JPH022595B2 - - Google Patents
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- JPH022595B2 JPH022595B2 JP55101444A JP10144480A JPH022595B2 JP H022595 B2 JPH022595 B2 JP H022595B2 JP 55101444 A JP55101444 A JP 55101444A JP 10144480 A JP10144480 A JP 10144480A JP H022595 B2 JPH022595 B2 JP H022595B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、限外濾過膜を備えた膜反応器中で同
時にホルメートデヒドロゲナーゼの存在でホルメ
ートイオンを用いてNAD+からNADHを再生し
つつ、基質特異性のデヒドロゲナーゼ、アンモニ
ウムイオン、および水溶性ポリマーへの結合によ
り分子量が増加したニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（NAD+／NADH）の存在で水溶性
α−ケトカルボン酸を相応するアミノ酸へ連続的
に酵素変換する方法に関する。
時にホルメートデヒドロゲナーゼの存在でホルメ
ートイオンを用いてNAD+からNADHを再生し
つつ、基質特異性のデヒドロゲナーゼ、アンモニ
ウムイオン、および水溶性ポリマーへの結合によ
り分子量が増加したニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（NAD+／NADH）の存在で水溶性
α−ケトカルボン酸を相応するアミノ酸へ連続的
に酵素変換する方法に関する。
膜反応器中での酵素反応は既に長い間研究され
てきたが、一般には、膜を介しての反応混合物の
強制対流なしに、補酵素の連続的再生なしに、か
つきわめて小さな基質濃度を用いて行なわれてき
た。かかる生産規模の反応の使用はそのために連
続的方法実施ができず、かつ低い時空収率しか得
られない点でこれまで失敗であつた。ところで本
発明による方法は、その膜が平均孔径１〜3nｍ
を有し、かつホルメートデヒドロゲナーゼ、基質
特異性デヒドロゲナーゼ、および平均分子量500
〜50000のポリオキシエチレンに結合して存在す
るNAD+／NADH0.1〜10ミリモル／の溶液を
含有する膜反応器に、最大可溶量の50〜100％の、
しかし2000ミリモル／を越えない量の基質であ
る、水溶性塩の形状の反応すべきα−ケトカルボ
ン酸、基質の量にほぼ当量のアンモニウムイオン
およびホルメート100〜6000ミリモル／の水溶
液を連続的に供給し、膜を介して差圧0.1〜15バ
ールを維持し、かつ膜の後方で形成されるアミノ
酸を含有する濾液流を連続的に導出することより
成る。
てきたが、一般には、膜を介しての反応混合物の
強制対流なしに、補酵素の連続的再生なしに、か
つきわめて小さな基質濃度を用いて行なわれてき
た。かかる生産規模の反応の使用はそのために連
続的方法実施ができず、かつ低い時空収率しか得
られない点でこれまで失敗であつた。ところで本
発明による方法は、その膜が平均孔径１〜3nｍ
を有し、かつホルメートデヒドロゲナーゼ、基質
特異性デヒドロゲナーゼ、および平均分子量500
〜50000のポリオキシエチレンに結合して存在す
るNAD+／NADH0.1〜10ミリモル／の溶液を
含有する膜反応器に、最大可溶量の50〜100％の、
しかし2000ミリモル／を越えない量の基質であ
る、水溶性塩の形状の反応すべきα−ケトカルボ
ン酸、基質の量にほぼ当量のアンモニウムイオン
およびホルメート100〜6000ミリモル／の水溶
液を連続的に供給し、膜を介して差圧0.1〜15バ
ールを維持し、かつ膜の後方で形成されるアミノ
酸を含有する濾液流を連続的に導出することより
成る。
本発明による方法は水溶性α−ケトカルボン酸
を連続的にかつ高い時空収率で相応するアミノ酸
に変えることを可能にし、したがつて該アミノ酸
の費用的に有利な製造に適用可能である。
を連続的にかつ高い時空収率で相応するアミノ酸
に変えることを可能にし、したがつて該アミノ酸
