JPH022594B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

＜技術分野＞ 本発明はリノール酸を唯一の脂肪酸とするホス
フアチジルコリン及びホスフアチジルエタノール
アミンの担子菌類ペリキユラリア属菌による製造
方法に関するものである。 ＜従来技術＞ 担子菌類ペリキユラリア属菌の培養によるリノ
ール酸含量の高い脂質を製造する方法については
既に提案されている。（特許第1111933号） ところで、グリセロ型リン脂質の一種であるホ
スフアチジルコリン（）及びホスフアチジルエ
タノールアミン（）は、次に示すような構造式
を持つことが知られている。 その構成脂肪酸であるRCOOH及びR′COOHが
いずれもリノール酸であるホスフアチジルコリン
あるいはホスフアチジルエタノールアミンが、微
生物の生産した脂質或は植物の生産した脂質から
単離濃縮された従来技術はない。 ＜目的＞ 本発明は、リノール酸を唯一の構成脂肪酸とす
るホスフアチジルコリン及びホスフアチジルエタ
ノールアミンの製造方法を提供することを目的と
する。 ＜構成＞ 本発明によれば、ペリキユラリア属菌を炭水化
物を炭素源とし、界面活性剤を加えた培地に培養
して得られた菌体から抽出して得られた脂質よ
り、リノール酸を唯一の構成脂肪酸とするホスフ
アチジルコリン及びホスフアチジルエタノールア
ミンを分離精製することを特徴とするリノール酸
を唯一の構成脂肪酸とするホスフアチジルコリン
及びホスフアチジルエタノールアミンの製造方法
が提供される。 ペリキユラリア属菌を培養する培地の炭素源で
ある炭水化物としては、たとえばグルコース、フ
ラクトース、サツカロース、糖蜜、デン粉、木材
糖化液、セルロースなどが用いられる。炭水化物
は培地１中に20ｇから150ｇ用いるのが好まし
い。窒素源としては、例えば硝酸アンモニウム、
リン酸アンモニウムなどのような無機窒素源、ま
たは尿素、ペプトン、酵母エキス、コーン・スチ
ーブ・リカーなどの有機窒素源が用いられる。ま
た界面活性剤としては、通常、疎水基として、長
鎖脂肪酸エステルなどを含む、非イオン性界面活
性剤あるいは、アニオン型のイオン性界面活性剤
が用いられる。このようなものとしては、例え
ば、Tween−20やTween−80、コール酸ナトリ
ウムなどが挙げられる。この界面活性剤は培地１
中に0.1ｇから５ｇ／添加することが好まし
く、界面活性剤の添加により、リノール酸を唯一
の構成脂肪酸とするホスフアチジルコリンあるい
はホスフアチジルエタノールアミンなどの脂質を
含んだ菌体が培地中に高濃度に培養される。無機
塩としては、例えばKH₂PO₄、K₂HPO₄、NaCl、
FeSO₄・7H₂O、MgSO₄・7H₂O、ZnSO₄・7H₂O
などが用いられる。その他必要に応じて微量要
素、その他の栄養源を添加する。 菌の培覆は、通常液体培地で、振とう培養、通
気撹はん培養などにより行なわれる。培地のPHは
3.0から6.0がよく、通常３日から10日間位培養を
行う。かくして、培養物中にリノール酸などの不
飽和脂肪酸含量の高いホスフアチジルコリン及び
ホスフアチジルエタノールアミンなどの脂質を含
んだ菌体が生産性高く生産されるので、培養物よ
り菌体を分離し、この菌体中よりリノール酸を唯
一の構成脂肪酸とするホスフアチジルコリン及び
ホスフアチジルエタノールアミンを含む脂質を採
取するのが好適である。培養物よりの菌体の分離
に当たつては、例えば遠心脱水機などにより極め
て容易に分離される。 ＜抽出方法＞ リノール酸を唯一の脂肪酸とするホスフアチジ
ルコリン及びホスフアチジルエタノールアミンを
含む脂質の採取は、多段抽出法で行なわれる。す
なわち、本発明においては、ペリキユラリア属菌
菌体を、まず水の存在下でアルコールを用いる第
一段処理工程において抽出処理する。この場合、
処理原料として用いる菌体には、培地から遠心分
離法や濾過法によつて分離された含水率50〜80％
程度の含水菌体ケーキや、その乾燥物を用いるこ
とができるが、経済性の点からは、含水菌体ケー
キを用いるのが有利である。また、この第１抽出
処理工程では、菌体は、水の存在下、アルコール
溶媒中で、機械力を加えて破砕させることが必要
であり、この菌体破砕によつて効率的な抽出処理
