PT93255A - Processo para a preparacao de uma lactona peptidica e de seus derivados - Google Patents

Description

0 invento diz respeito a um produto de fermentação obtido a partir do Stregtomycss qrisaoflavus que tem a estrutura de uma lactona. peptídica, a um processo para. a sua preparação, a derivados que se podem obter da lactona peptídica por clivagem da lactona e, facultativamente, à subsequente estsrificaçlo com um aleanol inferior, ao uso da lactona peptídica e dos referidos derivados como medicamentos e para a estimulação da formação do micélia aéreo e da produção de antibiótico nos Straptomycetssa preparações farmacêuticas contendo a lactona peptidica ou um dos referiidos derivados, a novos produtos de decomposição (clivagem) a à nova estirpe produtora*

As bactérias do género Streotomyces são caracterizadas por um ciclo de desenvolvimento complexo em que se forma um micélia aéreo a partir de um substrato de micélio sobre um substrato de nutriente sólido» Num processo de esporaçSo, as hifas terminais? aéreas, do micálio podem então fragmentar-se em cadeias de esporos» Os dados experimentais permitem supor que a difsrenciaçSo das células em micèlios aéreos e esporos se verifica durante o metabolismo secundário,, isto é, simultaneamente com a síntese dos antibióticos» pigmentos* substâncias de armazena-mento e geosmi n as =

Até agora* pouco se sabia sobre ã regulação do metabolismo secundário e da diferenciação nos Streptomvcetes» mas os dois pprocessos parecem ser controlados por dois grupos de substâncias sinal que servem de mediadors quer na célula, quer sn t rs a s célula s»

Recentemente, ficou demonstrado no caso dos Streptomvcetes que tanto o desenvolvimento dos micèlios aéreos, como a síntese dos antibióticos, são rigorosamente controlados» * f * f

i 0 controlo rigoroso é iniciado por dois; ef setores intraceiularess o tstraf os-fato de guanosina s o psntafosfato de guanosina*

Para além dos dois efectorss que estio geralmente disseminados nas bactérias, encontraram-se moléculas ds sinal, intracelulares, especificas da estirpe,· Nos Actynomycetes elas induzem a formação ds micélios aérsos s/ou antibióticos tais como, por exemplo, o factor A <2~isooctanail-”3íR}-hidroxiffietil--T--butirolactona) e o factor B í3'~<i-hutiIfosforil}-adenosina)„

Na procura de novas substâncias sinal intracelulares descobriu—se agora, com o auxilio do teste de difuslo de agar, uma estirpe que produz uma substância com a actividade desejada* A substância, numa baixa concentração, estimula a formação de micélios aéreos e antibióticos na estirpe produtora e em várias outras estirpes de StreptomycetesB sendo por isso designada por “hormaomicina” íhormao = !ipôr em movimento” em grego) » 0 presente invento refere-se à substância hormaomicina que se pode obter por fermentação com a estirpe Strepto.mvces qrisepflavus DSri__5195 e que revela, relativamente às- estirpes ftCt-hrgbac.ter.....crystal lopoietes ATCC 15481 e ftrthrpbacter oxydans ATCC 14358π uma concentração de inibição mínima inferior a pg/ml e mesmo inferior a Θ,Θνϊ mg/mi«

Ds acordo com as recentes descobertas-, a hormaomicina tem provavelmente a seguinte estrutura de fórmula (Σ) f

ho-n; i

V ii O invento refere-se especialmente á hormaomicina com as caractsristicas indicadas na secçSo dos Exemplos* na medida em que estas caractsristicas podem ser consideradas como certas5 sendo uma seiseção das mesmas suficiente para uma clara caracte- ricaçSo, isto é, por exemplo, à hormaomicina tendo, dentro da precisão de medida possível, pelo manos uma ou, de preferencia* todas as seguintes caracfcerísticas físicas§ ponto de fusão 166-168 °C, rotação ópiica íal*'Λ"'η = + 2@;!8°C (c = Θ,Ορ metanol), c) peso molecular 1129 ±2, d) em CDC1 como solvente os sinais 1 ’ ~ HRflN tão um desvio quimico è‘ relativaments ao tetrametilsilano considerado como padrão interno de * ©;s5 a -Θ,7 ppm, especialmente sinais para um protão cada um, a ©,48, ©,29, -©,15 e -©,63 PP®- á também espacialmente caractsristicD da hormaomicina que ela tenha dois radicais de aminaécido, ácido 2-amino-3-(2-ni·-· trociclopropil)-propi6nico, que é também referido a seguir como

3-<2~nitrQciciopropilJ-alanina (abreviado para NCP-alanina), podendo estes dois radicais diferir um do outro, no que respeita à configuração* nos centros assimétricos* O testo que se segue s a secção dos exemplos descrevem as descobertas a partir das quais se pode deduzir a estrutura de fórmula <I> s A hormaomicina optioamente activa revela máximos Uv a 278 e a 2®6 n.m (metanol) que variam apenas ligeiramente com as alterações do pH* No espectro Iv5 podem observar—se faixas para CO-lactona (1741 cm 1 > e CO-amida (a cerca de 164Θ e 1545 cm * A massa molar de 1128,4 é inferida a partir do espectro de massa FAB (íast atomic faombardment = bombardeamento atómico rápido)* De acordo com a análise elementai, a hormaomicina contém um átomo de cloro para além de C, H, Me 0 correspondendo à fórmula empírica CS_2_HAÍ?N1 JD1 XI *

0 espectro "H-RMM em CDC1-* revela seis grupos n!H qus se podem distinguir claramente s que* de certo modo* se vão permutando lentamente aos ii,i ppm* Podem identificar—se dez H aromáticos estrsitamente adjacentes e um sistema AB (ó,75/à,.@8 ppm, J - 4,5)„ Na gama dos 2 a 5,5 ppm há numerosos sinais 1H bem separados uns dos outros* Ocorre um grupo de sinais entre 1-2 ppm, sendo possível identificar cinco dupletos e um tripleto para os grupos metilo* São notáveis e típicos da hormaomicina dois multipletos a Ô,48 e @,29 ppm e outros dois paira além do tetrametilsilano (IMS) a -0,15 e -@,63 ppm*

No espectro á possível identificar um total de 55 átomos de carbono do seguinte tipos 6 CFu, 7 CH^* ló sp°--CH* 2,2 ~ 0í ^7- 14 sp -CH, 4 sp ~ϋ e 8 00* Na região dos átomos sp"'-C aparecem •7

sobrepostos dois grupos metilo (13*4 ppm), e na região sp^-U * 2 Λ

quatro sinais < 127 =, 4 ,· 12/ 5 75 12S=2s 12856 ppm) e na região dos grupos CO um grupo CO (16857 ppm) deverá ssr contado duas vezes» 0 espectro permite supor que a hormaomicina é um peptideo contendo dois aminoácidos aroíiiáticos e outros insturados»

Blocos estruturais de aminoácidos

Os aminoácidos presentes na hormaomicina slo deduzidos por idsntificsção dos componentes obtidos por hidrólise e por distribuição no antibiótico intacto com o auxilio dos espectros 1H/1H- e ^/^C-CDSY-RMN.

No hidrolisato total da hormaomicina Í6H HCl/ácido acético.-, 1s i 3 11@°C5 48 horas) podem ser detestadas a treonina (Tre) e a isoleucina (Ile) usando a análise automática de aminoácidos e por microdansilação EH, Laatschj J» Chromatogr» 175 <1979) 3983„ Observam-se aminoácidos neutros,, pouco usuais na regílo da prolina? valina (duas faixas) s fenilalanina (faixa com dupla intensidade)„ Para se testar em acoplamento de BC-HS (cromatografia a gas ligada a um espsctrómetro de massa)s os aminoácidos são convertiidos nos ésteres metálicos ou ésteres isopropilicos trifluoroaeetllados, ou produzem-se derivados de trimetilsililo. A partir dos espectros de massa das substâncias com o menor tempo de retenção á possivel distribuir a Tre e Ile* Além disso,, os aminoácidos que- ocorrem duas vezes podem ser distribuídos como β-metil—fenilalanina í íl-Me-Fe > através dos fragmentos característicos a m/z 23Θ <M^-COOCH^) e a 1Θ5 ( j ) no ΕΪ-MS (espectro de massa de ionização de eleetrSes) do éster metilico trifluoroacstilado e pelo ião molecular a míz 318 (CM + H3‘) no Cl—MS (espectro de massa de ionizaçãc quimica) do éster isopropílico trifluoroacatiladoOs dados estão de acordo com os que se referem ao R-lie—Fe-sintético. CY,,Kataoka et al * * Buli» Chem* SocJap = 49 (1976) 1Θ813,,

Relsiivaments aos aminaâcidQS anteriormsnte msncionadQ5s partindo de grupos metilo ou de grupos NH e a-O-l, os parceiros de acopla·" mente associados no espectro *H/AH—COSY podem ser descobertos e 1 i "3; ligados por meio do espectro "H/ “C-CGbY com os átomos de carbono associados» Os sinais dos dois blocos estruturais β-He-Fs diferem fortemente em alguns dos casos» é também surpreendente que a acoplamento Ha/H|3 seja num caso 1 = 435 Hs como no arninoá-eido livre e, no outro, seja 3 = i€?,5 Hz» o que indica diferentes conformações das cadeias laterais»

Um dos tris noovos aminoácidos é identificado como <Z>~-4-propenil-prolina (4~PE-Pro)= Uma indicação da massa molar da estrutura da prolina é fornecida pelo ião a m/z 265 <n) do éster metílico trifluoroacetílado em conjunção com os iSes a m/z ΞΘ6 (M’--COOCH^.) e 164» A estrutura da cadeia lateral e a sua posição na estrutura da prolina ê obtida a partir da correlação aos espectros» H—C<4) s H_--C(5) {ver Quadro 1) sobrepõem-se em CDCl^ e não podem ser distribuídos sem qualquer sombra de dúvida no espectro iH/iH-COSY {3,21 e 3,21/3,91 ppm>» Em CDC1.7/(CD-l^CO/G^D^ < 1 s I s 15, no entanto» é possível obter uma

distribuição adequada (2,98 e 3»ô7/3,85 ppm)» 0 sistema AB olefínico 5,2@/5.,58s £<„ 127=,5/128,2 em CDC1_») tem um acopla- mento AB de J = ΙΘ,5 Hz (eonfiguração Z) e nuns dos lados é adicionalmente dissociado por um grupo metílico olefinico iS..

