に療法的有効量を投与
することによる、ヒトを含めての温血動物における疾患
の治療のための使用に関する。約７０ｋｇの体重の温血
動物、例えばこの様な体重のヒトに投与する場合、投与
量は特に治療されるべき疾患に依存し、そして１日当り
０．１〜５ｇ、例えば０．５〜５ｇ、好ましくは０．２
〜２ｇである。投与は好ましくは医薬製剤の形で、非経
腸的に、例えば静脈内に、筋肉内に、又は腹腔内に、１
日数回に分けて行われる。

本発明はまた、ホルマオマイシン、特に、有効量の、す
なわち例えば抗生物質効果もしくは腫瘍抑制効果又は不
所望の免疫反応を抑制する効果を有する量のホルマオマ
イシン、式（ＩＩＩ）の化合物又はＲが水素である式（
Ｉ）の化合物の医薬として許容される塩を、医薬キャリ
ヤー物質、好ましくは１０％以上のキャリヤー物質と共
に含んで成る医薬製剤に関する。

本発明の薬理学的に活性な化合物は非経腸的に投与可能
な調製物の形で又は注入溶液の形で使用することができ
る。これらの液は好ましくは等張水溶液又は水性懸濁液
であり、例えば、活性成分を単独で又はマンニトールの
ごときキャリヤー物質と一緒に含有する凍結乾燥調製物
の場合、使用前に液を調製することができる。医薬製剤
は無菌化することができ、そして／又は助剤、例えば防
腐剤、安定剤、湿潤剤及び／又は乳化剤、溶解剤、浸透
圧調整塩及び／又は緩衝剤を含有することができる。

所望により他の薬理学的活性成分、例えば抗生物質を含
有することができる本発明の医薬製剤は、それ自体既知
の方法で、例えば常用の溶解又は凍結乾燥法により製造
することができ、そして約０．１〜９０％、特に約１〜
約３０％の活性成分を含有する。

次に、実施例により本発明を説明するが、これにより本
発明の範囲を限定するものではない。特にことわらない
限り、Ｒｆ値はシリカゲル薄層プレート（Ｓｉｌ　Ｇ／
ＵＶ２ｓａ）上で測定した。溶離剤混合物中の溶離剤相
互の比率は容量部（Ｖ／Ｖ）で示され、そして温度は°
Ｃで示される。旋光度の場合の溶剤又は溶剤混合物中の
物質の濃度（ｃ）は重量／容量％で示される。

核共鳴スペクトル〔テトラメチルシランに対する化光シ
フトδ（ｐｐｍ）　〕を示すため次の略号及び組合わせ
を用いる。

ｂ＝ニブロードｂｒｏａｄ） ｄ−ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ） Ｈｚ−ヘルツ Ｊ＝カップリングコンスタント ｍ−マルチイブレット（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ）ｑ−クア
ルテット（ｑｕａｒｔｅｔ） Ｓ−シングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ） １−）リプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）。

実ｍ １０！の発酵槽に９１の栄養溶液（２０ｇの合胞大豆粉
、２０ｇの肉粉末、１０ｇのマンニトール、０．２ｇの
ＮａＣｎ　、　０．’　５　ｇのＺｎＳＯ４・７ＨｚＯ
，１１の水道水、ｐ）１７．０）を仕込み、殺菌し、ス
トレプトマイセス、グリセオフラプスＤＳＭ　５１９５
株の前培養物（同じ栄養溶液、３２時間、２７”Ｃ）ｉ
Ｉ！、を接種し、そして、温度２７°Ｃ（８時間後に２
０°Ｃに下げる）、撹拌速度３００回／分、及び通気０
．５　ｖｖｍ（ｖｖｍ−空気体積／栄養培地体積／分）
の条件下で運転する。