の費用的に有利な製造に適用可能である。
反応容器として限外濾過膜を備えた膜反応器を
使用し、その膜は使用される酵素および反応に必
要な補酵素を反応器中に残留させるが、しかし低
分子生成物および未反応の基質を通過させる働き
をする。膜反応器はいわゆる扁平膜反応器として
形成されていてよい。この反応器の型は例えば平
らな円筒状容器であり、この上にＯ−リングでシ
ールされたカバーが固定される。このＯ−リング
と一緒に平面的に延ばされた平らな膜が張られ
る。基質流を配量ポンプによつて膜の下側にある
反応室に供給する。反応室は有利に撹拌装置、例
えば磁気撹拌機を備えている。生成物を含む濾液
流は膜、およびその機械的応力を避けるために膜
の上に配置された多孔板を通つて反応室を出、か
つカバーから導出される限外濾過膜の中空繊維
束、いわゆる中空繊維モジユールを扁平膜の代わ
りに用いた、いわゆる中空繊維膜反応器は、この
立体的配置のために膜と平行な流体のより高いレ
イノルズ数、したがつて膜への酵素たん白質の僅
かな被覆が得られる場合により有利である。この
反応器型は例えば反応容器、循環ポンプおよび中
空繊維モジユールから成る、ループ型反応器の種
類である。基質流は配量ポンプを用いて反応容器
に供給される。この中で反応混合物は循環され、
その際中空繊維膜への酵素たん白質による被覆を
できる限り小さく保つために循環流は基質流との
比で少なくとも約100：１である。生成物を含む
濾液流は中空繊維膜に通過して入り、ここで集め
られ、かつ導出される。本発明による方法では平
均孔径１〜3nｍを有する膜を使用する。膜とし
ての好適な材料は例えばアセチルセルロース、ポ
リアミド、ポリスルホンまたは変性ポリビニルア
ルコールである。
使用し、その膜は使用される酵素および反応に必
要な補酵素を反応器中に残留させるが、しかし低
分子生成物および未反応の基質を通過させる働き
をする。膜反応器はいわゆる扁平膜反応器として
形成されていてよい。この反応器の型は例えば平
らな円筒状容器であり、この上にＯ−リングでシ
ールされたカバーが固定される。このＯ−リング
と一緒に平面的に延ばされた平らな膜が張られ
る。基質流を配量ポンプによつて膜の下側にある
反応室に供給する。反応室は有利に撹拌装置、例
えば磁気撹拌機を備えている。生成物を含む濾液
流は膜、およびその機械的応力を避けるために膜
の上に配置された多孔板を通つて反応室を出、か
つカバーから導出される限外濾過膜の中空繊維
束、いわゆる中空繊維モジユールを扁平膜の代わ
りに用いた、いわゆる中空繊維膜反応器は、この
立体的配置のために膜と平行な流体のより高いレ
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かな被覆が得られる場合により有利である。この
反応器型は例えば反応容器、循環ポンプおよび中
空繊維モジユールから成る、ループ型反応器の種
類である。基質流は配量ポンプを用いて反応容器
に供給される。この中で反応混合物は循環され、
その際中空繊維膜への酵素たん白質による被覆を
できる限り小さく保つために循環流は基質流との
比で少なくとも約100：１である。生成物を含む
濾液流は中空繊維膜に通過して入り、ここで集め
られ、かつ導出される。本発明による方法では平
均孔径１〜3nｍを有する膜を使用する。膜とし
ての好適な材料は例えばアセチルセルロース、ポ
リアミド、ポリスルホンまたは変性ポリビニルア
ルコールである。
膜反応器はホルメートデヒドロゲナーゼ、基質
特異性デヒドロゲナーゼおよび分子量の増加した
NAD+／NADHの溶液を含む。ホルメートデヒ
ドロゲナーゼは有利にその活性が少なくとも
12000μモル／・分になるような量で使用され
る。使用量の上限は有利に、たん白質の濃度が最
大約20ｇ／になるように限定すべきである。基
質特異性デヒドロゲナーゼは有利に、ホルメート
デヒドロゲナーゼと基質特異性デヒドロゲナーゼ
の活性の比が１：１〜１：５になるような量で使
用する。
特異性デヒドロゲナーゼおよび分子量の増加した
NAD+／NADHの溶液を含む。ホルメートデヒ
ドロゲナーゼは有利にその活性が少なくとも
12000μモル／・分になるような量で使用され
る。使用量の上限は有利に、たん白質の濃度が最
大約20ｇ／になるように限定すべきである。基
