JPH02258706A - 殺虫剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）　発明の目的 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（１３ａｃｉ
ＬＩｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｊｅｎｓｉｓ：以下ＢＴ菌と
１．＝５）の産生ずる結晶毒素を有効、成分としＢＴ醒
細胞及び芽胞を含有しない鱗翅目昆虫等に対して有効な
殺虫剤（以下ＢＴ農薬という〕を製造する方法に関する
もので、農薬業界及び農業の分野で広く利用される吃の
である。

〔従来の技術〕

ＢＴ菌の産生ずる結晶毒素は、鱗翅目昆虫等に対して強
力な殺虫作用を示し、しかも、人畜魚介類に対して、無
害であることから。

バイオ農薬として実用化されている。

一般に、ＢＴ農薬は結晶毒素の他に、自己再生のための
生命体である胞子（芽胞とも言う）を含んでおり、自然
界において、そのままの状態で散布されると、胞子が発
芽し、さらにはＢＴ菌の増殖が生じ、蚕に薬害を与える
恐れがあシ、国内の養蚕業保護の立場から。

胞子の二次増殖のないＢＴ農薬が求められている。

この課題を解決するために、結晶毒素を含有するＢＴ菌
の培養液内の細菌細胞・芽胞に対して、該結晶毒素の殺
虫能を喪失せしめることなく、細菌細胞・芽胞ケ殺滅し
得る如き緩徐な化学的殺菌処理と同じく緩徐な物理的殺
菌処理を組合せ、それらを同時に行なうことを特徴とす
る殺虫剤の製造法が提案されている（特公昭５１−５０
４７号公報）。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記の方法は、＃ｌ菌細胞・芽胞の殺滅方法としては優
れているものであシ、実用化されている方法であるが、
該方法で得られた結晶毒素は、殺菌処理により、実用的
な濃度（ＢＴ濃薬は一般にコナガに対して１．０００乃
至２，０００倍の製剤水懸濁液とし、て用いられる）に
おける残存殺虫活性が低下したものとなり易く、細菌細
胞・芽胞の殺滅を完全に行なう場合、時によってはこれ
をかなυの高濃度で使用しなければ充分な殺虫性能を示
さない殺虫剤しか得られない事があるという問題点を有
する方法である。

本発明者等は、上記方法における細菌細胞・芽胞の殺滅
の効率を向上させ、品質の優れた製品が得られる製造方
法を確立すべく鋭意検討を行なった。

（ロ）　発明の構成 〔課題を解決するための手段〕 本発明者等は、前記問題点を解消するための検討過程に
おいて、培養液中に存在する水溶性成分が細菌細胞・芽
胞の殺滅効率を低下させ、ひいては結晶毒素の殺虫活性
を低下させることを見出し、培養液の殺菌前に水溶性成
分を除去することにより、実用に供し得る殺虫剤を製造
するに足る殺虫活性を有する結晶毒素が安定的に得られ
るばかりでなく、殺虫活性の飛躍的に向上した結晶毒素
が得られることを見出し１本発明を完成した。

すなわち、本発明はバチルス・チューリンゲンシスの産
生した結晶毒素を含有する培養液の殺菌を培養液中に存
在する水溶性成分の除去分離工程後に実施することを特
徴とする殺虫剤の製造方法に関するものである。

０結晶毒素を含有する培養液 本発明において殺虫剤の原料となる結晶毒素を含有する
培養液は、結晶毒素を産生ずるＢＴ菌、例えばバチルス
・チューリンゲンシス・バリエタス・クルスタキＨＤ−
１（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　ｌ　ｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉｓ　ｖａｒ　ｋｕｒｓｔａｋｉ　ＨＤ−１）等を公知
の培養方法及び条件で培養して得られるものである。

