JPH02178296A - 新規グルコサミン誘導体、これを用いる酵素活性測定試薬及び酵素活性測定方法 - Google Patents
新規グルコサミン誘導体、これを用いる酵素活性測定試薬及び酵素活性測定方法Info
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- JPH02178296A JPH02178296A JP63331646A JP33164688A JPH02178296A JP H02178296 A JPH02178296 A JP H02178296A JP 63331646 A JP63331646 A JP 63331646A JP 33164688 A JP33164688 A JP 33164688A JP H02178296 A JPH02178296 A JP H02178296A
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は新規フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−１
３−Ｄ−グルコサミニド誘導体、これを基質として用い
るＮ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測
定試薬及びＮ−アセチル−ｐ−Ｄ−グルコサミニダーゼ
活性の測定方法に関する。Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−グル
コサミニダーゼは糖質分解酵素のひとつで生体組織中に
広く分布し、とくに腎臓に多く存在する。特に近位尿細
管曲部に高いＮ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼ活性が認められている。
３−Ｄ−グルコサミニド誘導体、これを基質として用い
るＮ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測
定試薬及びＮ−アセチル−ｐ−Ｄ−グルコサミニダーゼ
活性の測定方法に関する。Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−グル
コサミニダーゼは糖質分解酵素のひとつで生体組織中に
広く分布し、とくに腎臓に多く存在する。特に近位尿細
管曲部に高いＮ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼ活性が認められている。
Ｎ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測
定は、腎移植後の拒絶反応の早期診断、急性腎不全、糸
球体腎炎等の各種腎疾患の診断及び経過観察、薬物の腎
毒性等に有用な情報を与えられるものとして臨床的意義
が高い。
定は、腎移植後の拒絶反応の早期診断、急性腎不全、糸
球体腎炎等の各種腎疾患の診断及び経過観察、薬物の腎
毒性等に有用な情報を与えられるものとして臨床的意義
が高い。
［従来の技術及び課題］
従来、Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以
下ＮＡＧと略する）活性の測定方法としては、Ｎ−アセ
チル−１３−Ｄ−グルコサミンの還元末端にｐ−ニトロ
フェノールを結合させた基質を用いてＮＡＧを作用させ
、遊離してくるｐ−二トロフェノールをアルカリ性下で
比色する方法が一般的である（ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ
ｇｙｍｏｌ、、 ２８．７０２ （１９７２） ）。
下ＮＡＧと略する）活性の測定方法としては、Ｎ−アセ
チル−１３−Ｄ−グルコサミンの還元末端にｐ−ニトロ
フェノールを結合させた基質を用いてＮＡＧを作用させ
、遊離してくるｐ−二トロフェノールをアルカリ性下で
比色する方法が一般的である（ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ
ｇｙｍｏｌ、、 ２８．７０２ （１９７２） ）。
ところがこの方法では、尿ブランクの測定が必要であり
、また、呈色物質の分子吸光係数が比較的小さく、分析
感度を上げるためには長時間の反応が必要であるといっ
た問題点が挙げられる。
、また、呈色物質の分子吸光係数が比較的小さく、分析
感度を上げるためには長時間の反応が必要であるといっ
た問題点が挙げられる。
その他、Ｎ−アセチルグルコサミンに４−メチルウンベ
リフェロンを結合させた基質を用いる方法（Ｃｕｎ、
Ｃｈｉｎ、 Ａｃｔａ、、 ２４．１８９ （１９６９
） ）も用いられているが、基質の溶解度が低くＫｍ値
以下の基質濃度で反応を行なうために尿中の阻害物質の
影響を受けやすいうえ、ｐ−ニトロフェノールを用いる
方法同様に尿ブランクを測定する必要があるといった問
題点が挙げられる。
リフェロンを結合させた基質を用いる方法（Ｃｕｎ、
