JPH0222288A - オリゴグルコシド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、後記の一般式■の化合物、その製造法並びに
ａ−アミラーゼを測定するための基質としてのその使用
に関する。

従来の技術 血清中のσ−アミラーゼの測定は、すいぞうの機能の重
要な臨床上のパラメータである。αアミラーゼを測定す
るために市場で得られる試薬は、以前には主として基質
としての澱粉又は澱粉誘導体の使用であった。しかしな
がらこの基質は、殊に均一性に関して不十分であること
が判明した。それ故この欠点を除去するために、澱粉及
び澱粉誘導体をオリゴサツカリド及びその光学的に測定
される誘導体に代え、その際殊にマルトテトラオース、
−ペンタオース、ヘキサオース及び−ヘプタオース及び
これらの誘導体によって重要な改良が得られた（ドイツ
公開特許第２７４１１９２号明細書、ドイツ公開特許第
２７５５８０３号明細書、米国特許第３８７９２６３号
明細書、米国特許第４００００４２号明細書）。

前記オリゴグルコシドを使用してのσ−アミラーゼ測定
の特に重要な実施形式は、α−グルコシダーゼの存在で
得られた。それというのもオリゴグルコシドのグルコー
スへの完全な分解が得られ、更にグルコースはこのため
の公知方法によって容易に測定することができたからで
ある（ドイツ公開特許第２７４１１９２号明細書参照）
。

しかしながら、助酵素のび一グルコシダーゼは、でき上
がった試薬混合物の保管貯蔵時間を下げることが判明し
た。それというのもこれはσ−アミラーゼの影響を有し
ないで、オリゴグルコシドの一定分解を惹起するからで
ある。

発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の課題はこれらの欠点を除去し、σ−グ
ルコシダーゼの存在でも十分に保存することができ、σ
−アミラーゼの検出の正確性を改良するα−アミラーゼ
の基質を得ることである。

問題点を解決するための手段 この課題は、本発明によれば、一般式Ｉ：［式中Ｒ及び
Ｒ１は、相互に独立にそれぞれ炭素原子１〜６個を有す
る直鎖状又は分校状のアルキル基又はアルコイル基又は
フェニル基を表わし、Ｒ２はグルコース単位２〜７個を
有するオリゴグルコシド基を表わし、Ｘは水素原子又は
光学的に測定される基を表わす］の化合物によって解決
される。

本発明による化合物ですぐ使える試薬は、α−グルコシ
ダーゼの存在でも変化をこうむらずそれ故長時間後にも
正確なα−アミラーゼの値が得られる。

アルキル基としては、メチル−二チル プロピル−イソプロピル−ブチル−イソブチル−ｔ−ブ
チル−〇−ペンチル基、これらの異性体、ｎ−ヘキシル
基、この異性体並びにシクロヘキシル基が挙げられる。

同じようにして、前記アルキル基に相応するアルコイル
基は、末端グルコシド基の４位及び／又は６位の酸素原
子の置換分として該当する。

オリゴグルコシド基Ｒ２では、グルコース単位３．４及
び６個を有するものが好ましい。

Ｘが光学的に測定される基の場合には、可視光線又は紫
外線の帯域でも色を有する基であるか又は他の化合物と
の反応により、例えば色素に変換するか又は色素と結合
して光学的に測定される基である。かかる光学的に測定
される基は当業者には明らかであり、詳説は不必要であ
る。好ましくはニトロ基を有するフェニル基、例えばニ
トロフェニル基又は３，４−ジニトロフェニル基である
。

