JPH02247565A - ペルオキシダーゼ標識ＨＢ↓ｓ抗原複合体、及びこの複合体を用いたＨＢ↓ｓ抗体の検出法 - Google Patents
ペルオキシダーゼ標識ＨＢ↓ｓ抗原複合体、及びこの複合体を用いたＨＢ↓ｓ抗体の検出法Info
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- JPH02247565A JPH02247565A JP6902889A JP6902889A JPH02247565A JP H02247565 A JPH02247565 A JP H02247565A JP 6902889 A JP6902889 A JP 6902889A JP 6902889 A JP6902889 A JP 6902889A JP H02247565 A JPH02247565 A JP H02247565A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ＨＢｓ抗体を酵素免疫測定法により検出する
のに有用なペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体、詳
しくは抗原性の失活を伴なわずに作製される複合体、及
びこの複合体を用いて行うＨＢｓ抗体の検出法に関する
ものである。
のに有用なペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体、詳
しくは抗原性の失活を伴なわずに作製される複合体、及
びこの複合体を用いて行うＨＢｓ抗体の検出法に関する
ものである。
（発明の背景）
Ｂ型肝炎ウィルス（）ＩＢＶ）は二重１１ＤＮＡウイル
スで、血液を介して伝播し、その感染は肝炎と関連する
ことが知られている。ＨＢＶ感染時の患者血液中には直
径４２ｎｍの球状粒子（ｐａｎｅ粒子）と直径２２ｎ■
の小型球状粒子あるいは管状粒子が存在する。
スで、血液を介して伝播し、その感染は肝炎と関連する
ことが知られている。ＨＢＶ感染時の患者血液中には直
径４２ｎｍの球状粒子（ｐａｎｅ粒子）と直径２２ｎ■
の小型球状粒子あるいは管状粒子が存在する。
また抗原性はウィルス表面抗原（ＨＢｓ） 、核抗原（
ＨＢｃ） 、ＨＢｅ抗原に分れ、ＨＢＶの感染を受けた
場合それらの抗原あるいは抗体の出現、消失は臨床経過
のマーカーになり得ることが知られている。例えば）１
８ｇ抗原の血中存在はＨＢＶに現在感染して・いること
を示し、ＨＢｅの存在は多くのＨＢＶの存在を示唆し、
肝炎を発症している場合には活動性肝炎である場合が多
い。
ＨＢｃ） 、ＨＢｅ抗原に分れ、ＨＢＶの感染を受けた
場合それらの抗原あるいは抗体の出現、消失は臨床経過
のマーカーになり得ることが知られている。例えば）１
８ｇ抗原の血中存在はＨＢＶに現在感染して・いること
を示し、ＨＢｅの存在は多くのＨＢＶの存在を示唆し、
肝炎を発症している場合には活動性肝炎である場合が多
い。
なお通常ＨＢｃは血中には存在しないと言われている。
一方、それらの抗原に対する抗体の変動も診断上重要で
ある。
ある。
例えばＨＢｓ抗体の出現は過去にＨＢＶの感染があった
ことを示していると共に、今後再感染が起こらないこと
を示している。 ＨＢｃ抗体の場合は複雑で、ＩｇＭタ
イプのＨＢｃ抗体はＨＢＶの感染初期を意味するが、Ｉ
ｇＧタイプのＨＢｃ抗体の場合は持続感染中であるか感
染終息期であることを示している。またＨＢｅ抗体の出
現はＨＢＶの感染が鎮静化の傾向にあることを意味して
いる。
ことを示していると共に、今後再感染が起こらないこと
を示している。 ＨＢｃ抗体の場合は複雑で、ＩｇＭタ
イプのＨＢｃ抗体はＨＢＶの感染初期を意味するが、Ｉ
ｇＧタイプのＨＢｃ抗体の場合は持続感染中であるか感
染終息期であることを示している。またＨＢｅ抗体の出
現はＨＢＶの感染が鎮静化の傾向にあることを意味して
いる。
従ってＨＢｓ抗体の測定は、上述したようにＨＢＶに感
染した場合、再感染の虞れがないことの確認となり得る
。また近時においてはＨＢＶの感染予防にワクチンの投
与が行なわれているが、このワクチンの投与後における
ＨＢｓ抗体の出現は能動免疫が成立したことを意味し、
今後、ＨＢＶに感染する危険性のないことを示している
。このようにＨＢｓ抗体の測定は、ＨＢＶの自然感染の
有無を知ることやワクチン投与の効果判定に有用である
。
染した場合、再感染の虞れがないことの確認となり得る
。また近時においてはＨＢＶの感染予防にワクチンの投