H 1561) e no outro lado por um grupo CH» F^artindo de αΟΗ (4,2$ ρpm) ·.! através de um arupo CH-, ,» t,.. „ , 2 \ 1,/2/2,θκ? ppm) s oe um grupo tn (3,21 ppm) atinge-se um outro grupo CH^ (3,21/3,91 ppm)» Este última corresponde no seu valor (52,8 ppm) ao C(5> da prolina, que demonstra a posição 4 do radical propenilo na estrutura da prolina» Na análise automática dos aminoácidos, a proporção de 4-PE-Pro é sempre claramente inferior a 1» Na análise BC—MS, para além do éster metílicD de N-trifluoroacetil-á-propenil-pro- lina é também possível detectar derivados 4—íl— ou

2—trif luproscetoxipropil) cu 4-(1- ou 2—cloropropil) correspondentes com d auxílio dos espectros de massa* Isto é explicado através da suposição ds que na hidrólise da hormaomiicina5 a 4-PE-Pro junta água ou HC1 à ligação dupla*

No acoplamento 8C~MS? os dois aminoácidos da totalidade do hidrolisato ainda não distribuídos fornecem* sob a forma de •ésteres metílicos trifluoroacetiladoss espectros de massa EI idênticos que não podem ser atribuídos a qualquer composto conhecido* A fim de se poder investigar estes aminoácidos mais aprofundadamente* a totalidade do hidrolisato de 1Θ mg de hcrmao-micina á submetida a separação por CLAP numa coluna de μ--Bondapak-NH,, (gel de sílica carregado com grupos nh2 > na sistema acetonitrilo/água C7s3í* A separação não fica completa;, mas numa írseção, de acordo com a análise automática dos aminoácidos, os ami.noácidQs desconhecidos e a isoleucina (He) encontram-se presentes em quantidades aproximatíamente iguais* Após darivati-zação, estes últimos podem produzir de novo espectros de massa EI idfnticos e, no rendimento CΪ-MS5 o ião molecular a m/z 285 CM + Η1"* A massa molar ds número par indica dois átomos de na molécula* o que é demonstrado pela alta resolução de iões do fragmento no EI-MS e do ião molecular dos derivados de trimetil-sililo e apresenta a fórmula empiirica C^H., para as arninoá-cidos livres* 0 éster metílieo trif luoroaceti lado perde NCU (m/z 238) ou COOCH^ Cm/s 225) primeiro e revela ainda iSes ds fragmento típicos de ura ácido nitroamino* Ma procura dos sirmis de "H-RíiN associados nos espectros de correlação da hormaomicinay encontram-ss, partindo dos grupos NH/s—CH, duas séries de correlação idênticas das quais uma pode ser claramente dintinquirfa e a outra, devido a sinais de sobreposição, é revelada apenas pela combinação dos espectros "H/^H-COSY e ^H/^C-COSY a 4ΘΦ MHz (Quadro 1)* Os dados 11S e RMN demonstrara a presença de 3—(nitro— ciclopropil)~alanina <NPC~Ala) que está presente duas vezes na f

hormaomicina» Enquanto os sinais “H-RMW correspondentes dos dois biocos estruturais na peptídeo intacto são claramente diferentes i/\S ~ 6^82 a 1,6/ ppm),, os sinais ^"C-KMN comparáveis são muito semelhantes <f\B < 2 ppm., Quadro 1» Os sinais típicos de 'Ί-f-RMN deslocadoss de campo slevado5 típicos da hormaomicina pertencem a um NCP~Ala= Os radicais fsnilo dos blocos estruturais js-Me-Fe poderio ser responsáveis pela protecção»

Tendo a mesma constituição « a separabi 1 idade dos aminoácidos livres na análise automática dos aminoácidos e? após derivatizaçãoj na análise 8C~H83 pode ser calculada apenas através da estereaquímica« H-C(5> Í2?9<3 e 3S99 ppm) nSo está escondido nos dois blocos estruturais e revela um esquema de acoplamento id§ntico Cddd5 5 linhas) a partir do qual se podem derivar as constantes de acoplamento (J = 6?és 353 e 3 = 3 ppm) = Deduz-se,, a partir da magnitude das constantes de acoplamento dos átomos de H no anel eiolopropano lí-L Frtschi st ala·, Helv„ Chim» Acta 7.1. £1988) 15531 que no H-C(5) há apenas um acoplamento cis a um dos dcsis protões em C-í6) e o grupes nitro e o radical alanilo estio assim na transfiguraçao, rslativamsnte um ao outro5 no anel ciclopropano» 0 esquema de acoplamento H~Cí5> reaparece do mesmo modo no espectro “H-RMN des aminoácidos NCP-Ala 1ivres, enriquecidos por CLAP no sinal 454β ppm5 que nlo ocorre duas veess apesar da presença de esterecisósteros» Presumivelmente» os dois aminoácidos diferem na configuração no átomo <s—C«

Se os aminoácidos detectados na totalidade do hidroli— sato da hormaomicina são combinados com condensação s entlo na cadeia peptídica* uma extremidade amino, uma extremidade carboxi e o grupo a-trsonina-OH (grupo alo-treonina-OH) estão livres,, faltando ainda um radical C^N que deve conter o átomo de Cl detestado para além dos átomos de H e 0» A extremidade amino da cadeia psptidica é acilada» uma vez que só então se obtêm um ·»

total de seis grupos NH amida no espectro lM—RliM= Consequente- mente, as análises dos grupos terminais com 2,4-dinitrifluoroben- ?sno e cloreto de dansilo slo negativas» 0 grupo s-treonina-OH é ssterificado 5 como se pode detectar da posição para campos mniais baixos do H-C<3> í5,35 ppm) 0 facto do radical C_.N estar ligado não como um éster mas amidicamente à cadeia peptidica pode ser infsrido através da clivagem com lactona da hormaomicina usando metanolCW„A* Ayer e L = M=, Pena Rodrigues, J„ Nat„ Prod» 5Θ <1987)4003,, Com a absorção do metanol forma-se um éster meiilico da hormaomicina com uma massa molar de 116® (FAB-MS, espectro de massa de bombardeamento atómico rápido) s 1161 CM -*· Hl', 1183 Lrl *

Na3 ' , no espectro “H-RnN de que o H da treonina é desviado para < 5 ppm s em que aparece um éster-OCH-, a 3,74 ppm» A parte até agora não distribuiria da molécula consiste por isso num grupo CG 159,3 ppm) e um radical C^H^HQCl» Os átomos de C são sp’:"-hibridados com valores 8ri compreendidos entre 103,5 s 121,4 ppm» Dois dos átomos de H formam o sistema AB a , 6,08/6,75

H ρρπη o terceiro é a 11,10 (Quadro D» Estes dados podem ser plausivvslmsnte combinados para o ácido 5-cloro-N-hídroxi-pir-roIe-2-carboxilico íCHPCA) amidicaínente ligado, que é desconhecido da literatura da especial idade e que nao podia até agora ser detestado nos hodroíisatos da hormaornieina» Os dados de RMN (Quadro 1) eoncordqm satisfatoriamsnts com os dos ácidos pirrols--2-carboxilicos substituídos na posição 5 e com os de radicais comparáveis na cromoximicina dos antibióticos LY„ Kawai et al.. Tetrahedron Lett= 26 (1985) 32733 e 55Í85 RP EH,, Deschamps et al„, pedido de Patente Europeia 246 9753»

Na hormaomicina 3 os aminoácidos detsctados e o ácido pirrole-2-carboxílico postulado formam, por meio de ligações amida, uma cadeia peptidica linear de que a extremidade carboxi fecha com um grupo a-treonina-OH para formar um anel lactona» 0

anel lactona transporta uma cadeia lateral ligada amidicamsnte na s-trsonina* A sequência postulada de biocos estruturais de amínoá-cidos no anel lactona é deduzida a partir das seguintes experiências s

Tal como atrás foi descrito,, a a-treonina participa com a sua função hidroxi na ligação lactonas α que pode ser constatado através das dados de ΛΗ-ΗΜΝ»

Deveria ser possível determinar o aminoácido que fornece a sua função carboxi à ligação lactona por redução da função éster a um álcool. Na rsacção da hormaomicina com LIA1H,, em tetrahidrofurano a €í°C;! após hidrólise total do produto de redução a subsequente derivatização para os ésteres metílicos trifluoroscetilados-j o derivado 4-propenil-prolinoI correspondente pode ser dstectario pela análise BC-SIS» Ν,Ο-his-trif Iuorpacetil~4~Dpropenil~arol inol s Eí-nss m/z = 333 CÍ0%5 fT>, 206 (1ΘΦ%, i’V - CCHo-0C0CF 3) , 164 (10%, pf - ECH,-

«&M —OCOCF-ζ + CH = CH-CH-ς * Hl > »

Abrindo o anel lactona da hormaomicina s formando o éster mstilico5 ontém-se o composto de fórmula II5 designado por éster metílico da hormaomicina.

