JPH02258794A - 色素を生成し得る配糖体およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は多糖加水分解酵素、例えばアミラーゼの活性を
測定するのに有用な配糖体、その製法、その使用および
それを用いる酵素検出または活性測定方法に関する。

し従来技術とその欠点］ グルコース単位の還元末端に、紫外線または可視光の特
定波長域に特性吸収を有する芳香族環、例えばフェノー
ル、ｐ−ニトロフェノール等が結合したオリゴ糖誘導体
が例えば、Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、１８２．　ｐ、５
２５−５２６　（１９５８）　；　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　（Ｔｏｋｙｏ）、　Ｖｏ
ｌ、６２．　Ｎｏ、４．４３９−４４６　（１９６７）
；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖ
ｏｌ、２．　Ｎｏ、５．４１８−４２０　（１９８Ｂ）
；特開昭５３−１２３８１号、特開昭５４−５１８９２
号等で知られている。これらの基質は、血液等の生体液
中のマルターゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ等の多
糖加水分解酵素の活性を測定するのに有用である。しか
しこのような基質を用いてα−アミラーゼ活性を測定す
る場合に、光吸収の測定は４１０ｎｍ付近のかなり短い
波長で行う必要があり、試料液例えば血清中に、ビリル
ビン等の短波長に吸収を有する物質が存在すると、その
妨害を受は易い、妨害を除くためにはいわゆる検体盲検
を行う必要があり、そのため分析操作が煩雑になる。

特開昭５６−１０３１９９号に記載されたインドキシル
マルトデキストリンは、加水分解されて長波長に吸収を
もつインジゴ色素を生成することができる（酸化剤の共
存を要す）基質で、試料液中に存在する、ビリルビン等
の短波長に吸収を有する物質の妨害を受けないが、イン
ジゴ色素の生成が遅く、またこの基質は出発原料からの
合成経路が長いので、優れた基質とは言いがたい。

「解決すべき技術課題］ 本発明は多糖加水分解酵素、例えばα−アミラーゼの活
性測定において、血中の色素１例えばビリルビンやヘモ
グロビンによる妨害を受けにくく、簡単な分析操作で、
しかも検出感度の高い測定を可能にする、自己顕色性基
質として有用な化合物およびその製法を提供することを
、技術的課題とする。

〔技術的課題の解決手段］ 上記課題の第１は、下記−最大［１］で表わされる化合
物により解決された。

［Ｉ］ ただし式中Ｒ１は低級アルキル基（置換されていてもよ
い）、Ａは１，４−ナフチレン基を表す、ｎはｏｔたは
８までの正の整数を表わす、ｎは３，４または５である
ことが好ましい。

−ａ式［１］中のＲ１で表されるアルキル基は、炭素原
子１ないし５個のものが好ましい、無置換のアルキル基
が好ましいが、置換基を有してもよい、置換基の例はハ
ロゲン原子（例えば塩素原子）、ニトロ基、シアノ基、
アルカンスルホニル基（炭素原子数４以下が好ましい）
、アルカンスルホンアミド基もしくはアルカンスルファ
モイル基（炭素原子数１から７が好ましい）、アルコキ
シ基もしくはアルキルチオ基（炭素原子数４以下が好ま
しく、さらにアルコキシ基等で置換されていてもよい）
、フェノキシ基（ハロゲン等の置換基を有していてもよ
い）、フェニルチオ基等である。好ましい置換基はアル
コキシ基である。

−最大［１］のＡで表される１、４−ナフチレン基は５
．６．７および８位のいずれか１つ以上に置換基を有し
てもよい。

置換基は例えばハロゲン原子（例えば塩素原子）、アル
キル基（炭素原子数４以下が好ましい）、アルコキシ基
もしくはアルキルチオ基（炭素原子数４以下が好ましく
、さらにアルコキシ基等で置換されていてもよい）、ア
ルカンスルホンアミド基もしくはアルカンスルファモイ
ル基（炭素原子数７以下が好ましい）、カルボンアミド
基もしくはカルバモイル基（炭素原子数８以下が好まし
い）、ヒドロキシ基。