培養液の遠心分離により得られる菌糸をメタノールによ
り２回抽出する。抽出物を濃縮して水相を得、そして酢
酸エチルと共に２回振とうすることにより抽出する。溶
剤の蒸発の後、有機相が褐色の生成物をもたらす。これ
をシリカゲルのカラム（溶離剤としてＣＨＣｆｉ　３を
使用する）上で分離する。次に、活性成分をセファデッ
クスＬＨ−２０カラム（修飾デキストランゲル）上でメ
タノールにより精製する。高圧液体クロマトグラフィー
（肝ＬＣ）（ＲＰ−ｈｙｐｅｒｓｉｌ−５ｔａｎ、　　
ＨｚＯ／ＣＨ３ＣＮ（０，１％ｌｌ３ＰＯ４）グラジェ
ント：３０％ＣＨ，ＣＮ→１００％ＣＨ，ＣＮ　ｉ検出
２５４ｎｍ　；保持時間６．７分（７７％（Ｈ３ＣＮ）
　）によりホルマオマイシンの濃縮を行う。最終精製の
ため、１４０　ｍｇのこの物質をシリカゲル（＜０．０
８ｍｍ孔直径；カラム２．５　Ｘ　５０ｃｍ　）上でｎ
−ヘキサン／アセトン（２：１）を用いてクロマトグラ
フ処理して、モリブダトリン酸により発色する（ＴＬＣ
）無色の不純物１８ｍｇを得る。ＣＨＣｆｆｉ　３／Ｍ
ｅＯＨ（９５：　５　）によりホルマオマイシンを溶出
する。この物質を溶解し、濃クロロホルム溶液を５００
蔵のｎ−ヘキサンに滴加することにより再結晶化する。

ホルマオマイシンを無色非晶質粉末として得る。融点１
６０°Ｃ〜１６８’Ｃｉ　Ｒｆ　＝０．３９（ＣＨＣｆ
３　　：メタノールー１００：４）；Ｒｆ　＝０．２８
　（ｎ−ヘキサン：アセトン−１：　１）；〔α〕６°
−＋２０．８°　（ｃｍｏ、５；メタノール）；ＵＶ　
（メタノール）　　：　２７８（９１５０）、　２０６
（４２９５０）ｎｍ　；ＩＲ（ＫＢｒ）　　：　３３９
０．３１００−２８００．１７４Ｌ　１６４５−１６２
０（ｂｒｏａｄ）、　１６１２＋　１５４５．１４５０
＋　１３６５　ｃｍ−’　；ファスト・アトム・ボンバ
ードメント・マス・スペクトル（Ｆａｓｔ　ａｔｏｍ　
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ
）（マトリクスとしてグリセリン）　　：　１１２９．
４（［Ｍ＋Ｈド）。

９３８、８３０．７００．５１６．４０１．３７３．３
００．２６４．２１８　；’Ｈ−ＮＭＲ及び”　Ｃ−Ｎ
ＭＲは第１表を参照のこと；Ｃ５５Ｈ６９Ｎ１００１４
ＣＩ（１１２９，６８）　　：計算値Ｃ５８，４Ｂ、　
Ｉ＋　６．１６．　Ｎ　１２．４０．０１９．８２゜Ｃ
Ｉ　　３．１４ 測定値ｃ　５ｓ、３ｓ、　Ｈ６，３Ｌ　Ｎ　１ｉ、６６
、０１９．３０ＣＩ　　２．９４゜ ホルマオマイシンは中性であり、メタノール、クロロホ
ルム、アセトン及び酢酸エチルに易溶であり、そして水
及びヘキサンに不溶である。薄層クロマトグラフィープ
レート上で、このものは口Ｖ光（２５４ｎｍ）を吸収し
、空気中に放置した場合に徐々に黄色に変化することが
でき、そしてバロリール（Ｂａｒｒｏｌ　ｌ１ｅｒ）に
従って染色され（青−緑）、ソしてエールリッヒ試薬に
より染色され（淡紫色）るが、しかしニンヒドリンによ
り染色されない。

