JPH022599B2 - - Google Patents
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- JPH022599B2 JPH022599B2 JP55010153A JP1015380A JPH022599B2 JP H022599 B2 JPH022599 B2 JP H022599B2 JP 55010153 A JP55010153 A JP 55010153A JP 1015380 A JP1015380 A JP 1015380A JP H022599 B2 JPH022599 B2 JP H022599B2
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- C07H15/236—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms with at least two saccharide radicals directly attached to the cyclohexane rings attached to non-adjacent ring carbon atoms of the cyclohexane rings, e.g. kanamycins, tobramycin, nebramycin, gentamicin A2 a saccharide radical being substituted by an alkylamino radical in position 3 and by two substituents different from hydrogen in position 4, e.g. gentamicin complex, sisomicin, verdamycin
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- C12P19/48—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin the cyclohexyl radical being substituted by two or more nitrogen atoms, e.g. destomycin, neamin
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Description
本発明はシソミシン（sisomicin）およびその
薬学的に許容される塩を微生物的手法により製造
する新規な方法に関する。 シソミシン、すなわちＯ−２，６−ジアミノ−
２，３，４，６−テトラデオキシ−α−Ｄ−グリ
セロ−４−ヘキセノピラノシル〔１→４〕−Ｏ−
｛３−デオキシ−４−Ｃ−メチル−３−（メチルア
ミノ）−β−Ｌ−アラボピラノシル〔１→６〕｝−
２−デオキシ−Ｄ−ストレプタミンは広範囲のス
ペクトルを有する抗生物質である。 シソミシンの製造に関しては、いくつかの微生
物学的方法が公知である（例、米国特許3832286
および3907771に開示の方法）。これらの特許によ
ると、微生物ミクロモノスポラ・インヨエンシス
（Micromonospora inyoensis）（NRRL 3292）
がシソミシンを主成分として生産する。 ミクロモノスポラ・グリセア（Ｍ・grisea）の
菌株（NRRL 3800）は、ほかにベルダミシン
（verdamicin）を（米国特許3951746）、ミクロモ
ノスポラ・ジオネンシス（Ｍ・zionensis）
（NRRL 5466）はほかに抗生物質Ｇ−52を（米
国特許3956068）およびミクロモノスポラ・プル
プレア変異株ニグレセンス（Ｍ・Purpureavar.
nigrescens）（MNG 00122）はほかにゲンタミシ
ン複合体（gentamicin complex）を（ハンガリ
ー国特許168778）、シソミシンと共に生産する。 ドナウ川地方の土からの土壤試料を研究中に、
シソミシンを生産する新規な微生物が単離され
た。この新規な微生物はJMS−１という識別記
号で呼ばれた。この菌株は従来公知のすべての微
生物から異なることが確められ、新菌種ミクロモ
ノスポラ・ダヌビエンシス（Micromonospora
danubiensis species nova）と命名された。この
微生物から、本発明者はさまざまの菌株精製法に
よつてJMS−３と呼ばれる菌株を得た。この菌
株（ハンガリー国、ブダペストのハンガリー国立
微生物収集機関に1978年６月19日に寄託、受託番
号MNG00171の発酵試験で、非常に高濃度のシ