Cl-·

NCP-Ala·a-Thr·B-Me-Phe·NCP-Ala·B-He-Phe (II)

Ile·4-PE-Pro-OCH3 0 inventa refere-se também a substâncias que se podem obter da hormaomicina por clivagem com 1antena e esterificaçSo com um alcanol inferior, especialmente o éster metálico da hormaomicina.*

Uma análise comparativa do espectro de massa FAB da hormaomicina e o éster mstilico de cadeia aberta de fármuls II fornece os dados que se sequem2 aos.......FAB-MS . da......hgr?naqmicina§ m/z = 1129,4/1131,5 (11%, CM+H3+), 938 (1%, CM+H3+- (CHPCA + HNO^J), 83Θ C2%s CM+2H3+- CNCP-A1aCHPCA)), 7ΘΘ/7Θ2 (2%, CM+2H3+-<NCP-Ala -β -He-Fen-Ile) ), 538/54© (1%, CM+H3* - (B-tle-Fen-NCP--Ala-B-Me-Fen-Ile) ) , 516/518 <2%, CM+H3+4-<NPC~Ala« β -•Me--Fen-Ile-4-PE-Pro + N0o>>, 4©1/403 <2%, CM+Hl^-tp-Me-Fen-NCP» -Ala-B-Me-Fen-Ile-4-PE-Pro)), 3©©/3©2 Í2X, NCP-Ala» CHPCA), 144/146 (22%, CHPCA, 134 (1©©%)).

BgSjL-±ABHMy__dgL^ de formula IS s m/z = í183/1185 <3,5%, CM+Na3+>, 1161/1163 <2%, CM+H3*Í, 992/994 (3,6%, CM+H3l4—PE—Pro—Ome + H) > , 879/S81 (1%, CM+H3+-<Ile-4-ΡΕ--Pro-Ome + H)), 718/72© (3%, CM+H3+ - (β-Ms-Fsn»I le» 4-PE-Pro-0me + H)), 562/564 (©,9%, CM+H j"1'- í NPC-Ala Íl-Me-Fsn -1 le - 4-PE-pro-0me + H>>, 534/536 (©,7%, CM+H 3+-<0C-NCP-Ala« β-Me-Fen I le-4-PE-Pra-Ome +H)), 419 (3%, a-Tre-B-He-Fen-NCP-Ala + Η), 4Θ1/4Φ3 í©,9%, a— i re* β~lie—Fen = NCP—A1 a + H) = Números ds massa dos blocos estruturais dos aminoàcidos CQ-CHR-NH s a— ires 1Θ© cu 101 4-PE-Pros 1-5/ lies 11--· NCP—AIas Íb6 p-rte—Fes iòl CHPCAs 144 0 FAB-MS do composto de fórmula II também revela a separação da radical 4“PE~Pro-0CH._ da extremidade carbaxi da cadeia aberta peptídica, α que confirma a sua participação na ligação 1sctons da hormaomicina=

Mo caso da hidrólise parcial da hormaomieina <HC1 Í2N/ /ácido acético 1 s ϊ 5 temperatura ambiente,; 48 horas), após deriva-tisaçSa para os ésteres metílicos acetilados, descobriram-se na análise SC-MS dois dipeptideos e um tripeptideo* éster, metilicg ds , ,,.,.Ν.;-1 r i f 1 μα rgacet 1 iJólí gn ija l.a n i cina 2 EI-Hss m/z = 402 <5%, M*), 343 <2%, «+-COOCH^), 23© (5%, M+-<QC- -Ile-OCH^)), 1005 (1©©%, CAHR-CH-CH^.) . Éster metálico de__NaQ-.bis"-trif.i.uoroacafcil-alo-treonina-fi-metil- -fenilalanina EI-Mss m/z = 427 (8,3%, M+-CGOCHx) , 26é (8,2%, M+-<OC-B~i¥Ie~Fe~ —OCH-ξ)) , Í92 Cl ,5% B-ne-Fe-OCH^) ? 176 <16%, 0 JH^-C < CH^ > =CH- —COOCI-U), 134 <9%5 NH^-CH-CH<CH^)), 185 (188%, CèH5-CH~CH3)= âsMr....Jgtlli£,o......dp_M-1 r i f 1 uorgace t i 1 -B-meti 1-fen i1a1an ina- iso 1 su- c ina-4-propen i i-pro1inaa EI-Hss m/c = 539 (1%, H*>, M+-í 0C-Xle»4-PE-Pro—OCH^) 438 í3%5 !1‘-<C(CH^)=CÍCH_)), = 185 Í9Ò%* C..H,_—CH—CH_»>« & %J *3 343 C i%,

Estes resultados confirmam partes da análise da sequência dos espectros FAB-HB» A estereoquímica dos sminoâcidos e a conformação do anel 1 actona ainda está,, até certa ponto, par resolver»

In vitro numa série de testes de diluição de agar, a harmaomicina revela uma acçlo antimicrobiana contra um certo número de bactérias? por exemplo, as Arthrobacter crystallopoie-tes, Arthrobacter oxydans,, a espécie Corynehactsriumj Brevibacts™ riuffl linens e Salmonella typhimurium» A concentração de inibição mínima sstâ dentro da gama da ®9®®®1 a 5® μα/ml« Q Suadro que se segue fornece alguns exemplos específicos?

Concentração mínima de inibição da estirpe

Arthrobacter crystallopoietes ATCC 15481. % ®s0@@i

Arthrobacter oxydans ATCC 14358 ®5®®®5

Corynebacteriuffl sp» ATCC 2383®

Brsvibactsrium linens ATCC 9172 1.®

Salmonella typhimurium ATCC 13311 5® t AiCCs American Type Cultura Collaction» Rockville, MD, USA A hormaomicina pode, por esse motivo , ser usada como agente antimicrobiano* Quando usada como antibiótico, no caso de uma irrfecção por Salmonella typhimurium5 a dose diária a ser administrada a um animal de sangue quente ds cerca de 7® kg os peso corporal é aproximadamente de ®,5 a 5 g, de preferência., de i a 2 g.

No casa de algumas estirpes de Streptomycetes? a hormaomicina provoca um aumento na formação de antibiótico numa concentração baixa de aproximad assente Θ,β5 pg/ml ou mais» For exemplo, a adição de hormaomicina numa concentração de Θ,®5 μη/ml a um caldo de fermentação contendo Streptomyces griseoflavus <Tu> i3®6 provoca uma duplicação da produção do antibiótico tirandami-cina, enquanto uma concentração de ipg/ml provoca aproximatíamente um aumento quatro vezes maior da produção» A hormaomicina pode, por isso, ser usada também para aumentar o rendimento de produtos de fermentação valiosos» A hormaomicina induz a formação de micélios aéreos de Streptomyces griseoflavus (DBn 5195) e de outras estirpes de Streptomyces» Se estas estirpes forem usadas como indicadores de bactérias para placas de testes e se se usar» além disso, um meio nutritivo de agar em que não se desenvolvem micélios aéreos íidentificáveis pela coloração branca), nesse caso iμα de horma-omicina aplicado num disco de papel à superfície do agar será capaz de iniciar a formação copiosa de micélios aéreos em redor do disco» Além disso., a substância induz a produção de antibiótico nestas estirpes» 0 método de acordo com o invento para a preparação da hormaomicina é o seguintes a estirpe Streptomyces griseoflavus D3M 5195 ou uma cultura que se pode derivar dessa estirpe» è cultivada num meio nutritivo adequado e a hormaomicina é isolada do caldo de cultura»

Este processo é a seguir explicado em mais pormenors a hormaomicina é obtida com o auxilio de um novo processo microbio— lógico, nomeadamente por fermentação com a nova estirpe de Streptomyces griseoflavus DSM 5195, que foi depositada com o número DSH 5195 na DsM tDeutsche Sammlung von ilikroarganismen und Zel Ikulturen (Colscção Alemã de microrganismos e culturas- celulares), Maschroder Weg 1B, D-3300, Braunschweig, República Federal Alemã, a 31 de Janeiro de 1989= A estirpe produtora de DSH 5195 foi isolada a partir de uma amostra de terra recolhida em Anuradhapura íSri LankaK Pertence ao género Strsptomyces, adapta-se em todas as caracte-risticas determinadoras do tipo ao tipo da estirpe da Strsqtomyces griseoflavus e deve, por isso, ser atribuída a esse tipOc A estirpe DSH 5195 é caracterizada pelas seguintes características (nomenclatura e tasonomia de acordo com R, Hutter, "Systematik der Strsptomycetsn” (Sistemática dos Estreptomicetes), Verlag Karger, Basileia, 1987): os esporos são bicudos o 0 micélio aéreo ê inicialmente branco pálido e torna-se cinzento (cinéreo) na fase madura. O mícélio aéreo é monopodica— mente ramificado e tem ramos laterais com hélices mais ou menos regulares com geralraente quatro a seis voltas (espirais tipo B)= Sobre peptona/ferro/agar a estirpe não forma melanina. A estirpe utiliza os seguintes açúcares s álcoois como fonte única de Cs D-fructose, D-glucoss, mio-inositol, D-manose, L-ramnose e, especialmente, D-xilose* Nlo se observa qualquer crescimento sobre L-arabinose, rafinose ou sacarose»

Uma cultura susceptivel de ser derivada no sentido atrás referido é qualquer cultura que continue a ter as caraets-rísticas da cultura depositada que são essenciais para efectuar o processo do invento, isto é, sobretudo uma cultura derivada, em particular uma cultura em que os microrganismos contenham os mesmos genes estruturais dos genes estruturais da estirpe D8M 5195 que sSo causadores da formação da hormaomicina. Uma cultura susceptível de ser derivada é também qualquer cultura em que as microrganismos contêm um equivalente, possível devido à degenerescência do código genético, dos genes estruturais da estirpe DSri 5195 que são causadores da formação da hormaomicina.