「　口　よ　自 実】ｌ引入 ７ｍｇのホルマオマイシンを２　ｍｌのメタノールに溶
解する。触媒量の固体に２ＣＯ，の添加の後、溶液を室
温にて１４時間撹拌し、次に２０ｍ１の氷水に江別しそ
してＣＨｚＣｊ２２（４Ｘ　６　ｍ）により抽出する。

緒にした有機相の蒸発残渣をシリカゲル上でクロマトグ
ラフ処理する（カラム１．ＯＸ３．Ｏｃｍ。

ＣＨＣｊ２．、：メタノールー９：１）。主ゾーンから
、式（ｎ）の開鎖ホルマオマイシンメチルエステルを得
る。融点１７２°Ｃ；　Ｒｆ　＝０．０５（ＣＨＣ１！
、＋　　：メタノールー１００　：　４　）　　；　Ｒ
ｆ　＝０．４６（ＣＨ１３：メタノールー９：１；染色
挙動はホルマオマイシンと同じである。）；ＵＶ（メタ
／　−ル）　　：２７８（１１２００）。

２１４（３１３００）ｎｍ　；　ＩＲ（ＫＢｒ）　　：
　３４００．３３００．３１００−２８５０゜１７５０
、１６３５（ｂｒｏａｄ）、　１５４５．１４５０．１
３７０．１０３０ＣＴ１１−’；ファスト・アトム・ボ
ンバードメント・マス・スペクトル（マトリクスとして
２−ニトロベンジルアルコール）　　：１１８３／１１
８５（［Ｍ＋Ｎａｌ”″）、　１１６１／１１６３（［
Ｍ＋Ｈ］　”″）、　９９２．７１８．４１９　；　１
１５９／１１６Ｈ［Ｍ−１（ヒ）；’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ
ＣｆｆｉｚＩ２００ＭＨｚ）　：　３．７４（ｓ、　３
Ｈ，０ＣＨａ）、他のシグナルパターンはホルマオマイ
シンに類似しているが、しかしシグナルは幾つかのケー
スにおいて広く、そして−層強くオーバーラツプし、そ
してテトラメチルシランの後のシグナルは存在しない。