ソミシンを含有する発酵培地が得られた。この菌
株はまた、工業技術院微生物工業技術研究所に、
昭和55年２月７日に、受托番号微工研菌寄第5400
号として寄託された。以下本明細書ではFERM
−ＰNo.5400と記す。 本発明はミクロモノスポラ・ダヌビエンシスの
菌種の１菌株、有利にはMNG00171菌株を、炭
素および窒素の同化性供給源と無機塩類を含有す
る栄養培地で、好気性条件下に培養し、必要なら
ば得られたシソミシンを発酵培地から単離して精
製し、および／またはシソミシンをその薬学的に
許容される塩に転化することによる、シソミシン
の新規な製造方法に関する。 本発明の方法で使用する微生物は、下記のよう
な顕微鏡下、肉眼上および生化学的性質を有す
る。 形 態 肉眼観察：ツアペツク（CzaPek）寒天培地に
より37℃で10日間培養したものは、強−中度の増
殖を示し、気中（aerial）菌糸体はなく、コロニ
ー（集落）は規則的な円形に発現し、淡い赤褐色
に着色していた。コロニー以外には、可溶性色素
の分泌は認められなかつた。 顕微鏡観察：隔壁を有しない直径0.5μの長い分
枝した糸状体；胞子は直径１〜1.5μの単純な胞子
体により保持される。胞子の形状は卵形ないし球
形である。 胞子の配列は単軸型（monopodial）である。 生化学的および生理学的性質：ミクロモノスポ
ラ・ダヌビエンシス菌株MNG−000171
（FERM−ＰNo.5400）は28〜37℃の温度で強度
に増殖するが、４４℃以上の温度では増殖は認
められない。 炭素源の利用を下記の栄養培地で検討した：酵
母エキス0.5％、炭素源1.0％、CaCO30.1％、寒天
1.5％、残部は蒸留水。結果を第１表に示す。
薬学的に許容される塩を微生物的手法により製造
する新規な方法に関する。 シソミシン、すなわちＯ−２，６−ジアミノ−
２，３，４，６−テトラデオキシ−α−Ｄ−グリ
セロ−４−ヘキセノピラノシル〔１→４〕−Ｏ−
｛３−デオキシ−４−Ｃ−メチル−３−（メチルア
ミノ）−β−Ｌ−アラボピラノシル〔１→６〕｝−
２−デオキシ−Ｄ−ストレプタミンは広範囲のス
ペクトルを有する抗生物質である。 シソミシンの製造に関しては、いくつかの微生
物学的方法が公知である（例、米国特許3832286
および3907771に開示の方法）。これらの特許によ
ると、微生物ミクロモノスポラ・インヨエンシス
（Micromonospora inyoensis）（NRRL 3292）
がシソミシンを主成分として生産する。 ミクロモノスポラ・グリセア（Ｍ・grisea）の
菌株（NRRL 3800）は、ほかにベルダミシン
（verdamicin）を（米国特許3951746）、ミクロモ
ノスポラ・ジオネンシス（Ｍ・zionensis）
（NRRL 5466）はほかに抗生物質Ｇ−52を（米
国特許3956068）およびミクロモノスポラ・プル
プレア変異株ニグレセンス（Ｍ・Purpureavar.
nigrescens）（MNG 00122）はほかにゲンタミシ
ン複合体（gentamicin complex）を（ハンガリ
ー国特許168778）、シソミシンと共に生産する。 ドナウ川地方の土からの土壤試料を研究中に、
シソミシンを生産する新規な微生物が単離され
た。この新規な微生物はJMS−１という識別記
号で呼ばれた。この菌株は従来公知のすべての微
生物から異なることが確められ、新菌種ミクロモ
ノスポラ・ダヌビエンシス（Micromonospora
danubiensis species nova）と命名された。この
微生物から、本発明者はさまざまの菌株精製法に
よつてJMS−３と呼ばれる菌株を得た。この菌
株（ハンガリー国、ブダペストのハンガリー国立
微生物収集機関に1978年６月19日に寄託、受託番
号MNG00171の発酵試験で、非常に高濃度のシ
ソミシンを含有する発酵培地が得られた。この菌
株はまた、工業技術院微生物工業技術研究所に、
昭和55年２月７日に、受托番号微工研菌寄第5400
号として寄託された。以下本明細書ではFERM
−ＰNo.5400と記す。 本発明はミクロモノスポラ・ダヌビエンシスの
菌種の１菌株、有利にはMNG00171菌株を、炭
素および窒素の同化性供給源と無機塩類を含有す
る栄養培地で、好気性条件下に培養し、必要なら
ば得られたシソミシンを発酵培地から単離して精
製し、および／またはシソミシンをその薬学的に
許容される塩に転化することによる、シソミシン
の新規な製造方法に関する。 本発明の方法で使用する微生物は、下記のよう
な顕微鏡下、肉眼上および生化学的性質を有す
る。 形 態 肉眼観察：ツアペツク（CzaPek）寒天培地に
より37℃で10日間培養したものは、強−中度の増