与が行なわれているが、このワクチンの投与後における
ＨＢｓ抗体の出現は能動免疫が成立したことを意味し、
今後、ＨＢＶに感染する危険性のないことを示している
。このようにＨＢｓ抗体の測定は、ＨＢＶの自然感染の
有無を知ることやワクチン投与の効果判定に有用である
。
（従来の技術）
血液中の抗体を検出する場合には、抗原と抗体の特異的
な反応を利用することが基本であり、古くはマイクロオ
フテルロニー法（ＭＯ法）あるいは−元免疫拡散法（Ｓ
ＲＩＤ法）が用いられていたが、最近は受身血球凝集法
（ＰＨＡ）が広く使われている。しかしこのＰＨＡは感
度が低く非特異的反応が生じ易い半定量反応であるとい
う欠点がある。また近年臨床検査、生化学分析において
、抗原・抗体どうしの免疫反応を利用し、マーカーとし
て酵素を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が−膜化しつ
つある。これは、標識として放射性物質を用いるラジオ
イムノアッセイ（ＲＩ＾）に比べ、危険性がなく、使用
施設の限定がない等の利点があるためである。
な反応を利用することが基本であり、古くはマイクロオ
フテルロニー法（ＭＯ法）あるいは−元免疫拡散法（Ｓ
ＲＩＤ法）が用いられていたが、最近は受身血球凝集法
（ＰＨＡ）が広く使われている。しかしこのＰＨＡは感
度が低く非特異的反応が生じ易い半定量反応であるとい
う欠点がある。また近年臨床検査、生化学分析において
、抗原・抗体どうしの免疫反応を利用し、マーカーとし
て酵素を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が−膜化しつ
つある。これは、標識として放射性物質を用いるラジオ
イムノアッセイ（ＲＩ＾）に比べ、危険性がなく、使用
施設の限定がない等の利点があるためである。
従って、上記ＨＢｓ抗体の検出にＥＩＡを利用しうる。
このＨＢｓ抗体検出ＥＩＡの実施は、例えば酵素免疫測
定法の一つであるサンドイツチ法についてこれを考える
と、精製されたＨＢｓ抗原を不溶性の支持体（例えばマ
イクロタイタープレートのウェル内壁、あるいはビーズ
等）に固定化し、これにＨＢｓ抗体検査の対象サンプル
を分注して免疫反応により［固定化ＨＢｓ抗原−ＨＢｓ
抗体］の結合体を形成させ、これに更に酵素を標識した
ＨＢｓ抗原を加えて免疫反応により［固定化ＨＢｓ抗原
−ＨＢｓ抗体−酵素標識ＨＢｓ抗原］の結合体を生成さ
せ、しかるのち、標識された酵素の活性で分解される基
質の反応を光学的に検出することで測定が行なわれる。
定法の一つであるサンドイツチ法についてこれを考える
と、精製されたＨＢｓ抗原を不溶性の支持体（例えばマ
イクロタイタープレートのウェル内壁、あるいはビーズ
等）に固定化し、これにＨＢｓ抗体検査の対象サンプル
を分注して免疫反応により［固定化ＨＢｓ抗原−ＨＢｓ
抗体］の結合体を形成させ、これに更に酵素を標識した
ＨＢｓ抗原を加えて免疫反応により［固定化ＨＢｓ抗原
−ＨＢｓ抗体−酵素標識ＨＢｓ抗原］の結合体を生成さ
せ、しかるのち、標識された酵素の活性で分解される基
質の反応を光学的に検出することで測定が行なわれる。
ところで抗原や抗体等のタンパク質に酵素を結合させる
ために化学的な処理を行うと、抗原性、あるいは酵素活
性の失活を伴ったり不必要な重合体を生ずる場合がある
。そして上記のようなＨＢｓ抗体検出のＥＩＡ実施に必
要な酵素標識ＨＢｓ抗原の作製法として、従来例えば、
ゲルタールアルデヒド処理又は過ヨーソ酸酸化法（ＮＡ
ＫＡＮＥ法）等の方法が知られている。
ために化学的な処理を行うと、抗原性、あるいは酵素活
性の失活を伴ったり不必要な重合体を生ずる場合がある
。そして上記のようなＨＢｓ抗体検出のＥＩＡ実施に必
要な酵素標識ＨＢｓ抗原の作製法として、従来例えば、
ゲルタールアルデヒド処理又は過ヨーソ酸酸化法（ＮＡ
ＫＡＮＥ法）等の方法が知られている。
（発明が解決しようとする課題）
しかし本発明が対象とするＨＢｓ抗体検出のためにＨＢ
ｓ抗原に酵素を標識させた複合体を作製させるのに、上
記過ヨーソ酸酸化法等の方法を用いる場合には、ＨＢｓ
抗原性の失活及び不均一な複合体を生ずる等の欠点があ
る。
ｓ抗原に酵素を標識させた複合体を作製させるのに、上
記過ヨーソ酸酸化法等の方法を用いる場合には、ＨＢｓ
抗原性の失活及び不均一な複合体を生ずる等の欠点があ
る。
また近年酵素標識タンパク質複合体を作成するのに二価