が達成される。このような菌体破砕を伴う抽出装
置としては、従来公知の湿式粉砕機、例えば、ボ
ールミル、マサツ円板ミル、ヘンセルミキサー等
を用いることができる。このような粉砕機により
菌体は、圧縮力やマサツ力等の機械力を受け、そ
の一部が破損ないし破砕される。この場合、菌体
を余りにも微細に破砕することは好ましくなく、
濾過性の点からは、その菌体の粒径が実質上変化
しない程度に機械力を加えるのが好ましい。アル
コール溶媒としては、通常、メタノール、エタノ
ール、プロパノール等の低級アルコールが用いら
れるが、人体に対する安全性の点から、エタノー
ルの使用が好ましい。アルコール溶媒の使用割合
は、菌体１重量部（乾燥物基準）に対し、２〜７
重量部、好ましくは３〜６重量部の割合である。
この第１抽出処理工程では、極性脂質を溶出させ
るために、水の存在下で抽出処理を行うことが必
要であり、水の存在量は、アルコール溶媒１重量
に対し、0.2〜0.7重量部、好ましくは0.3〜0.6重
量部である。この第１抽出処理系に対する水の添
加は、水を含む菌体を用いて実施し得る他、アル
コール溶媒に添加することによつて行なうことが
できる。このような抽出処理により、菌体に含ま
れる全極性脂質の90％以上を抽出分離させること
ができ、また中性脂質の一部が抽出される。ま
た、この第１抽出工程では、脂質回収率は、全脂
質回収率に対し、通常、30〜80重量％、好ましく
は40〜70重量％である。 次に、前記で得た第１抽出生成物は第１固液分
離工程で破砕菌体成分と極性脂質を含むアルコー
ル溶媒成分とにそれぞれ分離される。この場合、
固液分離法としては、遠心分離法や、濾過分離法
等の慣用の方法が採用される。脂質分は得られた
極性脂質を含むアルコール溶媒成分から常法に従
つて減圧下で溶媒を蒸留留去することにより得ら
れる。 ＜分離・濃縮法＞ 前記多段抽出方法のアルコールを溶媒とした、
第一段目の抽出操作により得られた極性脂質成分
について吸着カラムクロマトグラフイーあるいは
逆相高速液体クロマトグラフイーなどによる分
離・濃縮操作を行うことにより、リノール酸を唯
一の脂肪酸とするホスフアチジルコリン及びホス
フアチジルエタノールアミンが分離、精製され
る。すなわち、50から300メツシユ、好ましくは、
100から200メツシユのケイ酸（シリカゲル）、微
粒多孔質シリカ、シリカゲルＨ、シリカゲルＧ、
ケイ酸マグネシウムなどを充填剤としたカラムを
用いて、ヘキサン、シクロヘキサン、四塩化炭
素、ベンゼン、クロロホルム、ジエチルエーテ
ル、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、メ
タノールなどを溶媒に用いて、その極性に応じて
一種類ないし２から３種類混合した溶媒、例えば
クロロホルムとメタノール９：１、４：１、１：
１、１：４の混合溶媒を順次流下することによ
り、各極性脂質の吸着力の差により分離溶出が可
能になり、リノール酸を唯一の構成脂肪酸とする
ホスフアチジルコリンあるいはホスフアチジルエ
タノールアミンがそれぞれ分離されて含まれる溶
出液を得る。この溶出液より常法により溶媒を減
圧下で蒸留留去することにより、リノール酸を唯
一の構成脂肪酸とするホスフアチジルコリン及び
ホスフアチジルエタノールアミンを高濃度で含む
区分が得られることを見いだした。さらに、それ
らの区分あるいは前記のシリカゲルカラムにてク
ロロホルムによつて中性脂質区分を除いた後にメ
タノールによつて流出される極性脂質区分をシリ
カゲルにオクタデシル基などを共有結合したよう
な逆相高速液体クロマトグラフにてアセトニトリ
ル、メタノール、エタノール、水などの混合溶媒
を移動相とした逆相高速液体クロマトグラフイー
による精製を行うことにより、リノール酸を唯一
の構成脂肪酸とするホスフアチジルコリン及びホ
スフアチジルエタノールアミンがそれぞれほぼ
100％の濃度で分離濃縮されることが認められた。 かくして、本発明によればグルコースなどの炭
水化物を炭素源として界面活性剤を添加した培地
に高密度に培養された菌体より得られた脂質につ
いてカラムクロマトグラフイー、逆相高速液体ク
ロマトグラフイーなどによる分離・濃縮を行うこ
とにより、リノール酸を唯一の構成脂肪酸とする
ホスフアチジルコリン及びホスフアチジルエタノ