質特異性デヒドロゲナーゼは有利に、ホルメート
デヒドロゲナーゼと基質特異性デヒドロゲナーゼ
の活性の比が１：１〜１：５になるような量で使
用する。
本発明による方法で補酵素として必要な
NAD+／NADHはポリオキシエチレンに結合す
ることにより、均一な接触反応を可能にするため
に依然として水溶性であるが、他方２つの酵素と
一緒に膜によつて確実に保留される範囲内で分子
量を増加させなければならない。そのために例え
ば酸化型の補酵素を先ずエチレンイミンと反応さ
せてＮ(1)−アミノエチル誘導体にし、これを次に
カルボジイミド法〔カトレカナス
（Cuatrecanas）著、“ジヤーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリ（Ｊ・Biol.Chem.、245
巻、3059頁（1970年）〕を用いてそのポリオキシ
エチレン鎖が平均分子量500〜50000、有利に1500
〜10000を有するカルボキシル化ポリエチレング
リコールに結合する。次いで得られる結合生成物
を還元して相応するNADH誘導体にし、ジムロ
−（Dimroth）−転位によりＮ(6)−誘導体に変え、
かつ場合により再度酸化して相応するNAD+−誘
導体にする。分子量の増加した補酵素は、
NAD+／NADHの濃度が0.1〜10ミリモル／、
有利に１〜７ミリモル／になる量で使用され
る。
NAD+／NADHはポリオキシエチレンに結合す
ることにより、均一な接触反応を可能にするため
に依然として水溶性であるが、他方２つの酵素と
一緒に膜によつて確実に保留される範囲内で分子
量を増加させなければならない。そのために例え
ば酸化型の補酵素を先ずエチレンイミンと反応さ
せてＮ(1)−アミノエチル誘導体にし、これを次に
カルボジイミド法〔カトレカナス
（Cuatrecanas）著、“ジヤーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリ（Ｊ・Biol.Chem.、245
巻、3059頁（1970年）〕を用いてそのポリオキシ
エチレン鎖が平均分子量500〜50000、有利に1500
〜10000を有するカルボキシル化ポリエチレング
リコールに結合する。次いで得られる結合生成物
を還元して相応するNADH誘導体にし、ジムロ
−（Dimroth）−転位によりＮ(6)−誘導体に変え、
かつ場合により再度酸化して相応するNAD+−誘
導体にする。分子量の増加した補酵素は、
NAD+／NADHの濃度が0.1〜10ミリモル／、
有利に１〜７ミリモル／になる量で使用され
る。
基質、アンモニウムイオンおよびホルメートイ
オンの水溶液を膜反応器に連続的に供給する。基
質の濃度は最大可能濃度の50〜100％でなければ
ならないが、2000ミリモル／、有利に1000ミリ
モル／を超えてはならない。アンモニウムイオ
ンの濃度は基質の完全な変換のためには基質量と
当モル量でなければならないが、過剰のアンモニ
ウムイオンは反応を妨害しない。しかし他方本発
明による方法で膜の前で必然的に生じる生成物と
基質との再混合のために定量的な反応はいずれに
せよ達成することはできない。したがつて多くの
場合、若干過少量で、例えば基質の定量的反応に
必要な量の約80％のみを用いて使用すれば十分で
ある。ホルメートイオンの濃度は100〜6000ミリ
モル／、有利に300〜2000ミリモル／である。
ホルメートとしては有利に蟻酸ナトリウムまたは
蟻酸カリウムを使用する。しかし基質溶液にアン
モニウムイオンとホルメートイオンを一緒に蟻酸
アンモニウムの形状で添加するのが特に有利であ
る。
オンの水溶液を膜反応器に連続的に供給する。基
質の濃度は最大可能濃度の50〜100％でなければ
ならないが、2000ミリモル／、有利に1000ミリ
モル／を超えてはならない。アンモニウムイオ
ンの濃度は基質の完全な変換のためには基質量と
当モル量でなければならないが、過剰のアンモニ
ウムイオンは反応を妨害しない。しかし他方本発
明による方法で膜の前で必然的に生じる生成物と
基質との再混合のために定量的な反応はいずれに
せよ達成することはできない。したがつて多くの
場合、若干過少量で、例えば基質の定量的反応に
必要な量の約80％のみを用いて使用すれば十分で