Ｃｈｉｎ、 Ａｃｔａ、、 ２４．１８９ （１９６９
） ）も用いられているが、基質の溶解度が低くＫｍ値
以下の基質濃度で反応を行なうために尿中の阻害物質の
影響を受けやすいうえ、ｐ−ニトロフェノールを用いる
方法同様に尿ブランクを測定する必要があるといった問
題点が挙げられる。
さらにブランクテストを行なわなくてもよいように改良
した基質としてｍ−クレゾールスルホフタリルＮ−アセ
チル−４３−Ｄ−グルコサミニドが知られている（特開
昭５８−９９４、特公昭６３−７１９６ ）。
した基質としてｍ−クレゾールスルホフタリルＮ−アセ
チル−４３−Ｄ−グルコサミニドが知られている（特開
昭５８−９９４、特公昭６３−７１９６ ）。
しかし、これらは反応停止剤試薬を加え、アルカリ性で
発色させて測定するエンドポイント法を用いるため、２
試薬法で測定する必要があり時間もかかるので、自動化
するための機種を限定されるなどの欠点がある。
発色させて測定するエンドポイント法を用いるため、２
試薬法で測定する必要があり時間もかかるので、自動化
するための機種を限定されるなどの欠点がある。
しかして、上記の欠点を改良して酵素反応進行中の一定
時間間隔のＮＡＧ活性の吸光度差を測定するレート法で
測定できる基質として２−クロロ−４−ニトロフェニル
Ｎ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサミニドや４−クロロ
−２−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニドが知られている（特開昭６１−１１２０９２ ）
。しかし、これらは基質の溶解度が低くＫｍ値以下の基
質濃度で反応を行なうため尿中の阻害物質の影響を受け
やすいうえ、測定波長が４０５ ｎｍであるため、ｐ−
ニトロフェノールを用いる方法と同様に尿ブランクを測
定する必要があるという欠点がある。
時間間隔のＮＡＧ活性の吸光度差を測定するレート法で
測定できる基質として２−クロロ−４−ニトロフェニル
Ｎ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサミニドや４−クロロ
−２−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニドが知られている（特開昭６１−１１２０９２ ）
。しかし、これらは基質の溶解度が低くＫｍ値以下の基
質濃度で反応を行なうため尿中の阻害物質の影響を受け
やすいうえ、測定波長が４０５ ｎｍであるため、ｐ−
ニトロフェノールを用いる方法と同様に尿ブランクを測
定する必要があるという欠点がある。
比色法における尿ブランクは主としてビリルビンとヘモ
グロビンに由来しているため尿ブランクの測定を省略す
るためには、測定波長をこれらの物質の干渉のない５４
０ ｎｍ以上の領域に設定する必要がある。
グロビンに由来しているため尿ブランクの測定を省略す
るためには、測定波長をこれらの物質の干渉のない５４
０ ｎｍ以上の領域に設定する必要がある。
［課題を解決する為の手段］
本発明者等はこれらの問題点を解決するため種々研究し
た結果フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−
グルコサミニド誘導体を基質として含んだ測定液を使用
して、試料中のＮＡＧを正確簡単に得ることに成功した
。
た結果フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−
グルコサミニド誘導体を基質として含んだ測定液を使用
して、試料中のＮＡＧを正確簡単に得ることに成功した
。
すなわち、本発明はフェニルアゾナフトール誘導体が還
元末端にｐ−結合した一般式［Ｉ］（式中、Ｒ□〜３の
うち少なくとも一つはスルホン酸基またはアルカリ金属
スルホネート基を、残りはハロゲン、メトキシ基、ニト
ロ基または水素原子を示す。）で表わされる新規フエニ
ルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−グルコサミニ
ド誘導体；基質として一般式［Ｉ］で表わされるフエニ
ルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−４３−Ｄ−グルコサミ
ニド誘導体を含むＮ−アセチル−４３−Ｄ−グルコサミ
ニダーゼ活性測定ｉ試薬；及び一般式［Ｉ］で表わされ
る新規フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−１３−Ｄ
−グルコサミニド誘導体を含む測定試薬を緩衝液で溶解
し、これに検体を加えてインキュベートし、生成するフ
ェニルアゾナフトール誘導体をアルカリ溶液で発色させ
て比色定量することを特徴とするＮ−アセチル−１３−
Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測定方法である。
元末端にｐ−結合した一般式［Ｉ］（式中、Ｒ□〜３の