アミン基、七ノーまたはジ−アルキルアミノ基等である
。

上記課題の第２は以下の方法により解決された。すなわ
ち、下記−最大［Ｉａｌで表わされるオリゴ糖に＝［Ｉ
ａｌ （ただし式中Ａは１位がヒドロキシ基に結合する１、４
−ナフチレン基を表わし、Ｒ１は低級アルキル基（置換
されていてもよい）を表わす、） 式　（ＲＣＯ）２０　　（Ｒは低級アルキル基を表わす
）で表わされる有機酸無水物を作用させ、得られる下記
式［Ｉｂ］で表わされる化合物をハロゲン化して：［Ｉ
ｂコ これに下記式［Ｉａｌで表される化合物を作用させて：
［Ｉａｌ ＨＯ−Ａ−ＯＲ （ただし式中Ａは１位がヒドロキシ基に結合する１、４
〜ナフチレン基を表わし、Ｒ＋は低級アルキル基（置換
されていてもよい）を表わす、） 下記式［Ｉｅｌで表わされる化合物を得：［Ｉｅｌ （ただしＹはＣＯＲを表わす） 下記式［１ｃ］で表わされる化合物とじ：［Ｉａｌ （ただしＸはハロゲンを表わす） これを脱アシル化する方法により、解決された。

−ｉ式［１］で表される化合物は、従来α−アミラーゼ
活性測定に広く用いられた基質であるｐ−ニトロフェニ
ルペンタオースまたはｐ−ニトロフェニルヘプタオース
と異なり、遊離された４−アルコキシナフトールから誘
導される色素の吸収極大が長波長であるため、血液中の
ビリルビン、ヘモグロビン等の妨害を受けにくい。

−ｉ式［Ｉ］で表される化合物の具体例を以下に示す。

本発明の化合物の製法における各反応を、ｗ下に詳しく
説明する。

水酸基のアシル化反応 オリゴ糖のアシル化は、公知の方法、例えば反応物とし
ての有機酸無水物中で、好ましくは無水有機酸のアルカ
リ金属塩等の触媒の存在下に加熱処理することによって
行うことができる。

（ＲＣＯ）２０で表される有機酸無水物は、例えば無水
酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸等である。触媒とし
ては、無水有機酸のナトリウム塩、カリウム塩等のアル
カリ金属塩、ピリジン、ピコリン等が用いられる。

反応の調節又は反応後の目的物の精製を容易にするため
、反応溶液に非水溶媒例えばクロロホルム、ジクロロメ
タン等を添加することもできる。

Ｌ記反応に使用される有機酸無水物の量は、オリゴ糖の
重量の５〜５０倍、好ましくは７〜１５倍であり、また
触媒として無水有機酸のアルカリ金属塩を使用する場合
は、その量はオリゴ糖の重置の０．５〜３倍、好ましく
は０５〜１．５倍である。

反応温度は昔通約９０〜１４０℃、好ましくは１００〜
１１０℃である１反応時間は反応温度に依存するが、好
ましい反応温度条件では約２ないし４時間である。反応
混合物を常法により０〜５℃に冷却し、析出する固形物
を分別し、水洗したのち乾燥する。得られた固体生成物
は、エタノール、メタノール等のアルコール類、メチル
エチルケトン、アセトン等のケトン類、ジメチルエーテ
ル、ジエチルエーテル等のエーテル類等の溶媒を単独で
もしくは組み合わせて使用して再結晶することができる
が、該固体生成物を十分乾燥してそのまま反応に使用す
ることもできる。

オリゴ糖還元末端のハロゲン化： ハロゲン化は、無水ハロゲン化水素、塩化アルミニウム
と五塩化リン、四塩化チタン、または塩化第二スズ等を
用いて行なうが、生成物の収率とこれに関連する副反応
の抑制および目的物の精製の容易さから、ＰＡえばクロ
ロホルム、ジクロロメタン等の低極性非水溶媒沖で、無
水四ハロゲン化チタンを用いて処理する方法が特に好ま
しい。