殖を示し、気中（aerial）菌糸体はなく、コロニ
ー（集落）は規則的な円形に発現し、淡い赤褐色
に着色していた。コロニー以外には、可溶性色素
の分泌は認められなかつた。 顕微鏡観察：隔壁を有しない直径0.5μの長い分
枝した糸状体；胞子は直径１〜1.5μの単純な胞子
体により保持される。胞子の形状は卵形ないし球
形である。 胞子の配列は単軸型（monopodial）である。 生化学的および生理学的性質：ミクロモノスポ
ラ・ダヌビエンシス菌株MNG−000171
（FERM−ＰNo.5400）は28〜37℃の温度で強度
に増殖するが、４４℃以上の温度では増殖は認
められない。 炭素源の利用を下記の栄養培地で検討した：酵
母エキス0.5％、炭素源1.0％、CaCO30.1％、寒天
1.5％、残部は蒸留水。結果を第１表に示す。
【表】
【表】
窒素源の利用を下記の栄養培地で検討した：グ
ルコース１％、寒天1.5％、窒素源0.5〜１％、残
部蒸留水。結果を第２表に示す。
ルコース１％、寒天1.5％、窒素源0.5〜１％、残
部蒸留水。結果を第２表に示す。
【表】
ミクロモノスポラ・ダヌビエンシスの生長して
いるコロニーはゼラチン、牛乳およびでんぷんを
加水分解し、硝酸塩を亜硝酸塩に還元する。この
微生物は繁殖培地中に最大２％の塩化ナトリウム
を許容する。 培養特性 第３表にはミクロモノスポラ・ダヌビエンシス
JMS−３の培養特性が記載されている。（この観
察に対する発色の説明においては、Baumenns
Farbtonkarte Atla、Paul Baumann、Aue
−SA 87350 LAu 302、西独国を参照した。）
いるコロニーはゼラチン、牛乳およびでんぷんを
加水分解し、硝酸塩を亜硝酸塩に還元する。この
微生物は繁殖培地中に最大２％の塩化ナトリウム
を許容する。 培養特性 第３表にはミクロモノスポラ・ダヌビエンシス
JMS−３の培養特性が記載されている。（この観
察に対する発色の説明においては、Baumenns
Farbtonkarte Atla、Paul Baumann、Aue
−SA 87350 LAu 302、西独国を参照した。）
【表】
以上の事実に基いて、JMS−３と呼ばれるミ
クロモノスポラ属の菌株は文献に公知のミクロモ
ノスポラ属のどの菌種からも異なることが確証さ
れた。Luedemannのミクロモノスポラ属系統に
対して列挙された分類微候と比較して、JMS−
３菌株は新規な菌種であることが証明され、その
単離の場所によつて、この新規な菌種は新菌種ミ
クロモノスポラ・ダヌビエンシス（M.
danubiensis species nova）と命名された。 このミクロモノスポラ・ダヌビエンシスの菌株
は好気性条件下で深部培養状態で培養するのが有
利である。 シソミシン生産用の栄養培地には、ミクロモノ
スポラ・ダヌビエンシスの微生物が同化できる数
種の炭素および窒素源、無機塩類、微量元素およ
び消胞剤を存在させることができる。炭素、窒素
およびエネルギーの供給源としては、でんぷん、
水溶性でんぷん、デキストリン、グルコース、サ
ツカロース、コーンミール（corn meal）、大豆
ミール（soya meal）、大豆ミールの加水分解物、
カゼインの加水分解物、とうもろこし浸出液
（corn steep liquor）、酵母エキスなどが使用で
きる。 無機塩類としては、アンモニウム、鉄、亜鉛、
マンガン、マグネシウム、ナトリウム、カリウ
ム、およびコバルト塩の数種類を使用できる。栄
養培地の緩衝能を高めるために炭酸カルシウムを
使用するのが有利であり、消胞剤としては各種の
植物油（例、パーム油、ひまわり油、大豆油な
ど）が使用できる。 さまざまの栄養培地成分の使用により各種の栄
養培地が形成できる。接種菌の増殖のための栄養
物の要件は、本発酵の栄養物要件とは異なる。シ
ソミシンの生産に対しても最も有利な栄養培地の
１種は、大豆ミール、とうもろこし浸出液、コー
ンミール、でんぷん、サツカロース、炭酸カルシ
ウム、塩化コバルトおよびパーム油を含有する栄
養培地であることがわかつた。 発酵温度は25〜37℃の範囲内でよく、28〜33℃
の温度での発酵が最も有利である。 発酵器の形状に応じて攪伴は100〜600rpmの範
囲内でよい。毎分約１／1v／ｖの通気が有利で
ある。 発酵過程で生産される抗生物質（シソミシンお
よび“少量”成分）の活性は、表皮ブドウ球菌
（Staphyrococcus epidermidis）を試験微生物と
して、寒天拡散法によつて、標準シソミシン製品
に対する値として測定される。 96〜120時間の発酵中に、発酵ブロスの活性の
合計は400〜450U／ml（1U＝1μｇのシソミシン