本発明において用いられるＢＴ菌としては公知のものの
いずれでもよく、培養方法及び条件は具体的に説明する
と以下のとおりである。

ＢＴ醒は５窒素源、炭素源、ミネラルおよびビタミンに
富む天然培地を使用して培養することができるが、結晶
毒素ならびに菌体の産生は１通気攪拌条件に大きく左右
されるので、充分な好気的条件で培養することが好まし
く、それにより両者の産生量を増すことができる。培養
温度は、約２５〜３０℃、培養日数は２〜４日間でよい
。炭素源としては、例えば、蔗糖、麦芽糖、グルコース
、７ラクトース、塘密が利用され、窒素源としては、例
えば、コーンスチープリカー、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、綿実粉、酵母エキス、大豆粉、カゼイン
氷解物などが挙げられる。また、ミネラルおよびビタミ
ンは、精密、コーンスチープリカー、酵母エキスで代用
することができ、必要に応じては、無機塩類、ビタミン
類をさらに添加してもよい。特に、大量生産を行う場合
は、深部通気攪拌培上記の様にして培養した培養液中Ｋ
Ｉｆｉ、、培地に起因する成分、ＢＴＩｉｉが菌体外に
排出した代謝物あるいは菌体内に含有され、自己融解後
に培養液中に放出された代謝産物等の水溶性成分が存在
し、本発明者等は、これらのうちのどの成分であるかＫ
ついては解明していないが、これらの水溶性成分の存在
により殺菌の効率が低下し、このまま、すなわち水溶性
成分の存在下に完全に殺菌するためには殺菌条件をかな
シ厳しいものとせざるを得す。

ひいては結晶毒素の殺虫活性を低下させることを見出し
、本発明を完成したものである。

殺菌前に水溶性成分を除去することにより、実用的濃度
で有効的な殺虫剤を製造することが可能になるばかりで
なく、水溶性成分の除會′ 去の程夏によっては、今ま　予測することも出来なかっ
た程の殺虫活性を有する殺虫剤の製造を可能圧するもの
である。

芽胞及び結晶毒素が形成された培養終了液（培養の進行
状態は、位相差顕微鏡で容易に追跡できるン中の水溶性
成分を除く方法としては１通常の遠心分離法、ｒ適法、
沈降法などを利用して水溶液を除去する方法があげられ
る。特に、大量に処理する場合には、遠心分離機あるい
は膜１過材を使用する方法が好ましい。また、水溶性成
分の除去量は、前者の場合、遠心力（重力加速度）、通
液インターバル、洗浄インターバル等の操作条件により
、後者の場合、膜の孔径、圧力１通液速度等の操作条件
により異なるが、除去量が多すぎて芽胞及び結晶毒素の
分散性が阻害される様になることは避けるのが好ましく
、もし分ましい。

Ｏ殺菌 本発明における殺菌は、細菌細胞・芽胞を殺滅するため
に行われるものでありで、下記のような化学的殺菌処理
及び物理的殺菌処理方法があシ、前掲の特公昭５１−５
０４７号公報に提案されているように、単に一種類の殺
菌処理のみでは、結晶毒素の殺虫活性を低下させずに、
＃ｌ菌細胞・芽胞を完全に死滅させることは困難である
から１本発明においても緩徐な化学的殺菌処理と物理的
殺菌処理とを組合せて、それらを同時に行うことが好ま
しく、その方法により容易に細菌細胞・芽胞を完全に死
滅させることができ、殺虫能の優れた産業上極めて有用
な殺虫剤を得ることができる。

Ｑ化学的殺菌処理 化学的殺菌処理方法は、ホルマリン、パラトルエンスル
ホンクロルアミドナトリウム、パラトルエンスルホン酸
ジクロルアミド、アゾビスクロロホルムアミジン、アク
リフジビン、メチレンブルー、塩化ベンザルコニウム、
塩化セチルピリジニウムなどの薬剤を上述の培養液に適
量加え殺菌する方法である。

Ｏ物理的殺菌処理 物理的殺菌処理方法は、加熱、超音波、放射線などによ
り、上述の培養液を殺菌する方法である。

０殺虫活性の測定法 結晶毒素の殺虫活性を定量的に把握する方法としては、
コナガを用いた殺虫試験により半数致死濃度を求め、残
存殺虫活性を定量的に測定するという方法を採用した。