なお無水四ハロゲン化チタンとしては、四塩化チタン、
四臭化チタン・、四ヨウ化チタン等を用いることができ
、ヘプタデカアシルマルトペンタオースに対する無水四
ハロゲン化チタンの量は、通常１〜２０倍モルでよく、
３〜８１音モルが好ましい。

このハロゲン化反応は、室温と使用する溶媒の沸点との
間で常圧下で行なわれるが、溶媒の沸点で還流しなから
実施することが特に好ましい０反応時間は反応温度に依
存するが、溶媒の沸点付近で反応させる場合、通常は３
０分ないし１時間程度である９ 反応混合物を常法により冷却し、これに有機溶媒例えば
クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル等を加え、
有機溶媒層を分取し、水５飽和重炭酸ソーダ水溶液等で
数回洗浄したのち、乾燥し乾固する。

得られた固体生成物は、シリカゲルクロマトグラフィー
等の常法により分離精製したのち、エタノール、メタノ
ール等のアルコール類、メチルエチルゲトン、アセトン
等のケトン類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル等
のエーテル類等の溶媒を単独もしくは組み合わせて使用
して再結晶することができる。乾固物のまま十分乾燥し
て次の反応に使用することもできる。

置換反応： 前記のハロゲン体［Ｉｅｌのアノマー性ハロゲン基を、
前記一般式［Ｉｄｌの化合物で置換して、［Ｉｅｌを得
る。

この反応に使用する４−アルコキシ−１−ナフトールの
量は１〜２０倍モル、好ましくは１．２〜３．０倍モル
である。４アルコキシ−１−ナフトールは、反応を促進
させるために反応溶媒中で塩となって解離している必要
があり、このため無機塩、例えばナトリウム塩、カリウ
ム塩、バリウム塩又は有機塩、例えばトリエチルアミン
塩、トリブチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩等と
して用いられる。２種類以上のこれらの塩を併用するこ
とらできる。また前もって塩を調製せずに、反応溶液中
に無機塩基又は有機塩基を７．へ加するか、又は有機塩
基を直接反応溶媒としてもよい、塩基の添加量は、反応
が終了するまで液性を中性ないしアルカリ性に保持する
のに必要な量が好ましい。

本反応は、通常は溶媒の存在下に行うことが好ましい。

溶媒としては、本反応に関与しないものであれば特に限
定されないがハロゲン体［ｉｃ］及び４−アルコキシ−
１−ナフトール［Ｉｄｌ又はその塩の溶解度が大きく、
かつその反応性を高める溶媒が好ましく１例えば下記の
溶媒が用いられる。アミド例えばジメチルホルムアミド
やジメチルアセＩ・アミド、ニトリル例えばアセトニト
リルやベンゾニトリル、ジメチルスルホキシド、有機塩
基例えばトリアルキルアミン、ピリジン、ルチジン等、
芳香族炭化水素例えばベンゼン、トルエン、ならびにこ
れらの１１６以上の混合液。

本反応は一般に一５〜１００℃程度で進行するが、通常
は１０〜５０℃の反応温度が好ましい０反応時間は、反
応助剤である塩基の種類ならびに反応温度によって異な
るが、通常は５〜２０時間である０反応終了後、反応混
合物を氷水中に投入して析出する固形物をろ取するか、
又は適当な有機溶媒で目的物を抽出し、乾燥後に乾固す
ることにより。

固形物を得る。化合物［Ｉｅｌが固形物として得られる
。

これを常法により、例えばアルミナ、シリカゲル等と用
いるカラムクロマトグラフィ、有機溶媒を用いる結晶化
法などを適宜組み合わせ施すことにより、精製できる。

脱アシル化反応： 化合物（Ｉｅｌからのアシル基の除去は公知の方法、例
えば脱水したメタノール中のアルカリ金属アルコキシド
又は無水アンモニアのメタノール溶液等の触媒の存在下
で実施することができる。アルカリ金属アルコキシドと
しては、例えばナトリウムメトキシド、カリウムエＩ〜
キシド、カリウム−Ｌ−ブトキシド等を用いることがで
きる。