塩基活性）の値に達する。シソミシン活性は発酵
ブロス中の全抗生物質活性の約85％になる。 シソミシンの単離は公知の方法により実施でき
る。所望により、得られたシソミシン塩基を薬学
的に許容される塩に転化してもよい。 微生物のミクロモノスポラ・ダヌビエンシスに
より生産されるシソミシンの量は、従来公知の方
法による生産量のほぼ倍量である。すなわち、実
験室条件下では生産量は450U／mlをこえ、パイ
ロツトプラント発酵器でも350〜400／mlである。
発酵ブロスはシソミシンのほかには10〜15％の随
拌抗生物質を含有するだけである。 以下、実施例により本発明の方法を例示する。 実施例 １ 500mlの三角フラスコに入れた下記組成の滅菌
栄養培地100mlに、無菌条件下で、ミクロモノス
ポラ・ダヌビエンシスJMS−３（MNG00171
（FERM−ＰNo.5400））の冷凍貯蔵（undercool）
されていた菌株の菌糸体１ml（増殖性胞子数107
〜108／ml）を接種する。 でんぷん 25.0ｇ とうもろこし浸出液 7.0ｇ （NH4）2SO4 3.5ｇ NaCl 5.0ｇ CaCO3 8.0ｇ 水道水 1000ml この栄養培地のPH値は滅菌前に7.5に調整し、
滅菌後はPH値は7.0〜7.2となる。 この培養液を、水平（Plane）振トウ機
（220rpm、偏位7.5cm）で28℃において３日間培
養する。こうして得られた培養液を使用して、６
の滅菌栄養培地（10のガラス製発酵器に収
容）を無菌条件下で接種する。この栄養培地の組
成は上記の接種用栄養培地と同一である。 ガラス発酵器での培養は、400rpmの回転攪拌
下に、毎分１／1v／ｖの通気量で28℃の温度に
おいて実施する。必要に応じて、消胞剤としてパ
ーム油を使用する。 40時間生長させた接種物を本発酵用栄養培地の
接種に利用する。接種液の量は600ml、栄養培地
の量は６、PH値は7.0〜7.2、発酵器の容量は10
である。この栄養培地の組成を次に示す。 大豆ミール 50.0ｇ コーンスターチ 10.0ｇ サツカロース 30.0ｇ CaCO3 5.0ｇ とうもろこし浸出液 5.0 CoCl2・6H2O 4.5mg 水道水 1000ml 培養は31℃で、400rpmの回転攪拌下に、６
／分の通気量で実施する。消泡剤としてパーム
油を使用する。 抗生物質の生産は発酵開始から28〜34時間目に
始まり、110時間の発酵後に最高値に達する。 この時点で、発酵ブロスの全抗生物質含有量
は、表皮ブドウ球菌を試験微生物とした寒天拡散
法による測定で、標準シソミシンに基いて
400U／mlであると測定された（Ｊ・Ｓ・
Simpson、「分析微生物学」Analytical
Microbiology、Academic Press、米国、1963
年、87〜124ページ参照）。 実施例 ２ 実施例１にしたがつて水平振トウ機でミクロモ
ノスポラ・ダヌビエンシスJMS−３（MNG00171
（FERM−ＰNo.5400））の菌株によつて調製した
増殖性培養液を、下記組成の栄養培地に接種す
る。 大豆ミール 10.0ｇ でんぷん 10.0ｇ サツカロース 10.0ｇ CaCO3 4.0ｇ 水道水 1000ml この栄養培地のPH値は滅菌後に7.0〜7.2であ
り、培地の量は６で、容量10のガラス発酵器
に入れてある。培養条件は、温度31℃、回転攪拌
速度400rpm、通気量６／分である。消泡剤と
して、パーム油を必要に応じて使用する。 36時間で生長した培養液600mlを、下記組成の
本発酵用栄養培地の接種に利用する。 大豆ミール 30.0ｇ コーンミール 25.0ｇ CaCO3 5.0ｇ CoCl2・6H2O 10.0mg 水道水 1000ml この栄養培地のPH値は滅菌後に7.0〜7.2であ
る。培養条件は温度33℃、回転攪拌速度600rpm、
通気量６／分である。消泡剤としてパーム油を
使用する。 抗生物質の生産は発酵開始から26〜30時間目に
始まり、100時間の発酵後に最高値に達する。こ
の時点で、発酵ブロスの全抗生物質含有量は、標
準シソミシン試料に基いて420U／mlである。 実施例 ３ 実施例１の方法にしたがつて、水平振トウ機を
用いてミクロモノスポラ・ダヌビエンシスJMS
−３（MNG00171（FERM−ＰNo.5400））の菌株に
より調製した増殖性培養液を、下記組成の栄養培
地に接種する。 でんぷん 25.0ｇ 大豆ミール加水分解物 15.0ｇ （NH4）2SO4 2.0ｇ NaCl 3.0ｇ ZnSO4 0.5ｇ CaCO3 8.0ｇ 水道水 1000ml この栄養培地のPH値は滅菌後7.0〜7.2であり、
培地の量は６で、10のガラス発酵器に入れて
ある。大豆ミールの加水分解は、NOVO細菌プ
