JPS6236196A - アラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｌ−アラニンの製造法に関する。

Ｌ−７ラニンは生体を構成するアミノ酸の１つであり医
薬９食品分野等に需要の高い物質である。

〔従来の技術〕

アラニンの製造法は化学合成法１発酵法、アス／臂うギ
ン酸より酵素的に脱炭酸する方法などいくつかの方法が
知られ【いるがより安価で簡単な方法が望まれている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者尋は前に乳酸、アンモニア供与体及びニコチン
アミドアデニンヌクレオチド（以下ＮＡＤと略す）を含
有する水性媒体中で乳酸脱水素酵素（以下ＬＪ）Ｈと略
す）及びＬ−アラニン脱水素酵素（以下ＡＤＨと略す）
又は両方の酵素を高力価に含有する菌体又はその破砕物
と反応させることにより効率よくアラニンを生成蓄積さ
せることを見いだし特許出願した（゛特願５９−４０１
４１）。しかしながら菌体、　−１１ｉ体破砕物又は部
分精製酵素を用いる場合には共存するアラニンラセマー
ゼによりＤ−アラニンが副生する。これを抑制する方法
として熱処理、阻害剤等の方法を提示したがアラニンラ
セマーゼを完全に抑制又は消却しかつＬＤＨ。

ＡＤＨ活性に影響を与えない条件は規模を大きくした場
合時々不充分な結果となる場合があり、より簡単で確実
な方法を開発する必要がある。

〔問題点を解決する為の手段〕

本発明者等は上述の革情に鑑み、アラニン要求性を付与
した変異株の採取を鋭意検討した結果アラニンラセマー
ゼを欠失させることによりＤ−アラニン要求変異株を採
取することに成功し、ここに乳酸よりＬ−アラニンを製
造する簡便、かつ安価な製造法を確立した。

以下本発明を詳細に述べる。

本発明者等は酵素を用い安価な原料からアラニンな得る
方法を種々研究した結果、乳酸、アンモニア供与体及び
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと
略す。〕を含有する水性媒体中で乳酸脱水素酵素（以下
ＬＤＨと略す。）及びＬ−アラニン脱水累酵素（以下Ａ
ＤＨと略す。）を共役させることにより、該水性媒体中
にアラニンが効率よく生成・蓄積せしめることを見い出
した。

即ち、両酵素共にＮＡＤを補酵素とするが下式（１）に
示すようにＬＤＨＫよりＮＡＤはＮＡＤＨとなり乳酸は
ピルビン［Ｋｆ換され、次いでアンモニア供与体、例え
ばＮＨ４“の存在下でＡＤＨによりＮＡＤＨはＮＡＤ　
Ｋ酸化され、同時にピルビル酸はアラニンに変換される
。

式（１） 式（１）に示したよりなＮＡＤを共役する系を用いるこ
とＫより効率良く乳酸からアラニンを生産することがで
きる。本反応を行うＫはＮＡＤＨは反応の開始時に添加
するだけでよく、かつＮＡＤＨの添加量は小量で良い。

アンモニア供与体としてはアンモニア又はアンモニウム
塩が使用できる。

本発明で使用するＬＤＨ及びＡＤＨは動物、植物又は微
生物起源のいずれから得られたもので良いが、微生物起
源のものがより安価である。微生物起源のＬＤＨ及びＡ
ＤＨを使用すると式（１）の反応により安価にアラニン
を製造することができる。しかし、ＬＤＨとＡＤＨを同
時に高活性に生成する微生物は無いために各々の酵素を
高活性に生成する微生物を各々単独で培養しなければな
らない。

この点に関し、更に鋭意検討を加えた結果、ＬＤＨ生産
能を有し、ベクターＤＮＡとＡＤＨをコードする遺伝子
とが連結されているＤＮＡを有し、かつＡＤＨ生産能を
有する微生物を造成することに成功した。すなわち、高
活性のＡＤＨを有する・櫂チルススフェリカスＩＦＯ３
５２５の染色体ＤＮＡよりＡＤＨ遺伝子を取り出し、高
活性ＬＤＨな有しかつアラニンラセマーゼを欠失した変
異株エセリヒア・コリＭＫ５０１３株に組み込みＡＤＨ
とＬＤＨ活性の高いエセリヒア・コリＭＫ５０１３　Ｐ
ＩＣＲ３０１菌を得た。