ある。ホルメートイオンの濃度は100〜6000ミリ
モル／、有利に300〜2000ミリモル／である。
ホルメートとしては有利に蟻酸ナトリウムまたは
蟻酸カリウムを使用する。しかし基質溶液にアン
モニウムイオンとホルメートイオンを一緒に蟻酸
アンモニウムの形状で添加するのが特に有利であ
る。
反応の間膜を介して差圧0.1〜15バール、有利
に0.2〜３バールが維持されなければならず、こ
れは相応する寸法の、供給すべき基質溶液用配量
ポンプの使用により、かつ場合により膜の後の濾
液流中の絞り弁によつて得られる。差圧は、濾液
流が所望の速度で膜を貫通するように作用する。
膜の圧力側における絶対圧力は有利に、膜の前に
反応室中における、膜に沿つて強力な乱流を形成
し、かつそれにより膜への酵素または分子量の増
加した補酵素の被覆を避けるための強力な撹拌ま
たは循環の際にも圧力側において反応混合物の脱
ガスが起る程度には圧力がどの位置においても低
下しないように調節されなければならない。膜反
応器は酵素反応で一般的な温度25〜50℃に保持さ
れる。同様に反応の間の反応混合物のPHは酵素反
応で一般的なPH値範囲５〜９に保持される。
に0.2〜３バールが維持されなければならず、こ
れは相応する寸法の、供給すべき基質溶液用配量
ポンプの使用により、かつ場合により膜の後の濾
液流中の絞り弁によつて得られる。差圧は、濾液
流が所望の速度で膜を貫通するように作用する。
膜の圧力側における絶対圧力は有利に、膜の前に
反応室中における、膜に沿つて強力な乱流を形成
し、かつそれにより膜への酵素または分子量の増
加した補酵素の被覆を避けるための強力な撹拌ま
たは循環の際にも圧力側において反応混合物の脱
ガスが起る程度には圧力がどの位置においても低
下しないように調節されなければならない。膜反
応器は酵素反応で一般的な温度25〜50℃に保持さ
れる。同様に反応の間の反応混合物のPHは酵素反
応で一般的なPH値範囲５〜９に保持される。
本発明による方法の実施に好適なホルメートデ
ヒドロゲナーゼは例えばカンジダ・ボイジニイ
（Candida boidinii）またはプソイドモナス・オ
キサラチクス（Pseudomonas oxalaticus）から
単離することができる。本発明による方法で使用
可能な基質特異性デヒドロゲナーゼの例は、バシ
ルス・スブチリス（Bacillus subtilis）から取得
し得る、様々に使用可能なＬ−アラニンデヒドロ
ゲナーゼである。該デヒドロゲナーゼを用いて例
えば焦性ブドウ酸をＬ−アラニンに、２−オキソ
−４−メチルバレリアン酸をＬ−ロイシンに、２
−オキソ−３−メチルバレリアン酸をＬ−イソロ
イシンに、２−オキソ−３−メチル酪酸をＬ−バ
リンにまたは２−オキソ−バレリアン酸に変える
ことができる。有利に反応すべきα−ケトカルボ
ン酸はそのナトリウム塩またはカリウム塩の形状
で使用する。α−ケトカルボン酸を相応するアミ
ノ酸に変換する際に光学活性の中心が新たに形成
されるので濾液流中の生成物の濃度を旋光計によ
つて連続的に測定することができる。形成された
アミノ酸は濾液から自体公知の方法で、例えば酸
性イオン交換体を用いて取得することができる。
ヒドロゲナーゼは例えばカンジダ・ボイジニイ
（Candida boidinii）またはプソイドモナス・オ
キサラチクス（Pseudomonas oxalaticus）から
単離することができる。本発明による方法で使用
可能な基質特異性デヒドロゲナーゼの例は、バシ
ルス・スブチリス（Bacillus subtilis）から取得
し得る、様々に使用可能なＬ−アラニンデヒドロ
ゲナーゼである。該デヒドロゲナーゼを用いて例
えば焦性ブドウ酸をＬ−アラニンに、２−オキソ
−４−メチルバレリアン酸をＬ−ロイシンに、２
−オキソ−３−メチルバレリアン酸をＬ−イソロ
イシンに、２−オキソ−３−メチル酪酸をＬ−バ
リンにまたは２−オキソ−バレリアン酸に変える
ことができる。有利に反応すべきα−ケトカルボ
ン酸はそのナトリウム塩またはカリウム塩の形状
で使用する。α−ケトカルボン酸を相応するアミ
ノ酸に変換する際に光学活性の中心が新たに形成
されるので濾液流中の生成物の濃度を旋光計によ
つて連続的に測定することができる。形成された
アミノ酸は濾液から自体公知の方法で、例えば酸