ロテアーゼによりPH7.5、60℃で30分間実施した。 接種後に、400rpmの回転攪拌、６／分の通
気量、温度28℃で培養を行なう。 40時間で生長した培養液600mlを用いて、下記
組成の本発酵用栄養培地を接種する。 大豆ミール加水分解物 50.0ｇ でんぷん 10.0ｇ デキストリン 25.0ｇ CaCO3 5.0ｇ サツカロース 10.0ｇ CoCl2・6H2O 4.5mg 水道水 1000ml この栄養培地のPH値は滅菌後に7.0〜7.2であ
り、培地の量は６で、10のガラス発酵器に入
れてある。大豆ミールの加水分解は、NOVO細
菌プロテアーゼにより、60℃、PH7.5で30分間実
施した。 接種後に、31℃、600rpmの回転攪拌および６
／分の通気量で培養を行なう。消泡剤としてパ
ーム油を使用する。 抗生物質の生産は発酵開始から26〜30時間目に
始まり、100時間の発酵後に最高値に達する。こ
の時点で発酵ブロスの全抗生物質含有量は標準シ
ソミシン試料に基いて430U／mlである 実施例 ４ 実施例２にしたがつて、ガラス発酵器でミクロ
モノスポラ・ダヌビエンシスJMS−３
（MNG00171（FERM−ＰNo.5400））の菌株により
調製した増殖性培養液を、容量300のステンレ
ス鋼製予備発酵装置に入れてある下記組成の栄養
培地200に接種する。 大豆ミール 10.0ｇ でんぷん 10.0ｇ サツカロース 10.0ｇ CaCO3 4.0ｇ 水道水 1000ml この栄養培地PH値は滅菌後に7.0〜7.2である。
消泡剤としてパーム油を使用する。培養条件は温
度31℃、回転攪拌速度180rpm、通気量200／分
である。 36時間で生長した培養液を使用して、下記組成
の本発酵栄養培地2000を接種する。 大豆ミール 30.0ｇ コーンミール 25.0ｇ CaCO3 5.0ｇ CoCl2・6H2O 10.0mg 水道水 1000ml この栄養培地のPH値は滅菌後に7.0〜7.2であ
る。培養温度33℃、回転攪拌220rpm、通気量２
m3／分の条件下で、消泡剤として大豆油とパーム
油の50／50混合物を使用して本発酵を行なう。 抗生物質の生産は発酵開始から26〜30時間目に
始まり、100時間の発酵後に最高値に達する。こ
の時点で、発酵ブロスの全抗生物質含有量は、標
準シソミシン試料に基いて380U／mlである。 発酵終了後、常法による処理で288ｇの純粋な
シソミシン塩基が得られる。これは結合水も含有
している。 この生成物の特性は次のとおりである。 融点：198〜201℃ 〔α〕D＝＋188゜（Ｃ＝0.3水中） 元素分折値：１水和物として 計算値：Ｃ、49.80；Ｈ、8.2 ；Ｎ、14.95％ 実測値：Ｃ、49.15；Ｈ、8.37；Ｎ、15.15％ 赤外スペクトル（KBr）：νOH、NH 3170−
3360、 νCH＝COC 1690、 νCOC 1060cm-1 NMRスペクトル（D2O）：δ1.20（Me−4″、ｓ、
3H）、δ2.50（Me−Ｎ−3″、ｓ、3H）、δ2.56（Ｈ
−3″、ｄ、J2″3″＝10Hz、1H）、δ3.17（Ｈ−6′、
bs、2H）、δ3.30（Hax−5″、ｄ、Jgem＝12Hz、
1H）、δ3.80（Ｈ−2″、dd、J2″3″＝10Hz、J1″2″
＝
４Hz、1H）、δ4.04（He−5″、ｄ、Jgem＝12Hz、
1H）、δ4.88（Ｈ−4′、bt、1H）、δ5.09（Ｈ−1″、
ｄ、J1″2″＝４Hz、1H）、δ5.35（Ｈ−1′、ｄ、
J1′2′＝２Hz、1H）ppm 固有イオンの質量番号（ｍ／ｅ）：447、332、
304、160、145、127、118、110、100 実施例 ５ （シソミシン硫酸塩の製造） 純シソミシン塩基15ｇを脱イオン水60mlに溶解
し、得られた溶液にPH値が4.3になるまで5N硫酸
水溶液を滴下する。その後、この溶液に活性炭
1.5ｇを加え、混合物を30分間攪拌した後、Seitz
紙で過する。紙を３×50mlの脱イオン水で
洗浄し、洗液と液合わせて、１のメタノール
に連続攪拌しながら投入する。析出した沈殿を含
有する溶液を低温室で放置した後、沈殿を別す
る。別されたシソミシン硫酸塩を３×50mlのメ
タノールで洗浄し、P2O5上で恒量になるまで50
℃で真空乾操する。その結果、22ｇのシソミシン
硫酸塩が得られる。
クロモノスポラ属の菌株は文献に公知のミクロモ
ノスポラ属のどの菌種からも異なることが確証さ
れた。Luedemannのミクロモノスポラ属系統に
対して列挙された分類微候と比較して、JMS−
３菌株は新規な菌種であることが証明され、その
単離の場所によつて、この新規な菌種は新菌種ミ
クロモノスポラ・ダヌビエンシス（M.