性架橋試薬を用いることも知られているがこのうちのホ
モ二価性架橋試薬（Ｘ−トＸ）を用いて酵素標識ＨＢｓ
抗原複合体を作製する場合には、ＨＢｓ抗原とペルオキ
シダーゼの他に、ＨＢｓ抗原とＨＢｓ抗原、ペルオキシ
ダーゼとペルオキシダーゼの重合体を生じ易いという問
題がある。
性架橋試薬を用いることも知られているがこのうちのホ
モ二価性架橋試薬（Ｘ−トＸ）を用いて酵素標識ＨＢｓ
抗原複合体を作製する場合には、ＨＢｓ抗原とペルオキ
シダーゼの他に、ＨＢｓ抗原とＨＢｓ抗原、ペルオキシ
ダーゼとペルオキシダーゼの重合体を生じ易いという問
題がある。
これに対し本発明者が種々検討したところによると、特
定のへテロ二価性架橋試薬（Ｘ−Ｒ−Ｙ）を用いて酵素
標識ＨＢｓ抗原複合体を作製した場合には、上記した欠
点がなく、しかもこの酵素標識ＨＢｓ抗原複合体を用い
たＥＩＡが従来法に比べて容易に実施できる特徴のある
ことを見出した。
定のへテロ二価性架橋試薬（Ｘ−Ｒ−Ｙ）を用いて酵素
標識ＨＢｓ抗原複合体を作製した場合には、上記した欠
点がなく、しかもこの酵素標識ＨＢｓ抗原複合体を用い
たＥＩＡが従来法に比べて容易に実施できる特徴のある
ことを見出した。
本発明はこれらの知見からなされたものであり、その目
的は、ＨＢｓ抗体検出のＥＩＡに好適使用できる酵素標
識ＨＢｓ抗原複合体を提供するところにある。
的は、ＨＢｓ抗体検出のＥＩＡに好適使用できる酵素標
識ＨＢｓ抗原複合体を提供するところにある。
また本発明の別の目的は、この酵素標識ＨＢｓ抗原複合
体を用いた簡易なＥＩＡによるＩ（ａｇ抗体を検出する
方法にある。
体を用いた簡易なＥＩＡによるＩ（ａｇ抗体を検出する
方法にある。
（課題を解決するための手段）
これらの目的を実現する本発明の特徴は、代表的にはＮ
−スクシミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン
酸（以下５ＰＤＰと略称する）と、（Ｎ−（ε−マレイ
ミド カプロイロキシ）スクシニミド） （以下ＥＭＣ
Ｓと略称する）のへテロ二価性架橋試薬により、標識酵
素であるペルオキシダーゼをＨＢｓ抗原に結合させたペ
ルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体を提供するところ
にある。
−スクシミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン
酸（以下５ＰＤＰと略称する）と、（Ｎ−（ε−マレイ
ミド カプロイロキシ）スクシニミド） （以下ＥＭＣ
Ｓと略称する）のへテロ二価性架橋試薬により、標識酵
素であるペルオキシダーゼをＨＢｓ抗原に結合させたペ
ルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体を提供するところ
にある。
本発明に用いられる他のへテロ二価性架橋試薬としては
、ＧＭＢＳ：マレイミドブチリルオキシスクシニミド（
Ｎ−（ｙ −ｍａｌｅｌｓｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ
）ｓｕｃｃｌｎｌｍｌｄａ） 、 ＳＭＣＣ：スクシニ
ミヂル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボキシレート（ｓｕｃｃｉｎｉｓｉｄｙｌ ４
−（Ｎ−ｍａｌｅｌｓｌｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏ
ｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ）を例示
できる。
、ＧＭＢＳ：マレイミドブチリルオキシスクシニミド（
Ｎ−（ｙ −ｍａｌｅｌｓｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ
）ｓｕｃｃｌｎｌｍｌｄａ） 、 ＳＭＣＣ：スクシニ
ミヂル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボキシレート（ｓｕｃｃｉｎｉｓｉｄｙｌ ４
−（Ｎ−ｍａｌｅｌｓｌｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏ
ｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ）を例示
できる。
ペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体を用いた酵素免
疫測定法（Ｅ Ｉ Ａ）は、既知の方法に従って行なう
ことができ、例えば上述した二段階方式のサンドイツチ
法の他、マイクロタイタブレート等のウェルの内壁に抗
原を固定化し、サンプルと同時に上記複合体を分注する
所謂−段階方式のサンドイツチ法によって、あるいはペ
ルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体の乾燥品（凍結乾
燥品等）をウェル内に予め填加したものを準備しておい
て、これに）ＩＱｇ抗体検査対象のサンプルを分注する
方法によってもＥＩＡを実施することができる。特に本
発明におけるペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体を
用いた場合にこの一段階方式のサンドイツチ法により、
有効なＨＢｓ抗体のスクリーニングが可能となったこと
は実際の１（ａｓ抗体検出の業務において極めて有用な
効果をもたらす特徴がある。
疫測定法（Ｅ Ｉ Ａ）は、既知の方法に従って行なう
ことができ、例えば上述した二段階方式のサンドイツチ
法の他、マイクロタイタブレート等のウェルの内壁に抗
原を固定化し、サンプルと同時に上記複合体を分注する
所謂−段階方式のサンドイツチ法によって、あるいはペ
ルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体の乾燥品（凍結乾
燥品等）をウェル内に予め填加したものを準備しておい
て、これに）ＩＱｇ抗体検査対象のサンプルを分注する
方法によってもＥＩＡを実施することができる。特に本
発明におけるペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体を
用いた場合にこの一段階方式のサンドイツチ法により、
有効なＨＢｓ抗体のスクリーニングが可能となったこと
は実際の１（ａｓ抗体検出の業務において極めて有用な
効果をもたらす特徴がある。
（効果）
本発明は前記の構成をなすことによって、ペルオキシダ
ーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体が、ＨＢｓ抗原の抗原性を損
なうことなく抗原抗体反応の高い特異性を発揮させて、
感度の高いＨＢｓ抗体の検出を行なうことができる効果
がある。
ーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体が、ＨＢｓ抗原の抗原性を損
なうことなく抗原抗体反応の高い特異性を発揮させて、
感度の高いＨＢｓ抗体の検出を行なうことができる効果
がある。
また本発明のペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体を
用いることで、ＥＩＡ特に−段階方式の簡便なＥＩＡを
可能とし、大量のサンプルについてのＨＢｓ抗体の検出
を精度高く能率よく行なうことができるという効果があ
る。
用いることで、ＥＩＡ特に−段階方式の簡便なＥＩＡを
可能とし、大量のサンプルについてのＨＢｓ抗体の検出
を精度高く能率よく行なうことができるという効果があ
る。
（実施例）
以下本発明を図面に示す実施例に基づいて説明する。
実施例１
■と五亙旦■１
）Ｉｎｓ抗原陽性プール血清を、６０ｔ、 １０時間加
熱処理した後、ショ糖密度勾配遠心にてＨＢｓ抗原分画
を得、次いでＯ，ＯＳ％ホルマリンにより３７℃、９６
時間処理し精製８８ｇ抗原とした。
熱処理した後、ショ糖密度勾配遠心にてＨＢｓ抗原分画
を得、次いでＯ，ＯＳ％ホルマリンにより３７℃、９６
時間処理し精製８８ｇ抗原とした。
ペルオキシダーゼ ＨＢｓ ム の（マレイミ
ド化ＨＢｓ抗原の調製） ０．１Ｍリン酸＆ｌ衝液ＰＨ７，０に溶解したＨＢｓ抗
原ｌＯ■ｇ／■１に、 Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ＾）で溶解した（Ｎ−（ε−マレイミド カプ
ロイロキシ）スクシニミド） （ＥＭＣ５） （同位化
学研究所製）を１００μｇ／鳳ｇＨＢｓとなるように加
え、３０℃、３０分インキエベートした。
ド化ＨＢｓ抗原の調製） ０．１Ｍリン酸＆ｌ衝液ＰＨ７，０に溶解したＨＢｓ抗
原ｌＯ■ｇ／■１に、 Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ＾）で溶解した（Ｎ−（ε−マレイミド カプ