ールアミンの製造が可能になる。 ＜効果＞ リノール酸（C18：２（cis9、12））は、ほ乳動
物では体内で合成できない必須脂肪酸であり、生
体内でビスホモγ−リノレン酸やアラキドン酸な
どを経て、生体内で重要な生理的役割を果してい
るプロスタグランジンなどへ転換されていく前駆
物質である。また、生体内でのそれらの変換はホ
スフアチジルコリンやホスフアチジルエタノール
アミンなどのリン脂質状態で行われている。リン
脂質は、そのような必須脂肪酸の転換や、血清中
のの脂質量のコントロール、脂溶性ビタミンの消
化吸収、生体膜に結合した酵素の制御に関与して
いるなど生体膜上などで多くの生理的役割をはた
していることが知られており、特にリノール酸を
唯一の構成脂肪酸とするホスフアチジルエタノー
ルアミンが血清脂質像改善効果を持つことなどが
解明されてきた。従つて、リノール酸を唯一の構
成脂肪酸成分とするホスフアチジルコリン及びホ
スフアチジルエタノールアミンは生理活性を持つ
脂質として医薬品などとして利用できるものであ
ることは明かである。 ＜実施例＞ 次に本発明を実施例により詳細に説明する。 実施例 １ グルコース90ｇ、KH₂PO₄3.0ｇ、MgSO₄・
7H₂O0.5ｇ、NaCl0.1ｇ、マルトエキス0.2ｇ、イ
ーストエキス0.2ｇ、ペプトン0.1ｇ、FeSO₄・
7H₂O10mg、MnSO₄・4H₂O1.0mg、CaCl₂・
2H₂O1.0mg、ZnSO₄・7H₂O1.0mgと窒素源として
NH₄NO₃を3.0ｇ、界面活性剤としてTween−80
を5.0mlを脱イオン水1000mlに混合して培地を調
整した。 この培地200mlの入つた500mlフラスコに菌をそ
れぞれ接種し、30℃の培養温度で３日間培養を行
つた後、先の培地3.0の入つた4.5の容量の培
養槽に全量移植した。培養槽の培養条件は、培養
温度30℃、通気量0.5から2.0vvmで300から
700rpmでの撹拌として、６日間の培養を行つた。
培養後遠心分離法で菌体を集めた。培養中は、菌
体の増殖量、脂質の生成量及び培地中の炭水化物
の濃度の測定を行うために、所定の時間毎に50ml
ずつの試料の採取を行い、濾過法により菌体と培
地の分離を行つた。分離された菌体はその一部を
含水率の定量のため、精秤し恒温槽中120℃で一
昼夜乾燥し、含水率を求め、残りの菌体について
脂質の抽出を行つた。菌体からの脂質の抽出は、
残りの湿菌体にクロロホルム−メタノール（２：
1V／Ｖ）混液を加え、ガラスビーズ存在下にホ
モジナイズすることにより菌体の破砕と脂質の抽
出を同時に行つた。 なお、抽出を完全に行うため、これを５回繰返
し、全抽出液を集めた。上記抽出液をFlochの分
配洗浄法により精製した後、溶媒を減圧留去し、
重量法で全脂質量を測定した。菌体を除いた培地
については高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）により炭水化物（グルコース、フラク
トース、サツカロース）の濃度を測定した。 菌株ペリキユラリア属菌フイラメントサ・ソラ
ニIF05879、フイラメントサ・ササキIF08985、
プラテイコラIF06253について培養を行つた結果
について、菌体増殖量（乾燥重量ｇ／）、脂質
生成量（ｇ／）、脂質含量（％）、脂質中のリノ
ール酸含量（％）を表−１にまとめてしめした。
表−１で各菌株ともリノール酸を含む脂質が高く
生産されていることがわかる。 このようにして得られた菌体を遠心脱水機によ
り脱水分離して、含水率50から70％の菌体ブロツ
ク（ケーキ）を得る。この菌体ブロツク（以下湿
菌体と呼ぶ）をステンレス製ボールミルを用いて
菌体の破砕と抽出処理を行つた。ボールミルは内
容積６で、そこに前記の湿菌体1.0から2.0Kgと
エタノール２を溶媒として加えて４時間破砕抽
出処理を行つた。抽出液を濾過した後、得られた
菌体について再度ヘキサン２を溶媒として用い
て前記と同様の抽出処理を４時間行つた。この２
段抽出処理方法にて、前記３菌株についての第一
段のエタノールによる抽出結果を表−１に合わせ
て示した。 このエタノール抽出区分について、ケイ酸
（100から200メツシユ）を充填剤とするカラムク
ロマトグラフイーを行い、リノール酸を唯一の構
成脂肪酸成分とするホスフアチジルコリン及びホ