danubiensis species nova）と命名された。 このミクロモノスポラ・ダヌビエンシスの菌株
は好気性条件下で深部培養状態で培養するのが有
利である。 シソミシン生産用の栄養培地には、ミクロモノ
スポラ・ダヌビエンシスの微生物が同化できる数
種の炭素および窒素源、無機塩類、微量元素およ
び消胞剤を存在させることができる。炭素、窒素
およびエネルギーの供給源としては、でんぷん、
水溶性でんぷん、デキストリン、グルコース、サ
ツカロース、コーンミール（corn meal）、大豆
ミール（soya meal）、大豆ミールの加水分解物、
カゼインの加水分解物、とうもろこし浸出液
（corn steep liquor）、酵母エキスなどが使用で
きる。 無機塩類としては、アンモニウム、鉄、亜鉛、
マンガン、マグネシウム、ナトリウム、カリウ
ム、およびコバルト塩の数種類を使用できる。栄
養培地の緩衝能を高めるために炭酸カルシウムを
使用するのが有利であり、消胞剤としては各種の
植物油（例、パーム油、ひまわり油、大豆油な
ど）が使用できる。 さまざまの栄養培地成分の使用により各種の栄
養培地が形成できる。接種菌の増殖のための栄養
物の要件は、本発酵の栄養物要件とは異なる。シ
ソミシンの生産に対しても最も有利な栄養培地の
１種は、大豆ミール、とうもろこし浸出液、コー
ンミール、でんぷん、サツカロース、炭酸カルシ
ウム、塩化コバルトおよびパーム油を含有する栄
養培地であることがわかつた。 発酵温度は25〜37℃の範囲内でよく、28〜33℃
の温度での発酵が最も有利である。 発酵器の形状に応じて攪伴は100〜600rpmの範
囲内でよい。毎分約１／1v／ｖの通気が有利で
ある。 発酵過程で生産される抗生物質（シソミシンお
よび“少量”成分）の活性は、表皮ブドウ球菌
（Staphyrococcus epidermidis）を試験微生物と
して、寒天拡散法によつて、標準シソミシン製品
に対する値として測定される。 96〜120時間の発酵中に、発酵ブロスの活性の
合計は400〜450U／ml（1U＝1μｇのシソミシン
塩基活性）の値に達する。シソミシン活性は発酵
ブロス中の全抗生物質活性の約85％になる。 シソミシンの単離は公知の方法により実施でき
る。所望により、得られたシソミシン塩基を薬学
的に許容される塩に転化してもよい。 微生物のミクロモノスポラ・ダヌビエンシスに
より生産されるシソミシンの量は、従来公知の方
法による生産量のほぼ倍量である。すなわち、実
験室条件下では生産量は450U／mlをこえ、パイ
ロツトプラント発酵器でも350〜400／mlである。
発酵ブロスはシソミシンのほかには10〜15％の随
拌抗生物質を含有するだけである。 以下、実施例により本発明の方法を例示する。 実施例 １ 500mlの三角フラスコに入れた下記組成の滅菌
栄養培地100mlに、無菌条件下で、ミクロモノス
ポラ・ダヌビエンシスJMS−３（MNG00171
（FERM−ＰNo.5400））の冷凍貯蔵（undercool）
されていた菌株の菌糸体１ml（増殖性胞子数107
〜108／ml）を接種する。 でんぷん 25.0ｇ とうもろこし浸出液 7.0ｇ （NH4）2SO4 3.5ｇ NaCl 5.0ｇ CaCO3 8.0ｇ 水道水 1000ml この栄養培地のPH値は滅菌前に7.5に調整し、
滅菌後はPH値は7.0〜7.2となる。 この培養液を、水平（Plane）振トウ機
（220rpm、偏位7.5cm）で28℃において３日間培
養する。こうして得られた培養液を使用して、６
の滅菌栄養培地（10のガラス製発酵器に収
容）を無菌条件下で接種する。この栄養培地の組
成は上記の接種用栄養培地と同一である。 ガラス発酵器での培養は、400rpmの回転攪拌
下に、毎分１／1v／ｖの通気量で28℃の温度に
おいて実施する。必要に応じて、消胞剤としてパ
ーム油を使用する。 40時間生長させた接種物を本発酵用栄養培地の
接種に利用する。接種液の量は600ml、栄養培地
の量は６、PH値は7.0〜7.2、発酵器の容量は10
である。この栄養培地の組成を次に示す。 大豆ミール 50.0ｇ コーンスターチ 10.0ｇ サツカロース 30.0ｇ CaCO3 5.0ｇ とうもろこし浸出液 5.0 CoCl2・6H2O 4.5mg 水道水 1000ml 培養は31℃で、400rpmの回転攪拌下に、６
／分の通気量で実施する。消泡剤としてパーム
油を使用する。 抗生物質の生産は発酵開始から28〜34時間目に
始まり、110時間の発酵後に最高値に達する。 この時点で、発酵ブロスの全抗生物質含有量
は、表皮ブドウ球菌を試験微生物とした寒天拡散