うち少なくとも一つはスルホン酸基またはアルカリ金属
スルホネート基を、残りはハロゲン、メトキシ基、ニト
ロ基または水素原子を示す。）で表わされる新規フエニ
ルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−グルコサミニ
ド誘導体；基質として一般式［Ｉ］で表わされるフエニ
ルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−４３−Ｄ−グルコサミ
ニド誘導体を含むＮ−アセチル−４３−Ｄ−グルコサミ
ニダーゼ活性測定ｉ試薬；及び一般式［Ｉ］で表わされ
る新規フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−１３−Ｄ
−グルコサミニド誘導体を含む測定試薬を緩衝液で溶解
し、これに検体を加えてインキュベートし、生成するフ
ェニルアゾナフトール誘導体をアルカリ溶液で発色させ
て比色定量することを特徴とするＮ−アセチル−１３−
Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測定方法である。
本発明のＮＡＧ活性測定に用いる基質は一般式［月で示
される化合物、すなわちＮ−アセチルグルコサミンがそ
の還元性末端で置換芳香族化合物とり一結合したもので
ある。一般式［Ｉ］におけるアルカリ金属スルホネート
基としては、ナトリウムスルホネート、カリウムスルホ
ネートなどが、ハロゲンとしてはフッ素、塩素、臭素な
どが挙げられる。
される化合物、すなわちＮ−アセチルグルコサミンがそ
の還元性末端で置換芳香族化合物とり一結合したもので
ある。一般式［Ｉ］におけるアルカリ金属スルホネート
基としては、ナトリウムスルホネート、カリウムスルホ
ネートなどが、ハロゲンとしてはフッ素、塩素、臭素な
どが挙げられる。
たは水素原子を示す。）
上記の置換芳香族化合物は、ＮＡＧとその基質である一
般式［Ｉ］の化合物とが反応して該基質が解裂して生成
するアグリコンに相当し、基質とは異なったスペクトル
吸収を示す置換芳香族化合物である。
般式［Ｉ］の化合物とが反応して該基質が解裂して生成
するアグリコンに相当し、基質とは異なったスペクトル
吸収を示す置換芳香族化合物である。
基質が解裂して生成するアグリコンとは具体的には次の
一般式［１月（Ｒ１〜３は前記のものと同じ）で示され
るフェニルアゾナフトール誘導体である。
一般式［１月（Ｒ１〜３は前記のものと同じ）で示され
るフェニルアゾナフトール誘導体である。
これらのフェニルアゾナフトール誘導体としては、例え
ば、４−フェニルアゾ−１−ナフトール−４′ −スル
ホン酸、４−フェニルアゾ−１−ナフトール−４′ −
二トロー２′ −スルホン酸、４−（４’−メトキシフ
エニルアゾ）−１−ナフトール−５−スルホン酸、４−
（４’ −二トロフェニルアゾ）−１−ナフトール−５
−スルホン酸、４−（２’ −クロロ−４′ −二トロ
フェニルアゾ）−１−１−アト−ルー５−スルホン酸な
どと、これらのアルカリ金属塩が挙げられる。
ば、４−フェニルアゾ−１−ナフトール−４′ −スル
ホン酸、４−フェニルアゾ−１−ナフトール−４′ −
二トロー２′ −スルホン酸、４−（４’−メトキシフ
エニルアゾ）−１−ナフトール−５−スルホン酸、４−
（４’ −二トロフェニルアゾ）−１−ナフトール−５
−スルホン酸、４−（２’ −クロロ−４′ −二トロ
フェニルアゾ）−１−１−アト−ルー５−スルホン酸な
どと、これらのアルカリ金属塩が挙げられる。
第１図に（ａ）４−フェニルアゾ−１−ナフトール−４
′ −二トロー２′ −スルホン酸ナトリウム塩（フェ
ニルアゾナフトール誘導体二色素）と（ｂ）４−（４′
−二トロー２′−スルホフェニルアゾ）−１−ナフチ
ル−Ｎ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサニミドーナトリ
ウム塩（基質）のＵＶスペクトルを、第２図に（ｃ）４
−フェニルアゾ−１−ナフトール−４′ −スルホン酸
ナトリウム塩（フェニルアゾナフトール誘導体：色素）
と（ｄ）４−（４’−スルホフェニルアゾ）−１−ナフ
チル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドーナトリ
ウム塩（基質）のＵＶスペクトルを示す。第１図及び第
２図から明らかなように、色素（ａ）及び（ｅ）の吸収
ピークを示す波長では、それらに対応する基質（ｂ）及
び（ｄ）の吸収は極めて微弱である。
′ −二トロー２′ −スルホン酸ナトリウム塩（フェ
ニルアゾナフトール誘導体二色素）と（ｂ）４−（４′
−二トロー２′−スルホフェニルアゾ）−１−ナフチ
ル−Ｎ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサニミドーナトリ
ウム塩（基質）のＵＶスペクトルを、第２図に（ｃ）４
−フェニルアゾ−１−ナフトール−４′ −スルホン酸
ナトリウム塩（フェニルアゾナフトール誘導体：色素）