ロイロキシ）スクシニミド） （ＥＭＣ５） （同位化
学研究所製）を１００μｇ／鳳ｇＨＢｓとなるように加
え、３０℃、３０分インキエベートした。
反応後、セファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）
５０鳳１カラムにてゲルー過し、セントリコン３０（ア
ミコン社製）で濃縮し１ ｔａｌｌとした。
５０鳳１カラムにてゲルー過し、セントリコン３０（ア
ミコン社製）で濃縮し１ ｔａｌｌとした。
（ＳＨ化ペルオキシダーゼの調製）
０．１Ｍリン酸ｍ衝液、 ｐＨ７，０で溶解した西洋ワ
サビペルオキシダーゼ１ ■ｌに、ＤＭＦＡ（ジメチル
フォルムアミド）で溶解したＮ−スクシミジル３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ） （ファ
ルマシア社製）をモル比で１：５０になるように加え、
３０℃、３０分インキエベートした０反応後、セフ１デ
ックスＧ−５０，５０麿１カラムにてゲル２通し、セン
トリコン３０で濃縮し１ 膳１とした。
サビペルオキシダーゼ１ ■ｌに、ＤＭＦＡ（ジメチル
フォルムアミド）で溶解したＮ−スクシミジル３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ） （ファ
ルマシア社製）をモル比で１：５０になるように加え、
３０℃、３０分インキエベートした０反応後、セフ１デ
ックスＧ−５０，５０麿１カラムにてゲル２通し、セン
トリコン３０で濃縮し１ 膳１とした。
更にこれを最終濃度５０膳Ｍとなるようにジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）を加え、３０℃、 ３０分処理した後
、再びセファデックスＧ−５Ｇでゲル２通してペルオキ
シダーゼ標識用の８８ｇ抗原を得た。
トール（ＤＴＴ）を加え、３０℃、 ３０分処理した後
、再びセファデックスＧ−５Ｇでゲル２通してペルオキ
シダーゼ標識用の８８ｇ抗原を得た。
（カップリング）
作製したマレイミド化ＨＢｓ抗原１ ｍｆＬとＳＨ化
ペルオキシダーゼ１ ■１を濃度比１：１で混合し、３
０℃、２時間インキュベートした。
ペルオキシダーゼ１ ■１を濃度比１：１で混合し、３
０℃、２時間インキュベートした。
反応後、未反応のペルオキシダーゼを除去するためにセ
ファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）によりゲル
２通し、ペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原を得た。
ファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）によりゲル
２通し、ペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原を得た。
肱１里二里１進
精製ＨＢｓ抗原を０．１Ｍ炭酸Ｍ衝液（ｐＨ９，５）で
２μｇ／ｍｆＬの濃度に調製し、９６ウエルマイクロプ
レート（タンク社製）５０μｍウェルづつ分注し、４℃
、−晩装置した。このプレートを蒸留水で洗浄し、２％
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を２００μＩｔ／ウェ
ル分注し、３７℃、２時間ブロックした。その後、ＢＳ
Ａ溶液を取り除き、３７℃、２時間乾燥した。
２μｇ／ｍｆＬの濃度に調製し、９６ウエルマイクロプ
レート（タンク社製）５０μｍウェルづつ分注し、４℃
、−晩装置した。このプレートを蒸留水で洗浄し、２％
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を２００μＩｔ／ウェ
ル分注し、３７℃、２時間ブロックした。その後、ＢＳ
Ａ溶液を取り除き、３７℃、２時間乾燥した。
ＨＢｓ の 出
作製したＨＢｓ抗原プレートのウェルに、検体（血清）
５０μｍと、ベルオ￥シダーゼ標識抗原５０μｍを同時
に加え、３７℃、２時間インキュベート（試験Ｎｏｔ）
、これを−昼夜放置（試験Ｎ０２）％ また上記８８ｇ
抗原プレートのウェルに検体（血清）５０μｍを分注し
て３７℃、２時間インキュベートした後、ペルオキシダ
ーゼ標識抗原５０μＬを加えた（試験Ｎｏ３）の各偶を
作成した。
５０μｍと、ベルオ￥シダーゼ標識抗原５０μｍを同時
に加え、３７℃、２時間インキュベート（試験Ｎｏｔ）