法による測定で、標準シソミシンに基いて
400U／mlであると測定された（Ｊ・Ｓ・
Simpson、「分析微生物学」Analytical
Microbiology、Academic Press、米国、1963
年、87〜124ページ参照）。 実施例 ２ 実施例１にしたがつて水平振トウ機でミクロモ
ノスポラ・ダヌビエンシスJMS−３（MNG00171
（FERM−ＰNo.5400））の菌株によつて調製した
増殖性培養液を、下記組成の栄養培地に接種す
る。 大豆ミール 10.0ｇ でんぷん 10.0ｇ サツカロース 10.0ｇ CaCO3 4.0ｇ 水道水 1000ml この栄養培地のPH値は滅菌後に7.0〜7.2であ
り、培地の量は６で、容量10のガラス発酵器
に入れてある。培養条件は、温度31℃、回転攪拌
速度400rpm、通気量６／分である。消泡剤と
して、パーム油を必要に応じて使用する。 36時間で生長した培養液600mlを、下記組成の
本発酵用栄養培地の接種に利用する。 大豆ミール 30.0ｇ コーンミール 25.0ｇ CaCO3 5.0ｇ CoCl2・6H2O 10.0mg 水道水 1000ml この栄養培地のPH値は滅菌後に7.0〜7.2であ
る。培養条件は温度33℃、回転攪拌速度600rpm、
通気量６／分である。消泡剤としてパーム油を
使用する。 抗生物質の生産は発酵開始から26〜30時間目に
始まり、100時間の発酵後に最高値に達する。こ
の時点で、発酵ブロスの全抗生物質含有量は、標
準シソミシン試料に基いて420U／mlである。 実施例 ３ 実施例１の方法にしたがつて、水平振トウ機を
用いてミクロモノスポラ・ダヌビエンシスJMS
−３（MNG00171（FERM−ＰNo.5400））の菌株に
より調製した増殖性培養液を、下記組成の栄養培
地に接種する。 でんぷん 25.0ｇ 大豆ミール加水分解物 15.0ｇ （NH4）2SO4 2.0ｇ NaCl 3.0ｇ ZnSO4 0.5ｇ CaCO3 8.0ｇ 水道水 1000ml この栄養培地のPH値は滅菌後7.0〜7.2であり、
培地の量は６で、10のガラス発酵器に入れて
ある。大豆ミールの加水分解は、NOVO細菌プ
ロテアーゼによりPH7.5、60℃で30分間実施した。 接種後に、400rpmの回転攪拌、６／分の通
気量、温度28℃で培養を行なう。 40時間で生長した培養液600mlを用いて、下記
組成の本発酵用栄養培地を接種する。 大豆ミール加水分解物 50.0ｇ でんぷん 10.0ｇ デキストリン 25.0ｇ CaCO3 5.0ｇ サツカロース 10.0ｇ CoCl2・6H2O 4.5mg 水道水 1000ml この栄養培地のPH値は滅菌後に7.0〜7.2であ
り、培地の量は６で、10のガラス発酵器に入
れてある。大豆ミールの加水分解は、NOVO細
菌プロテアーゼにより、60℃、PH7.5で30分間実
施した。 接種後に、31℃、600rpmの回転攪拌および６
／分の通気量で培養を行なう。消泡剤としてパ
ーム油を使用する。 抗生物質の生産は発酵開始から26〜30時間目に
始まり、100時間の発酵後に最高値に達する。こ
の時点で発酵ブロスの全抗生物質含有量は標準シ
ソミシン試料に基いて430U／mlである 実施例 ４ 実施例２にしたがつて、ガラス発酵器でミクロ
モノスポラ・ダヌビエンシスJMS−３
（MNG00171（FERM−ＰNo.5400））の菌株により
調製した増殖性培養液を、容量300のステンレ
ス鋼製予備発酵装置に入れてある下記組成の栄養
培地200に接種する。 大豆ミール 10.0ｇ でんぷん 10.0ｇ サツカロース 10.0ｇ CaCO3 4.0ｇ 水道水 1000ml この栄養培地PH値は滅菌後に7.0〜7.2である。
消泡剤としてパーム油を使用する。培養条件は温
度31℃、回転攪拌速度180rpm、通気量200／分
である。 36時間で生長した培養液を使用して、下記組成
の本発酵栄養培地2000を接種する。 大豆ミール 30.0ｇ コーンミール 25.0ｇ CaCO3 5.0ｇ CoCl2・6H2O 10.0mg 水道水 1000ml この栄養培地のPH値は滅菌後に7.0〜7.2であ
る。培養温度33℃、回転攪拌220rpm、通気量２
m3／分の条件下で、消泡剤として大豆油とパーム
油の50／50混合物を使用して本発酵を行なう。 抗生物質の生産は発酵開始から26〜30時間目に
始まり、100時間の発酵後に最高値に達する。こ
の時点で、発酵ブロスの全抗生物質含有量は、標
準シソミシン試料に基いて380U／mlである。 発酵終了後、常法による処理で288ｇの純粋な