すなわち。

適当に希釈した試料液夫々に対する検定供試昆虫の死亡
率を測定し、試料液の濃度と死亡率との関係から半数致
死濃度を求め殺虫活性の高低を比較する方法である。

０調剤 ＢＴ菌の培養液から水溶性成分を除いた後に、上述の殺
菌処理を行い、必要に応じて。

固液分離、精製を行うことで、結晶毒素な有する死滅し
た芽胞から成る殺虫剤が得られる。

かかる殺虫剤は１通常、公知の方法で粉剤としたυ。あ
るいｆｉ浴剤に懸濁させて製剤とすることが出来る。

そして、その有効成分量は、対象昆虫罠よって異なるが
、通常公知の範囲で用いられ、また他の殺虫剤などと併
用されてもさしつかえない。

〔作用〕

どの水溶性成分が殺菌効率を低下させているのかは不明
であるが、水溶性成分を培養液より除くことによって、
培養液の殺菌処理をより緩徐（例えば、化学殺菌剤の使
用量が軽減する）にすることが可能で、結晶毒素の殺虫
活性の低下を防止できるばかりでなく、従来の方法では
予測できないほど殺虫活性を飛躍的に高めることができ
るという作用を本発明は奏するものである。

〔実施例〕

以下実施例を用いて、更に詳細に本発明を説明する。

実施例１．（培養液上澄部分の一部を水で置換した場合
：ホルマリン使用） バチルス・チューリンゲンシス健バリエタス・クルスタ
キＨＤ　−１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓｖａｒ　ｋｕｒｓｔａｋｉ　ＨＤ−１）を坂ロ
フラスコ中のＣ培地℃、３日間振盪培養する。６日培養
後の培養液を卓上型遠心分離機（１４０００ｒｐｍ、４
℃。

１０分間）を用いて遠心分離し、上澄（水溶液）部分を
デカンテーションにより、回収する。その際、得られた
上澄の容量を測定しておく。つぎに、この培養液上澄部
分の一部を水で置換（１００チ、９０％、８０％、６０
％、４０％。

２０％、０％）した液をそれぞれ作製し、遠心分離後に
得られた土間容量分だけ、遠心管中の残渣にもどし、再
分散させる。その際、攪拌欅による分散に続き、超音波
処理（出力４０Ｗ。

Ｂ）（、ＡＮＳＯＮ　５ＯＮＩＦＩＥＲ４５０超音波発
生装置な使用：試料を氷水中で冷却しながら、照射６０
秒・休止３０秒のインタバルで計５分間）を′施した。

このようにして、培養液上澄部分の一部ないし、すべて
を水で置換し、再分散させた種々の調製液（細菌細胞・
芽胞・結晶毒素の量は同じで、水溶性成分の量が異なる
）５１づつを試験管に分注し、これにホルマリン各濃度
液５−を添加混合し、混合液中のホルマリン濃度を０．
１％〜１、０　％の範囲で０．１％刻みの水準となるよ
うにし５これを７０℃に１０分間加熱した後、室温に冷
却し、１４０００ｒｐｍ・１０分間遠心し、上清液をす
て沈降物に無菌水１０ゴを加えて。

再び懸濁し、さらに遠心以降の操作を繰り返す。

つぎに無菌水に懸濁した最終液について、生残細胞・芽
胞数及び残存殺虫活性を測定する（測定法は以下のとお
り）。

生残細胞・芽胞数測定 試料液１１１１１を採り、無菌水にて適宜希釈し、Ｎｕ
ｔｒｉｅｎｔ　−Ｂｒｏｔｈ−寒天培地（肉エキス１％
。

ポリペプトン１チ、塩化ナトリウム０．５　％　、寒天
１．５％：ｐＨ７，０）上に流し、３０℃にて４８時間
培養し、発生するコロニー数を数えて、これより試料中
の生残芽胞数（ケ／罰）を計算が０ケ／１となるホルマ
リンの混合液中濃度の最小値（細菌細胞・芽胞を完全に
死滅させる臨界濃度に相当する）と同処理液の残存殺虫
活性を表１に示す。

試料厚を無菌水にて適宜希釈し、５ないし、７濃度段階
の検定液を５０＋ｕｌずつ用意する。この検定液にキャ
ベツ生葉（２００ｃｄ）を１分間浸漬した後、風乾する
。これを大型シャーレに敷き、各区（＃度区）２０頭の
コナガ３令幼虫を放飼し、７２時間後に死生数を数え、
死亡率（％）を算出する。この結果をフイニー（）’１
ｎｎｅｙ）の図解法（ｐｉｎｎｅｙ、Ｄ、　Ｊ、（１９
４７）　ｐｒｏｂｉｔ　Ａｌ′１ａｌｙｓｉｓ。