と（ｄ）４−（４’−スルホフェニルアゾ）−１−ナフ
チル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドーナトリ
ウム塩（基質）のＵＶスペクトルを示す。第１図及び第
２図から明らかなように、色素（ａ）及び（ｅ）の吸収
ピークを示す波長では、それらに対応する基質（ｂ）及
び（ｄ）の吸収は極めて微弱である。
これら基質の合成方法は、下の反応式に示す通りである
。即ち、Ｎ−アセチルグルコサミンをアセデル化し、こ
のアセチル化されたＮ−アセチルグルコサミンと置換芳
香族化合物、アグリコンを結合させた後、脱アセチルす
ることにより合成するか（実験化学講座２４．３０４．
１９５Ｂ）、又はアセチル化されたＮ−アセチルグルコ
サミンをハロゲン化し、次いでそのハロゲン化物と置換
芳香族化合物、アグリコンをエーテル結合させたあと、
脱アセチルすることにより合成することができる（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ＩＩ、 ３３４）。
。即ち、Ｎ−アセチルグルコサミンをアセデル化し、こ
のアセチル化されたＮ−アセチルグルコサミンと置換芳
香族化合物、アグリコンを結合させた後、脱アセチルす
ることにより合成するか（実験化学講座２４．３０４．
１９５Ｂ）、又はアセチル化されたＮ−アセチルグルコ
サミンをハロゲン化し、次いでそのハロゲン化物と置換
芳香族化合物、アグリコンをエーテル結合させたあと、
脱アセチルすることにより合成することができる（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ＩＩ、 ３３４）。
［１１］
Ｎ−アセチルグルコサミン
２、３．４．６−チトラア七チルグルコサミンハロゲン
化Ｎ−アセチルグルコサミン 脱アセチル化 化合物［月 本発明のＮＡＧ活性測定試薬に用いる緩衝液は体液など
の検体中のＮＡＧの至適ｐＨ４，０〜６．０を保つもの
であれば、いかなるものでも良い。例えば、クエン酸緩
衝液やその他の有機酸緩衝液が挙げられる。又、必要に
より界面活性剤、防腐剤、塩化ナトリウム、安定化剤等
を含有しても良い。
化Ｎ−アセチルグルコサミン 脱アセチル化 化合物［月 本発明のＮＡＧ活性測定試薬に用いる緩衝液は体液など
の検体中のＮＡＧの至適ｐＨ４，０〜６．０を保つもの
であれば、いかなるものでも良い。例えば、クエン酸緩
衝液やその他の有機酸緩衝液が挙げられる。又、必要に
より界面活性剤、防腐剤、塩化ナトリウム、安定化剤等
を含有しても良い。
本発明は先に述べた通りＮＡＧ活性を測定するものであ
り、試料中のＮＡＧとその基質であるフエニルアゾナフ
チル−Ｎ−アセチル−４３−Ｄ−グルコサミニド誘導体
とをインキュベートして酵素反応を行わせ、遊離するフ
ェニルアゾナフトール誘導体をアルカリ溶液で発色させ
て比色定量し、試料中のＮＡＧ活性を測定するものであ
る。
り、試料中のＮＡＧとその基質であるフエニルアゾナフ
チル−Ｎ−アセチル−４３−Ｄ−グルコサミニド誘導体
とをインキュベートして酵素反応を行わせ、遊離するフ
ェニルアゾナフトール誘導体をアルカリ溶液で発色させ
て比色定量し、試料中のＮＡＧ活性を測定するものであ
る。
本発明の測定方法はレート法、エンドポイント法のいず
れでも測定できる。即ち、酵素反応進行中の一定時間間
隔の吸光度差を測定するレート法や反応停止液を加えて
測定するエンドポイント法でも測定することができる。
れでも測定できる。即ち、酵素反応進行中の一定時間間
隔の吸光度差を測定するレート法や反応停止液を加えて
測定するエンドポイント法でも測定することができる。
又、遊離するフェニルアゾナフトール誘導体の吸収波長
が５００〜６００ｎｍにあり、生体試料中の夾雑物によ
る測定上の影響をほとんど受けないので、本発明のＮＡ
Ｇ活性測定試薬を用いることにより正確な測定結果が得
られる。
が５００〜６００ｎｍにあり、生体試料中の夾雑物によ
る測定上の影響をほとんど受けないので、本発明のＮＡ
Ｇ活性測定試薬を用いることにより正確な測定結果が得
られる。
しかも第１図及び第２図から明らかなように、色素（ａ
）及び（ｃ）の吸収ピークを示す波長では基質（ｂ）及
び（ｄ）の吸収は極めて微弱であるから、前記吸収ピー
クを示す波長で反応を追跡すれば、基質の減少を正確に
追うことができる。
）及び（ｃ）の吸収ピークを示す波長では基質（ｂ）及
び（ｄ）の吸収は極めて微弱であるから、前記吸収ピー
クを示す波長で反応を追跡すれば、基質の減少を正確に
追うことができる。
［実施例］
以下に実施例および実験例によりさらに詳細に説明する
が、本発明はこれによって限定されるものではない。
が、本発明はこれによって限定されるものではない。
実施例１
ａ）クロロホルム７５ｍ１中の２．３．４．６−チトラ
アセチルグルコサミンクロライド９．３ ｇ （２５，
３ミリモル）の溶液を６０’Ｃに加温する。この温度で
ＩＮ−カセイソーダ２５．３ ｍｌのトリエチルベンジ