Uma cultura susceptível de ser derivada é especial mente qualquer cultura que contenha microrganismos do género StreptDmyces, de preferência da estirpe Streptomyces qriseoflavus, que sejam capazes de produzir hormaomicina» 0 termo “cultura susceptível de ser derivada da estirpe DSn 5195" inclui também todos os mutantes da estirpe que sejam capazes de produzir a hormaoniicina» 0 meio nutritivo usado é uma solução ou suspensão, de preferência uma solução ou suspensão aquosa, que contenha de preferência pelo menos uma fonte de carbono e pelo menos urna fonte de azoto, e de preferência também minerais* Os exemplos de fontes de carbono adequadas sãos glicerina, carbohidratos assimiláveis, tais como ciclitóis, por exemplo, manitol, polissacarí— deos, por exemplo» amido, dissacarídeos, por exemplo, lactose e sacarose, e monossacarídeos, em especial, glucose e frutose, s também matérias primas industriais contendo carbo-hidratos, tais como açúcar de beterraba ou melaço de cana de açúcar» As fontes adequadas de azoto sãos amino-âcidos, especialmente os a-aminoáci-dos ocorrendo naturalmente, peptídeos s proteínas e seus produtos de decomposição, tais como psptonas e triptonas e também sais ds amónio e nitratos, e as corrrespondsntes matérias primas industriais contendo azoto, tais como estractos de carne, hidrolisato ds caseína e autolisato de levedura e sxtracto ds levedura» São também adequadas fontes industriais mistas de 0 e N, tais como várias sementes de plantas que são usadas sob a forma de extrac— tos aquosos, farinha ou farelo, por exemplo, feijão, tal como, feijão de soja, grãos ds cereais, por exemplo trigo, em especial milho (“licor de milho macerado*8) ? e também sementes de algodão e sxtracto de malte. Para além dos sais ds amónio, tais corno,

sspeciaimente c 1 crsto, -sulfato ou nitrato de amónio e outras nitratos, o meio nutritivo contêm como sais inorgânicos cloretos, carbonatos, sulfatos ε especialmente fosfatas de metais alcalinos e de metais alcalinos terrosos, tais· como, especial mente, de sódio, potássio, magnésio e cálcio, e também elementos vesti-·· giais, tais como ferro, cinco e manganésio.

Usa-se, de preferência o meio nutritivo descrito no

Exemplo 1» 0 meio nutritivo é esteriliçado s inoculado com uma cultura da estirpe produtora seguindo os processas usuais» A cultura efectua—se aerobicamsnte, isto á, numa superfície de cultura estática ou de preferência submersa, sacudindo ou agitando com ar ou oxigénio num frasco de agitação ou em fermentadores» A temperatura adequada é de aproximadamente 15*0 a 4Θ°0, em especial entre aproximadamente 20°C e 3@°C„ 0 período de fermentação leva de preferência de í a 3 dias» Numa forma preferida do processo de acordo com o invento, a cultura é incubada, primeiro, durante 8 horas a 27°C e depois a temperatura é reducida para A modificação da temperatura provoca um aumento do rendimento de hormaomicina* Nestas condiçSes, s formação de hormaomicina atinge o máximo passadas 45 horas, como se pode observar com o auxilio do teste de difusão de agar e de cromatogrsfia liquida de pressão elevada» A cultura efectua-se, de preferência em várias fases, isto é, sm primeiro lugar prepa-rara-sa uma ou mais pré-culturas num meio liquido nutritivo, e as pré—culturas são depois inoculadas no meio de produção propriamente dito, por exemplo, numa proporção de is2ô„ 0 isolamento é efeciuado por métodos físico—químicos usando meios de separação conhecidos per se» especialmente por

centrifugação? filtração» extraeção de soiventss5 precipitação, cristalização s cromatografia, mais especialmenie por cromatogra-fia ds adsorção e ds partição» A hormaomicina é encontrada nas células numa proporção ds 98%= Ela é sa primeiro lugar extraída das células usando um solvente adequado, por exemplo, um álcool, tal como o metanol·, 0 produto bruto resultante é purificado por extraeção usando um solvente adequado, tal como o acetato de etilo, e por cromatogra~ fia sucessiva sobre gel de silica e um gel de dextrano modifica-doj- oor exemplo, Sephadex ’EwLH-209 em vários solventes» 0 invento refere-se especialmente a um processo para a preparação de hormaomicina, processo esse que compreende cultivar aerobicamente a estirpe de Streptomycss griseoflavus DSM 5195 ou um microrganismo contendo os mesmos genes estruturais da referida espécie que são causadores da formação da hormaomicina, num meio nutritivo aquoso contendo uma fonte de carbono e de azoto e sais inorgânicos, e isolando a hormaomicina» 0 inventa refere-se especialmente a uma forma do processo atrás mencionado que compreende cultivar um microrganismo formando hormaonixcina da espécie Sireotomyces griseoflavus»

Uma forma preferida do processo atrás mencionado compreende cultivar a espécie Streptomycss griseoflavus DSM 5Í95 ou um mutante da referida estirpe formando hormaomicina«

Uma forma especialmente preferida do processo atrás mencionado compreende a cultura da estirpe Streptomyces griseoflavus DSM 5195= A fermentação efectua-sa de preferência nas condições descritas na secção dos Exemplos=

Os microrganismos que contêm as mesmos genes estruturais responsáveis pela formação da hormaomieina como sucede com a estirpe DSH 5195, podem ser produzidos artificia 1 mente, por sHSiiiplo, por meio de manipulação genética, de modo conhecido per ses isolando os genes estruturais correspondentes da estirpe DBM 5195 s incorporando-os, num local adequado, no material genético da um micoroganismo diferente adequado, Os microrganismos adequados são nlo só aqueles em que os genes estruturais em questão podem ser incorporadas, mas também aqueles em que os genes podem ser exprimidos e em que a hormaomieina formada não é decomposta mas, de preferência, é segregada para dentro do caldo ds fermentação. Estes microrganismos adequados são em especial outras estirpes do género Birepiomyces, especialmente as da espécie Streptomyces griseoflavus, na medida em que ainda não possuem os genes estruturais atrás mencionados.

Unta vez que a sequência de nucleotídeos dos genes-estruturais atrás mencionados foi clarificada5 também elas podem ser produzidos sinteticamente, caso em que -á possível, como resultado de uma degenerescência do código genético, substituir determinadas sequências de nucleotídeos constituídas por três nucleotídeos sucessivos, os chamados codSes, por outros cotíSes que codificam o mesmo aminoácido.

Os muiantes formando hormaomieina podem ser produzidos, por exemplo, sob a acção de raios ultravioleta ou de raios—X ou por mutações químicas, por exemplo, N—matil-N"-nitro-N-nitroso--guanidina, e isolados de maneira conhecida per se por selecçã.o de acordo com as suas propriedades específicas.

0 invento refere-se também a um processo para a preparação de um material de fermentação contendo hormaomicina numa quantidade -detec tàv-sl = processo esse que compreende cultivar a estirpe Streptomyces griseoflavus interrompendo o processo num ponto adequado a fim de isolar ou purificar a hormaomicina* 0 invento refere-se também a novos produtos de clivagem ou de decomposição da hormaomicina? especial mente a novas síninoá-eidos., por exemplo, ao ácido 2“amino-3“(2-nítrociclopropil)-pro-piónica 3 ao ácido ( Z) -4~propsnil-prol ina e ao ácido 2--amino“-3-f e-nilbutírico e também ao ácido 5-cloro-M-hidroKÍpirrole-2-carboKi-lico e a fragmentos peptidxcos pré-formados na hormaomicina,, contendo pelo menos um dos novos ácidos atrás mencionados»

Estes produtos de clivagem podem ser usados na síntese química da hormaomicina» 0 invento refere—se especialmente aos compostos de fórmula ϊII que se podem obter por clivagem com lactona,, da hormaomicina s» facultalivamentes por subsequente esterificação com um alcanol inferior»

✓ \

I II

ηο-ν; ι

V ίι em que R é hidrogénio ou alquilo inferior,, e sais do composto de fórmula III em que R é hidrogénio»