、これを−昼夜放置（試験Ｎ０２）％ また上記８８ｇ
抗原プレートのウェルに検体（血清）５０μｍを分注し
て３７℃、２時間インキュベートした後、ペルオキシダ
ーゼ標識抗原５０μＬを加えた（試験Ｎｏ３）の各偶を
作成した。
次に各偶のプレートを蒸留水で３〜５回洗浄し、よく水
分を取り除いた後、次の呈色反応を行なワた。すなわち
、基質溶液（０−）エコレンジアミン２ Ｂ／ｍｕ！
、過酸化水素水０．０３％、クエン酸緩衝液）１００μ
ｍを各ウェルに加え、室温で３０分インキエベートした
。その後、４Ｎ硫酸を１００μｍづつ各ウェルに加えて
反応を停止させ、４９０ｎ■の吸光度をマイクロプレー
トリーダーで測定した。
分を取り除いた後、次の呈色反応を行なワた。すなわち
、基質溶液（０−）エコレンジアミン２ Ｂ／ｍｕ！
、過酸化水素水０．０３％、クエン酸緩衝液）１００μ
ｍを各ウェルに加え、室温で３０分インキエベートした
。その後、４Ｎ硫酸を１００μｍづつ各ウェルに加えて
反応を停止させ、４９０ｎ■の吸光度をマイクロプレー
トリーダーで測定した。
毘頂
（感度）
上記の方法でＨＢｓ抗体の検量線を作成し、その結果よ
り最低検出濃度２発色度を第１図に示した。
り最低検出濃度２発色度を第１図に示した。
また比較のために市販のアボット社製ＥＩＡキット（ビ
オチン化ＨＢｓ抗原と、アビジン−酵素の複合体とを使
用時に混合して使用する２ステップ方式）を用いた比較
例１、特殊免疫研究所社製イムニスＥＩＡキット（２ス
テップ方式）を用いた比較例２で夫々ＨＢｓ抗体を測定
し、その結果を第１図に併記した。
オチン化ＨＢｓ抗原と、アビジン−酵素の複合体とを使
用時に混合して使用する２ステップ方式）を用いた比較
例１、特殊免疫研究所社製イムニスＥＩＡキット（２ス
テップ方式）を用いた比較例２で夫々ＨＢｓ抗体を測定
し、その結果を第１図に併記した。
この結果から分るように、本例のペルオキシダーゼ標識
ＨＢｓ抗原複合体を用いたＥＩＡによれば、試験Ｎｏ２
．３は勿論のこと、抗原−抗体−抗原の反応を一段階で
行った例においても、反応自体は２時間で済むという短
時間処理でありながら、比較例１．２に比べて同等ない
しより高い感度を示す効果が確認され、ＥＩＡの特異性
、感度に全く問題はなかった。
ＨＢｓ抗原複合体を用いたＥＩＡによれば、試験Ｎｏ２
．３は勿論のこと、抗原−抗体−抗原の反応を一段階で
行った例においても、反応自体は２時間で済むという短
時間処理でありながら、比較例１．２に比べて同等ない
しより高い感度を示す効果が確認され、ＥＩＡの特異性
、感度に全く問題はなかった。
（再現性、特異性）
上記実施例についての同時再現性と日差再現性を検討し
た。同時再現性はＨＢｓ抗体陽性血清を同時に１０回測
定し、又日差再現性は同一のＨＢｓ抗体陽性血清を測定
日を変えて５回測定し、そのバラツキを変動係数（Ｃｏ
ａｉ’ｆｉｃｉｅｎｔｏｆ ｖａｒｌａｔｌｏｎ ：
ＣＶ値）で検討した。同様に上記比較例！、２０市販キ
ットについても行なった、その結果、同時再現性は本発
明（ＣＶ−３，６％）、比較例１ （ＣＶ−７，９１％
）、比較例２（ＣＶ−５，４％）、日差再現性は本発明
（ＣＶ＝８．５％）、比較例１ （ＣＶ−９，０％）。
た。同時再現性はＨＢｓ抗体陽性血清を同時に１０回測
定し、又日差再現性は同一のＨＢｓ抗体陽性血清を測定
日を変えて５回測定し、そのバラツキを変動係数（Ｃｏ
ａｉ’ｆｉｃｉｅｎｔｏｆ ｖａｒｌａｔｌｏｎ ：
ＣＶ値）で検討した。同様に上記比較例！、２０市販キ
ットについても行なった、その結果、同時再現性は本発
明（ＣＶ−３，６％）、比較例１ （ＣＶ−７，９１％
）、比較例２（ＣＶ−５，４％）、日差再現性は本発明
（ＣＶ＝８．５％）、比較例１ （ＣＶ−９，０％）。
比較例２ （ＣＶ、−２３，７％）であった。
以上のように本発明は各比較例１及び２と同等ないしそ
れ以上の優れた結果を得た。
れ以上の優れた結果を得た。
また特異性を確認するためにＨＢｓ抗原陰性血清９０検
体につき上記測定を行った。
体につき上記測定を行った。
その結果によると、上記実施例による結果では３３検体
が陽性と判定され、残り５７検体は陰性であった。この
陽性検体の確認試験を以下の方法で実施した。
が陽性と判定され、残り５７検体は陰性であった。この
陽性検体の確認試験を以下の方法で実施した。
予め陽性検体５０μｍにＨＢｓ抗原陽性血清５０μｍを
、３７度、１時間インキエベートし、その５０μｍを前
述のＨＢｓ抗体検出系で測定した。対照として陽性抗体