反応終了後の目的物の精製を容易にするため、脱水メタ
ノールにクロロホルム、ジクロロメタン糖の低極性非水
溶媒を添加して反応することが好ましい、添加する低極
性井水溶媒は、脱アシル化反応を阻害せず、生成した４
−アルコキシナフトール配糖体が反応系から析出するこ
とが必要であるため、その量は溶媒によって異なるが、
使用する脱水メタノールの量の０．５ないし２ｆ＆か好
ましい。

脱アシル化反応は、０〜３０℃の温度で６〜２４時間以
内で終了する。脱水メタノール羊独溶媒の反応系では、
反応終了後に減圧下でメタノールを除去し、得られる固
形物を酸性のイオン交換樹脂または無機酸を用いて混在
する塩基性物質を中和した後、薄層クロマＩ・グラフィ
、カラムクロマトグラフィ等により化合物を精製する。

低極性溶媒を添加した反応系の場合は、目的物が反応液
中から析出するので、これをヂし取り、分離精製する。

本発明の一般式［１］の化合物は加水分解されて−ａ式
Ｎｄｉの化合物を遊離する。一般式［Ｉｄｌの化合物は
適当な酸化剤により酸化され、自己カップリングの結果
、色素を生成する０例えば前記具体例（１）の化合物は
下記の式の色素を生成する。

他の化合物についても対応する構造の色素が生成される
。

本発明の化合物は例えば以下に示すような反応によりア
ミラーゼ活性測定に利用できる。

１〉４−メトキシ−１−ナフトールマルトペンタオース
−１−８，０アミラーゼ ーーー→４−メトキシ〜１−ナフトールマルトグルコシ
ド十マルトトリオース １）４−メトキシ−１−ｆフトールマルトグルコシド＋
Ｈ２０グルコシダーゼ ４−メトキシ−１−ナフト−フレ士グルコース酸化 ｉｉｉ＞４−メトキシ−】−ナフト−ルー−一−→二量
体く色素ン即ちアミラーゼによって基質が加水分解され
、４−メトキシ−１−ナフトールマルトグルコシドにな
り、さらに第２の酵素〈α−またはβ−グルコシダーゼ
）で加水分解される。

遊離された４−メトキシ−Ｉ−ナフトールは酸化剤の存
在下に自己カップリングを起こし、青色色素を生成し、
色素の生成速度が酵素活性に対応する。適当な酸化剤は
、例えばチオシアン酸第２鉄、スズ酸第２鉄、フェリシ
アン化カリ等の第２鉄化合物、あるいは高い原子価を有
する遷移金属化合物である。

以下に本発明の化合物の代表的なものの製造方法の実施
例を示す、他の化合物も実施例に準じて容易に合成でき
る。

［実施例１］　化合物ＰＡ（１）の製法（Ａ）ヘプタデ
カアセチルマルトペンタオースの合成マルトペンタオー
ス２０ｇ、無水酸１１！２６０ｓｊ！および無水酢酸ナ
トリウム２０ｇの混合物を、１００〜１１０℃で５時間
撹拌し、氷水６００ｍｆｆ１中に投入して１０時間撹拌
した。５℃以下に冷却して結晶化させ、Ｐ取し、水洗し
、乾燥しな、得られた結晶をエタノールから２回再結晶
を繰り返し、下記構造式に相当する目的物３５ｇを得た
。