スフアチジルエタノールアミンの分離濃縮を行つ
た。即ち、前記抽出脂質２ｇに対して30ｇのケイ
酸を充填したカラムに脂質を吸着させた後、中性
脂質分をクロロホルムで、糖脂質区分をアセトン
で流出させた後、クロロホルムとメタノールの
９：１、４：１、１：１、１：４の混合液を順次
流した。その結果、クロロホルムとメタノール
４：１の区分にホスフアチジルエタノールアミン
が、また１：４の区分にホスフアチジルコリンが
93.5％以上の濃度で濃縮されていることがリン脂
質組成分析用の高速液体クロマトグラフイーによ
る分析の結果認められた。このようにして得られ
たホスフアチジルコリン及びホスフアチジルエタ
ノールアミンについて逆相高速液体クロマトグラ
フイーによる組成分析の結果、リノール酸を唯一
の構成脂肪酸とする成分はそれぞれ67.5％から
92.2％と極めて高い値であつた。また加水分解の
後にメチルエステル化を行い、その脂肪酸組成を
比べた結果、リノール酸の含量は76から92％と極
めて高い値が得られており、リノール酸を唯一の
構成脂肪酸とするホスフアチジルコリン及びホス
フアチジルエタノールアミンが高い含量で含まれ
ていることが認められた。更にこの二つの区分に
ついて分取用の逆相高速液体クロマトグラフイー
による精製を行い、リノール酸を唯一の構成脂肪
酸とするホスフアチジルコリン及びホスフアチジ
ルエタノールアミンの単離を行つた。使用したカ
ラムはシリカゲルの表面にオクタデシル基を共有
結合させた充填剤を用いた内径16.7mm、長さ250
mmの分取用の逆相高速液体クロマトグラフのカラ
ムで、移動相はアセトニトリルとメタノールの
１：１の混合溶液を使用し、ポンプの流速を毎分
15mlとしておこなつた。前記のシリカゲルクロマ
トグラフイーにより分離された成分10mgから50mg
をこの逆相高速液体クロマトグラフイーにて分離
させることによりホスフアチジルコリン及びホス
フアチジルエタノールアミンはそれぞれリノール
酸を唯一の構成脂肪酸とする区分とその他の成分
とに分離され、リノール酸だけの区分を分取する
ことにより、表−２に示すようにリノール酸を唯
一の構成脂肪酸とするホスフアチジルコリン及び
ホスフアチジルエタノールアミンがほぼ100％の
濃度で得られることが認められた。 実施例 ２ 実施例１と同様に培養を行つて得られた湿菌体
をボールミルによる抽出操作を行い、エタノール
抽出区分を得た。このエタノール抽出区分２ｇに
対して30ｇのケイ酸を充填したカラムに脂質を吸
着させ、中性脂質分をクロロホルムで流出させた
後、メタノールにて糖脂質及びホスフアチジルコ
リン及びホスフアチジルエタノールアミンなどの
含まれる極性脂質区分を流出させた。この極性脂
質区分について逆相高速液体クロマトグラフイー
によつてリノール酸を唯一の脂肪酸とするホスフ
アチジルコリン及びホスフアチジルエタノールア
ミンの精製を行つた。即ち、シリカゲルの表面に
オクタデシル基を共有結合させた充填剤の内径
6.4mm、長さ250mmの分取用の逆相高速液体クロマ
トグラフカラムで、移動層として5.0％の水を加
えたメタノールを用いて、流速を毎分6.0mlとし
た条件で極性脂質区分10から20mgの分離を行つ
た。これにより、極性脂質区分の各種成分はそれ
ぞれの成分ごとに、またその構成脂肪酸組成ごと
に分離して流出してくるので、それらの中心成分
であるリノール酸を唯一の構成脂肪酸とするホス
フアチジルコリン及びホスフアチジルエタノール
アミンの区分を分取した。その結果、表−３に示
す様にそれぞれの区分からリノール酸を唯一の構
成脂肪酸とするホスフアチジルコリン及びホスフ
アチジルエタノールアミンがほぼ100％の濃度で
得られることが認められた。

【表】

【表】

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ペリキユラリア属菌を炭水化物を炭素源と
   し、界面活性剤を加えた培地に培養して得られた
   菌体から抽出して得られた脂質より、リノール酸
   を唯一の構成脂肪酸とするホスフアチジルコリン
   及びホスフアチジルエタノールアミンを分離精製
   することを特徴とするリノール酸を唯一の構成脂
   肪酸とするホスフアチジルコリン及びホスフアチ
   ジルエタノールアミンの製造方法。