をＨＢｓ抗原・抗体陰性血清で処理した。その結果、対
照は陰性化しなかったが、陽性と判定された３３検体は
陰性となったことによりＨＢｓ抗体陽性であることが確
認された。
、３７度、１時間インキエベートし、その５０μｍを前
述のＨＢｓ抗体検出系で測定した。対照として陽性抗体
をＨＢｓ抗原・抗体陰性血清で処理した。その結果、対
照は陰性化しなかったが、陽性と判定された３３検体は
陰性となったことによりＨＢｓ抗体陽性であることが確
認された。
従ってこの結果から上記実施例による免疫反応では非特
異的な反応は生じないものと結論された。
異的な反応は生じないものと結論された。
なお本発明のペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原標識複合
体を、まず固定化抗原と検体（血清）の免疫反応を行な
わせ、洗浄した後に、ウェル内に加える所謂二段階方式
の反応に供した場合には反応時間が上記−段階方式の場
合に比べて約２倍となるが、感度、再現性は一層向上さ
れる特徴がある。したがって−段階方式の測定によりＨ
Ｂｓ抗体検出を行って擬陽性［±］の測定結果が現われ
たものにつき二段階方式の測定を行なうようにすれば、
サンプルに対して効率がよくかつ精度の高いＨＢｓ抗体
検出がで籾る。更に一昼夜放置する長時間法によれば測
定結果は一層改善された。
体を、まず固定化抗原と検体（血清）の免疫反応を行な
わせ、洗浄した後に、ウェル内に加える所謂二段階方式
の反応に供した場合には反応時間が上記−段階方式の場
合に比べて約２倍となるが、感度、再現性は一層向上さ
れる特徴がある。したがって−段階方式の測定によりＨ
Ｂｓ抗体検出を行って擬陽性［±］の測定結果が現われ
たものにつき二段階方式の測定を行なうようにすれば、
サンプルに対して効率がよくかつ精度の高いＨＢｓ抗体
検出がで籾る。更に一昼夜放置する長時間法によれば測
定結果は一層改善された。
実施例２
上記実施例１で作製したＨＢｓ抗原固相化マイクロプレ
ートの各ウェルに、同様に実施例１で作製したペルオキ
シダーゼ標識）ＩＢｇ抗原複合体に安定剤としてグルコ
ース（最終濃度２．５％）を加えた溶液を５０μｍ分注
し、これを凍結乾燥した。
ートの各ウェルに、同様に実施例１で作製したペルオキ
シダーゼ標識）ＩＢｇ抗原複合体に安定剤としてグルコ
ース（最終濃度２．５％）を加えた溶液を５０μｍ分注
し、これを凍結乾燥した。
上記により準備されたマイクロプレートの各ウェルに、
検体を５０μｍ分注して２時間、３７℃インキエベート
し、蒸留水により十分洗浄した後、前述と同様の基買呈
色反応を行なった。
検体を５０μｍ分注して２時間、３７℃インキエベート
し、蒸留水により十分洗浄した後、前述と同様の基買呈
色反応を行なった。
その結果は第２図に示した通りであり、実施例１の結果
に比べて若干発色が劣るものの、ＨＢｓ抗体検出測定に
十分なものであった。
に比べて若干発色が劣るものの、ＨＢｓ抗体検出測定に
十分なものであった。
なお上記ペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体の乾燥
時に加える安定剤としては、上記グルコースの他にマン
ニトール、キシリトール。
時に加える安定剤としては、上記グルコースの他にマン
ニトール、キシリトール。
シェークロース等を用いることもできる。
図面第１図は本発明よりなるＥＩＡを用いた各種測定法
における検量線を比較例と対比して示した図、第２図は
グルコースを前もって加えて凍結乾燥して標識抗原を用
いた場合のＥＩＡ測定の結果を、グルコースを添加しな
い場合と対比して示した図である。 他４名 第 図 第 ↑ （０，１１，Ｕｌ 希釈倍率（２″１ 図
における検量線を比較例と対比して示した図、第２図は
グルコースを前もって加えて凍結乾燥して標識抗原を用
いた場合のＥＩＡ測定の結果を、グルコースを添加しな
い場合と対比して示した図である。 他４名 第 図 第 ↑ （０，１１，Ｕｌ 希釈倍率（２″１ 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヘテロ二価性架橋体により、ペルオキシダーゼをＨ
Ｂｓ抗原に結合させたペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原
複合体。 ２ ヘテロ二価性架橋体がＮ−スクシミジル３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオン酸及び｛Ｎ−（ε−マレイ