性イオン交換体を用いて取得することができる。
次いで実施例につき本発明を詳説する。
例 １
磁気撹拌機、および名目排除限界値
（nominelle Ausschlussgrenze）5000を有する、
直径62mm限外濾過膜〔供給会社：アミコン
（Amicon）、Witten；Type DM5〕を備えた、容
量10mlの、40℃に保持された扁平膜反応器を滅菌
のために供給速度20ml／時間に調節された配量ポ
ンプを用いて約５時間水性ホルムアルデヒド溶液
で洗浄した。引続き更に約５時間ホルムアルデヒ
ド溶液を蒸留水で追い出した。次いで同様に供給
速度20ml／時間で約2.5時間滅菌濾過器（0.2μｍ）
に通して濾過されたピルビン酸ナトリウム500ミ
リモル／、蟻酸アンモニウム400ミリモル／
および燐酸二水素ナトリウム50ミリモル／を含
み、かつ苛性ソーダ液でPH８に調節された基質溶
液を供給した。その後基質溶液の代わりに、平均
分子量10000のポリオキシエチレンに結合した
NADH3.66ミリモル／およびPH８の燐酸塩緩
衝剤50ミリモル／を含有する補酵素溶液10mlを
配量した。補酵素溶液の添加完了後更に前記の基
質溶液を供給速度20ml／時間で供給した。次いで
膜の前の反応室に側方の孔からホルメートデヒド
ロゲナーゼ（ホルメートを基質として活性6.74μ
モル／mg・分、40℃、PH８）を水性グリセリン溶
液の形状で（グリセリン50重量％；ホルメートデ
ヒドロゲナーゼ10mg／ml）かつＬ−アラニンデヒ
ドロゲナーゼ1.62mg（ピルベートを基質として活
性415μモル／mg・分、40℃、PH８）を水性硫酸
アンモニウム溶液（（NH4）2SO42.4モル／；Ｌ
−アラニンデヒドロゲナーゼ５mg／ml）の形状で
スプレーを用いて添加した。この選択された調節
ではホルメートデヒドロゲナーゼとＬ−アラニン
デヒドロゲナーゼの活性の比が１：１になる。反
応は濾液流中に挿入された旋光計−流通クベツト
を用いて連続的に追求する。膜を介しての差圧は
初め0.2バールであり、徐々に0.5バールに上昇
し、次いで一定になつた。全部で約50時間の操作
時間内でＬ−アラニン6.45ミリモル／時間であつ
た。
（nominelle Ausschlussgrenze）5000を有する、
直径62mm限外濾過膜〔供給会社：アミコン
（Amicon）、Witten；Type DM5〕を備えた、容
量10mlの、40℃に保持された扁平膜反応器を滅菌
のために供給速度20ml／時間に調節された配量ポ
ンプを用いて約５時間水性ホルムアルデヒド溶液
で洗浄した。引続き更に約５時間ホルムアルデヒ
ド溶液を蒸留水で追い出した。次いで同様に供給
速度20ml／時間で約2.5時間滅菌濾過器（0.2μｍ）
に通して濾過されたピルビン酸ナトリウム500ミ
リモル／、蟻酸アンモニウム400ミリモル／
および燐酸二水素ナトリウム50ミリモル／を含
み、かつ苛性ソーダ液でPH８に調節された基質溶
液を供給した。その後基質溶液の代わりに、平均
分子量10000のポリオキシエチレンに結合した
NADH3.66ミリモル／およびPH８の燐酸塩緩
衝剤50ミリモル／を含有する補酵素溶液10mlを
配量した。補酵素溶液の添加完了後更に前記の基
質溶液を供給速度20ml／時間で供給した。次いで
膜の前の反応室に側方の孔からホルメートデヒド
ロゲナーゼ（ホルメートを基質として活性6.74μ
モル／mg・分、40℃、PH８）を水性グリセリン溶
液の形状で（グリセリン50重量％；ホルメートデ
ヒドロゲナーゼ10mg／ml）かつＬ−アラニンデヒ
ドロゲナーゼ1.62mg（ピルベートを基質として活
性415μモル／mg・分、40℃、PH８）を水性硫酸
アンモニウム溶液（（NH4）2SO42.4モル／；Ｌ
−アラニンデヒドロゲナーゼ５mg／ml）の形状で
スプレーを用いて添加した。この選択された調節
ではホルメートデヒドロゲナーゼとＬ−アラニン
デヒドロゲナーゼの活性の比が１：１になる。反
応は濾液流中に挿入された旋光計−流通クベツト
を用いて連続的に追求する。膜を介しての差圧は
初め0.2バールであり、徐々に0.5バールに上昇
し、次いで一定になつた。全部で約50時間の操作
時間内でＬ−アラニン6.45ミリモル／時間であつ
た。