ルアンモニウムクロライド３．４ ｇ （１２，６ミリ
モル）と４−（４’−二トロー２′−スルホフェニルア
ゾ）−１−ナフトール５．０ ｇ （１２，６ミリモル
）の溶液を添加する。
アセチルグルコサミンクロライド９．３ ｇ （２５，
３ミリモル）の溶液を６０’Ｃに加温する。この温度で
ＩＮ−カセイソーダ２５．３ ｍｌのトリエチルベンジ
ルアンモニウムクロライド３．４ ｇ （１２，６ミリ
モル）と４−（４’−二トロー２′−スルホフェニルア
ゾ）−１−ナフトール５．０ ｇ （１２，６ミリモル
）の溶液を添加する。
反応混合液を６時間還流させ、その後室温で一晩撹拌す
る。有機相を分離し水相を数回クロロホルムで振とうす
る。出発物質を除去するために、合した有機相を０．Ｉ
Ｎ−カセイソーダ水で数回振どうする。クロロホルム相
を水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥後、有機溶剤を濃縮
する。残渣をエーテルに落とすと４−（４’ −ニトロ
−２′−スルホフェニルアゾ）−１−ナフチル−２，３
，４，６−テトラアセチルグルコサミニドーナトリウム
塩２．８ｇが得ら。
る。有機相を分離し水相を数回クロロホルムで振とうす
る。出発物質を除去するために、合した有機相を０．Ｉ
Ｎ−カセイソーダ水で数回振どうする。クロロホルム相
を水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥後、有機溶剤を濃縮
する。残渣をエーテルに落とすと４−（４’ −ニトロ
−２′−スルホフェニルアゾ）−１−ナフチル−２，３
，４，６−テトラアセチルグルコサミニドーナトリウム
塩２．８ｇが得ら。
れる。
赤色無定形粉末（収率：理論量の３１％）シリカゲル薄
層クロマトグラフィー（展開溶媒ｎ−ブチルアルコール
：酢酸：水＝４ ： １：１ ｖ／ｖ） ：訂＝ ０．
７８ ｂ）無水メタノール２０ｍ１にａ）で得たテトラアセチ
ルグルコサミニド２．８ ｇ （３，９ミリモル）を溶
かした溶液を０〜５°Ｃに冷却する。脱アセチル化する
ために、この温度で撹拌下にメタノールの２８％ナトリ
ウムメチラート溶液０．４６ ｍｌ（２ミリモル）を添
加する。０〜５℃で１時間撹拌後、５００ｍ１乾燥エー
テルに落とし、生成物を析出させる。生成物を濾取し、
エーテルで洗浄後、減圧乾燥してからカラムクロマトグ
ラフィーにより精製を行う。０．７ ｇの４−（４′
−二トロー２′−スルホフェニルアゾ）−１−ナフチル
−Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−グルコサミニド−ナトリウム
塩が得られる。
層クロマトグラフィー（展開溶媒ｎ−ブチルアルコール
：酢酸：水＝４ ： １：１ ｖ／ｖ） ：訂＝ ０．
７８ ｂ）無水メタノール２０ｍ１にａ）で得たテトラアセチ
ルグルコサミニド２．８ ｇ （３，９ミリモル）を溶
かした溶液を０〜５°Ｃに冷却する。脱アセチル化する
ために、この温度で撹拌下にメタノールの２８％ナトリ
ウムメチラート溶液０．４６ ｍｌ（２ミリモル）を添
加する。０〜５℃で１時間撹拌後、５００ｍ１乾燥エー
テルに落とし、生成物を析出させる。生成物を濾取し、
エーテルで洗浄後、減圧乾燥してからカラムクロマトグ
ラフィーにより精製を行う。０．７ ｇの４−（４′
−二トロー２′−スルホフェニルアゾ）−１−ナフチル
−Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−グルコサミニド−ナトリウム
塩が得られる。
赤色無定形粉末（収率：理論量の１６％）融点： １２
０−１２４°Ｃ（分解） シリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒ｎ−ブチ
ルアルコール：酢酸：水＝４ ： １：１ ’ｖ／ｖ）
：Ｒｆ＝０．３２ 実施例２ 実施例１と同様にして、下記のフェニルアゾナフトール
誘導体をテトラアセチルグルコサミンクロライドと反応
させてそれぞれ対応する基質を合成することができる。
０−１２４°Ｃ（分解） シリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒ｎ−ブチ
ルアルコール：酢酸：水＝４ ： １：１ ’ｖ／ｖ）
：Ｒｆ＝０．３２ 実施例２ 実施例１と同様にして、下記のフェニルアゾナフトール
誘導体をテトラアセチルグルコサミンクロライドと反応
させてそれぞれ対応する基質を合成することができる。
４−フェニルアゾ−１−ナフ
トール−５−スルホン酸 ０．２９ ９８−
１０２（薄層クロマトグラフィーの展開溶媒は実施例１
と同じ）実験例１ 測定の実施 ａ）使里１立浪腹二週翌 緩衝溶液 クエン酸 ２５ｍＭ水溶液 クエン酸ナトリウム ２５ｍＭ水溶液上記二試液を混
合してｐＨ４，２に調製する。
１０２（薄層クロマトグラフィーの展開溶媒は実施例１
と同じ）実験例１ 測定の実施 ａ）使里１立浪腹二週翌 緩衝溶液 クエン酸 ２５ｍＭ水溶液 クエン酸ナトリウム ２５ｍＭ水溶液上記二試液を混