Os sais dos compostos de fórmula III são da prafarfncia sais metálicos alcalinos ou alcalino terrosos, não tóxicos5 farmacêuticamente aceitáveis, 'por exemplo, sais de sódio, potássio, magnésio e cálcio, ou sais com amónia ou aminas orgânicas adequadas5 sendo especialmente adequadas para a formação de sais mona-, di~ ou poli-aminas primárias, secundárias ou terciárias aiifáticas, cicioalifáticas, cicloalifáticas-alifáticas ou aralifáticas, tais como alquil inferior aminas, por exemplo, trietilamina, hidroxi alquil inferior aminas, por exemplo, 2-hidraxietilamina5 bis-(2-hidroxietil>-amina, 2—hidroxietiIdi-etilamina ou tri-(2-hidroxietil >-assina, ésteres alif áticos básicos de ácidos carboxilicos, por exemplo, éster 2-dietilamino-etílico do acido 4-aminoben sóico, alquilsno inferior aminas, por exemplo, 1-etilpiperidina, cicloalquilaminas, por exemplo·. diciciohexilamina, ou henzilaminas, per exemplo, N,N* —dibensil -etilencdiaisins5 e também bases do tipo piridina, por exemplo, piridina, colidina e quinolina»

Para fins de isolamento ou de purificação ê também possível usar sais não adequados farmacêuticsmenie aceitáveis» Contudo, apenas slo usados terapeuticamente sais nSo tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, e estes são, par consequência, os preferidos» 0 invento refere-se também a um processo para a preparação de um composto de fórmula III ou a uns sal desse composto em que R é hidrogénio, processo em que a hormaomicina de fórmula I é submetida a clivagem com 1aciona, dando origem, assim, s um consposto de fórmula III em que R é hidrogénio, ou a um seu sal, e para a preparação de um composto ds fórmula III em que R é alquilo inferior, processo em que facultativamente o composto ds fórmula ΙΙΪ em que R á hidrogénio é esterifiçado, caso seja necessário depois de se proteger os grupos hidroxi livres por grupos protectores facilmente removíveis, ou para a preparação ds um sal, o composto de fórmula III em que R é hidrogénio â convertido num sal, ou um sal resultante é convertido no ácido livre» A clivagem com lactona efsetua-se de maneira conhecida per se» A hormaomicina é tratada, de preferfncia, num solvente adequado com um agente básico adequado, especialmente um agente básico fraco, tal como o sal de uma base forte s um ácido fraco, por exemplo, carbonato de potássio, cianeto de metal alcalino ou sulfursto de sódio» Caso se deseje, a agente básico pode ser usado em quantides catalíticas» Se a clivagem com lactona se efsetuar num alc-anol inferior adequada, tal como o metanol ou stanol, obtém-se um éster de fórmula III, em que R é o radical alquilo inferior correspondente a esse alcanol inferior»

Ss a clivagem com 1aciona não se efeciuar nesse a1canal inferior,, o composto resultante de fórmula III em que R é hidrogénio pode ser esterifiçado de maneira conhecida psr ss, A esterificação pode ser efectuada, por exemplo, fazendo reagir um derivado de ácido carhoxílico reactivo de um composto de fórmula III em que R é hidrogénio com o álcool correspondente. AI terna tivaments, o composto de fórmula III em que R é hidrogénio pode ser esterificado por reacção com um derivado reactivo do álcool desejado como componente de esterifi-cação„

Os agentes de esterificaç-lo adequados são, por exemplo, os dlazo-alcanos inferiores correspondentes, por exemplo, diazo™ metano, diazoeiano, diazo—n—butano= Estes reagentes são empregados na presença de um solvente inerte adequado, tal como um hidrocarboneto alifático, cicloalifético ou aromático, tal como o hexano, eiclohexano, henzena ou tolueno, ou um hidrocarboneto alifático halogenado, por exemplo, cloreto de metileno, ou um éter, tal como um éter di-alquilo inferior, par exemplo, éter dietílico, ou um éter cíclico, por exemplo, tetrahidrofurano ou dioxano, ou uma mistura de solventes e, confarme o reagente diazo, com aquecimento è temperatura! ambiente ou com aquecimento suave e também, se necessário, num recipiente fechado e/ou numa atnicssfera de gas inerte, por exemplo, numa atmosfera de azoto.

Outros agentes de esterificaçlo adequados são os ésteres dos álcoois correspondentes, em especial aqueles que contêm ácidos inorgânicos ou orgânicos fortes, tais como os-ácidos minerais, por exemplo, os ácidos hidrohálicos, tais como o ácido clorídrico, bromidrico ou iodidrico, ou os ácidos halossul-íúricos, por exemplo, o ácido fluorossulfúrico, ou os- ácidos sul fónicos orgânicos fortes, tais como os ácidos tais como os aIcanossulfónicas inferiores que são insubstituidos ou substituídos 5 por exemplo, com um halogéneo, tal coma o flúor, ou ácidos suífónicos aromáticos, por exemplo, ácidos benzenossulfónicos que são insubstituidos ou substituídos, por exemplo, com alquilo inferior, tal coma meti lo.? halogéneo ? tal casso bromo e/au com nitro, por exemplo, ácido metanossulfónico, trifluorometanossul-fónico ou p-toluenossulfónica. Estes ésteres sSo, entre outros, halelos de alquilo inferior, sulfatos de di-alquilo inferior, tal como sulfato di-metiia, e também ésteres de alquilo inferior de ácido fluorossulfónico5 por exemplo, éster metiiico de ácido fluorossulfónico5 ou ésteres de alquilo inferior de ácida metanas--sultónico insubstituído ou halo-substituído, por exemplo, éster metiiico de ácido trifluorometanossulfónica, SSo geralmente usados na presença de um solvente inerte, tal como um hidrocarboné to alifático, cicloalifático ou aromático, insubstituído ou halogenado, por exemplo, clorado, um éter tal como dioxano ou tetrahidrofurano, ou uma sua mistura, é preferível usar agentes de condensação adequados, tais como carbonatos de metais alcalinos ou carbonatos ácidos, por exemplo, carbonata ou bicarbonato de sódio ou de potássio (em geral juntamente com um sulfato), ou bases orgânicas, tais como tri-alquil inferior aminas geralmente estsricamsnts impedidas, por exemplo, N,N-di-isopropil-M-eti1amina (de preferência juntamente com ésteres de alquilo inferior de ácido halossulfónico ou ésteres de alquilo inferior de ácido metanossulfónico halo—substituído)3 efectusndo—se a operação com arrefecimento, à temperatura ambiente ou com aquecimento, por exemplo, a temperaturas compreendidas entre aproximadamente —2&°C e aproximadamente +5©°C, se necessário, num recipiente fechado e/ou numa atmosfera de gas inerte, por exemplo, numa atmosfera de azoto„

Uutros agentes de estsrificação são os sais de oxónio tri-substituídos correspondentes (os chamados sais de Meerwein), ou sais de carbénio ou de halónio di-substituidos, em que os substituintss são radicais esterificantes, por exemplo, sais de tri-alquil inferior oxónio, e também sais de tíi-alcoxi inferior carbénio ou di-alquil inferior halónio, em especial, os sais correspondentes com ácidos complexos contendo flúor,, tais como os tetrafluorboratoSp hexafluorofosfatos, hexafluoroantimcnatos ou hexacloroantimonatos correspondentes» Estes reagentes são, por exemplo, o hexafluoroantimonaio de trimetiloxónio ou trietiloxó-nio, hexacloroantimonato, hexafluorofosfato ou tetrafluoroborato, hexafluorofosfato de dimetoxicarbénio ou hexafluoroantimonato ds dimetilbromónio» Estes agentes são usados de preferincia num solvente inerte, tal como um éter ou um hidrocarbonsto halogena-do, por exemplo, éter dietilico, tetrahidrofurano ou cloreto de metileno, ou numa sua mistura, caso nscecessário na presença de uma base, tal como uma base orgânica, por exemplo uma tri-alquil inferior amina, de preferfncia uma tri-alquil inferior amina estericamente impedida, por exemplo Ν,Ν-diisopropil-N-etilamina, e com arrefecimento, à temperatura ambiente ou com aquecimento suave, por exemplo compreendido entre aproximadamenie -20°C e aproximasamante 50°C, se necessário num recipiente fechado s/ou numa atmosfera de g-as inerte, por exemplo, numa atmosfera de asoto»

Uma forma preferida da reacçSo de esterificaçSo é a reacção de um sal de césio do composto de fórmula III em que R é hidrogénio, com o álcool desejado como componente de esterifica-ção, em que o grupo hidroxi se encontra sob a forma esterifiçada reactiva, por exemplo, sob a forma de um haleto» A fim ds se evitar a formação de lactona, a operação é ou efectuada com usn considerável excesso do alcanol inferior desejado como componente de esterificação, que é usado, por exemplo, simultaneamente como solvente, ou se protegem antes de. esterificaçla os grupos hidroxi livres presentes no composto de fórmula ϊϊϊ*

Os grupos- protsctores de hidroxi e os métodos- pelos quais eles são introduzidos e removidos são descritos, por exemplo, em "Protective Groups in Qrganic Chemistry" (Grupos Pratectores na Química Orgânica), Plenum Press, Londres, Nova Iorque, 1973, e em "Methoden der Organischen Chemie” (Métodos da Química Orgânica) , Houben I4sy i, 4ã edição. Volume 15/1, Georg--Thieme-Verlag 5 Estugarda , 1974, e em Theodora W. Greene, “Protective Groups in Organic Synihesis-% (Grupos Protectorss na Síntese Orgânica) John Wiley & Sons, Nova Iorque 1981= é carac-terístico dos grupos protectorss o facto de eles poderem ser prontamente removidos, isto ê, sem que se verifiquem reacçSes secundárias indesejáveis, par exemplo, por solvólise, redução, fotólise ou alternativamente soh condíçSes fisiológicas*