収量はＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ１mgに対
してＬ−アラニン108ミリモル、もしくはホルメ
ートデヒドロゲナーゼ１mgに対してＬ−アラニン
1.75ミリモルであつた。
してＬ−アラニン108ミリモル、もしくはホルメ
ートデヒドロゲナーゼ１mgに対してＬ−アラニン
1.75ミリモルであつた。
例 ２
温度25℃に保持された10ml−扁平膜反応器〔名
目排除限界値5000を有する膜；供給会社：アミコ
ン、Witten；Type YM5〕の滅菌を例１のよう
にして行なつた。
目排除限界値5000を有する膜；供給会社：アミコ
ン、Witten；Type YM5〕の滅菌を例１のよう
にして行なつた。
次いで供給速度20ml／時間で約2.5時間滅菌濾
過された、ピルビン酸ナトリウム400ミリモル／
、蟻酸アンモニウム400ミリモル／および燐
酸二水素ナトリウム50ミリモル／を含有し、か
つ苛性ソーダ液でPH８に調節された溶液を供給し
た。引続き基質溶液の代わりに供給速度４ml／時
間で例１による補酵素溶液７mlおよびホルメート
デヒドロゲナーゼ138ml（ホルメートを基質とし
て活性0.85μモル／mg・分、25℃およびPH８）を
水性グリセリン溶液（グリセリン50重量％；ホル
メートデヒドロゲナーゼ10mg／ml）の形状で供給
した。次いで側面の孔から反応室にＬ−アラニン
デヒドロゲナーゼ2.78mg（ピルベートを基質とし
て活性233μモル／mg・分、25℃、PH８）を水性
硫酸アンモニウム溶液（（NH4）2SO42.4モル／
；Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ５mg／ml）の
形状でスプレーを用いて添加した。ホルメートデ
ヒドロゲナーゼとＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ
の活性の比は１：４であつた。操作時間59時間以
内でＬ−アラニン48ミリモルが得られ、これはＬ
−アラニンデヒドロゲナーゼ１mgに対してＬ−ア
ラニン173ミリモルもしくはホルメートデヒドロ
ゲナーゼ１mgに対してＬ−アラニン0.35ミリモル
に相当する。
過された、ピルビン酸ナトリウム400ミリモル／
、蟻酸アンモニウム400ミリモル／および燐
酸二水素ナトリウム50ミリモル／を含有し、か
つ苛性ソーダ液でPH８に調節された溶液を供給し
た。引続き基質溶液の代わりに供給速度４ml／時
間で例１による補酵素溶液７mlおよびホルメート
デヒドロゲナーゼ138ml（ホルメートを基質とし
て活性0.85μモル／mg・分、25℃およびPH８）を
水性グリセリン溶液（グリセリン50重量％；ホル
メートデヒドロゲナーゼ10mg／ml）の形状で供給
した。次いで側面の孔から反応室にＬ−アラニン
デヒドロゲナーゼ2.78mg（ピルベートを基質とし
て活性233μモル／mg・分、25℃、PH８）を水性
硫酸アンモニウム溶液（（NH4）2SO42.4モル／
；Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ５mg／ml）の
形状でスプレーを用いて添加した。ホルメートデ
ヒドロゲナーゼとＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ
の活性の比は１：４であつた。操作時間59時間以
内でＬ−アラニン48ミリモルが得られ、これはＬ
−アラニンデヒドロゲナーゼ１mgに対してＬ−ア
ラニン173ミリモルもしくはホルメートデヒドロ
ゲナーゼ１mgに対してＬ−アラニン0.35ミリモル
に相当する。
例 ３
温度25℃に保持された、10ml−扁平膜反応器
〔名目排除限界値5000を有する膜；供給会社：ア
ミコン、Witten；Type YM5〕の滅菌を例１の
ようにして実施した。
〔名目排除限界値5000を有する膜；供給会社：ア
ミコン、Witten；Type YM5〕の滅菌を例１の
ようにして実施した。
次いで供給速度20ml／時間で約2.5時間ピルビ
ン酸ナトリウム400ミリモル／、蟻酸800ミリモ
ル／および燐酸二水素ナトリウム50ミリモル／
を含み、かつ苛性ソーダ液でPH８に調節された
滅菌濾過された溶液を供給した。引続き基質溶液