遺伝子供４菌であるバチルス・スフエリカスＩＦＯ３５
２５より染色体ＤＮＡを抽出する方法は例えばＪ、　Ｂ
ａｅｔ＠ｒｉ／１８９　１０６５（１９６５）に記載さ
れている様な通常の方法で行なうことが出来る。

ベクターＤＮＡとしては微生物の菌体内で自己増殖でき
るものであればどの様なものでも良くその１つとしてＰ
Ｂｌ　３２２がある。染色体ＤＮＡ及びベクターＤＮＡ
はそれぞれ制限エンドニ、クレアーゼを用−て切断する
、制限工ンドニ、クレアーゼは用いるベクターＤＮＡ　
Ｋより適宜選択するのが良い・又、染色体ＤＮＡ　Ｋつ
いては制限エンドニ、クレアーゼにより切断が部分的に
起る様に反応条件を調節すれば多くの種類の制限エンド
ニ、クレアーゼが使用出来る。かくして得られ友染色体
ＤＮＡ断片と切断されたベクターＤＮＡを連結せしめる
方法はリボーゼを用いる通常の方法が使用出来る。この
様にして得られた染色体ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡが
連結し次ＤＮＡの受容菌はＬＤｆ（活性の高い菌株であ
れば何でも良い。

受容菌への導入は例えばＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ　５
３１５９（１９７０）Ｋ記載されている様な通常の形質
転換法が使用出来る。形質転換株の内ＡＤＨ遺伝子を含
む形質転換株を選ぶにはベクターＤＮＡのマーカーの性
質とＡＤＨ活性を指標として選択すれば良い。この様な
操作によりＬＤＨ、ＡＤＨ活性を高く有する菌株を造成
することができる。以下に具体的にＡＤＨ活性を高く有
する菌株の造成手法につ−て説明する。

１）染色体ＤＮＡの調製 バチルス・スフエリカスＩＦＯ３５２５を１１の「Ｂ８
ｃｔ−ｐｅｎａｓｓａｙ　Ｂｒｏｔｈ　Ｊ　（商品名Ｄ
ｌｆｅｏ１ＪＡ）中、４５℃で約２時間、振盪培養を行
ない対数増殖期の菌体を集菌後、通常のＤＮＡ抽出法（
Ｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ１８９．１０６５（１９６５）な
ど）釦より染色体ＤＮＡを抽出精製し２．６ダを採取。

２）染色体ＤＮＡ断片のベクターＤＮＡへの挿入少なく
ともＡＤＨ遺伝子を含む遺伝子領域をクローニングする
為、そのベクターとなる自己増殖性ＤＮＡとしてアンピ
シリン耐性！ラズミドＰＢＲ３２２を用いた。

１）で得九ＤＮＡ　１０μｙとベクターＤＮＡ　５μＩ
をそれぞれとり、制限工ンドニ、クレアーゼの一種であ
るＳａｔ　−１を３７℃で１時間作用させてＤＮＡ鎖を
切断した。６５℃、１０分熱処理後両反応液を混合しＡ
ＴＰ　、及びジチオスライトール存在下。

Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを用いて１０℃。

２４時間、　ＤＮＡ鎖の連結反応を行うな。

３）　　ＡＤＨ遺伝子を担りたｆ２ズミドによる形質転
換を行うためのエセリヒア・コリＭＫ５０１３を：Ｉｆ
ｆンピテントな状態（ＤＮＡの取込み能を有する状態）
とするＫはＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｔ　５３　１５９（
１９７０）の記載に従い細胞を調製し念。

このコンピテントな細胞懸濁液に２〕で得たベクターＤ
ＮＡとＡＤＨをコードする遺伝子とが連結したＤＮＡを
含むＤＮＡの溶解液を加え水冷下３０分保ち、直ちに４
２℃、２分間、ヒートン、、りを与えた。

次にこの細胞懸濁液の一定量を取り新たな培地（１４ト
リグトン、０．５酵母エキス、０．５係食塩。

０．０５％硫酸マグネシウム７水塩、ｐＨ７，２）Ｋ接
種し、３７℃−１時間振盪培養を行ない形質転換を完了
させた。

培養液をアンビシＩＪ　７５０μ９／ゴを含む寒天１．
５１を加えた前記培地上に塗布し、３７℃に保温し友。

１〜２日後、培地上に出現した２１０ケのコロニーを釣
菌し各クローンをそれぞれ純化し、ＡＤＨ活性を発現し
た株ＭＫ５０１３−ＰＩＣＲ−３を選択した。この菌株
中に存在する！ラズミドＰＩＣＲ−３はＩＩＫペース（
アーであった。