Ｃａｍｂｒｉａｇｅ　Ｕｎｉｖ、Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ　（Ｌｏｒｄａｎ）。

３１８　ｐｐ）を用いて解析し、半数致死ｎ度（検定液
に含有する試料液の濃度（ｐｐｍ〕として表示する）を
求める。

培養液上澄部分の一部な（化すべてを水で置換した調製
液を当該処理で殺菌し、生残芽胞数き、残存殺虫活性も
増大することが示された。

また、その置換の割合は８０％以上でほぼ一定の結果を
与えた。

実施例２　（培養液上澄部分の一部を水で置換しり場合
：パラトルエンスルホンクロルア定ドナ胞・結晶毒素の
＠濁液（培養液上澄部分の一部ないしすべてを水で置換
し、再分散させたものン５１づつを試験管に分注し、こ
れにパラトルエンスルホンクロル了ミドナトリウムの各
＃度の水溶液５就を添加混合し、混合液中のパラトルエ
ンスルホンクロルアミ）”−）−）ｊｌム［ｔｆＯ７０
３％〜０．１チの範囲でｏ、ｏ１ｓ刻みの水準懸濁し、
これについて生残細胞・芽胞数及び残存殺虫活性を測定
した。この結果を表２に示す。

＼ 操作して、バラトルエン７スルホンクロルアミドナトリ
ウムを除去した沈降物を集め、無菌水に上表２において
も、培養液上管部分を水で置換することにより、混合液
中パラトルエンスルホンクロルアミドナトリウム濃度を
軽減でき、残存殺虫活性が増大することが認められた。

また、その置換の割合は９０チ以上でほぼ一定の結果を
与えた。

以上、実施例１．２から明らかな通り、培養中の水溶性
成分を除くことで、殺菌用の化学薬品の濃度を軽減でき
、その結果として、残存殺虫活性が増大する（表１．２
では、ＬＣ，ｏの低下に相当する）ことが確認できたが
、実際の工業生産を想定した場合、−旦、遠心分離した
沈澱物（細菌細胞・芽胞・結晶毒素からなる）を水もし
くは電澄を用いて、もとの培養液レベルに戻して、殺菌
処理を行うことは、必ずしも得策とは言えない。

そこで２殺菌処理後の液の分離・濃縮の負担を軽減する
ためＫ、培養液中の水溶性成分を除いた粘養液濃縮物に
ついて殺菌処理を試みた。

実施例６ 実施例１と同様に調製した培養液０．８ｔを日立連続遠
心分離用ローター（容２１１）に入れ、回転数を種々変
えて（重力加速度１．０００ｘ、ｐ−７，ＱＯＯＸｇ）
回分遠心分離（４℃、１０分間）を行う。遠心終了後、
沈澱部をまき込まないように注意深く、上清部分をとり
除き、水溶性成分の除去割合（濃縮比率：Ｘｌ、Ｘ２゜
超音波処理を施す。

この処理液５ｄづつを試験管に分注し、これにホルマリ
ン各濃度液５１Ｒ１を添加混合し、混合液中のホルマリ
ン濃度を適宜５設定したものを７０℃１０分間加熱した
後、実施例１と同様に操作してホルマリンを除去した沈
降物を集め、無菌水に懸濁し、これについて生残細胞・
芽胞数及び残存殺虫活性を測定した。生残芽胞数が０ケ
／ｎｉｌとなる混合液中のホルマリン濃度の最小値と開
成の残存殺虫活性を表３に示す。

表６から明らかなように、培養液からの水溶性成分の除
去割合の増大割合に応じて、細菌細胞・芽胞を完全に殺
滅するのに必要なホルマリン量（臨界濃度）の増加割合
は小さくなり、ゆえに培養固形分換算のホルマリン使用
量（混合液中のホルマリン臨界濃度／混合液中の固形分
濃度）の値を軽減でき、その結果として、培養固形分（
農薬本体となる）あたシの残存殺虫活性を飛躍ＩＴｈＫ
高めることが可能となった。また、水溶性成分の除去割
合、すなわち培養液の濃縮比率は、培養固形分換算の残
存殺虫活性が変化しなくなる１０倍以上になるようにす
るのが望ましいが、濃縮された培養液中の固形分濃度が
１５チを越えると、液の粘稠性が著しく増大し、流動性
を失う恐れがあるので、とくに濃縮液中の培養固形分濃
度を４〜１５チの範囲に調整することが望ましい。表３
には記載していないが、濃縮液中の培養固形分濃度が１
５％のものを殺菌処理に供したところ、培養固形分換算
の残存殺虫活性は＃縦比率１０倍（開成固形分濃度：４
チ）のものとほとんど変わらなかった。