合してｐＨ４，２に調製する。
試薬溶液１
４−（４’ −二トロー２′−スルホフェニルアゾ）−
１−ナフチル−Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−グルコサミニド
−ナトリウム塩を０．５ ｍＭ濃度で緩衝溶液に溶解す
る。
１−ナフチル−Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−グルコサミニド
−ナトリウム塩を０．５ ｍＭ濃度で緩衝溶液に溶解す
る。
試薬溶液２
ジェタノールアミン ＩＭ
塩化マグネシウム ０．５ ｍＭ
ｐＨ値（塩酸で調製） １０．５ （２５°Ｃ）酵
素溶液 市販のＮＡＧを緩衝溶液に溶かす。この溶液の活性は約
１００Ｕ＃である。
素溶液 市販のＮＡＧを緩衝溶液に溶かす。この溶液の活性は約
１００Ｕ＃である。
ｂ）■定友汰
エンドポイント法によりＮＡＧ活性を測定した。
試薬溶液１を１ｍｌ取り３７°Ｃで５分間加温した後、
酵素溶液０．１ｍｌ加え混合する。３７°Ｃで５分間反
応した後、試薬溶液２を２ｍｌ添加し、アルカリ条件下
にして反応を停止させる。５分間静置した後６００ｎｍ
で吸光度を測定する（基質ブランクは酵素溶液の代りに
水を用いる）。
酵素溶液０．１ｍｌ加え混合する。３７°Ｃで５分間反
応した後、試薬溶液２を２ｍｌ添加し、アルカリ条件下
にして反応を停止させる。５分間静置した後６００ｎｍ
で吸光度を測定する（基質ブランクは酵素溶液の代りに
水を用いる）。
酵素溶液を生理食塩水で１０段階に希釈した例の測定値
を記載する。
を記載する。
第３図にＮＡＧ希釈濃度とＯＤ値との関係を示した。こ
の結果は原点を通過するきれいな直線を示した。この事
実はＮＡＧ活性とＯＤとが比例関係にあることをあられ
すとともに、この新規なＮＡＧ活性測定方法の実用性及
び有用性を示している。
の結果は原点を通過するきれいな直線を示した。この事
実はＮＡＧ活性とＯＤとが比例関係にあることをあられ
すとともに、この新規なＮＡＧ活性測定方法の実用性及
び有用性を示している。
実験例２
測定の実施
ａ）伍里±立浪亘２皿販
緩衝溶液
クエン酸 ５０ｍＭ水溶液クエン酸ナトリ
ウム ５０ｍＭ水溶液上記二試波音混合してｐＨ５，
０に調製する。
ウム ５０ｍＭ水溶液上記二試波音混合してｐＨ５，
０に調製する。
試薬溶液
４−（４’ −スルホフェニルアゾ）−１−ナフチル−
Ｎ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサミニド−ナトリウム
塩を２ｍＭ濃度で水に溶解する。
Ｎ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサミニド−ナトリウム
塩を２ｍＭ濃度で水に溶解する。
酵素溶液
市販のＮＡＧを緩衝溶液に溶かす。この溶液の活性は約
２００ Ｕ ／ ｅである。
２００ Ｕ ／ ｅである。
ｂ）皿定立汰
レートアッセイ法によりＮＡＧ活性を測定した。
緩衝溶液を１．５ｍｌと試薬溶液０．２ｍｌとり３７°
Ｃで３０秒間加温した後、酵素溶液２５１１１を加え撹
拌後、分光光度計で５０５ ｎｍにおける吸光度の増加
を測定する。
Ｃで３０秒間加温した後、酵素溶液２５１１１を加え撹
拌後、分光光度計で５０５ ｎｍにおける吸光度の増加
を測定する。
酵素溶液を生理食塩水で５段階に希釈した例の測定値を
記載する。
記載する。
第４図はＮＡＧ及び希釈ＮＡＧにおけるタイムコースを
各２度測定した結果である。第４図かられかるように、
５１５は８分まで、それ以外の各ＮＡＧにおいて１０分
までは直線性を示し、少なくとも２００Ｕ／ｅまではレ
ートアッセイ法が適用できることを示している。
各２度測定した結果である。第４図かられかるように、
５１５は８分まで、それ以外の各ＮＡＧにおいて１０分
までは直線性を示し、少なくとも２００Ｕ／ｅまではレ
ートアッセイ法が適用できることを示している。
また、第５図にＮＡＧ希釈濃度とΔＯＤとの関係を示し
た。この結果は原点を通過するきれいな直線を示した。
た。この結果は原点を通過するきれいな直線を示した。
この事実はＮＡＧ活性とΔＯＤとが比例関係にあること
をあられすとともに、この新規なＮＡＧ活性測定方法の
実用性および有用性を示している。
をあられすとともに、この新規なＮＡＧ活性測定方法の
実用性および有用性を示している。
［発明の効果］
本発明のＮＡＧ活性測定法は種々の点で従来法の問題点
が解決されている。本発明の利点を記すと次のごとくで
ある。
が解決されている。本発明の利点を記すと次のごとくで
ある。
（１）基質の水溶性が高く、反応液中で任意の基質濃度
に設定することができ、尿中の阻害物質の影響を受けず
に反応が行なえる。
に設定することができ、尿中の阻害物質の影響を受けず
に反応が行なえる。
（２）測定波長が５００〜６００ ｎｍであるため生体
試料中の夾雑物の影響をほとんど受けないので、試料ブ