次にＭＫ５０１３−ＰＩＣＲ−３株を用い組み換えプラ
ズミドの小型化を図った。すなわちＭＫ５０１３−ＰＩ
ＣＲ−３株中に存在するプラズミドＰＩＣＲ−３を制限
酵素Ｈ１ｎｄ　ＩＩＩで完全に分解後再度ＰＢＲ３２２
プラスミドに接続せしめ組み換えデラズミドＰＩＣＲ−
３０１を得た。本グラズミドＰＩＣＲ−３０１は８にペ
ースペアーであった。該グラズミドを３）と同様の処理
によりエセリヒア・コリＭＫ−５０１３に導入しエセリ
ヒア・コリＭＫ５０１３＞ＰＩＣＲ−３０１ｅＡＪ　。

１’２２１＜ｋ、ｒＥ１２ｚ−ＰＱ＋ワワさてこの様に
して得られ九菌株及び兄妹の培養は通常の細菌培養法、
即ち培地としては炭素源。

窒素源無機イオン、更に心壁に応じアミノ酸、ビタミン
等の有機微量金属を含むもので良い。炭素源としてはグ
ルコース、フラクトース、デキストリン等、乳酸等の有
機酸、窒素源としてはベグトン、イーストエキス、アン
モニア及びその塩等が使用出来る。

培養は好気的条件で−、湿温度適宜調節してＬＤＩ（、
ＡＤＨの活性が最大になるまで行なう。

酵素反応に用いるには培養した菌体なそのままでも良い
し、集菌し洗浄後？−ルミル、フレンチプレス、又は超
音波破砕装置等で破砕した細胞抽出液でも良い。又、硫
安分画、限外デ過、ｒル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィ等で棺製した標品も用いることができる。更に、Ｌ
Ｄ）ｌ　、　ＡＤＨＩＬ１＋ｉ　酵素又は含有菌体又は
破砕物を固定化したものも用−ることかできる。

乳酸よりアラニンの変換には造成した菌株を用いて乳酸
を含む培地で２４〜１２０時間培養するか菌体又は酵素
標品にＮＡＤ　、乳酸及びアンモニア供与体を含む水性
媒体をｐＨ４，０−１０，０望ましくは７．０〜８．０
に保ちつつ２０℃〜８０℃、望ましくは３０℃〜５０℃
で反応することＫよりアラニンな生成させることが出来
る。

４）　　Ｄ−アラニン要求性株の誘導 エセリヒア・コリＣ−６００株をブイヨン寒天培地に接
種し３０℃１夜培養する、寒天培地上に生育した菌体な
１００μｇ／１ＩＬｔのニトロソグアニジンを含む０．
１　Ｍリン酸緩衝液に懸濁し３０℃。

３０分処理する、遠心洗浄（１００００ｒｐｍ）でニト
ロソグアニジンを除去し適当に希釈後ブイヨン寒天グレ
ートに約１００コロニー／グレートとなる様に楯ｔき１
夜３０℃でコロニーを生育させる。

一方、グルコース０．５％、硫安０．５４　、リン酸１
カリ０．１４　、リン酸２カリ傭酸マグネシウム０．０
５％、食塩０．１　％　ｔ　ＦｅＳＯ４及びＶＬｎ、Ｓ
０４を各々２　ｐ’ｐｍ　ｅ寒天１．５係を含む培地を
２分割し一方にＬ−アラニン、他方にＤ−アラニンを各
々０．１１づつ加えた寒天プレートを作り、ブイヨン寒
天グレートに生育させたニトロングアニノン処理菌をレ
プリカする。レプリカされたグレートを３０℃。