の代わりに供給速度４ml／時間で例１による補酵
素溶液10mlおよびホルメートデヒドロゲナーゼ85
mg（ホルメートを基質として活性0.85μモル／
mg・分。25℃、PH８）を水性グリセリン溶液（グ
リセリン50重量％；ホルメートデヒドロゲナーゼ
10mg／ml）の形状で供給した。次いで側部の孔か
ら反応室にＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ0.94mg
（ピルベートを基質として活性233μモル／mg・
分。25℃、PH８）を水性硫酸アンモニウム溶液
（（NH4）2SO42.4モル／；Ｌ−アラニンデヒド
ロゲナーゼ５mg／ml）の形状でスプレーを用いて
添加した。活性の比は１：2.2であつた。操作時
間140時間以内でＬ−アラニン92ミリモルが得ら
れ、これはＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ１mgに
対してＬ−アラニン98ミリモル、もしくはホルメ
ートデヒドロゲナーゼ１mgに対してＬ−アラニン
1.08ミリモルに相当した。
ン酸ナトリウム400ミリモル／、蟻酸800ミリモ
ル／および燐酸二水素ナトリウム50ミリモル／
を含み、かつ苛性ソーダ液でPH８に調節された
滅菌濾過された溶液を供給した。引続き基質溶液
の代わりに供給速度４ml／時間で例１による補酵
素溶液10mlおよびホルメートデヒドロゲナーゼ85
mg（ホルメートを基質として活性0.85μモル／
mg・分。25℃、PH８）を水性グリセリン溶液（グ
リセリン50重量％；ホルメートデヒドロゲナーゼ
10mg／ml）の形状で供給した。次いで側部の孔か
ら反応室にＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ0.94mg
（ピルベートを基質として活性233μモル／mg・
分。25℃、PH８）を水性硫酸アンモニウム溶液
（（NH4）2SO42.4モル／；Ｌ−アラニンデヒド
ロゲナーゼ５mg／ml）の形状でスプレーを用いて
添加した。活性の比は１：2.2であつた。操作時
間140時間以内でＬ−アラニン92ミリモルが得ら
れ、これはＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ１mgに
対してＬ−アラニン98ミリモル、もしくはホルメ
ートデヒドロゲナーゼ１mgに対してＬ−アラニン
1.08ミリモルに相当した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 限外濾過膜を備えた膜反応器中で同時にホル
メートデヒドロゲナーゼの存在でホルメートイオ
ンを用いてNAD+からNADHを再生しつつ、基
質特異性のデヒドロゲナーゼ、アンモニウムイオ
ン、および水溶性ポリマーへの結合により分子量
が増加したニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（NAD+／NADH）の存在で水溶性α−ケト
カルボン酸を相応するアミノ酸へ連続的に酵素変
換するための方法において、平均孔径１〜3nｍ
の膜を具備し、かつホルメートデヒドロゲナー
ゼ、基質特異性デヒドロゲナーゼおよび平均分子
量500〜50000のポリオキシエチレンに結合して存
在するNAD+／NADH0.1〜10ミリモル／の溶
液を含有する膜反応器に、最大可溶量の50〜100
％の、しかし2000ミリモル／を越えない量の基
質である、水溶性塩の形状の反応すべきα−ケト
カルボン酸、基質の量にほぼ当量のアンモニウム
イオンおよびホルメート100〜6000ミリモル／
の水溶液を連続的に供給し、膜を介して差圧0.1
〜15バールを維持し、かつ膜の後方で形成される
アミノ酸を含有する濾液流を連続的に導出するこ
とを特徴とする、水溶性α−ケトカルボン酸を相
応するアミノ酸に連続的に酵素変換する方法。 ２ ホルメートデヒドロゲナーゼおよび基質特異
性デヒドロゲナーゼをその活性の比が１：１〜
１：５になるような量で使用する、特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 ３ 供給すべき基質溶液にアンモニウムイオンお
よびホルメートイオンを一緒にアンモニウムホル