ランクの測定が省略できる。そのため正確な測定結果が
得られる。
試料中の夾雑物の影響をほとんど受けないので、試料ブ
ランクの測定が省略できる。そのため正確な測定結果が
得られる。
（３）呈色物質に分子吸光係数が比較的大きなアゾ色素
を用いているため短時間でも測定が可能である。
を用いているため短時間でも測定が可能である。
（４）用いる色素の種類によってエンドポイント法だけ
でなく、レート法でも測定することができる。
でなく、レート法でも測定することができる。
以上のごとく、本発明のＮＡＧ活性測定方法は、従来法
の有する問題点を解決し、正確かつ簡単にＮＡＧ活性を
測定できるものである。
の有する問題点を解決し、正確かつ簡単にＮＡＧ活性を
測定できるものである。
従って本発明のＮＡＧ活性測定法は、正常人、腎障害を
有する患者等の尿中ＮＡＧ活性を測定する方法として極
めて有用である。
有する患者等の尿中ＮＡＧ活性を測定する方法として極
めて有用である。
第１図はａ）４−フェニルアゾ−１−ナフトール−４′
−二トロー２′ −スルホン酸ナトリウム塩及びｂ
）４−（４’ −二トロー２′−スルホフェニルアゾ）
−１−ナフチル−Ｎ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサミ
ニド、ナトリウム塩のＵＶスペクトル図である。第２図
はｃ） ４−フェニルアゾ−１−ナフトール−４′−ス
ルホン酸ナトリウム塩及びｄ）４−（４′ −スルホフ
ェニルアゾ）−１−ナフチル−Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−
グルコサミニド−ナトリウム塩のＵＶスペクトル図であ
る。第３図は希釈ＮＡＧとＯＤとの関係を示すグラフで
ある。第４図は希釈ＮＡＧによるタイムコースを示す。 第５図は希釈ＮＡＧとΔＯＤの関係を示すグラフである
。
−二トロー２′ −スルホン酸ナトリウム塩及びｂ
）４−（４’ −二トロー２′−スルホフェニルアゾ）
−１−ナフチル−Ｎ−アセチル−１３−Ｄ−グルコサミ
ニド、ナトリウム塩のＵＶスペクトル図である。第２図
はｃ） ４−フェニルアゾ−１−ナフトール−４′−ス
ルホン酸ナトリウム塩及びｄ）４−（４′ −スルホフ
ェニルアゾ）−１−ナフチル−Ｎ−アセチル−ｐ−Ｄ−
グルコサミニド−ナトリウム塩のＵＶスペクトル図であ
る。第３図は希釈ＮＡＧとＯＤとの関係を示すグラフで
ある。第４図は希釈ＮＡＧによるタイムコースを示す。 第５図は希釈ＮＡＧとΔＯＤの関係を示すグラフである
。
Claims (3)
- （１）一般式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ （式中、Ｒ＿１＿〜＿３のうち少なくとも一つはスルホ
ン酸基またはアルカリ金属スルホネート基を、残りはハ
ロゲン、メトキシ基、ニトロ基または水素原子を示す。 ）で表わされる新規フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチ
ル−１３−Ｄ−グルコサミニド誘導体。 - （２）基質として下記一般式［ I ］で表わされるフエ
ニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニド誘導体を含むＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ダーゼ活性測定試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ （式中、Ｒ＿１＿〜＿３のうち少なくとも一つはスルホ
ン酸基またはアルカリ金属スルホネート基を、残りはハ
ロゲン、メトキシ基、ニトロ基または水素原子を示す。 ） - （３）基質として下記一般式［ I ］で表わされる新規
フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニド誘導体を含む測定試薬を緩衝液で溶解し、これ
に検体を加えてインキュベートし、生成するフェニルア
ゾナフトール誘導体をアルカリ溶液で発色させて比色定
量することを特徴とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニダーゼ活性の測定方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ （式中、Ｒ＿１＿〜＿３のうち少なくとも一つはスルホ
ン酸基またはアルカリ金属スルホネート基を、残りはハ
ロゲン、メトキシ基、ニトロ基または水素原子を示す。 ）
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63331646A JPH0631294B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | 新規グルコサミン誘導体、これを用いる酵素活性測定試薬及び酵素活性測定方法 |