１夜培養しＬ−アラニン含有培地で生育せず、Ｄ−アラ
ニン含有培地で生育したコロニーを分離する。

以上の操作により第１表に示した４株の変異株が得られ
た。

エセリヒア・コリＣ−６００＋　　　　　　＋　　　　
　＋ＭＫ５０１３　　−　　　　　＋　　　　　−５０
１４−＋　　　　　− ５０４１−＋　　　　　− ５０４３−＋　　　　　− ５０６１−＋　　　　　− アラニンラセマーゼ活性は０．１　Ｍ　Ｄ又はＬ−アラ
ニン、０．１Ｍ）リス塩酸（ｐＨ８，５）に６菌を懸濁
させ３７℃で６０分反応させた後市販キラルパックによ
りラセマーゼ活性の有無を判定した。

これ等４株の内ＭＫ５０１３を代表株として用いた。

このＤ−ア、ラニン要求性を付与させる操作はベクター
とＡＤＨをコードする遺伝子とが連結されているＤＮＡ
を組み込む前であっても、組み込んだ後でもよい。

ＬＤＨ、ＡＤＨ活性及びアラニンの定量法は次のように
して行った。

ＬＤＨ活性は５ｔｏｌｚｅｎｂａｃｈ、　Ｆ　（１９６
６）　Ｍ＠ｔｈｏｄ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　９２
７８記載の方法に従つた０ ＡＤｆ（活性は左右田健次、大島敏久（１９７６）生化
学実験講座ｌｌ上１９３記載の方法に従りた。

アラニンの定量はＤＬ−アラニンは通常のアミノ酸分析
機により定量、Ｄ、Ｌの分別定 量はＰ、　Ｅｅ　Ｈａｒｅ等、Ｓｃｌ＠ｎｅｅ　２０４
１２２６（１９７９）記載の高速液体クロマトグラフィ
な用−る方法に従った。

ができる。

以下に実施例をめげてさらに詳細に説明する。

実施例−１ エセリヒア・コリＡＪ　ｌ’Ｚ−’Ｚｌｌ？株をｇｌａ
ｃｏｓｓ　１９６　ｅｐ＠ｐｔｏｎ　０．１４　ｍイー
ストエキス０．５％、ＤＬ−アラニンｏ、ｏｏｓｓ、食
塩０．５４を含む液体培地に接種し、３７℃１夜前培養
する。

一方、ＤＬ−乳酸アンモニウム１０％、リン酸−カリ０
．１　％　、リン酸二カリ０．２　％　、硫酸マグネシ
ウム７水塩Ｏ，ＯＳ＊、食塩０．１憾、イーストエキス
０．０５４．Ｌ−スレオニン０．００５係、Ｌ−ロイシ
ン０．００２５憾、ＤＬ−アラニン０．００２５憾、チ
アミン０．０００１憾、　ｐｉ−１７，２を含む液体培
地を５００ｄ肩付フラスコに５Ｑｒｔｒｌづつ分注しオ
ートクレーブ殺菌（１２０℃、１０分）し前培養した培
養液を５４接種し、３７℃、４８時間振盪培養した結果
２．８Ｉ／ｌｉｔのＬ−アラニンが蓄積した。

実施例−２ 実施例−１の前培養培地で３７℃、１夜培養した培養液
を１００００　ｒｐｍ　、　１０分遠心分離し菌体な集
め０．１モルリン酸緩衝液で２回洗浄し同緩衝液に懸濁
する。

一方、１０チのＤＬ−乳酸、５憾ＮＨ４ＣＬ　、　０．
１５憾ＮＡＤを含む反応液に１０！ｎ９／ｒＲ１（漫画
）となる様に菌体を加え、アンモニアで−を８．０とし
３７℃２４時間ゆっくり攪拌しつつ反応した結果、７．
２１／ｄｔのＬ−アラニンが生成した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）Ｄ−アラニン要求性、乳酸脱水素酵素活性及びＬ−
   アラニン脱水素酵素活性を有し、乳酸及びアンモニア供
   与体からＬ−アラニンを生成する能力を有する微生物を
   水性媒体中で乳酸及びアンモニア供与体に作用させてＬ
   −アラニンを生成・蓄積せしめ、これを採取することを
   特徴とするＬ−アラニンの製造法。 ２）微生物がＤ−アラニン要求性及び乳酸脱水素酵素活
   性を有し、ベクターＤＮＡとＬ−アラニン脱水素酵素を
   コードする遺伝子とが連結されているＤＮＡを有する微
   生物である特許請求の範囲第１項記載のアラニンの製造
   法。