ミドカプロイロキシ）スクシニミド｝であることを特徴
とする請求項１に記載のペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗
原複合体。 ３ 請求項１又は２に記載のペルオキシダーゼ標識ＨＢ
ｓ抗原複合体を用いて酵素免疫測定法によりＨＢｓ抗体
を検出することを特徴とするＨＢｓ抗体の検出法。 ４ 固定化ＨＢｓ抗原を有し、かつ請求項１又は２に記
載のペルオキシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体の乾燥物を
予め填加したウェル内に、 ＨＢｓ抗体検査の対象サンプルを分注することを特徴と
する請求項３に記載のＨＢｓ抗体の検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6902889A JPH02247565A (ja) | 1989-03-20 | 1989-03-20 | ペルオキシダーゼ標識ＨＢ↓ｓ抗原複合体、及びこの複合体を用いたＨＢ↓ｓ抗体の検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6902889A JPH02247565A (ja) | 1989-03-20 | 1989-03-20 | ペルオキシダーゼ標識ＨＢ↓ｓ抗原複合体、及びこの複合体を用いたＨＢ↓ｓ抗体の検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02247565A true JPH02247565A (ja) | 1990-10-03 |
Family
ID=13390720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6902889A Pending JPH02247565A (ja) | 1989-03-20 | 1989-03-20 | ペルオキシダーゼ標識ＨＢ↓ｓ抗原複合体、及びこの複合体を用いたＨＢ↓ｓ抗体の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02247565A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5639627A (en) * | 1993-02-04 | 1997-06-17 | Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for assaying specific antibody |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58149700A (ja) * | 1982-03-02 | 1983-09-06 | Takeda Chem Ind Ltd | ペルオキシダ−ゼ含有複合体，その製造法および試薬 |
| JPS6144356A (ja) * | 1984-07-16 | 1986-03-04 | アボツト ラボラトリ−ズ | Ｂ型肝炎に対する共通決定因子抗体の検出のための免疫決定法 |
-
1989
- 1989-03-20 JP JP6902889A patent/JPH02247565A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58149700A (ja) * | 1982-03-02 | 1983-09-06 | Takeda Chem Ind Ltd | ペルオキシダ−ゼ含有複合体，その製造法および試薬 |
| JPS6144356A (ja) * | 1984-07-16 | 1986-03-04 | アボツト ラボラトリ−ズ | Ｂ型肝炎に対する共通決定因子抗体の検出のための免疫決定法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5639627A (en) * | 1993-02-04 | 1997-06-17 | Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for assaying specific antibody |
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