したがって、使用する遠心分離機等の性能によシ、上記
範囲の固形分濃度になるように水溶性成分を除去し濃縮
すればよい。さらに、表６の結果は、１０倍濃縮によっ
て、無処理に較べて、培養固形分換算の化学薬品（この
場合、ホルマリン）の使用量を大幅に削減（約３Ａ、ｘ
＊）できることを示しておυ、製造コストの低減にも寄
与することを意味する。

実施例４ 実施例６と同様に調製（超音波処理を含む）した濃縮液
５ゴづつを試験管に分注し、これにパラトルエンスルホ
ンクロルアミドナトリウム各濃度液５Ｎを添加混合し、
混合液中のパラトルエンスルホンクロルアミドナトリウ
ム濃度を適宜設定したものを、６０℃１０分間加熱した
後、実施例３と同様にパラトルエンスルホンクロルアミ
ドナトリウムを除去した濃縮液について、生残芽胞数な
らびに残存殺虫活性を測定した。その結果な弐４に記す
。

上表４でも、表６と同様に、水溶性成分を除去して濃縮
された培養液を殺菌処理することで、培養固形分換算の
化学薬品（この場合、パラトルエンスルホンクロルアミ
ドナトリウム）の使用量を大幅に削減（１０倍濃縮で約
１．／６．７）でき。

培養固形分（農薬本体となる）換算の残存殺虫活性も飛
躍的に高まる（１０倍７Ｊ縮で約６．３倍）ことが確認
できた。

実施例５ バチルス・チューリンゲンシスーバリエタス・クリスタ
キＨ，Ｄ　−１を坂ロフラスコ中の肉エキス・ペプトン
培地（肉エキス１％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウ
ム０８２５％：　ｐ　Ｈ，−、、ｊ　Ｏ）５０Ｍに接種
し、３０℃、６日間振盪培養する。。

同培養液を実施例ろと同様に水溶性成分を除去濃縮し、
超音波処理を施した。開成を用いて、実施例６および実
施例４と同様に殺菌処理を行い、その８菌処理後の生残
芽胞数ならびに残存殺虫活性を求めた。

その結果、１０倍′ｍ縮（濃縮液中の培養固形分濃度：
６％）によ、りて、無処理に較べて、培養固形分換算の
化学薬品の使用ｆを大幅に削減（＃、＃マ！７ン：約’
＋１５．５．ハラトＡエンスルホンクロルアミドナトリ
ウム：約１／’５）でき。

残存殺虫活性も増加（ホルーＦＷン：約１．５倍。

バラトルユニ／スルホンクロルアミドナトリウム：約１
，８倍）　Ｌ　７”：　６本結四は、表３および表４の
結果とよい一致を見た。

ｅ→　発明の効果 本発明は、フナガ、モンうロチヨウ、ヨトウガ、イチモ
ンジセセリなどの鱗翅目昆虫の幼虫に対して有効で、か
つ生菌体および胞子による二次増殖がない殺虫剤の製造
法に関（７、結晶毒素を含有するバチルス・チューリン
ゲンシスの培養液から、水溶性成分を除去ｌ、た後に、
殺菌処理を施−！ことで、化学薬品の使用量を大＠に削
減し、たより緩徐な殺菌処理を可能とし、しかも、殺菌
処理後の残存殺虫活性を飛躍的に高められるという優れ
た効果を有し、当該殺虫剤の生産性向上ならびに品質向
上に大きく寄与するため、農薬業界及び農業の分野に広
く貢献できるものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の産生した結晶毒素を含
   有する培養液の殺菌を、培養液中に存在する水溶性成分
   の除去分離工程後に実施することを特徴とする殺虫剤の
   製造方法。