融点　１２３ないし１２７℃ 〈ただしＹはＣＯＣＨ３を表わず〉 （Ｂ）ヘキサデカアセチルマルトペンタオシルクロリド
の合成 上記（Ａ）で得たヘプタデカアセチルマルトペンタオー
スＬｏｇ、脱水クロロホルム５０−１および四塩化チタ
ン６ｇを、ｌ＃間環流撹拌して反応させた０反応後クロ
ロホルム３００社を加え、１００ｍ１’の水で３回洗浄
し、クロロホルム相を分離し５ついで無水硫酸ナトリウ
ム３０ｇを加えて脱水し、無水１ｉｊＥ酸ナトリウムを
ろ過して除去した。減圧下で濃縮、乾燥した後、メタノ
ール２０ｍ１に加熱溶解し、水冷して、結晶化させた。

メタノールをデカンテーションで除き、エタノールＬｏ
ａ１とｎ−ヘキサン２０ｍ１の混合液で加熱溶解し、得
られた液を撹拌子水冷すると白色結晶が析出する。結晶
をＰ取し、ｎ〜ヘキサンで洗い、乾燥させた。下記構造
式に相当する白色結晶８．１ｇが得られた。　融点　１
２３〜１２９℃ （ＹはＣＯＣＨ３を表す） 元素弁Ｎ値：Ｃ５ｚＨｌｉ（Ｌ＋ＣＪとしてＣＨＣ１ 理論値（％）　　４９．００　５．５６　　２．２３実
測値（％）　　４Ｂ、７０　５．４０　　２．１８（Ｃ
）化合物例（１）の合成 上記（Ｂ）で得られたヘキサデカアセチルマルトペンタ
オ・シルクロリド２ｇ、４−メトキシ−１−ナフトール
８．７ｇ、トリエチルアミン５．０５ｇを脱水したジメ
チルホルムアミド３０ｍ１に溶解した後、５０℃で撹拌
加熱した０反応終了後、酢酸エチル２００ｍ１を追加し
て、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、
減圧下に蒸発乾固しな、シリカゲルカラムクロマトグラ
フィ（溶出液は酢酸エチル：ｎ−ヘキサン１：５混液）
で精製し、淡黄色の生成物１．５ｇを得た。

この粗生成＊　１　ｇを脱水メタノール２ｍ／、脱水ジ
クロロメタン７社の混合液に溶解し、これにさらに０．
５Ｎナトリウムメトキサイドｌｄを添加して、室温下撹
拌して１０時間反応させた０反応後析出しな沈澱をｌ取
し、脱水メタノール−ジクロロメタン混合液（１：　１
）　、次にジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥する
と、目的とする化合物の１１Ｉ製結晶０．３１ｇが得ら
れた。この粗生成物を水とＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔｄ、製Ｂ１ｏ−Ｇｅ１　Ｐ−２を
用いたカラムクロマトグラフィにより精製し、目的とす
る化合物（ｔ）０．２８ｇを得た。

融点　１９３〜１９５℃ 次に上記のアゾ色素配糖体をもちいた多層分析要素およ
びアミラーゼ活性測定方法の実施例を示す。

［実施例３］ ゼラチン下塗りされている厚さ１８０μｍのポリエチレ
ンテレフタレート無色透明平滑フィルム上に下記の組成
（ａ）の水溶液を乾燥後の厚さが７μｍになるように塗
布し、乾燥した。

（ａ） ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　　３００ｇ界
面活性剤　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇくオ
リン社製５ｕｒ４ａｃｔａｎＬ　１０Ｇ　）ボリーコ（
スチレン−トメチルモルホリニウムメチルスチレン−ジ
ビニルベンゼン） 重合比５５・４３：２ １５％ラテックス溶液　　　　　　　　２８０ｇフェリ
シアン化カリウム　　　　　　　　　　　５ｇ水　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１５０ｇ
（希Ｎ　ａ　ＯＨ溶液でｐＨを７．０に調整する）次に
上記ゼラチン層上に、下記の組成（ｂ）の水溶液を乾燥
後の厚さが５μｍになるように塗布し乾燥した。