メートの形で添加する、特許請求の範囲第１また
は２項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19792930070 DE2930070A1 (de) | 1979-07-25 | 1979-07-25 | Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen umwandlung von wasserloeslichen alpha -ketocarbonsaeuren in die entsprechenden aminosaeuren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5664792A JPS5664792A (en) | 1981-06-02 |
| JPH022595B2 true JPH022595B2 (ja) | 1990-01-18 |
Family
ID=6076684
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10144480A Granted JPS5664792A (en) | 1979-07-25 | 1980-07-25 | Continuous enzymatic conversion of water soluble alphaaketocarboxylic acid to corresponding to amino acid |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4304858A (ja) |
| EP (1) | EP0023346B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5664792A (ja) |
| CA (1) | CA1139697A (ja) |
| DE (2) | DE2930070A1 (ja) |
| SU (1) | SU1069622A3 (ja) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4481292A (en) * | 1980-07-01 | 1984-11-06 | The Coca-Cola Company | Process for the generation of acetaldehyde from ethanol |
| EP0076266B1 (en) * | 1981-04-08 | 1988-11-09 | GORTON, Lo | Electrode for the electrochemical regeneration of co-enzyme, a method of making said electrode, and the use thereof |
| US4451566A (en) * | 1981-12-04 | 1984-05-29 | Spencer Donald B | Methods and apparatus for enzymatically producing ethanol |
| DE3247981A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur gewinnung von l-aepfelsaeure |
| US4600692A (en) * | 1983-02-10 | 1986-07-15 | Purification Engineering, Inc. | Immobilized cells for preparing phenylalanine |
| DE3307094A1 (de) * | 1983-03-01 | 1984-09-06 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen umwandlung von (alpha)-hydroxycarbonsaeuren in entsprechende optisch aktive (alpha)-aminocarbonsaeuren |
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