尖巖拠人　　人　注射　　Ｉ ２５０■のホルマオマイシンをプロピレングリコール３
００に溶解する。溶液を無菌濾過しそして無菌条件下で
３威のアンプルに導入する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトマイセス・グリセオフラブス（￥Ｓｔｒ
   ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥　￥ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ￥
   ）ＤＳＭ　５１９５株を用いる発酵により得られ、そし
   てアースロバクター・クリスタロポイエテス（￥Ａｒｔ
   ｈｒｏｂａｃｔｅｒ￥　￥ｃｒｖｓｔａｌｌｏｐｏｉｅ
   ｔｅｓ￥）ＡＴＣＣ　１５４８１株及びアースロバクタ
   ー・オキシダンス（￥Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ￥　￥
   ｏｘｙｄａｎｓ￥）ＡＴＣＣ　１４３５８株に対して０
   ．０１μｇ／ｍｌ未満の最小阻止濃度を示す物質ホルマ
   オマイシン（ｈｏｒｍａｏｍｙｃｉｎ）。 ２、次の式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で表わされる物質ホルマオマイシン。 ３、測定の正確さの範囲内で次の物理的性質：ａ）融点
   １６６〜１６８℃、ｂ）旋光度〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝＋
   ２０．８°（ｃ＝０．５；メタノール）、ｃ）分子量１
   １２９±２、ｄ）溶剤としてのＣＤＣｌ＿３中で＾１Ｈ
   −ＮＭＲシグナルが内部標準としてのテトラメチルシラ
   ンに対して＋０．５〜−０．７ｐｐｍの化学シフトδを
   有する：の少なくとも１つを有する請求項１又は２に記
   載の物質。 ４、測定の正確さの範囲内で前記ａ）〜ｄ）のすべての
   物理的性質を有する請求項３に記載の物質。 ５、測定の正確さの範囲内で、溶剤としてのＣＤＣｌ＿
   ３中で内部標準としてのテトラメチルシランに対してそ
   れぞれ０．４８、０．２９、−０．１５及び−０．６３
   ｐｐｍの１プロトンについての化学シフトを有する＾１
   Ｈ−ＮＭＲシグナルを有する、請求項３又は４に記載の
   方法。 ６、アミノ酸２−アミノ−３−（２−ニトロシクロプロ
   ピル）−プロピオン酸の２個の基を有し、これらの２個
   の基が不斉中心におけるコンフィグレーションに関して
   相互に異ることができる、請求項１及び３〜５のいずれ
   か１項に記載の物質。 ７、請求項１〜６のいずれか１項に記載の物質ホルマオ
   マイシンからラクトン開裂及び場合によってはこれに続
   く低級アルカノールによるエステル化により得られる、
   次の式（III）： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中、Ｒは水素又は低級アルキル基である）で表わさ
   れる物質、又はＲが水素である式（III）の化合物の塩
   。 ８、請求項７に記載のホルマオマイシンメチルエステル
   。 ９、請求項１〜８のいずれか１項に記載の物質又は次の
   式（III）： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中Ｒは水素である） で表わされる化合物の医薬として許容される塩を、腫瘍
   抑制量又は不所望な免疫反応を抑制する量で、１０％以
   上の医薬として許容されるキャリヤー物質と共に含んで
   成る、腫瘍抑制効果又は不所望の免疫反応を抑制する効
   果を有する、温血動物に投与するための医薬製剤。 １０、請求項１〜６のいずれか１項に記載のホルマオマ
   イシンの製造方法であって、ストレプトマイセス（￥Ｓ
   ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥）属に属し該ホルマオマイシ
   ンを生産することができる微生物を適当な栄養培地中で
   培養し、そして培養物からホルマオマイシンを採取する
   ことを特徴とする方法。 １１、ストレプトマイセス・グリセオフラブス（￥Ｓｔ
   ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥　￥ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ
   ￥）ＤＳＭ　５１９５株又は該株のホルマオマイシンの
   生成の原因となる構造遺伝子と同じ構造遺伝子を含有す
   る微生物を炭素源及び窒素源並びに無機塩類を含有する
   水性栄養培地中で好気的に培養し、そしてホルマオマイ
   シンを単離することを特徴とする請求項１０に記載の方
   法。 １２、ストレプトマイセス・グリセオフラブス（￥Ｓｔ
   ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥　￥ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ
   ￥）種のホルマオマイシン生産微生物を培養することを
   特徴とする、請求項１０に記載の方法。 １３、ストレプトマイセス・グリセオフラブス（￥Ｓｔ
   ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥　￥ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ
   ￥）ＤＳＭ　５１９５株又は該株のホルマオマイシン生
   産変異株を培養することを特徴とする、請求項１０に記
   載の方法。 １４、ストレプトマイセス・グリセオフラブス（￥Ｓｔ
   ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥　￥ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ
   ￥）ＤＳＭ　５１９５株を培養することを特徴とする、
   請求項１０に記載の方法。 １５、ストレプトマイセス・グリセオフラブス（￥Ｓｔ
   ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥　￥ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ
   ￥）ＤＳＭ　５１９５株及びホルマオマイシンを生産す
   ることができる、該株に由来する培養物。 １６、次の式（III）： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中、Ｒは水素又は低級アルキル基である）により表
   わされる化合物又はＲが水素である式（III）の化合物
   の塩の製造方法であって、次の式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で表わされるホルマオマイシンをラクトン開裂に付し、
   こうしてＲが水素である式（III）の化合物又はその塩
   を得、そしてＲが低級アルキルである式（III）の化合
   物の製造のために、場合によっては、必要により遊離ヒ
   ドロキシル基を容易に除去し得る保護基により保護した
   後にＲが水素である式（III）の化合物をエステル化し
   、そしてすべての保護基を除去し、あるいは塩を製造す
   るために、Ｒが水素である式（III）の化合物を塩に転
   換し、あるいは得られた塩を遊離酸に転換する、ことを
   特徴とする方法。