| US07/457,266 US5126329A (en) | 1988-12-29 | 1989-12-27 | Glucosamine derivatives and compositions reagents and containing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63331646A JPH0631294B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | 新規グルコサミン誘導体、これを用いる酵素活性測定試薬及び酵素活性測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02178296A true JPH02178296A (ja) | 1990-07-11 |
| JPH0631294B2 JPH0631294B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=18245993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63331646A Expired - Lifetime JPH0631294B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | 新規グルコサミン誘導体、これを用いる酵素活性測定試薬及び酵素活性測定方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5126329A (ja) |
| JP (1) | JPH0631294B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3942355A1 (de) * | 1989-12-21 | 1991-06-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | N- und o-substituierte aminophenolderivate, zwischenprodukte zu deren herstellung, deren verwendung als hydrolasesubstrate, ein entsprechendes bestimmungsverfahren und hierfuer geeignetes diagnostisches mittel |
| DE3942356A1 (de) * | 1989-12-21 | 1991-06-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung von 1-arylsemicarbaziden zur stabilisierung von enzymsubstraten, entsprechende verfahren und diagnostisches mittel enthaltend einen solchen stabilisator |
| JP2722874B2 (ja) * | 1991-08-01 | 1998-03-09 | 日東紡績株式会社 | 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体及びこれを基質に用いたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定法 |
| CN108218926A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-06-29 | 广东优尼德生物科技有限公司 | 检测N-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷酶的底物及其制备方法和试剂盒 |
| US11919837B1 (en) | 2023-11-02 | 2024-03-05 | King Faisal University | 4,4′-naphthalene-1,5-diylbis(diazene-2,1-diyl)dinaphthalen-1-ol as an antioxidant compound |
-
1988
- 1988-12-29 JP JP63331646A patent/JPH0631294B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-12-27 US US07/457,266 patent/US5126329A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5126329A (en) | 1992-06-30 |
| JPH0631294B2 (ja) | 1994-04-27 |
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