本発明による化合物の製造は、末端に場合により光学的
に測定される基Ｘを有するグルコース単位３〜８個を有
するオリゴグルコシドから出発して、これをエステル化
又はエーテル化の条件下にオルトオキシ化合物、好まし
くはジアルコキシエタン又は相応するベンジル誘導体と
反応させ、Ｒ及びＲ１が一緒になって場合により置換さ
れているメチレン基を形成する一般式■の化合物を形成
し、続いて場合により例えばベルアセデル化によって遊
離ＯＨ基を封鎖し、４位又は６位の酸素原子のメチレン
橋を分解し必要の場合にはこのようにして形成した４位
又は６位の遊離ＯＨ基をなおエーテル化又はエステル化
又はエーテル置換又はエステル置換し、最後に他のＯＨ
−封鎖基、例えばアセチル基を脱離することによって行
うことができる。

この合成で中間生成物として生じる、場合により置換さ
れているメチレン橋を有する化合物は、一般式■： Ｒ３−Ｘ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ＩＩ［式中Ｘは前記のものを表わし、Ｒ３はグルコース
単位３〜８個を有するオリゴグルコシド基を表わす］の
化合物を、ｐ−ドルオールスルホン酸の存在で一般弐■
： Ｒ４−Ｃ−（〇−低級アルキル）２ ［式中Ｒ４及びＲ５は相互に独立にそれぞれ水素原子又
は炭素原子１〜５個を有するアルキル基又はフェニル基
を表わす１の化合物と極性有機溶剤中で反応させること
によって製造される極性有機溶剤としては、ジメチルホ
ルムアミド又はホルムアミドが好ましいが、比較される
塩基度を有する他の極性有機溶剤も適当である意外なこ
とにも、前記反応によって均一な生成物が得られ、存在
する多くのＯＨ基を保護することは不必要である。場合
により形成した副産物は容易に分離することができる。

反応は好ましくは温度約ｌＯ〜７０°Ｃ１好ましくは室
温で行う。反応では殆ど副産物は形成しないので、十分
な収率を得るためには、好ましくは化学量論的過剰量の
一般弐■の化合物で作業する。

一般弐■の化合物の例は、ジメトキシメタンジメトキシ
エタン、ジェトキシエタン、ジプロポキシエタン、ジブ
トキシエタン、ジメトキシプロパン、ジメトキシイソプ
ロパン及びフエニルジメトキシメタンである。

一般式■の化合物の例は、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオースマルトヘプタオース
及び末端で光学的に測定される基によって置換されてい
るこれらの誘導体、例エハモノニトロフェニルーマルト
ヘスタオ−７，，３，４−’；ニトロフェニルーマルト
ヘプタオースその他である。

本発明による化合物のすぐれた保管貯蔵性は基！、！：
してのｐ−ニトロフェニルマルトへフタオシド（Ｇ７ｐ
ＮＰ）での十分に普及した常用のαアミラーゼの呈色試
験の条件下、即ち緩衝液のｐ　Ｈ，７，１；　ＮａＣｌ
２５０　ｍＭ　；　ａ−グルコシダーゼ約３０Ｕ／ｍ１
２；基質５　ｍ　Ｍで、４，６−エチリデン−ｐ−ニト
ロフェニルマルトへブタオシド（Ｅｔｈ　−Ｇ７ｐＮＰ
）で２５℃で４日間内のラグ相及び線型に関する実際に
同じ反応経過でグルコースは形成しないが、Ｇ７ｐＮＰ
では著しいグルコースへの分解が生じることを示す。４
℃での同じ条件下では、本発明による基質で８日間後に
グルコースの形成は生じなかったが、これに反して公知
比較基質では著しい分解が生じた。

それ数本発明によって、α−アミラーゼの基質としてα
−グルコシダーゼの存在ですぐれた性質を有する新規化
合物が得られる。

実施例 例　　１ ４．６−エチリデン−４−ニトロフェニル−σ−Ｄ−マ
ルトヘプタオシドの製造法。

バッチ： ４−ニトロフェニル＝α−Ｄ−マルトヘプタオシド　　
　　２５０ｇ　（１９６ｍモル）アセトアルデヒド−ジ
メチルアセタール３１．５ｍ＜１（２９７ｍモル） バラ−ドルオールスルホン酸・Ｈ２Ｏ ２０ｇ ＤＭＦ　（ジメチルホルムアミド）　　１．５Ｑ合　　
成　： ４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘフタオシｌ’２
５０ｇ及びバラ−ドルオールスルポン酸・Ｈ２Ｏ２０ｇ
をＤＭＦ約１．５１２にとがし、無水にするために回転
蒸発器で回転させて乾燥する。その除水の含量が０．４
％から０．０２％に下がる。