シソミシン塩基が得られる。これは結合水も含有
している。 この生成物の特性は次のとおりである。 融点：198〜201℃ 〔α〕D＝＋188゜（Ｃ＝0.3水中） 元素分折値：１水和物として 計算値：Ｃ、49.80；Ｈ、8.2 ；Ｎ、14.95％ 実測値：Ｃ、49.15；Ｈ、8.37；Ｎ、15.15％ 赤外スペクトル（KBr）：νOH、NH 3170−
3360、 νCH＝COC 1690、 νCOC 1060cm-1 NMRスペクトル（D2O）：δ1.20（Me−4″、ｓ、
3H）、δ2.50（Me−Ｎ−3″、ｓ、3H）、δ2.56（Ｈ
−3″、ｄ、J2″3″＝10Hz、1H）、δ3.17（Ｈ−6′、
bs、2H）、δ3.30（Hax−5″、ｄ、Jgem＝12Hz、
1H）、δ3.80（Ｈ−2″、dd、J2″3″＝10Hz、J1″2″
＝
４Hz、1H）、δ4.04（He−5″、ｄ、Jgem＝12Hz、
1H）、δ4.88（Ｈ−4′、bt、1H）、δ5.09（Ｈ−1″、
ｄ、J1″2″＝４Hz、1H）、δ5.35（Ｈ−1′、ｄ、
J1′2′＝２Hz、1H）ppm 固有イオンの質量番号（ｍ／ｅ）：447、332、
304、160、145、127、118、110、100 実施例 ５ （シソミシン硫酸塩の製造） 純シソミシン塩基15ｇを脱イオン水60mlに溶解
し、得られた溶液にPH値が4.3になるまで5N硫酸
水溶液を滴下する。その後、この溶液に活性炭
1.5ｇを加え、混合物を30分間攪拌した後、Seitz
紙で過する。紙を３×50mlの脱イオン水で
洗浄し、洗液と液合わせて、１のメタノール
に連続攪拌しながら投入する。析出した沈殿を含
有する溶液を低温室で放置した後、沈殿を別す
る。別されたシソミシン硫酸塩を３×50mlのメ
タノールで洗浄し、P2O5上で恒量になるまで50
℃で真空乾操する。その結果、22ｇのシソミシン
硫酸塩が得られる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 抗生物質のシソミシンおよびその薬学的に許
容される塩の製造方法であつて、同化性炭素およ
び窒素源と無機塩類を含有する栄養培地で、ミク
ロモノスポラ・ダヌビエンシス
（Micromonospora danubiensis）の菌株を好気
性発酵し、生成するシソミシンを捕集し、所望に
より、その塩を形成することからなる方法。 ２ 特許請求の範囲第１項記載の方法であつて、
炭素および窒素源として、でんぷん、デキストリ
ン、サツカロース、コーンミール、大豆ミール、
とうもろこし浸出液および加水分解大豆ミールか
ら選ばれる材料を使用する方法。 ３ 特許請求の範囲第１項記載の方法であつて、
培養を25〜37℃、特に28〜33℃で行なう方法。 ４ 特許請求の範囲第１項記載の方法であつて、
無機塩類としてアンモニウム、コバルトおよび亜
鉛塩を使用する方法。 ５ 特許請求の範囲第１項記載の方法であつて、
発酵ブロスから単離されたシソミシンを硫酸塩に
転化する方法。 ６ 特許請求の範囲第１項記載の方法であつて、
大豆ミール、とうもろこし浸出液、コーンミー
ル、でんぷん、サツカロース、炭酸カルシウム、
塩化コバルトおよびパーム油を含有する栄養培地
を使用する方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU79CI1906A HU179145B (en) | 1979-02-01 | 1979-02-01 | Process for microbiological producing sysomycin with fermenting micromonospora danubiensis |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS55108295A JPS55108295A (en) | 1980-08-20 |
| JPH022599B2 true JPH022599B2 (ja) | 1990-01-18 |
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|---|---|---|---|
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| GB (1) | GB2043687B (ja) |
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-
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