Os grupas protectores de hidroxi são, por exemplo, radicais acilo, tais como alcanoílo inferior insubstituído ou substituído, por exemplo, com halogéneo, tal como 2,2-dicloroacs-tilo, ou radicais acilo de semiésteres de ácido carbónico, em especial, t-butoxicarbonilo, bsnziloxicarbonilo insubstituído ou substituído, por exemplo, 4-nitrobenziloxicarbonilo, ou difenil-matoxicarbonilo, ou 2-halo-aIcoxi inferior carbonilo, tal como 2,2,2~tricloroetoxicarbonilo, e também tritilo ou formilo, ou radicais si li la ou astanilo orgânicos, e também grupos esterifi-cadores facilmente removíveis, tais como t-alquilo inferior, por exemplo, t—butilo, radicais hidrocarboneto 2—oxa— ou 2-tia -aiifáticos ou 2-o κ a-- ou 2-tia-cicloalifáticos, em especial 1- alcoxi inferior-.alqu.ila inferior ou i-alquil inferior—tio-al-quilo inferior, por exemplo, metoximetilo, i-metoxietilo, 1-eto-xistilo, metiltiometilo, 1-metiltioetilo ou l-etiltioetilo, ou 2- oxa~ ou 2-tia-cicloalquilo com 5 ou é> átomos no anel, por

exemplo, ietrahidrofurilo ou 2-tetrahidropiraniIo ou análogos tia correspondentes, e também 1—fanil—alquilo inferior insubsiituído ou substituído, tal como bensilo ou difenilmetilo insubstituído ou substituído, sendo os substituintes adequados dos radicais fenilo , por exemplo, haloqéneo, tal como cloro, a.lcoxi inferior, tal como ínetoxi e/ou nitro»

Os radicais sililo ou sstaniia orqSnicos atrás mencionados cant?ss? de preferencia» alquilo inferior, em especial metilo, como suhstituinte dos átomos de silício ou de estanho» Os grupos sililo ou sstanilo correspondentes sao especialments tri-alquil inferior sililo, em particular tri-metiIsi1i1o, e também dimetil-t-butil-sililo» ou estanilo substituído corrsspon-dentemente, por exemplo, iri-n-butilestanilo» A remoclo dos grupos protectores de hiaroxi ê efsctuada de maneira conhecida per se por exemplo, por meio ds solvéliss, em espacial hidrólise, alcoólise ou -acidóliss, ou por meio ds redução, em especial hidrogenólise ou reduçSo química, facultativamente por fases ou simultaneamente» 0 tri-alquil inferior sililo também pode ser removido por tratamento com um sal de ácido hid rofluórico fornecendo um iao de fluoreto, tal como um fluoreto de metal alcalino, por exemplo, flucreto tíe sódio ou de potássio, na presença ds um poliéter macrociclico (”c ro^n ether">, ou um fluoreto de uma base quaternária orgânica, tal como fluoreto de tetra-alquil inferior amónio ou fluoreto de tri-alquil inferior-arilaménio, por exemplo, fluoreto de tetra-stilamónio ou fluoreto de tetrabutilamónio, na presença de um solvente polar aprótico, tal como o sulfóxido de dimetilo ou a |\i, M-dimsti laeetamida»

Os sais do composto de fórmula III em que E é hidrogénio podem ser preparados de maneira conhecida per__se, por exemplo, por rsacçSo com uma base adequada, par exempla, por tratamento com compostos metálicos adequados, tais como sais de metais alcalinas de ácidas csrbaxílicos orgânicas adequados, por exemplo, o sal de sódio do ácido c-etiIcaproico, ou com sais de metais alcalinos ou alcalina terrosos inorgânicas adequados, especialmente os que derivam de um ácido fraco e de preferencia volátil, por exemplo, bicarbonato de sódio, ou com amónia ou com uma amina orgânica, usando-se, de preferencia, quantidades estsquiométricas ou apenas um pequeno excesso da agente formador de sal.

Os sais podem ser convertidos no composto livre de uma maneira usual,, por exemplo, por tratamento com um ácida adequada,

Salvo indicaçtío em contrário, os processos atrás descritos incluindo os processos para remover os «grupos protecta-res e os passos adicionais do processo, afestuam-se de maneira conhecida per se, por exemplo, na presença de solventes a de diluentss, caso seja necessário na presença de agentes de condensação ou de catalisadores, a temperatura reduzida ou elevada, por exemplo, a uma temperatura compreendida aproximadamsnte entre -20°C e aproximadamsnte +100*0, s® especial, entre aproximadamen-fce + 1!-‘C e aproximadamente +70°C, sobretudo entre a temperatura, ambiente <aproximadaínente +20*0 e +45°C, à pressão normal ou a pressão elevada, num recipiente adequado e, se necessário, numa atmosfera de gas inerte, por exemplo, numa atmosfera de azoto.

Tendo em conta todos os substituimies presentes na molécula, devem, caso seja necessário, quando se encontram presentes radicais facilmente hidrolisáveis, usar—se condições de rescção especialmente suaves, tais como tempos de reacção reduzidos, agentes ácidos ou básicos suaves em concentrações baixas, proporções de quantidades estequiométricas e uma selecção de

% - catalisadores, solventes, de condições de temperatura s/ou pressão adequadas, 0 invento refere—se também àquelas formas do processo em que um composta que se pode obter cama interceediàrio em qualquer fase do processo é usado como material de partida efsciuando-se depois os restantes passos tio processo, ou em que o processo è interrompido em qualquer fase, ou em que se forma um material de partida sob as condições da rsacção, ou em que ss usa a forma de um derivado reactivo ou de um sal * Tendo em conta a relação intima entre o ácida livre e os seus sais, uma rsfsrgncia ao ácido livre também pode incluir o sal correspondente e vice versa, sempre que nas circunstâncias seja possível ou apropriado, É preferível usar os materiais de partida que, de acordo com o processo, dão origem ao composto atrás descrito e considerado como sendo particularmente valioso, 0 presente invento refere-se também aos novos materiais de partida e/ou intermediários s a processos para a sua preparação, De preferência, os materiais de partida usados e as condições de reacção empregadas são escolhidos de modo a obter-se os compostos mencionados neste pedido de patente como sendo particu— 1armente preferidos,

Para além das actividades biológicas e faraaco1ágicas atrás descritas para a hormaomicina, a hormaomicina e os compostos de fórmula III e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis revelam propriedades anti—proliferantes, imunossupressoras e inihidoras de inflamação, como se pode constatar, por exemplo, através das seguintes experiências? A fim de se demonstrar as propriedades anti-proliferan— tes, determina—se a acçSo inibidora das compostos de fórmula I no

crescimento do carcinoma T24 da bexiga humana* Estas células sSo incubadas no "meio essencial mínimo de Eaglest a que se adicionou 5% ív/v) de soro fetal de vitelo? num incubador humidificado? a 37*0 s a 5% por volume de C0._, na atmosfera* As células de carcinoma (1&ΘΘ—15Θ0} são inoculadas em placas microtituladas contendo 9è cavidades e incubadas durante a noite nas condições atrás mencionadas* A substância a ser testada è adicionada em diluições em série no 19 dia* As placas são incubadas durante 5 dias nas condições atrás mencionadas* Durante este período? as culturas de controlo sofrem pelo menos quatro divisões celulares* Após a incubação? as células são fixadas numa solução de gluta-raldeido aquosa a 3=3% (p/v)? lavadas com água e tingidas com uma solução de asul de metíieno a ®?®5% (peso/volume)* Depois da lavagem a cor é eluída com ácido clorídrico aquoso a 3% <p/v>* A densidade óptica (DO) por depressão? que é dirsctamente proporcional ao número de células? é então medida com um fotémetro (Titertsk multiskan) a óóo nm = Os valores ΙΟ.-.., são calculados com um sistema de computadoras usando a fórmulas BU,(teste - DO,,_ (início)

ÓCÍJ SÕO x 1Θ® duaãs (controlo) - (inicio)

Os valores IC^ são definidos como a concentração de ingrediente activo a que o número de células por cavidade no final da período de incubação constitui apenas 5®% do número de células nas culturas de controlo* Os valores- 10½¾ resultantes para os compostos de fórmulas I e III são aproximadamente Θ5 a Spmol/Iitro? por exemplo? 1 pmol/litro*

Os compostos de fórmulas I e ΣΙΙ são? por esse motivo? também adequados nao tratamento de tumores? por exemplo? da bexiga*

As propriedades imunossupressoras podem ser inferidas,, por exemplo., a partir dos seguintes testess

InifeislQ-áa.......proliferação de células T no sangue, humano..............induzida por anticorpos inonocionais anti-CD 5

Adicionam-se ao sangue humano venoso 1Θ unidades de heparina por mi„ sendo este depois diluído numa razão de ls6 (v/v) com o meio RPMí 164© í8ibco>» Depois da adição de 5@ ng/rnl de anticorpos monoclonais anti-CD 3 <TR 66, IgBlK)„ o sangue diluído é introduzida numa placa titulada com 96 cavidades em porções de 15© μΐ por depressão» Adiciona-ss então em porções ds 5Θ μΐ por cavidade um composto de fórmula I ou III no meio RPhI atrás mencionado» Usa-se coma composto de referfncia a Ciclospo-rina A (C8A* Sandoz, Basileia, Suíça) ou a prsdnisalona.