（ｂ）　　ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　２０
０ｇ界面活性剤　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ（
オリン社製５ｕｒ４ａｃＬａｎｔ　１０　Ｇ　＞β−グ
ルコシダーゼ　　　　　　　　　３５０万Ｉ［Ｊ水　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２６００ｇ（希
ＮａＯＨ溶液でｐ＋−１を７．０に調整する）次に上記
ゼラチン層上に下記の組成（ｃ）の水溶液を乾燥後の厚
さが３μｍになるように塗布し、乾燥した。

（ｃ） ゼラチン　　　　　　　　　　　　３０ｇ界面活性剤　
　　　　　　　　　　　４ｇ（オリン社製５ｕｒｆａｃ
ｔａｎｔ　ＩＯＧ　）酸化チタン（アナターセ型）　　
　２０ｇ水　　　　　　　　　　　　　　　　　９５０
ｇ（希ＮａＯＨ溶液でｐＨを７．０に調整する）次に上
記酸化チタン／ゼラチン層の上に約３０ｇ／ｍ２の割合
で水を全面に均一に供給して湿潤させた後、その上にト
リコット編み物（ポリエステル製４０ゲイジ）を軽く圧
力をかけてラミネートし、乾燥させた。

次にこの布に下記の組成（ｄ）の水溶液を１５０　ｃｃ
／ｍ”の割合でほぼ均一に塗布し、乾燥させ、アミラー
ゼ測定用多層分析要素を作製した。

（ｄ） 化合物例（１）　　　　　　　　　　　　５ｇ水　　　
　　　　　　　　　　　　　　１６００ｇリン酸カリウ
ム　　　　　　　　　　６０ｇポリビニルピロリドン　
　　　　１４０ｇ（平均分子量　７０万） （希Ｎ　ａ　ＯＨ溶液でｐＨを７．３に調整する）第１
表 第１表から明らかなごとく、本発明の分析要素により管
理血清中のアミラーゼ活性を精度よく測定できた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記一般式［ I ］で表わされる化合物：［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ ｛ただし、式中Ａは１位がオリゴ糖に結合する１，４−
   ナフチレン基を表わし、Ｒ＾１は低級アルキル基（置換
   されていてもよい）を表わす。ｎは０または８までの整
   数を表わす。｝ （２）一般式（ I ）のｎが３，４または５を表わす特
   許請求の範囲（１）の化合物。 （３）下記一般式［ I ａ］で表わされるオリゴ糖に［
   I ａ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ 下記式 （ＲＣＯ）＿２Ｏ （Ｒは低級アルキル基を表わす。） で表わされる有機酸無水物を作用させ、得られる下記式
   ［ I ｂ］で表わされる化合物をハロゲン化して、［ I
   ｂ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただしＹはＣＯＲを表わす） 下記式［ I ｃ］で表わされる化合物とし、 ［ I ｃ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただしＸはハロゲンを表わす） これに下記式［ I ｄ］で表される化合物を作用させて
   、［ I ｄ］ ＨＯ−Ａ−ＯＲ＾１ ｛ただし式中Ａは１位がヒドロキシ基に結合する１，４
   −ナフチレン基を表わし、Ｒ＾１は低級アルキル基（置
   換されていてもよい）を表わす。。｝ 下記式［ I ｅ］で表わされる化合物を得、 ［ I ｅ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ これを脱アシル化することを特徴とする、一般式［ I
   ］で表わされる化合物の製法。 ［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ ｛ただし各式中ｎは０または８までの整数を表わす。｝
   （４）アミラーゼの基質としての請求項（１）または（
   ２）の化合物の使用。 （５）請求項（１）または（２）の化合物を基質として
   用いるアミラーゼの検出または活性測定方法。 （６）α−グルコシダーゼまたは／およびβ−グルコシ
   ダーゼの存在下に行う、請求項（５）の検出または活性
   測定方法。 （７）酸化剤の存在下に４−アルコキシナフトール化合
   物から生ずる青色色素を光学的に検出する請求項（５）
   の検出または活性測定方法。