残渣をＤＭＦｌ、５ｆｆにとがし、アセトアルデヒド−
ジメチルアセタール３１．５ｍ４を添加し、先づ５０°
Ｃで９時間撹拌し、次いで室温で約１０時間維持する。

反応混合物を濃縮乾燥し、残渣を水にとかし、水酸化リ
チウム溶液でｐａ１７．３に調節し、濾過し、７５０ｍ
（２に濃縮する。

ＨＰＬＣ分析によって、原料約２０％を有するエチリデ
ン−４−二トロフェニルーα−Ｄマルトヘプタオシド約
７５〜８０％の含量が得られる。

クロマトグラフィーによる精製： 試料溶液（７５０ｍｆｆ）を、Ｄｏｗｅｘ５０　　Ｗ　
Ｘ　２（２００〜４００メツシユ）リチウム＋７００ヲ
有スる１５０Ｘ２５ｃｍのカラムにあけ、水で流量１．
５１２／時間で溶出する。その際フラクション４．５Ｑ
を採取し、クロマトグラフィーを紫外線検出器を用いて
２８０ｎｍで行う。

約１００Ｑによって未反応の４−二トロフェニルーα−
Ｄ−マルトヘプタオシドが溶出し、約２００Ｑによって
求める生成物が溶出する。

生成物を含有するフラクションを合し、濃縮乾燥する。

残渣をメタノール１．５Ｑにとかし、濾過し、０°Ｃで
イソプロパツール４ａ及び石油エーテル１０１２で沈殿
させる。４°Ｃ′？ｌｓ１夜撹拌後に、生成物を吸引濾
過し、イソプロパツール及び石油エーテルで洗浄し、乾
燥基中で３０°Ｃで乾燥する。

収量：１５０ｇ　（理論量の５８％）、無色の粉末、分
子量１３００゜ 分析： Ｈ２Ｏ［フイシャ−（Ｋ、　Ｆｉｓｃｈｅｒ）による１
４．５％ イソプロパツール（ガスクロマトグラフィーによる）　
　　　　　　　　　　　　　　５％酸性加水分解（酵素
）によるアセトアルデヒド９１　％ ［αＩＤ２５°Ｃ（乾燥物質に対する）−７７°（Ｃ−
１，Ｈ２Ｏ） ＨＰＬＣｎ面の％９９（−ＮＨ２−柱５μ；アセトニト
リル／水１：ｌ、ｃ−燐酸１ｍモル／Ｑ、３０５ｎｍで
検波）。

例　　２ ４．６−ニチリデンーマルトヘプタオースの製造法。

バッチ： マルトヘプタオース　ＩＱｇ（８，７ｍモル）アセトア
ルデヒド−ジメチルアセタール１．８　ｍＱ　（１７ｍ
　モル） パラ−ドルオールスルホン酸・Ｈ２Ｏ１ｇＤＭＦ　　　
　　　　　　　　　　　　７５ｍＱ合　　成　： マルトヘプタオース１０９及びバラ−ドルオールスルホ
ン酸−Ｈ２０１ｇをＤＭＦ１００ｍ１２にとかし、濃縮
乾燥する。この方法で残渣を無水にする。残渣をＤＭＦ
７５ｍ１２にとかし、アセトアルデヒド−ジメチルアセ
タール１．７肩１２を加え、密閉して５０℃で１５時間
撹拌する。次いで反応溶液を濃縮乾燥し、残渣を水にと
かし、水酸化リチウムでｐＨ７に中和し、濾過し、５０
ｒａＱに濃縮する。