Após 48 horas a 37 °C e com um teor de 7% por volume de _ 7 UQ, no ar, adiciona-se por cavidade Ι,Θ μϋί de ~H-timidina em μΐ ds meio RPMI (Amershams actividade especifica 5 Ci/mmol)»

Após roais 16 horas as células são recolhidas sobre filtros de fibra ds vidro (LKB, Bromma, Suécia) usando uma máquina com 96 cavidades (L..KB)» Depois dos filtros terem secado, a sua radioactividade é medida (Optiscint CLKB3, contador ds cintilações Betaplate CLKBl)» Os resultados são expressos como valores médios da cpro (contagem por minuto) determinada para cada cavidade., para tr@s concentrações diferentes, na presença e na ausência das substâncias do teste e a actuaçlo das substâncias é fornecida como percentagem de inibição que é definida como se segue» κ 10Θ % inibiçlo = tm cpm de controlo

Exo» cpm = cpiTi das células T e dos anticorpos monacionais anii-—CD 3 e da substância do teste» cpflí do controlo = cpm das células T a dos anticorpos monoelonais anti-CD 3 (1ΘΘ% de incorporação)»

Dessnha-sa uma curva de inibiçlo e os vaiares sSa dados em pmol/litro» No tests atrás mencionada os valores IC^ compreendidos entre J. ?5 e 15? por exemplo? 7?5 μίηοΐ/litra? são determinados para a hormaomicina e para os compostos de fórmula III» determinando-se um valor IC^ de Θ?3 μοαΐ/litro para a ciclosporina A»

Inibição da proliferação de células T no sangue humano induzida pela interlaukina-2 O teste efectua—se de forma análoga è que foi atrás descrita? mas adicionando-se 1ΘΘ unidades/ml ds recombinante interleukina—2 ÍHoffmann—La Roche? Basileia? Suíça) ecn lugar de 5® ng/rni de anticorpos anti-CD 3» Neste teste os valores IC^.. compreendidos entre 4 e 4Θ? por exemplo 17 pmol/litro são determinados para a hormaomicina e para os compostos ds fórmula III»

Os compostos da fórmulas I e III slo? por isso? usados também como agente imunossupressorss para suprimir reacçSes de imunidade indesejáveis? por exemplo em transplantações ou alar- \

As propriedades de inibição da inflamação podem ser demonstradas,, por exemplo,, ín vitro pela inibição da actividsos da fosfolipase A0 (obtida a partir ds leucócitos humanos)» •jÍ.

Teste in vitro para a determinado da inibição da fosfolipase Λ» obtida a partir de leucócitos humanos

Os leucócitos humanos polimorfoniic 1 earss rssutrof í 1 icos são isolados a partir de "buffy coats" (coágulos brancos) por sedimentação fraccionada multifass e são congelados» A fosfoli-pase A,, é extraída tía suspensão celular por homogeneização com adição de H^SO^ 0S36M gelado em NaCl 2N e' o supernadante obtido após centrifugação a ΙΘ?#Θβ g é dializado contra um tampão de acetato de sódio de pH 4»5»

Para se determinar a activídade enzimàtica, a enzima (10-3Θ p.g de proteína) é incubada a 37°C durante 1 hora num tampão tris-HCl ®?1M de pH7 com a adição de 1 mmol de CaCl„ e o substrato constituído por fosfolipidos (2 prnol) da Escherichia coli á rotulado radioactivamente per via biossintética com ácido C-olexco» A reacçso e suspensa pela stíxçao de reagente de Dole < isopropanol/heptano/H^SQ^ 1NS 40si©si5 v/v) e o ácido i~rC-oleico libertado seisctivamente pela fosfolipase A,, é extraído» 0 substrato assim extraído é removido completaraente por filtração do extracto através de uma coluna de gel de sílica» A determinais. ç'áa do ácido ~ 'C-oleico no eluato è efectuada por radiometria. A fim de se determinar a seção inibidora dos compostos de fórmulas 1 e III sobre a fosfolipase » os compostos são adicionados ao lote ds incubação sob a forma ds soluções em água, sulfóxido de dimstilo Cconcentração final do lote até a um máximo de 5% por volume) ou etanol (concentração final do lote até a um máximo de 2S5% por volume)» A intensidade ds actuação dos

compostos do teste é expressa em isto é, a concentraçSo que produz uma inibição ds ΞΘ% da actividads de controlo.. A IC~^ é determinada graficamente traçando a percentagem de inibição sobra a ordsnatía contra o logaritmo ds concentração Cumol) sobre a ahcissa.

Mesíe modelos os valores SC^ compreendidos entre 2 e 18,. por exemplo 7, em pmol/litro são obtidos para os compostos de fórmulas I e 111=

0 invento refere-se também à utilização da harmaomici-na, de um composto ds fórmula III ou a um sal farmaceulicamente aceitável de um composto de fórmula III s \ I II • · H3c

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V hÒ-ch3 9 9

V hc-ch2—' SH c=o —no2

* V (III)

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V èi síb qus R s hidrogénio o para α tratamento clínico ds doenças ©m animais de sangue quente, incluindo seres humanos, especialmente através da administração de quantidades terapeuticamente eficazes dos compostos atrás mencionados. Quando administrada a animais

de sangue quente de aproxímadamenie 7Θ kg de pesa corporal, par exempla a um ser humano com este peso, a dosagem depende, entre outros factores, da doença a ser tratada e vai ds 1,1 a 5 g, por exemplo, Θ,5 a 5 g, ds preferencia ®,5 a 2 g, por exemplo, 1 a 2 g por dia* A administração efectua-se, de preferência, sob a forma de preparações farmacêuticas, por via parentérica, por exeinplo, intravenosa, intramuscular ou intraperitonal, dividida em várias doses diárias. 0 invento refere-se também a preparaçSes farmacêuticas contendo hormaomicins, especial.mente uma dose eficaz de hormaomi-cina, isto é, uma dose tendo, por exemplo efeito antibiótico ou ds inibição de tumores ou de supressão ds rsacçSes de imunidade indesejáveis, a um composto de fórmula ΪΪΙ ou a um sal fsrmaceu-ticamente aceitável ds um composto ds fórmula III em que R á hidrogénio, juntamente com um material constituindo um veiculo farmacêutico, ds preferência incluindo mais de 3.Θ% desse material «

Os compostos farmacologicamente activos do presente invento podsra ssr usados sob a forma de preparaçSes administráveis por via parentérica ou sob a forma de soluções de infusão. Essas soluções são de peferfncia soluções ou suspensões aquosas isotónicas que, por exemplo, no caso de preparaçSes liofiUsadas que contêm o ingrediente sctivo sozinho ou juntamente com um veicula, por exemplo, manitol, podem ser preparadas antes de utilizadas. As preparaçSes farmacêuticas podem ser esterilizadas s/du conter adjuvantes, por exemplo, conservantes, estabilizadores, molhantes e/ou. emulsificantes, solubilizantes, sais para regular a pressão osmótisa e/ou tampões. As presentes preparações farmacêuticas que, caso se deseje, podem conter outras substâncias fsrmacDiogicamsnte activas, tais como antibióticos, são manufacturatías de maneira conhecida per se„ por exemplo, por *

meio de processos de dissoluçlo ou de liofilizaçlo convencionais, s cont§m aproximadamente de 0,1% s 90%, em especial de aproxima-damente 1% a aproximadamente 3Θ%5 de ingrediente<s) activoCs).

Os Exemplos que se seguem ilustram d invento mas não o limitam de forma alguma. Salvo indicação em contrário, os valores R, são determinados sobre placas de camada fina de gel de sílica (Sil Β/ϋν„_.Λ). A razão de um eluente para o outro nas 254 misturas de eluentes usadas é dada em partes por volume Cv/v), e as temperaturas em graus centígradas», A concentração c.:, da substância num solvente ou numa mistura de solventes no caso de rotação ôptica á dada em percentagem <peso/volume>»

Usam-se as seguintes abreviaturas para indicar os espectros de rssonância nuclear (desvio químico ê sm ppm relativamente ao tetrametilsilano)s b = largo d - dupleto Hz = Hertz J = constante de acoplamento m ~ multipleto q -· quarteto s = singleto t = tripleto ÍHesLBÍS_l

Um fermentador de ΪΦ litros é carregado com 9 litros de uma solução nutritiva (2® g de farinha de soja 1®®% gorda, 2Θ q farinha de c&rriev 10 g de roanitol, θ,2 g de NaCL, 0„5 g de ZnSO^. x 7 1 litro de água corrente, pH 7), esterilizado, inoculado 11

com i litro ds unsa pré-cultura da estirpe Streptomyces grissofla-vus DSM 5195 (mesma solução nutritva, com 32 horas, 27°C) e posto a funcionar durante 45 horas nas seguintes condiçõess temperatura 27°C (passadas S horas reduz-se para 20°C>, velocidade do agitadors 3®# revoluções por minuto» fornecimento de ar 0,5 vvm (vvm - volume de ar/volum© de meio nutritivo/minuto)„ Q micèlio obtido por centrifugação do caldo de cultura é SKiraido duas vsces com metanol» 0 extracto é concentrado até è. fase aquosa s extraído agitando du.as vszss com acetato de stilo* Após evaporação do solvente, a fase orgânica dá origem a um produto acastanhado» Este é separado numa coluna de gel ds sílica CCHCl.» como eluente) » As fracções activas são em seguida purificadas com metanol sobre uma coluna Sephadex (E)LH~2@ (gol de dextrano modifiçado)« 0 enriquecimento da hormaomicina é sfectuado por cromatografia liquida de alta pressão (CLAP) CEP hipersil-5 μπι, Ho0/CHTCN (0,1% HTPO^)-gradientes 30% CH-XM para 100% CH-^-CN, detecçãos 254 nm , tempo de retenção = 6,,7 minutas <77% CH^-CN) * Tendo em vista a purificação final» 14® mg desta carga de substâncias são cromatografados sobre gel de sílica (diâmetro dos poros <Θ»Θ8 mm; 2,5 x 5Θ cm) com n-hexano/acstona <2íí1)=. obtendo-se IS mg de uma impureza incolor que pode ser tingida com ácido molibdatofesférico (CCF)» A hormaomicina è eluída com CHCL^/MeDH (95s5)» A substância é dissolvida e re-precipitada através da adição gota a gota de uma solução concentrada de clorofórmio em 5ΦΘ ml de n-hexano» A hormaomicina é obtida sob a forma de um pó incolor» amorfo, com um ponto d© fusão da loé-168°Cf Rf = 0^39 (CHCL^smetanol = 100,4); ™ * “= “? fj-r =: ®,28 (n-hexanosacetona = l= -h20,8°(c ·- ®,5í metanol)5 Uv (metanol)s 278 (9150), 2Θ6 (4295Θ) nm? IV (KBr)s 339Θ, 31Θ0-2300» 1741, 1645-1620 (largo), 1612, 1545» 145Θ, 1365 cm 's' , Espectro ds massa de bombardeamento atómico rápido (glicerina como matriz)s 1129,4 CEH+H3+), 938, 83Θ, 700, 516, 4©i, 373, 3®0, 264, 218; ÍH“RMW e l3C-EHN ver Ouadro 1; <*

C55H69Ni0°i4C1 (íl29*ò8)

Calculada C 58,48 H 6,16 N Ι2,4Φ Ο 19,82 CL 3,14

Encontrado C 58,35 H é,31 N 11,66 0 19,30 CL 2,94 A horã>ac:?.ir.ina é neutra, facilmente solúvel em metanol, clorofórmio, acetona e acetato de eiila e insolúvel na água a em hexfino» Sobre placas de cromatografia de camada fina ela extingue as radiações UV í254 nm), torna-se lentamente amarela quando exposta ao ar e pode ser tingida de acordo com Barrollisr (azul esverdeado) e com o reagente de Ehrlich ívioleta pálido) mas nSo com nin-hidrina»

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Quadro I: Ce dados H-RMN da hormaomicina * (CDCI3. 100.6 e 400 MHz)

«O 00 <f *Λ «H <t .35 .98 CM 00 .97 .22 cr» < ,80 ,60 r—i CM 35 09 rH 08 ιΛ rH lO 00 0 0 rH fH l-H rH cn γη r-*

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Quadro 1 (cont ) <u -μ to c μ tu d s t!ag ε -μ o w u w l " r—ι ro •d c β -Η 0)· β m ίο I ι—I m m ι r-i ι—I -H ítj *» y α> ·μ a ^ ι 2 tn h ι (D& Qi I sf I fO β ' ·Η Η -H ° m μ u α •η ι 'S H fO -H (¾ β

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Dissolvem-se / mg de hormaomicina e® 2 ml de metanol»

Depois da adição de suant idades catalíticas de !<^C0_» sé lido,; a u -· solução é agitada à temperatura ambiente durante 14 horas» vertida depois sobre 2Θ ml de gelo-água e extraída com CH^Cl.-, (4

•st. jC x é ml)» 0 resíduo de evaporação das fases orgânicas combinadas é cromatgrafado sobre gel de sílica (coluna 1»® x 3S® cm» CHCl^.ϊmetanol = 9sl). Obtém-se da zona principal o éster meti 1 i™ cc de cadeia aberta da hormaomicina de fórmula II ρ p=f» 172°C, Rf = ®»Θ5 <CHCl?smetanol = 1ΘΘ s 4 >, R» = Θ»46 CCHCl-^s metanol = 9sl)p a comportamento em relação à tintagem é o mesmo da hormaomicina), UV <metanol) s 278 <U2@€», 214 (3130@> nm, IV (KBr/s 34®05 33005 3100-28505 174Θ5 1635 (largo)» 1345, 145Θ, 137Θ»

10Θ30 cm “i espectro de massa de bombardeamento atómico rápido (álcool 2-nitrobenzilico coma matriz)? 1183/1185 (tn+Nal^ç 1161/1163 (CW+Hl^) 992, 718, 419» 1159/1161 (CM-HlT) p 1H-RMN í CDCi-y, 200 MHz)s 3,74 (s, 3H? OCH.T) » o -restante esquema de sinal é semelhante ao da hormaomicina mas os sinais são, em determinados casos, largos s sobrepõem-se mais fortemente, estando ausentes os sinais abaixo do tstrametilsilano» Í2i®ffiais_38 Presaraglo.......farmacSut iça.....ga ra__jnjeccio......int r amusçu.,1ar

Dissolvem-se 250 mg de hormaomicina em polietileno glicol 300» A solução è filtrada de forma estéril a introduzida numa ampola de 3 ml em condições assépticas»

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕESs lâ» - Processo para a preparação da substância hormso— «sicina que revela rela ti valente às estirpes Arthrobacter crys-tallapoiet.es ftTCC 15481 e Arthrobacter QKydans ATCC 14358 uma concentração inibidora mínima inferior a ®5®i μα/ml5 tenda a hormaomicina provavelmente a estrutura de acordo com a fórmula !

   «Η.Λ V il e5 dentro dos 1 isiites de precisão das medições? as seguintes caracteristicas físicass a) ponto de fusão ióó-168°Cs rotação òptica = 4-v@s8° <c = 0s5jf metanol), c) peso molecular 1129±25 d) tendo em CDC1-. como solvente os sinais “H—NMR um desvio químico S compreendida entre 4-0,5 e --0,7 ppm, relativamsn-te ao tetrametilsilano tomado como padrão interno, caracterizado por a estirpe Strsptomycss griseaflavus DSM 5195 ou uma cultura que possa derivar dessa estirpe, ser cultivada num meio nutriente-adequada e a horraaomicina ser isolada do caldo de cultura»

   2ã» - Processo de acordo com a Reivindicação i? carac-terizado por a estirpe Streptomyces griseoflavus D8M 5195 ou um microrganismo contendo os mesmos genes estruturais dos genes estruturais da referida estirpe que são os responsáveis pela formação da hormaomicina, ser cultivada aerobicamente num meio nutriente aquoso contendo uma fonte de carbono e azoto e sais inorgânicos, e por a hormaomicina ser isolada. 3§n - Processo de acordo com a Reivindicação 1F carac-terizado por se cultivar um microrganismo,! que forma hormaomicina, da espécie Streptomyces griseoflavus» 4ã= — Processo de acordo com s. Reivindicação 1 = carac— terizado por se cultivar a estirpe Strsptomyces griseoflavus DSH 5195 ou um mutante dessa estirpe, que forma hormaomicina. 5-ê,= - Processo de acordo com a Reivindicação 1, carac— terizado por se cultivar a estirpe Streptomyces griseoflavus DSM 5:195 = 6â= - Processo para o subsequente processamento da hormaomicina3 em que se prepara um composto de fórmula III Λ **

   (III) ΐ=/ίΒ QLíS H é hidrogên X \J K J'*Á eiiuUXiu in Ísíí 10ΓOU USB toSl da C OíB μ OS fj 0 TÓlTllLil a I í I ser! que R è hidrogénio, caracteri zado por referido p; rOCSSSO -3 harma ofisicina de fórmula I - to no

   (I) * » ί ser submetida a clivagem da I aciona,, dando assim origem a um composto de fórmula III em que R é hidrogénio ou a um seu sal, e por5 para a preparação ds um composto de fórmula III em que R é alquilo inferior? se esterificar facultativamente o composto ds fórmula III em que R é hidrogénio,, caso seja necessário» depois de se proteger os grupos hidroKi livres com qrupos protsctores facilmente removíveiss s se removerem quaisquer grupos protecto-res, ou para a preparação de um sal se converter o composto de fórmula III em que R ê hidrogénio num sal 5 ou se converter um sal resultante no ácido livre» 7§„ - Processo de acordo com a Reivindicação éP para a preparação de um composto de fórmula III em que R representa metiloj caractericado por se dissolver a hormaomicina em metanol e se tratar com quantidades catalíticas de uma base fraca adequada s se isolar o composto desejado da mistura da reacção» 8â„ - Processo para. a manufactura de preparações farmacêuticas» caracteriçado por um composto obtido de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 7 ser incorporado na referida preparação numa percentagem de 1 a 30%„ 9s = - Método ide utilização ds um composto preparado de acordo com as Reivindicações 1 a 7 para o tratamento terapêutico do corpo humano? caracterizado por se administrar diariamente uma dose de 1ΘΘ a 1ΘΦΦ mg do composto activo» 10 ên - Método de Litili za^-Su de acorda o □dl Θ. HO i, vindi .ca- (” .~itj c -¾í5 C ΐθΓίΖδΰΟ pOí r o refe >rido composto se r usado como I im Xiii.DXdur ds tumores ou como um agente supressor de rsac :çci0s ds imun idade indesej áveis = Liísuoa e |-evsrsirc3 de 1990

   1200 USSOA