クロマトグラフィーによる精製： 試料溶液５０ｍＱを、Ｄｏｖｅｘ５０　　ＷＸ　２　（
２００〜４００メツシユ）Ｌ＋　３．５Ｑを有するクロ
マトグラフィーのカラム（１８０Ｘ５ｃｍ）にあけ水で
流量１５０　ｍＱ／時間で溶出する。紫外線検波器（２
８０ｎｍ）を通るフラクション３０＋ＩｌＱを採取する
。

１．８Ｑによりマルトヘプタオースが溶出し、２．２５
Ｑによりエチリデン−マルトヘプタオースが溶出する。

主要７ラクシタンを合し、回転させて乾燥し水を若干添
加してメタノール２００ｍＱにとかしイソプロパツール
２００ｍ（２を加え、４°Ｃで撹拌する。その際生成物
が沈殿し、これを吸引濾過しインプロパツール及び石油
エーテルで洗浄し、真空中で２５°ＣでＰ２Ｏ５によっ
て乾燥する。

収量：６．２ｇ　（理論量の６０％） 分析： 水［フィシャー（Ｋ、　Ｆｉｓｃｈｅｒ）による１７．
６％ 酸性加水分解（酵素）によるアセトアルデヒド９１．２
％ ［αＩＤ２５°Ｃ（乾燥物質に対する）＝６９°　（ｃ
−１，Ｈ２Ｏ） ＨＰＬＣ（例１の条件参照）：面の％　９６テトラゾリ
ウムブルーとの反応は、還元性末端が存在しないことを
示す。

例　　３ 試薬： エチリデン−Ｇ７ｐＮＰ　６８２．５ｍｇ（５，２５ｍ
モル／Ｑ）を、塩化ナトリウム（５２，５ｍモル／Ｑ）
並びにアルファーグルコシダーゼ（４２Ｕ／ｍＱ）を含
有する燐酸ナトリウム緩衝液１００ｍ（１（１０５ｍモ
ル／４）にとかし、ｐＨ７，１０に調節した。

試験の最終濃度： 燐酸塩緩衝液１００ｍモル／　Ｑ％ＮａＣＱ５０　ｍ−
Ｅ：Ａｙ／ＱＳ　ＭＷ　５　ｍモル／Ｑ１　アルファー
グルコシダーゼ４０Ｕ／ｍＱ。

試験バッチ： ２５℃に加熱した試薬２．０ｍＱに試料０　、　ｌ　ｒ
ａＱを添加し、混合物を２５°Ｃに加熱した。予培養時
間４分間（ラグ相）後に、吸光の増大をＨｇ４０５ｎｍ
でエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　）光度計で記
録した。毎分の吸光の変化（ΔＥ／分）から、試料中の
アミラーゼの活性を次式によって計算した。

ΔＥ／分・Ｖ−１０００・３ 一ΔＥ／分・７０００　［Ｕ／ＱＩ −Ｖ−ｄ アルファーアミラーゼの再発見： 活性の測定を、４°Ｃ及び２５℃で保存した試薬で一定
の時間間隔でくり返し、次の値が得られ　ｌこ　。

最初の値 ４時間（２５°Ｃ） ８時間　／／ ２４時間　／／ ３２時間　〃 ４８時間　／／ ８時間（４℃） ２４時間　／／ ４８時間　ｌ／ ７２時間　！／ ８０時間　〃 平均値／ＶＫ ＋２１ ３．２％ ３．０％ 個々の値は、手工による酵素の活性の測定に対する通常
の変動中である。

２．０％

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ I ［式中Ｒ及びＲ＿１は、相互に独立にそれぞれ炭素原子
   １〜６個を有する直鎖状又は分枝状のアルキル基又はア
   ルコール基又はフェニル基を表わし、Ｒ＿２はグルコー
   ス単位２〜７個を有するオリゴグルコシド基を表わし、
   Ｘは水素原子又は光学的に測定される基を表わす］の化
   合物。